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Juliana Wojciechowski
Universidade Federal do Paran
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All content following this page was uploaded by Juliana Wojciechowski on 05 January 2015.
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1. O que so microalgas?
As algas compreendem um grupo artificial muito diverso de organismos
fotossintetizadores. Esses organismos so classificados como talfitos, isto , plantas
inferiores, por apresentarem uma estrutura simples, no vascularizada, sem raiz, caule e
folhas. As estruturas reprodutivas das microalgas so desprotegidas, produtoras de esporos e
desprovidas de sementes e flores (criptgamas).
As microalgas podem ser procariticas ou eucariticas, pluricelulares ou unicelulares,
e apresentam similaridade em muitos aspectos com as plantas superiores, como, por exemplo,
a composio de seus carboidratos de reserva, protenas e pigmentos fotossintticos. As algas
possuem clorofila a como seu pigmento fotossinttico primrio. Outros tipos de clorofila, bem
como carotenides (caroteno e fucoxantina), ficocianina e ficoeritrina apresentam uma
distribuio mais limitada nas algas, funcionando como pigmentos acessrios.
As algas apresentam uma ampla distribuio geogrfica, podendo ser encontradas em
praticamente todas as condies ambientais da Terra, desde solos frteis a desertos quentes e
frios. Entretanto, no ambiente aqutico, tanto marinho quanto em guas epicontinentais, que
encontramos maior prevalncia das microalgas. Nos ambientes aquticos as algas
desempenham um papel central na base da cadeia alimentar, na qual funcionam com
produtores primrios, produzindo matria orgnica e dixido de carbono, alm de servirem
como fonte de oxignio, necessrios para o metabolismo dos consumidores.
A tradicional classificao das microalgas tem sido baseada nos tipos de pigmentos,
natureza qumica dos produtos de reserva e constituintes da parede celular. Tambm tm sido
considerados aspectos citolgicos e morfolgicos nessa classificao, tais como a ocorrncia
de clulas flageladas, a estrutura dos flagelos, os processos de formao do ncleo e da
diviso celular, a presena e a caracterizao de envoltrio do(s) cloroplasto(s) e a possvel
conexo entre o retculo endoplasmtico e a membrana nuclear. Alm dessas caractersticas,
tcnicas de biologia molecular tm sido igualmente usadas.
As microalgas fazem parte de grupo muito heterogneo de organismos,
predominantemente aquticos e geralmente unicelulares microscpicos, podendo formar
colnias e apresentar pouca ou nenhuma diferenciao celular. A colorao desses
organismos variada e caracterstica, oportunizada pela presena de pigmentos e mecanismo
fotoautotrfico. Filogeneticamente, as microalgas so um grupo polifiltico, cujos
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representantes so dispersos em pelo menos cinco das grandes linhagens eucariticas e um
importante grupo procaritico. O termo microalgas, portanto, no tem valor taxonmico,
uma vez que engloba micro-organismos com clorofila a e outros pigmentos fotossintticos
capazes de realizar a fotossntese oxignica.
Sob a denominao microalgas esto includos organismos com dois tipos de estrutura
celular: estrutura procaritica, com representantes nas Divises Cyanophyta (cianobactrias) e
Prochlorophyta; estrutura celular eucaritica, com representantes nas Divises Chlorophyta,
Euglenophyta, Rhodophyta, Haptophyta, Heterokontophyta (Bacillariophyceae,
Chrysophyceae, Xantophyceae etc.), Cryptophyta e Dinophyta, segundo Hoek et al. (1995).
As microalgas so caracterizadas como micro-organismos fotossintticos, que
combinam gua e dixido de carbono atmosfrico com luz solar para produzirem vrias
formas de energia para produzirem biomassa (polissacardeos, protenas, lipdios e
hidrocarbonetos), que pode ser utilizada na produo de biocombustveis e suplementos
alimentares, e tambm podem ser empregados na captura de dixido de carbono da atmosfera.
As microalgas produzem mais oxignio de que todas as plantas juntas existentes no mundo,
sendo responsveis por pelo menos 60% da produo primria da Terra.
A biomassa microalgal apresenta cerca de 50% de carbono na sua composio, assim
o fornecimento deste nutriente aos cultivos representa um importante componente dos custos
de produo, seja gasoso na forma de dixido de carbono, ou slido, principalmente na forma
de bicarbonato.
2. Cultivo de microalgas
Em razo de suas pequenas dimenses, muitos estudos com microalgas so
substancialmente favorecidos se elas so cultivadas. O cultivo de microalgas um sistema
biolgico eficiente na utilizao da energia solar para a produo de matria orgnica, o que
possibilita grandes rendimentos anuais de biomassa (alta produtividade). Alm disso, o
cultivo de microalgas apresenta algumas vantagens como a simplicidade de nutrientes
necessrios, a duplicao da biomassa em um curto perodo de tempo e a possibilidade de
manipular suas condies, de modo a aumentar a produo de um metablito especfico. Tais
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compostos apresentam um elevado valor comercial, principalmente por serem produtos
naturais.
Algas e microalgas so fontes de molculas de alto valor agregado. A composio
bioqumica das clulas destes organismos possui caractersticas interessantes, uma vez que
apresenta significativas propores de protenas, lipdeos, carboidratos, pigmentos e minerais.
Esses produtos podem ser utilizados como ingrediente de alimentos destinados ao consumo
humano, alimentao animal, extrao de biomolculas e produo de biocombustveis.
O ciclo de vida da maioria das microalgas se completa em poucas horas, o que
favorece a seleo de cepas e o melhoramento gentico das espcies.
O cultivo de microalgas uma disciplina relativamente recente, mas vem alcanando
progressos notveis nas ltimas dcadas. Diversas aplicaes importantes podem ser feitas
por intermdio dos cultivos de microalgas.
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proveniente do gs de combusto do carvo e contribuir para a reduo do aquecimento
global.
A composio dos efluentes pode variar de acordo com sua origem. Muitos efluentes
podem conter grande quantidade de matria orgnica ou, ainda, apresentar altas concentraes
de metais txicos, representando um grave problema para o meio ambiente.
