TEKNIK PEWARNAAN IMMUNOHISTOKIMIA UNTUK MENUNJUKKAN

Spirochetes Treponema pallidum

Abstrak

Teknik pewarnaan Immunohistokimia (IHC) dideskripsikan dengan menggunakan

antibodi poliklonal anti Treponema pallidum spirochetes dengan sistem deteksi colloidal
gold dan peroksidase sejenis lobak untuk mendemonstrasikan spirochetes di dalam sayatan
jaringan yang telah difiksasi dengan formalin dan ditanam didalam parafin untuk selanjutnya
diamati dengan menggunakan mikroskop cahaya. Reaksi immunostaining untuk sistem
deteksi colloidal gold tervisualisasi dengan peningkatan immunogold silver staining (IGSS).
Reaksi immunostaining dengan sistem deteksi peroksidase lobak tervisualisasi dengan
penggunaan DAB (3,3-Diaminobenzidine) dan AEC (3-amino-9-ethylcarbaole).

Teknik Immunohistokimia digunakan untuk mendemonstrasikan keberadaan

organisme dengan pewarnaan yang lebih spesifik dibandingkan dengan teknik silver
tradisional karena hanya organisme-organisme yang terwarnai di dalam jaringan, sehingga
mudah membedakan organisme tersebut dari jaringan yang akan diamati. Pekerjaan tambahan
diperlukan untuk menentukan kegunaan dari teknik-teknik ini di dalam laboratorium
histopatologi.

Pendahuluan

Treponema pallidum adalah agen penyebab penyakit sifilis. Diagnosa dari sifilis di
dalam sampel jaringan tergantung pada keakuratan penampakan Treponema pallidum di
dalam sampel jaringan. Secara tradisional, penampakan organisme-organisme ini dalam
sayatan jaringan untuk diamati di bawah mikroskop cahaya dengan menggunakan metode
impregnasi silver seperti Warthin Starry atau Steiner dan Steiner. Metode-metode ini kadang-
kadang sangat tidak praktis dan hasilnya tidak selalu konsisten dan reprodusibel. Peneliti
menemukan bahwasannya dengan menggunakan metode IHC , organisme-organisme mudah
diidentifikasi tanpa pewarnaan nonspesifik yang sering didigunakan ketika pewarnaan
dengan metode pewarnaan silver tradisional.

Bahan dan Metode

Fiksasi spesimen dengan formalin, penanaman spesimen didalam parafin yang

diketahui berisi organisme spirochetes tang telah disayat dengan ketebalan sekitar 4-6
mikron, ditempatkan pada slide PlusTM Superfrost, dan dikeringkan pada suhu 58o-60oC.
Sayatan dideparafinasi dan dihidrasi ke dalam air suling. Pewarnaan secara rutin hematoksilin
dan eosin dan modifikasi dari pewarna silver Steiner dan Steiner secara tradisional telah
ditunjukkan.Pengaktifan epitope yang terinduksi panas menggunakan buffer sitrat pH 6.0 di
dalam steamer vegetable ditunjukkan pada sayatan bewarna dengan IHC. Sayatan terwarnai
dengan spirochetes anti Treponema pallidum kelinci. Spesifikasi antibodi dicantumkan dalam
Tabel 1. Deteksi colloidal gold tercapai dengan menggunakan Histogold Kit, sama seperti
sistem deteksi peroksidase sejenis tanaman lobak yang terkonjugasi polimer universal. Tiap-
tiap bahan yang digunakan sesuai dengan spesifikasi pabriknya.

Reaksi immunostaining untuk sistem deteksi colloidal gold divisualisasikan dengan

menggunakan peningkatan immunogold silver staining (IGSS). Reaksi immunostaining
dengan sistem deteksi peroksidase lobak tervisualisasi dengan penggunaan DAB (3,3-
Diaminobenzidine) dan AEC (3-amino-9-ethylcarbaole).

Spesifikasi untuk sistem deteksi dan pewarnaan digunakan secara rinci pada tabel 2.
Immunostain dievaluasi untuk membedakan prosedur yang memenuhi untuk mempermudah
pengenalan organisme.

