CAPTULO 8.

ENZIMAS Y CATLISIS 141

Facilitando reacciones de oxidorreduccin gracias al paso rever NH,

sible de su estado de oxidacin.
Cambiando la polaridad de ciertos enlaces para hacerlos ms
susceptibles a ciertos reactivos.
Esta ltima funcin es necesaria en las reacciones de fosforilacin
de ciertos aminocidos que tienen un grupo hidroxilo. La fosforila
cin se produce por la transferencia del grupo fosfato desde el ATP o
el GTP (Fig. 8-11). Los cationes de magnesio hacen que los electro
nes se alejen ms del fsforo (reactivo electrfilo) que queda ms
susceptible al ataque por el grupo nuclefilo (OH de Ser, Thr o
Tyr), con lo que se promueve la hidrlisis del enlace fosfoanhdrido y
(Ser)
se consigue su transferencia desde el ATP a la cadena lateral del ami
nocido. Figura 8-11. Los ca tio n es m et lico s com o co fa cto
En muchos casos las enzimas utilizan una combinacin de estos res en las qu in asas. La fosforilacin de las cadenas
mecanismos para conseguir un aumento de la velocidad de la reac laterales de Ser, Thr y Tyr catalizada por las quinasas
cin. Un ejemplo de esta combinacin se da en la quimotripsina, comienza por el ataque del grupo nuclefilo OH a

una proteasa que combina la catlisis covalente con la catlisis cido- un grupo fosfato de un nucletido trifosfato. El Mg2+
atrae a los electrones del enlace P = 0 haciendo que
base general gracias a la presencia de dos residuos catalticos: una Ser
el P tenga una deficiencia de electrones y sea ms
y una His. En esta proteasa, la reaccin comienza con la transferencia
susceptible al ataque por el nuclefilo.
de un protn de la Ser a la His (vase Fig. 8 - 10a y b). Esto crea en la
Ser un grupo O m uy nuclefilo que ataca al carbono del grupo
carbonilo que posee una baja densidad electrnica (vase Fig. 8-10b). A conti
nuacin se forma un enlace covalente transitorio que hace que se desplacen dos & Las enzimas combinan diferentes
mecanismos qumicos para disminuir
electrones del doble enlace C = 0 hacia el oxgeno (ms electronegativo) que la energa de activacin y aumentar
adquiere carga negativa (vase Fig. 8 - 10c). Esta carga negativa es estabilizada la velocidad de la reaccin.
por interacciones no covalentes con otros aminocidos del centro activo (los
tomos del enlace peptdico de una Gly y una Ser). El resultado de esta accin
combinada es la hidrlisis del enlace peptdico mediante una ruta con una me
nor energa de activacin.

O CINTICA ENZIMTICA

La cintica qumica estudia las velocidades de reaccin

Realizar ensayos en el laboratorio en diferentes condiciones experimentales para
d i s datos cinticos obtenidos en
estudiar la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas aporta informa el laboratorio permiten conocer as
cin sobre aspectos como la afinidad de la enzima por el sustrato o la eficiencia pectos sobre el mecanismo de la re
con la que se transforma ese sustrato en el producto de la reaccin. Tambin accin enzimtica estudiada.
pueden proporcionar informacin sobre ciertos detalles del mecanismo qumico
por el que transcurre la reaccin catalizada. Estos datos ayudan a predecir su
comportamiento en el ambiente celular o su respuesta ante cualquier variacin
de las condiciones habituales (Recuadro 8-5).
Equilibrio
I
Cintica de las reacciones de un solo sustrato Producto (P)