A cultura de Spirulina em efluente suno demonstrou a possibilidade do seu uso na
remoo de DQO e fsforo, alm da produo de biomassa, podendo ser uma possvel
soluo para o impacto ambiental gerado pela descarga de efluentes em fontes naturais. A
biomassa produzida pode ser adicionada a raes de peixes.
Os estudos baseados em processos biolgicos para o tratamento de efluentes tm se
intensificado. A biossoro, que consiste na absoro de metais txicos por microrganismos,
pode ser uma alternativa sem efeitos deletrios ao ambiente. As principais vantagens da
biossoro so baixo custo e boa eficincia. Dentre os micro-organismos utilizados na
biossoro, as microalgas possuem destaque em funo da sua capacidade de reteno e
imobilizao de metais. Essa tecnologia promissora e est em expanso.
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O biodiesel fabricado por meio de um processo qumico chamado transesterificao,
onde a gordura ou o leo vegetal so separados, gerando o glicerol e cidos graxos, os quais
so esterificados, geralmente utilizando metanol e catalisadores. Os steres produzidos nesse
processo (biodiesel) e glicerina (produto que pode ser aproveitado na indstria farmacutica e
de cosmticos) so livres de compostos sulfurados e aromticos e, at o momento, estudos
tm mostrado que so menos txicos que o diesel.
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Tabela 2 - Principais microalgas cultivadas para uso comercial e suas aplicaes.
Grupo Aplicaes Microalgas
Achnanthes
Amphora
Capartogramma
Biocombustveis Catenula
Nanotecnologia Chaetoceros
Diatomceas Medicina Coscinodiscus
Alimentao animal Eunotia
Bioindicao Fragilaria
Gomphonema
Thalassiosira
Skeletonema
Biocombustveis Dinophyceae
Dinoflagelados Alimentao humana Noctiluciphyceae
Bioindicao Syndiniophyceae
Biocombustveis Pediastrum
Alimentao humana Botryococcus
Algas Verdes Alimentao animal Chlorella
Bioindicao Chamydomonas
Biofertilizante Dunaliella
Scenedesmus
Biocombustveis
Despoluio e regenerao de solos
Tratamento de guas residuais
Remoo de metais pesados Spirulina
Cianobactrias Medicina Oscillatoria
Reduo do CO2 Cyanothece
Alimentao humana
Alimentao animal
Bioindicao
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3.4 Produo de biossurfactantes de microalgas
3.5 Alimentao
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propriedades teraputicas. Atualmente, so comercializadas como alimento natural ou
suplemento alimentar e so encontradas formulaes em p, tabletes, cpsulas ou extratos.
So tambm incorporadas em massas, petiscos, doces, bebidas etc., tanto como suplemento
nutricional quanto como corantes naturais.
As microalgas so aplicadas tambm em aquicultura, para a alimentao direta ou
indireta de algumas espcies de peixes, moluscos, crustceos e de diversos organismos
forrageiros de interesse econmico.
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Principais grupos
de microalgas
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CIANOBACTRIAS
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1. Cianobactrias
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1.2 Taxonomia do grupo
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acordo com esse sistema de classificao, a classe Cyanophyceae compreende quatro ordens
(Tabela 3).
Caractersticas:
Filamentos solitrios, raramente em pequenos fascculos irregulares (grupos) de fcil
desintegrao, mais ou menos retos ou ligeiramente ondulados, isopolares, vida livre,
geralmente sem bainha. Tricomas cilndricos, com clulas ligeiramente constritas nas paredes
transversais, certas vezes ligeiramente afilado nas extremidades. Clulas ligeiramente mais
curtas do que largas at isodiamtricas, raramente ligeiramente mais longas que largas, na
maioria das vezes com aertopos por todo o volume da clula. Clulas finais (quando
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totalmente desenvolvido) amplamente arredondadas ou ligeiramente reduzidas, com parede
celular espessa ou com caliptra. Pode ocorrer falsa ramificao, hetercitos e acinetos
ausentes.
Caractersticas:
Unicelular-colonial; colnias gelatinosas, livres flutuantes ou anexadas a substrato,
esfricas, discides ou irregulares. Podem tornar-se macroscpicas, amorfas, irregulares, com
clulas irregularmente distribudas dentro de um envelope comum, s vezes densamente
aglomeradas; mucilagem colonial incolor, geralmente homognea, fina, discreta, raramente
com a margem limitada. Clulas esfricas ou hemisfricas (aps a diviso), com contedo
homogneo, azul-verde, acinzentado ou amarelado, com vrios at numerosos aertopos.
Vrias cepas so txicas.
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Dolichospermum Wacklin, Hoffmann et Komrek
Caractersticas:
Os tricomas so isopolares, metamricos com relao posio dos hetercitos, com
constries nas paredes transversais, sem bainhas firmes, s vezes com fina bainha
mucilaginosa, envelopes disfluentes. As clulas apicais so morfologicamente semelhantes s
clulas vegetativas, no se diferenciam e so capazes de se dividir. Vesculas de gs ocorrem
obrigatoriamente em clulas em fase vegetativa. Hetercitos aparecem intercalarmente,
solitrios (excepcionalmente em pares), e desenvolvem-se a partir de clulas vegetativas em
posio metamrica. Os acinetos podem desenvolvem-se paraheterociticamente, o que
significa que surgem ligados com os hetercitos, raramente ao lado do hetercito ou de ambos
os lados, mais comumente separado deles por vrias clulas, solitrios at 5 (6) em uma
fileira. Os acinetos maduros so, geralmente, trs ou mais vezes maior que as clulas
vegetativas. Todas as espcies (morfotipos) so planctnicas em estado vegetativo, nunca
formam tapetes ssseis sobre o substrato. Os filamentos vivem solitrios ou em pequenos
grupos.