Kontrol

Untuk memverifikasi spesifikasi dari mikroskop cahaya dengan pewarnaan Steiner

dan Steiner dan reaksi immunostaining, sayatan jaringan usus halus tikus diketahui
mengandung organisme spirochete dimasukkan kedalam tiap-tiap pewarnaan. Teknik
pewarnaan Immunogold Silver Staining (IGSS) untuk mendemonstrasikan Spirochetes
Treponema pallidum

Jaringan difiksasi di dalam formalin kemudian ditanam didalam parafin, jaringan

disayat dengan ketebalan 3-5 , selanjutnya ditempatkan pada slide Superfrost Plus,
dikeringkan pada suhu 58-60oC, dideparafinasi dan dihidrasi dengan air suling. Setelah
langkah ke enam , digunakan bahan kaca yang dibersihkan secara kimia.

1. Lakukan pengaktifan epitope terinduksi panas dengan meletakkan sayatan didalam buffer
sitrat pH 6.0, dan dipanaskan pada suhu 90oC selama 45 menit di dalam steamer
vegetable. Menyiapkan sayatan pada suhu ruang sebelum dilanjutkan.
2. Mencuci sayatan ke dalam air suling dan kemudian meletakkan sayatan tersebut ke
dalam Phosphate Buffer Saline (PBS).
3. Memberikan serum kambing normal (NGS) untuk menekan pewarnaan nonspesific latar
belakang jaringannya. Inkubasi selama 20 menit pada suhu ruang.
4. Hilangkan NGS yang berlebihan dari sekitar sayatan jaringan dan memberikan antibodi
anti Treponema pallidum kelinci. Inkubasi selama semalam di dalam refrigerator pada
suhu 4oC.
5. Mencuci sayatan ke dalam PBS sebanyak tiga kali.
6. Memberikan colloidal gold yang terkonjugasi dengan IgG anti-rabbit kambing. Inkubasi
selama 30 menit pada suhu ruang
7. Mencuci dalam PBS sebanyak tiga kali
8. Mengaplikasikan sayatan yang telah diberi perlakuan sebelumnya ke dalam cairan
dengan konsentrasi meningkat sesuai dengan instruksi yang telah diberikan. Inkubasi
selama 5 menit.
Catatan: amati secara mikroskopik perkembangan dari silver. Jika tidak cukup gelap,
cuci slide di dalam PBS dan aplikasikan larutan bertingkat silver segar selama 5 menit
berikutnya.
9. Cuci di dalam air suling dengan baik
10. Pewarnaan yang diinginkan: digunakan pewarna metanil yellow atau nuclear fast red
(NFR).
11. Dehidrasi, penjernihan, dan penempelan pada permount

12. Hasil pewarnaan: spirochetes tampak berbentuk spiral dan bewarna hitam pada
latarbelakang yang bewarna kuning jika diwarnai dengan metanil yellow atau pada latar
belakang bewarna merah jika diwarnai dengan NFR.

Teknik Immunohistokimia untuk mendemonstrasikan Treponema pallidum

Jaringan difiksasi di dalam formalin kemudian ditanam didalam parafin, jaringan

disayat dengan ketebalan 3-5 , selanjutnya ditempatkan pada slide Superfrost Plus,
dikeringkan pada suhu 58-60oC, dideparafinasi dan dihidrasi dengan air suling.

1. Lakukan pengaktifan epitope terinduksi panas dengan meletakkan sayatan didalam buffer
sitrat pH 6.0, dan dipanaskan pada suhu 90oC selama 45 menit di dalam steamer
vegetable. Menyiapkan sayatan pada suhu ruang sebelum dilanjutkan.
2. Mencuci sayatan ke dalam air suling.
3. Tempatkan sayatan ke dalam 3% larutan H2O2 selama 10 menit untuk menutup
peroksidase endogenous. (persiapkan methanol atau air suling).
4. Mencuci ke dalam beberapa pilihan air suling atau air yang telah dideionisasikan dan
kemudian tempatkan dalam PBS.
5. Mengaplikasikan serum kambing normal (NGS) untuk menekan pewarnaan nonspesifik
dari latar belakang jaringannya. Inkubasi selama 20 menit.
6. Hilangkan NGS yang berlebihan di sekitar sayatan dan aplikasikan antibodi anti
Treponema pallidum. Inkubasi selama semalam di dalam refrigerator pada suhu 4oC.
7. Mencuci sayatan di dalam PBS sebanyak tiga kali
8. Mengaplikasikan polimer universal HRP. Inkubasi selama 45 menit.
9. Mencuci slide dalam PBS sebanyak tiga kali.
10. Mengaplikasikan substrat kromogen: DAB atau AEC. Inkubasi hingga intensitas warna
yang diinginkan.
11. Cuci dalam beberapa pilihan air suling.
12. Pewarnaan dalam hematoksilin.
13. Bilas dalam beberapa pilihan air suling; intensifitas pewarnaan inti dengan sebuah
perantara yang memberikan warna biru pada inti
14. Bilas dalam beberapa pilihan air destilasi. (jika AEC digunakan, tutup dengan media
penutup cair; jika DAB digunakan, lakukan dehidrasi, penjernihan dan penutupan dalam
permount).