Los estudios de la velocidad de las reacciones enzimticas de un solo sustrato se

realizan mezclando una concentracin conocida de enzima con una concentra
cin concreta de sustrato, y midiendo la desaparicin de sustrato o la aparicin
de producto a lo largo del tiempo (Fig. 8-12). El mtodo analtico de medida de Sustrato (S)
sustrato o de producto depender de sus caractersticas qumicas, pero son habi
tuales los mtodos espectroscpicos, de fluorescencia o radiomtricos. Tiempo
Si se realiza una representacin grfica de este tipo de ensayo se obtiene una
curva de progreso como la que se muestra en la figura 8-13. Figura 8-12. D iagram a de d e sa p arici n de
su stra to y a p a rici n de p ro d u cto en una
Como puede apreciarse, en la primera etapa la reaccin sigue una cintica de
reacci n c a ta liza d a . En la etapa inicial de la
primer orden hasta que la desaparicin de sustrato es suficientemente elevada
reaccin se observa una desaparicin pro
(aproximadamente a partir de un 1 0 %) para que esta relacin deje de ser lineal. gresiva de sustrato y una aparicin de pro
Por este motivo las medidas de velocidad se miden en la primera etapa lineal, se ducto hasta llegar al equilibrio. Para una re
denominan velocidades iniciales (V0) y se determinan como la pendiente de la accin reversible, en el equilibrio no hay
curva de progreso al principio de la reaccin. Si en el mismo tipo de grfico re cambio neto en las concentraciones de sus
presentamos ensayos realizados con diferentes concentraciones de sustrato, se trato y producto.

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142 SECCIN II. LA ENERGA Y LAS FUNCIONES CELULARES

R ecu a d ro 8-5. C o n c e p to s b sico s. O rd en de u na re a cc i n . U n id ad es de la co n sta n te de velo cid ad

La cintica qumica estudia la velocidad de las reacciones y los procesos qumicos.

En una reaccin S >P, la velocidad se puede expresar matemticamente como:

desaparicin de sustrato V0 = -

a p a rici n de p ro d u cto 1V0 =

H / d[P]

Las unidades de velocidad sern, por tanto, unidades de concentracin divididas por unidades de tiempo y se suelen expresar como M *s- '.

Las reacciones qumicas se pueden clasificar, segn su comportamiento cintico, en reacciones de primer orden, de segundo orden y de orden
cero. En cada caso, la velocidad es proporcional a una constante de velocidad (k) y a la concentracin de uno o ms sustratos en unas condicio
nes determinadas. Com o veremos a continuacin, k tiene distintas unidades dependiendo del orden de la reaccin.

Reacciones de prim er orden

Son reacciones del tipo A >B, en las que la velocidad depende de un solo sustrato:

V = k [ A]

En este tipo de reacciones, k se da en unidades de tiem po-1 (s~1). Un valor elevado de k, implica una velocidad elevada.

En el caso de reacciones reversibles A<= B:

^ b=MM y vB_A =M B]
Como en el equilibrio la velocidad de transformacin de reactivos en productos es igual que la de productos en reactivos, igualando las ecua
ciones anteriores, y despejando, se obtiene que /c1/Ac_1 = [B]/[A], La relacin entre las constantes de velocidad de la reaccin directa y la inversa
(/c,//c_,) es el valor de la constante de equilibrio de la reaccin: keq (vase captulo 1).

Reacciones de segundo orden

Se trata de reacciones en las que intervienen dos sustratos para dar un producto:

2 A >B o A + B >C

En este tipo de reacciones, la velocidad depender de la concentracin de los dos sustratos: V = k [A ]2 o V/=/c[A][B], En ambos casos, las unida
des de la constante de velocidad sern N/T1 s~\

Reacciones de orden cero

En este tipo de reacciones la velocidad es independiente de la concentracin de sustrato. Puede depender de otros factores como, por ejemplo,
la concentracin de catalizador.

Figura 8-13. C u rso de una rea cci n c a ta li
zad a con u na co n ce n tra c i n de enzim a
co n sta n te . La concentracin de producto va
aumentando de forma lineal hasta que el
sustrato va desapareciendo en el transcurso
del tiempo, y la reaccin alcanza el equili
brio. La velocidad inicial (V0) se determina
como la pendiente de la recta en el inicio de
la reaccin. La velocidad a cualquier tiempo
t se representa com o Vt.
pueden comparar las velocidades iniciales en cada situacin (Fig. 8-14). Esta
informacin se puede llevar a otro tipo de grfica en la que cada punto represen
ta V0 frente a una concentracin de sustrato (Fig. 8-15). Para la mayora de las
reacciones catalizadas por enzimas, los datos experimentales proporcionan grfi
cas como la mostrada en la figura 8-15 en las que se identifican tres zonas clara
mente diferenciadas.
Una primera etapa lineal, a bajas concentraciones de sustrato, en la que la
reaccin se comporta como si fuera de primer orden.
Una segunda etapa curvilnea, a concentraciones de sustrato intermedias,
en la que hay un descenso en la respuesta al aumento de la concentracin
de sustrato.
Una ltima etapa, a elevadas concentraciones de sustrato en la que la velo
cidad no vara al aumentar la concentracin de sustrato. La reaccin sigue
una cintica de orden cero.
Este comportamiento se puede explicar de una forma cualitativa suponiendo
que la reaccin enzimtica transcurre mediante la reaccin que ya se ha visto al
principio del captulo:
E + S += ES E +P reaccin ( 1 )
k-\
U nin del Etapa
sustrato cataltica
A bajas concentraciones de sustrato, la velocidad ser proporcional a la con
centracin de sustrato [S]; pero a concentraciones elevadas de sustrato, toda la
enzima estar saturada formando el complejo ES, por lo que la velocidad depen-