Caractersticas:
Filamentosas; filamentos de livre flutuao, solitrios, apenas em algumas espcies
unidos em colnias ou fascculo; Microscpicos ou colnias macroscpicas (at 2 cm de
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comprimento) com tricomas paralelamente orientados; Tricomas retos, ligeiramente curvados
ou ligeiramente enrolados, cilndricos ao longo do comprimento ou acentuadamente ou
continuamente reduzidos em direo s extremidades, sem constrio nas paredes
transversais, sempre sem bainhas firmes, vrias espcies com envelope mucilaginoso muito
fino e incolor; Tricomas isopolares, com clulas distintamente alongadas e s vezes
vacuolizadas nas extremidades, sempre subsimtricos (deslocados para uma extremidade do
tricoma). Clulas vegetativas cilndricas ou em forma de barril, colorao azul-verde plido
ou azul-esverdeada, geralmente com aertopos. Hetercitos em forma de barril ou cilndricos
com extremidades arredondadas ou obtusas. Acinetos raramente esfricos ou ovais,
cilndricos com extremidades arredondadas, desenvolvendo solitariamente ou em linhas curtas
(de dois ou trs), geralmente em posio assimtrica no tricoma.
Caractersticas:
Filamentos de livre flutuao, solitrios, retos, curvos ou espiralados, em vrias
espcies afilados em direo as extremidades, sem bainha mucilaginosa. Tricomas isopolares
(heteropolares apenas em tricomas com apenas um hetercito), subsimtrico, com ou sem
constries nas paredes transversais. As clulas so cilndricas ou em forma de barril,
geralmente mais longas que largas, de colorao azul-esverdeado plido, amarelado ou verde-
oliva, facultativamente com aertopos; Clulas finais cnicas ou pontiagudas. Hetercitos
apenas terminal, oval, ovide ou cnico; Acinetos so elipsoidais ou cilndricos,
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desenvolvem-se usualmente ligeiramente afastados dos hetercitos, raramente adjacentes aos
hetercitos apicais. Reproduo por fragmentao do tricomas e por acinetos.
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compostos essenciais sobrevivncia e multiplicao das cianobactrias. As alteraes
naturais dos ecossistemas e as atividades humanas, como o uso recorrente de adubos e
fertilizantes, descargas sanitrias e explorao agrcola e agropecuria, tm contribudo para a
degradao da qualidade das guas e para o fenmeno da eutrofizao.
A ocorrncia de floraes em ecossistemas de gua doce atribuda a caractersticas
das cianobactrias como sua capacidade de regular a posio na coluna de gua, ajustar a
composio relativa dos pigmentos em funo da quantidade e intensidade luminosas, alta
afinidade e eficincia na absoro de fsforo, habilidade de fixar nitrognio atmosfrico, entre
outras. O estudo das floraes e o conhecimento de suas causas so essenciais para sua
preveno e manejo.
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Tabela 4 Cianotoxinas classificadas com relao ao mecanismo
de ao e seus gneros potenciais produtores.
Mecanismos
Toxina Gneros
de toxicidade
Neurotxicas Anatoxina-a Dolichospermum
Anatoxina-a(s) Cylindrospermopsis
Saxitoxina Aphanizomenon
Lyngbya
Planktothrix
Hepatotxicas Microcistina Microcystis
Nodularina Nodularia
Cilindrospermopsina Cylindrospermopsis
Oscillatoria
Aphanocapsa
Dermatotxicas Lipopolissacardeos Todas
(LPS)
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cidos graxos poli-insaturados, carotenides, ficobilinas, polissacardeos, vitaminas, esteris e
diversos compostos bioativos naturais.
Algumas espcies de cianobactrias tm a taxonomia baseada, por exemplo, no modo
de reproduo, medida das clulas reprodutivas, nmero, localizao e espaamento dos
acinetos e hetercitos, padres de diviso celular (orientao do eixo de diviso celular), entre
outros. Essas caractersticas so mais facilmente observadas mantendo as espcies em cultivo.
O isolamento e cultivo das cianobactrias facilitam as observaes dos indivduos em
microscpio tico, eletrnico e de transmisso, pois a manuteno em laboratrio permite o
aumento do nmero de indivduos nas amostras e a probabilidade de encontrar as estruturas
necessrias para a identificao.
A toxicidade em concentrao de toxina produzida por clula de cianobactria pode
ser determinada com relativa confiana a partir da quantificao de toxina produzidas por
cepas mantidas em laboratrio. Alem disso, alguns parmetros ambientais podem ser variados
a fim de determinar se a produo da toxina influenciada pelo meio.
A ecofisiologia das cianobactrias pode ser estuda em laboratrio a partir de
parmetros ambientais isolados, o que pode fornecer resultados conclusivos sobre o
comportamento das espcies frente s caractersticas ambientais.
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para obteno de biocompostos com aplicaes nutricionais e de sade. Ainda, tem sido
relatada a aplicao do gnero em tratamento de efluentes, processos de biossoro e na
produo de biocombustveis.
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DINOFLAGELADOS
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1. Dinoflagelados
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1.2 Taxonomia do grupo
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1.3 Principais gneros de dinoflagelados de gua
doce
Ceratium Schrank
Caractersticas:
Tecado; nico gnero com 1-3 cornos antiapicais formados pela projeo das placas
ps-cingulares e/ou antiapicais e um corno apical formado pelas placas apicais e poro apical.
Placas fortemente ornamentadas. Mixotrfico, protoplasma amarelo a marrom, sem estigma.
Frmula de placas: 4, 5, 5, 2.
Espcies conhecidas para o Brasil: C. furcoides, C. hirundinella.
Gymnodinium Stein
Caractersticas:
Atecado, cngulo geralmente equatorial, dividindo a clula em duas partes iguais.
Algumas espcies fotossintticas, verdes, amareladas, marrons ou azul-esverdeadas. Outras
espcies sem plastos. O sulco extende-se em forma de fenda ao pice da clula, formando um
gancho no sentido anti-horrio. Estigma presente ou ausente.
Espcies conhecidas para o Brasil: G. aeruginosum, G. biciliatum, G. fuscum, G.
simplex, G. uberrimum.
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Figura 7 Gymnodinium fuscum. Foto: K. Cavalcante
Parvodinium Carty
Caractersticas:
Clulas pequenas e ovoides, placas delicadas. Presena de poro apical. Maioria
fotossinttica, protoplasma amarelo-ouro a marrom. Espinhos podem ocorrer na regio
antiapical. Frmula de placas: 4, 2a, 7,C6, S5, 5, 2.