Hasil pewarnaan: Spirochetes menggunakan kromogen AEC bewarna merah pada latar
belakang biru. Spirochetes menggunakan kromogen DAB bewarna hitam kecoklatan
pada latar belakang biru.

Hasil

Seperti yang terlihat pada gambar 2,3 dan 4, pewarnaan IHC menunjukkan pewarnaan
organisme lebih spesifik daripada teknik impregnation silver tradisional yang ditunjukkan
pada gambar 1. Hanya organisme-organisme yang terwarnai dalam persiapan immunostained
dan organisme-organisme tersebut siap dibedakan dari latarbelakangnya. Ketika pewarnaan
dengan metanil yellow, sayatan menggunakan teknik IGSS secara tertutup menyerupai
pewarnaan itu dengan teknik impregnation silver secara tradisional.

Diskusi

Untuk pemeriksaan ini, modifikasi Steiner dan teknik impregnasi silver Steiner, dan
dua teknik IHC (HRP Polimer dan teknik IGSS) ditunjukkan pada kontrol positif Treponema
pallidum, sama seperti pada slide kontrol spirochete yang dibeli dari penyedia pendatang
baru.

Informasi dari penjual menunjukkan bahwa slide kontrol spirochetes mereka

diproduksi dibawah kondisi terkontrol secara hati-hati dalam pada T hyodysenteriae,
mikroorganisme yang dibeli dari kumpulan kultur tipe Amerika yang dimasukkan kedalam
organ rodentia.
 Waktu inkubasi, suhu, dan HIER pada pembukaan antigen secara optimal untuk
pewarnaan IHC. Sebagai akibatnya, sayatan menjalani pengaktifan epitope dengan
menggunakan buffer sitrat pada pH 6.0 dan kemudian diinkubasi dengan antibodi primer
selama semalam pada suhu 4oC. Antibodi yang bdigunakan pada teknik IHC adalah antibodi
poliklonal anti Treponema pallidum kelinci.

Teknik polimer HRP digunakan untuk melokalisasi organisme diikuti oleh substrat
kromogen AEC dan DAB, sebelum diwarnai dengan hematoksilin Mayer yang termodifikasi.
Spirochetes bewarna merah dengan substrat AEC dan bewarna coklat dengan substrat DAB.
Dalam sayatan jaringan yang terimunostaining dengan menggunakan teknik IGSS untuk
melokalisasi dan memvisualisasi spirochetes, organisme terwarnai hitam pada latar belakang
jaringan yang bewarna merah-pink ketika menggunakan NFR sebagai pewarna, dan pada
latar belakang jaringan yang bewarna kuning ketika menggunakan metanil yellow sebagai
pewarna.

Kesimpulan

Teknik pewarnaan IHC digunakan dalam penelitian ini terlihat lebih unggul
dibandingkan dengan metode pewarnaan silver tradisional untuk mendemonstrasi spirochetes
T. pallidum . Teknik IHC bersifat reproducible dan konsisten, dan mereka menunjukkan
pewarnaan yang lebih spesifik daripada teknik pewarnaan silver secara tradisional.
Sensitifitas meningkat sejak terdapat perbedaan yang jelas antara organisme terwarnai dan
latar belakangnya, diikuti organisme-organisme yang siap untuk keluar dari sekitar jaringan.
Pekerjaan tambahan diperlukan dalam laboratorium histopatologi untuk membedakan
manfaat dari teknik-teknik dalam mendiagnosa penyakit spirochetes.