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 CAPTULO 8. ENZIMAS Y CATLISIS 143

der de su concentracin y se podr expresar como v - k2 [ES]. Es decir, depen

elevadas concentraciones de
der de la velocidad de transformacin qumica de ES a EP y de la liberacin de sustrato la velocidad de la reaccin
producto y enzima libre. En estas condiciones, la adicin de ms sustrato no no aumenta cuando lo hace la con
afecta a la velocidad, por lo que la reaccin muestra un comportamiento de or centracin de sustrato debido a un
den cero y se dice que hay un efecto de saturacin de la enzima por el sustrato. efecto de saturacin de la enzima.
Para expresar este comportamiento mediante una expresin matemtica Leo
nor M ichaelis y M aud Menten en 1913, desarrollaron un razonamiento que se
basaba en asumir ciertos supuestos:
1. La primera etapa de la reaccin enzimtica es la formacin rpida del
complejo ES mediante una reaccin reversible. En este supuesto se puede
definir una constate ks (constante de disociacin) que es la inversa de ka
(constante de asociacin).
l _ [E lib r e l [ S ] /<r\

[ES] ( j
donde [Elibre] = [Etotal] - [ES]. Se utilizan los valores de ks en lugar de los
de k3, porque los primeros tienen unidades de concentracin y esto permi
te comparar su valor con el de la concentracin que sustrato. Cuanto ms
fuerte sea la unin de la enzima al sustrato menor ser el valor de la ks.
Tiempo (s)

E + S <= ES Figura 8-14. C u rva s de p ro greso para una

k-\ se rie de re a cc io n e s con d ife re n tes co n
Sustituyendo el valor de [Elibre] en la ecuacin (5) por [Elibre] = ce n tra cio n e s in icia les de su stra to . La V0
= [Etotal] [ES] y despejando, obtenemos que: (pendiente de las rectas) aumenta a medida
que lo hace la [S], S1 a S7.

[ES] = -[| ^ '-| | ] (6 )

2 . En una segunda etapa mucho mas lenta (cat < k^} el complejo ES se
transforma enproducto y enzima libre en una o varias reacciones. En este (b)
caso, la velocidad depende de la concentracin de complejo enzima-sus
trato [ES] y de la constante de velocidad de la etapa ms lenta, que se
denomina kCM(constante cataltica):

ES E +P V0 = [ES] (7)
Combinando las reacciones (6 ) y (7), y simplificando, podemos calcular la
velocidad de la reaccin
v = L [E to ta l] [ S ]

cat ks + [S]
0
que describe la velocidad de reaccin como una funcin hiperblica en funcin
de la [S].
Cuando [S] tiende al infinito, toda la enzima se encuentra como complejo
ES, por lo que se puede considerar que
Figura 8-15. D iagram a de v e lo cid a d e s ini
= ka , [E] (8 ) cia le s de re a cci n fre n te a co n ce n tra ci n
de su stra to . En este tipo de grficas cada
Combinando esta ecuacin con la anterior obtenemos:
velocidad inicial (pendiente de la recta de la
Y = Knax [S] /n\ figura anterior) se representa frente a la [S],
La V/max solo se obtiene com o un valor
0 ks + [S] U)
aproximado. La Km representa la [S] que co
que explica el comportamiento cintico de aquellas reacciones en las que hay incide con la mitad de la Vmax.
una formacin rpida del complejo ES, seguidas de una etapa posterior ms
lenta en la que se produce y libera el producto de la reaccin.