Espcies conhecidas para o Brasil: P. africanum, P. inconspicuum, P. umbonatum.
Peridiniopsis Lemmermann
Caractersticas:
Pacas delicadas a moderadamente espessas, algumas espcies com ornamentao de
placas conspcua. Poro apical presente. Espcies fotossintticas, protoplasma amarelo a
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marrom, outras espcies heterotrficas. Ampla variao de padro de placas, este gnero
necessita reviso. Frmula de placas: 3-5, 0-1a, 6-7, 5, 2
Espcies conhecidas para o Brasil: P. amazonica, P. cunningtonii.
Peridinium Ehrenberg
Caractersticas:
Clulas relativamente grandes, em geral esfricas a ovais. Placas fortemente
ornamentadas. Poro apical presente ou ausente. Fotossintetizantes, protoplasma amarelo a
marrom. Frmula de placas: 4, 2-3a, 7, 5, 2.
Espcies conhecidas para o Brasil: P. gatunense, P. gutwinskii, P. willei, P. volzii.
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Prosoaulax Calado et Moestrup
Caractersticas:
Atecado. Epiteca bastante reduzida. Geralmente sem cloroplastos (registros de
espcies com cleptoplastos). Estigma presente ou ausente.
Espcies conhecidas para o Brasil: P. lacustris.
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DIATOMCEAS
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1. Diatomceas
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frstula. A frstula altamente diferenciada, ornamentada por diferentes tipos de estruturas,
e sempre dividida em duas unidades chamadas tecas, as quais se encaixam como duas placas
de petri (Figura 13). A teca maior conhecida como epiteca (sempre originada da clula
me), enquanto a menor chamada hipoteca. Cada uma das tecas composta pela valva e
pelo cngulo. As valvas so localizadas nas extremidades da clula e se unem por vrias
unidades silceas delicadas, as bandas do cngulo. Cada valva composta por superfcie e
manto. Uma variedade de estruturas e projees ornamentam as frstulas, as quais so a base
da taxonomia das diatomceas.
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1.2 Taxonomia do grupo
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1.3 Reproduo
Aps sucessivas geraes, o resultado deste processo ser a reduo do tamanho das
clulas de uma parte da populao (aquelas que herdaram as hipovalvas das clulas-mes,
Figura 15). Quando atingido um limite, diferente para cada espcie, as diatomceas entram
em reproduo sexuada , restabelecendo o tamanho original das clulas, da seguinte forma:
clulas adultas (2n) produzem gametas (n) por meio de meiose . Aps a fuso de gametas
(plasmogamia, mas sem a fuso de ncleos), uma clula desenvolve-se e se expande em
volume o auxsporo e ento, ocorre a fuso dos ncleos (cariogamia) e a formao do
zigoto (2n), antes da formao da nova frstula. via auxsporo que o tamanho original da
espcie restabelecido, aps as sucessivas divises assexuadas.
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1.4 Motilidade
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Basicamente, mucopolissacardeos so secretados no interior da clula e atravessam a
membrana celular, alcanando o meio externo via fenda da rafe. No interior da clula,
filamentos de actina (protena contrtil) estabelecem ligao com as protenas transmembrana,
que por sua vez ligam-se s molculas de mucopolissacardeo. No contato com o meio, estas
estruturas hidratam e se fixam ao substrato. Elas esto, portanto, livres no interior da clula e
na fissura da rafe, mas fixadas ao substrato. So os movimentos dos filamentos de actina
presentes na periferia da clula, movimentando o contedo citoplasmtico, em interao com
as estruturas proticas transmembranas, que fazem com que a diatomcea movimente-se em
relao ao substrato. Na regio distal da rafe, a mucilagem destaca-se da clula na
helictoglossa, deixando um rastro mucoso e efmero.
Motilidade uma estratgia ecolgica importante para as diatomceas perifticas que,
com limitada disperso, podem buscar microhabitats com melhores condies para o
crescimento, especialmente de luz e de nutrientes.
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Isolamento e
cultivo de
microalgas
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1. Materiais necessrios
A lista de materiais necessrios para o isolamento de algas est disponvel na Tabela 5.
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2. Equipamentos necessrios
O laboratrio utilizado para o isolamento e cultivo de microalgas deve possuir, no
mnimo, os equipamentos listados na Tabela 6.
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organismos, fornecendo as condies e os nutrientes necessrios para o crescimento e a
sntese celular.
No ambiente natural, assim como nos cultivos, o crescimento de uma populao
microalgal resultado da interao entre fatores biolgicos, fsicos e qumicos. Os fatores
biolgicos esto relacionados s prprias taxas metablicas da espcie cultivada, bem como
com a possvel influncia de outros organismos sobre o desenvolvimento algal. Os
requerimentos de fatores fsico-qumicos referem-se principalmente a iluminao,
temperatura, oxignio e disponibilidade de micro e macronutrientes. Os principais
requerimentos nutricionais das algas so: fonte de carbono, nitrognio, fsforo, magnsio,
sdio, sulfato, potssio e outros microelementos. Muitos meios de cultura tm sido
desenvolvidos para diferentes espcies de algas, baseados nos requerimentos especficos de
cada uma delas.
3.1.1 Luz
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A luz permite a realizao da fotossntese pelas algas. Uma estreita faixa de
comprimento de onda (400-700 nm) utilizada e conhecida como radiao
fotossinteticamente ativa (RFA ou PAR em ingls).
3.1.2 Temperatura
A temperatura um importante fator de regulao das taxas das reaes qumicas dos
processos biolgicos, como a fotossntese e a respirao, por exemplo. A velocidade de
crescimento do fitoplncton, portanto, tambm tende a aumentar com o aumento proporcional
da temperatura (at 35 ou 40C). A temperatura pode tambm alterar a morfologia das
clulas. Por exemplo, algumas espcies cenobiais ou filamentosas (Stichococcus,
Scenedesmus) podem desagregar-se em clulas solitrias sob temperaturas elevadas e outras
podem alterar as dimenses das clulas (Synechococcus, desmdeas).
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3.1.4 pH
3.1.5 Macronutrientes
3.1.5.1 Nitrognio
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clulas, devido rapidez de reaes associadas ao baixo consumo de energia. Na escassez
destes dois compostos, vrias espcies do fitoplncton passam a utilizar o nitrito e/ou matria
orgnica dissolvida, o qual a frao mais abundante depois do N2, e suas principais fontes
so a lise celular (morte ou herbivoria), decomposio e excreo pelo fitoplncton e
macrfitas.
Quando o nitrognio est presente em baixas concentraes esse elemento torna-se
limitante da produo primria do fitoplncton. J as cianobactrias so capazes de fixar N2 e
no so desfavorecidas pela falta de nitrognio dissolvido na gua.
3.1.5.2 Fsforo
3.1.5.3 Slica
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3.1.5.4 Outros macronutrientes
3.1.6 Micronutrientes
44
3.2 Preparo do meio de cultivo adequado
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destilada ou deionizada. Todas as solues stock so esterilizadas por autoclavagem ou
filtrao.
O meio de cultivo preparado alguns dias antes do isolamento das microalgas atravs
da adio de uma determinada quantidade de cada soluo stock a gua destilada ou
deionizada estril. Na maioria dos casos o pH deve ser regulado atravs da adio de HCl ou
NaOH 1N. A autoclavagem normalmente realizada aps esses procedimentos. A
metodologia de preparo depende do meio de cultivo utilizado.
Os meios de cultivo usados no isolamento e manuteno de microalgas so
normalmente compostos de uma soluo stock rica em nitrognio, uma rica em fsforo, uma
soluo de ferro (soluo de Fe-EDTA) e uma de micronutrientes. As solues stock so
adicionadas em propores determinadas gua destilada ou deionizada.
Alguns cuidados devem ser tomados durante o preparo das solues stock e do meio
de cultivo. Entre eles, listamos os principais:
Reao; Certos metais traos devem ser preparados separadamente, pois reagem uns
com os outros.
Manuteno do pH; A esterilizao do meio de cultivo comumente realizada por
autoclavagem, o que pode causar mudanas no pH da soluo. Para a manuteno do
pH pode-se adicionar um tampo orgnico, como TRIS (hidroximetil amino-metano).
Adio de vitaminas; A autoclavagem pode causar a desnaturao de certas vitaminas.
As vitaminas, em geral, so adicionadas aps a autoclavagem do meio, em capela de
fluxo laminar.
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A amostra de gua bruta pode ser filtrada para separar as diferentes fraes do
plncton (como o fitoplncton do zooplncton, por exemplo). A amostra de fitoplncton pode
ser enriquecida e armazenada durante algumas semanas.
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choque de composio de nutrientes. Nesse caso deve-se realizar uma aclimatao gradual da
espcie ao meio de cultivo.
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meio de cultivo estril (Figura 18a diluio 1/10). Dessa primeira diluio, pipeta-se 1 mL
em outro tubo de ensaio contendo 9 mL de meio de cultivo estril (Figura 18a diluio
1/100) e assim por diante. As amostras diludas devem ser incubadas e monitoradas. Esse
procedimento recomendado para espcies filamentosas. Para espcies no filamentosas,
recomenda-se que a diluio seja realizada da mesma maneira em placas de Petri contendo
meio slido (Figura 18b).
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Nesse procedimento, as amostras contendo as microalgas de interesse so inoculadas
em placa de Petri com meio de cultivo e gar (meio slido). Uma fonte luminosa colocada
prxima ao gar, a fim de concentrar os indivduos fototticos em um ponto. Dessa maneira,
os indivduos de interesse so previamente separados das outras microalgas. Aps alguns
minutos, o isolamento pode ser realizado facilmente por capilaridade.
50
3.5.2 Tipos de culturas
51
3.5.2.1 Culturas contnuas
52
cultivo a que est submetida. Sendo assim, imprescindvel a realizao da curva de
crescimento para cada espcie isolada. O tempo entre repicagens, em geral, fica em torno de
15 dias.
A capela de fluxo laminar um equipamento projetado para criar uma rea de trabalho
estril, que permite a manipulao de materiais sem contaminao. Esse equipamento um
gabinete de proteo, tipo bancada, com laterais e teto de vidro para melhor visualizao dos
trabalhos. A capela funciona como uma cmara quase isolada, onde o ar filtrado injetado em
uma s direo na rea de trabalho, garantindo um ambiente renovado e limpo (Figura 22).
53
a trabalhar. A lmpada UV deve ser desligada antes de iniciar as atividades. O uso de luvas
no obrigatrio, mas preciso lavar as mos e braos com sabonete e aplicar lcool 70%
antes de trabalhar sob a capela. Dentro do fluxo, deve-se trabalhar prximo a chama do bico
de Bunsen ou da lamparina. Devido cuidado deve ser tomado para no obstruir as perfuraes
da capela por onde passa o fluxo de ar. Evitar movimentos bruscos que podem causar
queimaduras com a chama. As pipetas no devem tocar os Erlenmeyers ou tubos com os
cultivos, nem qualquer outro tipo de vidraria. Usar um bquer como lixo de cultivo e
posicionar a uma distncia segura do bico de Bunsen.
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O procedimento correto , a cada repicagem, manter pelo menos 3 back ups dos
cultivos anteriores. Portanto, considerando uma repicagem por ms, as culturas devem ser
descartadas apenas aps 4 meses da inoculao.
O descarte das culturas em desuso deve ser realizado em galo com volume de
aproximadamente 5 L contendo 1 L de gua sanitria. Quando o contedo do galo de
resduos estiver entre amarelo e branco, este pode ser descartado na pia.
55
3.7.3.2 Protocolo para descontaminao por fungos e bactrias
Antifngico Fluconazol
Antibitico Penicilina
Uma contaminao moderada por bactrias pode ser resolvida atravs do uso de
antibiticos como a Penicilina. Nesse caso, uma alquota da cultura contaminada transferida
para meio estril contendo um nvel tolervel de antibitico. Deve-se atentar para o fato de
que cianobactrias so semelhantes s bactrias e podem ser afetadas tambm pelo
antibitico. A repicagem deve ser realizada algumas vezes (o quanto for conveniente) da
mesma forma. Ento, diversas alquotas da cultura devem ser pipetadas em tubos menores
contendo meio de cultivo sem antibitico. Por diluio, alguns tubos devem conter apenas
algas, sem bactrias.