El modelo del estado estacionario y la ecuacin

O Se puede explicar el comporta
de Michaelis-Menten miento de numerosas reacciones en
En algunas ocasiones no se cumple que kait < K por lo que Brigs y Haldane zimticas suponiendo que la primera
llegaron a una expresin matemtica ms general, que se puede ajustar a esta si etapa es rpida y reversible y la velo
tuacin siempre que se cumpla que la [ES] permanezca constante, por lo que se cidad est condicionada por la trans
formacin mucho ms lenta del sus
denomina cintica del estado estacionario. Este tipo de cintica se obtiene cuan
trato a producto.
do la [S] [Elibre! 5 lejos de las condiciones celulares pero en unas condiciones

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144 SECCIN II. LA ENERGA Y LAS FUNCIONES CELULARES
( l a ecuacin de Michaelis-Men-
ten explica el comportamiento de las
reacciones en las que la concentra
cin del complejo enzima-sustrato
permanece constante y la concentra
cin de sustrato es muy superior a la
de enzima.
d La /cs permite estimar el grado
de disociacin del complejo ES y es
timar la afinidad de la enzima por el
sustrato.
m uy fciles de obtener en el laboratorio. En esta situacin, la [ES] depende de la
velocidad de formacin del complejo ES (controlada por kx) y de la velocidad de
desaparicin del complejo ES, que puede producirse por dos situaciones:
1. Por la disociacin del complejo ES para dar Elibre y sustrato, controlada
por k_x.
2. Por la formacin de producto y liberacin de Elibre, controlada por /ecat.
Igualando la velocidad de formacin del complejo ES con la velocidad de
desaparicin (situacin de estado estacionario), y despejando, se obtiene un
nuevo valor para la [ES]:
[ES] = [Ebre] [SlibrJ
k-l + cat
K
En esta ecuacin se define una nueva constante que surge de la combinacin de
las constantes de velocidad de la reaccin que se denomina la constante de M i-
chaelis-M enten y se denomina Km de forma abreviada. La ecuacin anterior
puede ahora simplificarse:
[ES] [Ebre] [S)bre]
K
Teniendo en cuenta que la disminucin de sustrato en la fase estacionaria es
prcticamente insignificante, se puede sustituir [SlibrJ por la [S]. De igual forma,
sabiendo que [Elibre] = [Etotd] - [ES], se llega a la siguiente ecuacin:
[ES] [Et0J [S]
+ [S]
Calculando la velocidad en funcin de la [ES] y teniendo en cuenta que cuando
la concentracin de sustrato tiende a infinito, Vmax = kCM[E], obtenemos:
V- [S]
Km + [S]
0
Aunque esta ecuacin difiere de la obtenida inicialmente por Michaelis-
Menten, se conoce universalmente como la ecuacin de Michaelis-Menten.
Como se muestra en el recuadro 8 - 6 , esta expresin matemtica se ajusta a
los datos experimentales obtenidos para las reacciones de un nico sustrato re
presentados en la figura 8-15.
Parmetros enzimticos caractersticos de una enzima
Una vez encontrada una expresin matemtica que describe los datos experi
mentales se ver a continuacin qu informacin aportan los diferentes parme
tros cinticos de esta expresin. Tambin se examinar cmo la variacin de es
tos valores en distintas condiciones experimentales ayuda a comprender el me
canismo de las reacciones enzimticas estudiadas.
Significado de Vmax
La velocidad mxima es la tasa mxima terica que se obtiene en unas condicio
nes determinadas. El valor exacto no se obtiene experimentalmente: se obtiene
un valor aproximado cuando la velocidad comienza a ser independiente de la
concentracin de sustrato ([S] o). Para alcanzar la Vm3X sera necesario que
todas las molculas de enzima estuvieran estrechamente unidas con el sustrato.
Como se ver ms adelante algunas transformaciones matemticas permiten ob
tener un valor numrico de Vmax a partir de los datos experimentales.
Significado de ks
Como ya hemos visto, ks = k_Jkv es una constante de disociacin del complejo
ES derivada de constantes de velocidad. Su valor puede servir de referencia para
conocer la afinidad de la enzima por el sustrato. Un valor elevado de ks indica
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