A soluo de antibitico pode ser preparada dissolvendo 100 mg de Penicilina G (sal
de sdio ou potssio), 25 mg de sulfato dihidroestreptomicina e 25 mg de sulfato gentamicina
em 10 mL de gua destilada ou deionizada. Essa soluo deve ser filtrada em membrana de
filtrao e mantida congelada at o uso. A dose recomendada de 0,5 mL da soluo de
antibitico para cada 50 mL de cultura contaminada.
56
Luz UV
O sucesso desse processo depende do grupo de alga que se est cultivando, das
bactrias presentes e da resposta dos organismos a luz UV. Porm, o uso constante da luz UV
reduz significativamente a ocorrncia de contaminaes durante a manuteno dos cultivos. O
recomendado manter as culturas sob luz UV, durante 20 minutos, antes de cada repicagem.
57
ndices e clculos
relacionados
58
1. Curva de crescimento
Quando uma cultura no contnua de cianobactrias desenvolvida em um sistema
fechado, o seu crescimento pode ser representado por uma curva de crescimento. Esta curva
dividida em diferentes fases de crescimento: Fase lag, log, estacionria e de declnio (Figura
23).
A fase lag a fase inicial de crescimento, um perodo varivel, onde no h aumento
significativo da populao de microalgas. A fase lag corresponde ao perodo de adaptao das
clulas ao novo meio de cultivo, absoro de coenzimas essenciais, preparao do complexo
enzimtico e outros constituintes celulares necessrios absoro dos nutrientes presentes no
meio. A fase lag tambm observada quando as clulas sofrem traumas fsicos (choque
trmico, radiaes) ou qumicos (produtos txicos), ou at mesmo quando so transferidas de
um meio para outro de composio diferente, devido necessidade de sntese de vrias
enzimas especficas. nesse perodo que realizada a reparao das clulas que sofreram
danos. Assim, durante este perodo observa-se um aumento na quantidade de protenas, no
peso seco e no tamanho celular.
A fase log ou exponencial corresponde etapa em que as clulas esto plenamente
adaptadas, absorvendo nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando.
Neste momento, a quantidade de produtos finais de metabolismo ainda pequena. A taxa de
crescimento exponencial varivel, de acordo com o tempo de gerao do organismo.
Geralmente, procariticos crescem mais rapidamente que eucariticos. Nesta fase so
realizadas as medidas de tempo de gerao. Por ser a fase mais saudvel das clulas, onde
todas esto se dividindo, nesse momento que deve ser realizada a repicagem da cultura.
Durante a fase estacionria os nutrientes esto entrando em escassez e os produtos
txicos esto se tornando mais abundantes. Nesta etapa no h crescimento lquido da
populao, ou seja, o nmero de clulas que se divide equivalente ao nmero de clulas que
morrem. nessa fase em que vrios metablitos secundrios so sintetizados, incluindo as
cianotoxinas, e em que aparecem os acinetos.
Na fase de declnio ou morte a maioria das clulas est em processo de morte,
embora outras ainda estejam se dividindo e a densidade de clulas viveis cai lentamente. Em
alguns casos h a lise celular. Culturas descontnuas tendem a sofrer mutaes que podem
repercutir na populao como um todo. As prprias condies ambientais tendem a promover
59
variaes de carter fenotpico (reversvel) nas culturas. nessa fase que essas mutaes so
particularmente visveis.
2. Medidas do crescimento
O crescimento dos microrganismos pode ser mensurado por diferentes tcnicas,
adaptveis a diferentes grupos ou situaes. As medidas de crescimento podem ser avaliaes
diretas e indiretas. Dentre as avaliaes diretas podemos citar a contagem de clulas sob
microscpio e o clculo do biovolume celular. Dentre as avaliaes indiretas esto a medida
da turbidez da amostra, de clorofila-a e peso seco.
Dentre as diferentes tcnicas utilizadas, descreveremos alguns exemplos:
A contagem total de clulas uma metodologia que envolve a contagem direta das
clulas de cianobactrias em uma amostra de cultivo sob microscpio, utilizando cmaras de
contagem. A contagem direta uma tcnica rpida, mas tem como principais limitaes a
60
impossibilidade de distino entre clulas vivas e mortas e possveis erros de contagem
devido s pequenas dimenses de algumas clulas ou pela formao de agregados celulares.
Para a contagem de cianobactrias coloniais, como Microcystis, por exemplo,
recomenda-se realizar a digesto da mucilagem (pode-se usar hidrxido de potssio) antes de
iniciar a contagem de clulas.
61
Recomenda-se contar 4 reas na diagonal em cada metade e fazer uma mdia dessas
contagens. A diferena entre o nmero de clulas contadas em uma metade e na outra no
deve ultrapassar 10%.
O clculo para determinao do nmero de clulas :
rea da cmara = 16 mm2
Profundidade = 0,2 mm
Volume = 3,2 mm3
Figura 25 Cmara de Sedgwick-Rafter (a) e detalhe da grade presente na base da cmara (b).
62
quadrcula corresponde a 1 L de amostra. Este mtodo empregado na anlise de amostras
onde existe grande quantidade de organismos.
A contagem das microalgas pode ser realizada por metodologias como de campos
aleatrios (ou semi-aleatrios), transeces (uma determinada faixa dentro da cmara) ou total
63
(cuba toda). Para realizar a contagem das microalgas deve-se levar em considerao o nmero
mnimo de organismos a ser contado, para garantir uma margem de erro satisfatria (ver item
2.1.4). A distribuio dos organismos na cmara deve ser homognea.
Recomenda-se contar as espcies maiores (> 50 m) em objetiva de menor aumento
(5x ou 10x), em toda a cmara. As espcies de tamanho mdio (10 - 50 m) podem ser
contadas em objetiva intermediria (10x, 20x), em uma rea menor (faixas ou campos) de
acordo com a concentrao da amostra.
A contagem a partir da metodologia de campos aleatrios bem aceita, pois possibilita
verificar o coeficiente de variao (CV) a partir do valor mdio (m) e o desvio padro (DP)
obtido entre os campos para os organismos mais abundantes:
CV = DP * 100/m
Figura 26 Esquema dos campos contados a partir do mtodo de contagem por campos
aleatrios ou semi-aleatrios.
64
rea de visualizao da objetiva usada, o nmero de faixas ou campos contados, a rea da
cmara de sedimentao e o volume de amostra sedimentado. Esse fator varia de acordo com
o microscpio utilizado e normalmente j vem junto com o equipamento em forma de tabela.
65
Tabela 10 Principais gneros de cianobactrias, formas geomtricas que normalmente
assumem e frmulas utilizadas para o clculo do biovolume.
Gneros Forma geomtrica Frmula
Microcystis Esfera
Dolichospermum
Chroococcus
2.3 Turbidez
66
O espectrofotmetro permite selecionar o comprimento de onda adequado anlise de
um determinado componente. A medida da intensidade do feixe de luz que atravessa a
amostra convertida em um sinal de absorbncia para o comprimento de onda da anlise.
A turbidez medida a 750 nm pode ser usada como uma inferncia do nmero de
clulas que uma amostra contm. Primeiro medida a absorbncia do meio de cultivo sem a
inoculao de microalgas (Figura 27A), esse o branco e a turbidez do meio de cultivo com
microalgas vai ser medida a partir da. As clulas dispersam a luz e quanto maior o nmero de
clulas mais turva a amostra (Figura 27B), consequentemente, menos luz atravessa o tubo.
Os dados de absorbncia podem ser correlacionados com dados de medidas diretas do
crescimento, atravs de uma curva de calibrao (regresso linear).
67
2.4 Estimativa de peso seco
A estimativa de peso seco pode ser usada para determinar a quantidade de algas em
uma amostra. Para isso, deve ser realizada a separao mecnica das algas presentes num
volume conhecido de meio de cultivo. Esse procedimento realizado por centrifugao,
floculao ou filtrao e a escolha do mtodo dependente do grupo de algas que se quer
separar. A determinao do peso seco e feita, normalmente, por gravimetria e a secagem do
material em estufa ou por liofilizao (Figura 28). Da mesma maneira que para a absorbncia,
uma curva de calibrao (regresso linear) com dados de medidas diretas de crescimento pode
ser construda.
68
2.5.1 Extrao de clorofila
69
3. Taxa de crescimento
No cultivo de microalgas, o termo crescimento refere-se ao aumento do nmero de
clulas ou das dimenses celulares. O crescimento populacional de microalgas , portanto,
definido como o aumento do nmero ou da massa de clulas.
Uma forma tradicional de calcular o crescimento exponencial de microalgas em
cultivo considera que durante o crescimento exponencial a taxa de aumento de clulas por
unidade de tempo proporcional ao nmero de clulas presentes na cultura no instante de
tempo inicial, segundo a seguinte equao:
70
Ao final do experimento uma reta pode ser ajustada aos dados da curva de crescimento
da espcie (medida de crescimento em escala logartmica versus o tempo de cultivo). Esse
ajuste permite encontrar a taxa de crescimento intrnseca do cultivo (.dia-1) dada pela
inclinao da curva (a). Sendo a equao geral da reta:
5. Tempo de duplicao
A partir das equaes de taxa de crescimento tambm possvel calcular as
duplicaes por unidade de tempo (dias ou fraes de dias). O tempo de duplicao (T2) da
cultura pode ser calculado a partir de uma estimativa de r, com o resultado expresso na
mesma unidade de tempo, conforme equao a seguir:
71
6. Tempo de gerao
O tempo de gerao (g) uma medida de crescimento que se refere ao intervalo de
tempo necessrio para que uma clula de cianobactria se duplique. O tempo de gerao
especfico dos organismos e pode divergir bastante mesmo entre as espcies de
cianobactrias. Por no tratar-se de um parmetro absoluto, uma vez que dependente de
fatores genticos e nutricionais, o tempo de gerao pode indicar o estado fisiolgico da
cultura.
O tempo de gerao calculado para a cultura, quando essa se encontra em fase
exponencial de crescimento (Figura 29). O procedimento para o clculo do tempo de gerao
:
Calcular o nmero de geraes (n) a partir da frmula:
72
Figura 29 Exemplo uma cultura com 1 gerao
e tempo de gerao de 2 dias.
importante notar as diferenas conceituais que fundamentam os termos taxa de crescimento, duplicaes
por dia e tempo de duplicao. Intuitivamente, pode parecer que uma diviso por dia seria equivalente a uma
taxa de crescimento de 1 d-1, porm, isso no verdade. A natureza contnua do crescimento exponencial
significa que uma cultura que cresce a uma taxa k de uma diviso por dia, tem um tempo de duplicao T2 de um
dia e uma taxa de crescimento r de 0,69 d-1.
7. Q10
O coeficiente de temperatura (Q10) representa o fator de aumento de uma reao a cada
elevao de 10C na temperatura. Esse coeficiente foi calculado a partir da equao:
Q10 = (R2/R1)^(10/T2-T1)
Onde T1 representa a temperatura mais baixa na qual a cepa foi cultivada, T2 a temperatura
mais alta, R1 representa a taxa de crescimento da cepa quando submetida a temperatura mais
baixa e R2 a taxa de crescimento da cepa quando submetida a temperatura mais alta.
73
6. Ik
O lk um coeficiente que representa o valor de intensidade luminosa que se aproxima
da saturao do crescimento algal. Esse valor nos d uma ideia do requerimento de luz que a
microalga tem para crescer. Valores baixos de lk so tpicos de gneros de cianobactrias
formadoras de floraes dispersivas e adaptadas a baixas intensidades luminosas, como
Cylindrospermopsis, Planktothrix e Limnothrix. Valores altos so tpicos de gneros de
cianobactrias formadoras de floraes acumulativas, como Microcystis, por exemplo.
O valor do Ik obtido a partir de um ajuste de modelo (recomendado por Jassby e
Platt, 1976). Para encontrar esse valor preciso calcular a taxa de crescimento da espcie de
cianobactria isolada em diferentes intensidades luminosas e plotar esses valores em um
grfico. Uma curva ajustada, ento, as taxas de crescimento. O valor de Ik est no encontro
da taxa de crescimento mxima da espcie isolada e uma reta traada com a mesma inclinao
da curva ajustada.
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ANEXOS
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ANEXO 1 Protocolo de preparao do meio F/2
Solues primrias
Composto: Quantidade (g) para 1 L:
NaNO3 75
Na2HPO4 5
Soluo de Vitaminas
Composto: Quantidade (g) para 1 L:
Biotina 10
B12 1
Tiamina HCl 0,2
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As solues de vitaminas devem ser mantidas no escuro. As solues primrias e as solues
bsicas de metais trao devem ser feitas separadamente (uma para cada metal). Para usar gua
do local, essa deve ser filtrada em filtro com abertura de malha de 0,2 m e armazenada na
geladeira.
77
ANEXO 2 Protocolo de preparao do meio ASM-1
Soluo Estoque A
Composto: Quantidade (g) para 1 L:
NaNO3 8,5
MgCl2.6H2O 2,05
MgSO4.7H2O 2,45
CaCl2.2H2O 1,45
Soluo Estoque B
Composto: Quantidade (g) para 100 mL:
KH2PO4.3H2O 0,87
Na2HPO4.12H2O 1,78
Soluo Estoque C
Composto: Quantidade (g) para 100 mL:
H3BO3 2,48
MnCL2.4H2O 1,39
FeCl3.6H2O 0,65
ZnCl2 0,335
CoCl2.6H2O 0,019
CuCl 0,0014
Soluo Stock D
Composto: Quantidade (g) para 100 mL:
Na2.EDTA.2H2O 1,86
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O meio pode ser preparado com gua do local filtrada em filtro com abertura de poro de 0,2
m, gua destilada ou Milli-Q. As solues estoque devem ser guardadas sob refrigerao.
Para a preparao do meio ASM-1, as solues estoque devem ser retiradas da geladeira com
antecedncia (tempo suficiente para atingir a temperatura ambiente). O pH deve ser ajustado
(entre 7,6 e 7,8) com NaOH e HCl 1 M antes da autoclavagem. Autoclavar o meio de cultivo
a 120C por 20 minutos.
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Glossrio de termos relacionados
Auttrofo: Ser vivo capaz de produzir matria orgnica a partir de material inorgnico e
energia luminosa ou qumica.
Back up: Cultura de microalgas que no mais utilizada aps repicagem, mas mantida sob
condies adequadas de crescimento em laboratrio. O back up funciona como uma garantia
de manuteno das cepas isoladas caso ocorra algum imprevisto com a cultura estoque em
uso.
Bainha de mucilagem: Camada mucilagenosa que envolve clulas ou tricomas, formada por
polissacardeos excretados pelas clulas. Nas cianobactrias coloniais frequentemente
chamada de envelope mucilagenoso (fechado), enquanto que nas filamentosas de bainha
(aberta).
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Cmara de Sedgwick-Rafter: Cmara utilizada para quantificao de organismos em
microscpio tico comum, com capacidade de 1 ml e dimenses de 20 mm de largura, 50 mm
de comprimento por 1 mm de altura.
Cianotoxinas: Toxinas produzidas por cianobactrias que causam efeitos adversos sade do
homem e outros animais.
Endotoxina: Toxinas que esto presentes no interior das clulas e que somente so liberadas
para o meio aps o rompimento da parede celular. Isso pode ocorrer devido ao
envelhecimento da clula ou utilizao de compostos qumicos que atuem sobre essa parede.
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Eutrofizao: Processo de enriquecimento das guas de ecossistemas aquticos por meio do
aumento da concentrao de nutrientes, especialmente nitrognio e fsforo. Pode ser um
processo natural, devido falta de mistura entre as camadas superficiais e profundas de um
ecossistema aqutico, ou artificial, com o aporte de efluentes agrcolas, urbanos ou industriais
nos corpos de gua. Este enriquecimento produz mudanas na qualidade da gua, como a
reduo do oxignio dissolvido, pode causar morte de peixes e decrscimo da diversidade de
espcies das diferentes comunidades. A eutrofizao normalmente acompanhada de
aumento de biomassa vegetal e multiplicao excessiva de cianobactrias.
Filamento: Conjunto constitudo pela bainha mucilagenosa e pela fileira de clulas (ver
Tricoma).
Fisso binria: Diviso da clula em duas clulas-filhas que atingem o tamanho da clula
me antes da prxima diviso. Tipo de reproduo caracterstico de Cianobactrias.
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Frstula: Parede celular silicosa das diatomceas, constituda por duas partes que se
assemelham s partes superior e inferior de uma caixa perfeitamente ajustada. Essas partes
so chamadas de valvas ou epiteca e hipoteca.
Lntico: Em limnologia o termo refere-se a ambientes de gua com baixa vazo, como lagos
e reservatrios.
Ltico: Em limnologia o termo refere-se a ambientes de gua corrente (com alta vazo), como
rios, crregos e riachos.
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Metalmnio: Em limnologia chama-se a zona de um corpo de gua ocupada pela termoclina
(ver Termoclina) e situada entre o hipolmnio e epilmnio.
Retculo de Whipple: Retculo usado para contagem de clulas em uma das oculares do
microscpio tico. O retculo apresenta-se dividido em 100 quadrados, sendo que o quadrado
central apresenta 25 subdivises.
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Tcnica de Utermhl: Tcnica utilizada para a sedimentao e contagem de fitoplncton. Os
organismos so concentrados diretamente em cmaras de sedimentao (ver Cmara de
Utermhl) e so observadas e contadas no microscpico invertido.
Tempo de Residncia: Em limnologia refere-se ao tempo mdio que a massa de gua fica
retida em um compartimento antes de ser transportada para o compartimento adjacente. O
tempo de residncia constitui um indicador importante do comportamento ecolgico e da
capacidade de auto-limpeza de ecossistemas aquticos.
Zona ftica: Em limnologia refere-se a camada de um corpo de gua onde a luz pode penetrar
o suficiente para a realizao da fotossntese.
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