CLARIANA ZANUTTO PAULINO

Produo de biomassa por Rubrivivax gelatinosus em

efluente de abatedouro avcola utilizando mtodos
industriais

ARAATUBA-SP
2006
 CLARIANA ZANUTTO PAULINO

Produo de biomassa por Rubrivivax gelatinosus em

efluente de abatedouro avcola utilizando mtodos
industriais

Dissertao de mestrado apresentada

Faculdade de Odontologia de Araatuba e
Curso de Medicina Veterinria da
Universidade Estadual Paulista Jlio de
Mesquita Filho - UNESP, como parte dos
requisitos para a obteno do ttulo de
Mestre.

Orientadora: Prof. Dra. Elisa Helena Giglio Ponsano

ARAATUBA-SP
2006
 Dedico....

Aos meus pais

Celso Gomes Paulino

Clotilde Zanutto Paulino

pela fora, amor, incentivo, carinho e por estarem sempre

presentes em todos os momentos de minha vida.

 AGRADECIMENTOS

A Prof. Dra. Elisa Helena Giglio Ponsano pela orientao deste

trabalho;

Ao Prof. Dr. Marcos Franke Pinto pela prontido na busca das

amostras;

Ao funcionrio do Laboratrio de Anlise de Alimentos do

Departamento de Apoio, Produo e Sade Animal da Faculdade de
Medicina Veterinria (UNESP-Araatuba), Alexandre Jos Teixeira por todo
auxlio tcnico recebido ao longo do desenvolvimento deste trabalho;

As bibliotecrias da Faculdade de Medicina Veterinria (UNESP-

Araatuba), Ftima Maria Metello Bertolucci e Isabel Pereira de Matos por
todas as orientaes recebidas e reviso das referncias bibliogrficas;

Ao Departamento de Fisiologia de Odontologia da Unesp de

Araatuba, pela utilizao dos equipamentos;

A Sanear pela realizao das anlises de DQO do efluente;

A empresa Frango Sertanejo de Guapiau-SP, pelo fornecimento do

efluente para a realizao da pesquisa;

A Capes pela concesso da bolsa de mestrado;

 A Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo, Fapesp,
pelo apoio financeiro para a realizao da pesquisa;

A Universidade Estadual Paulista, pela oportunidade de realizao

deste curso de mestrado;

A todos que direta ou indiretamente, contriburam para a concluso

deste trabalho.
 SUMRIO

Pgina

CAPTULO 1- CONSIDERAES INICIAIS 10

Biotecnologia e biorremediao ambiental 10
Metabolismo energtico 13
A fotossntese e as bactrias fotossintetizantes 14
As Bactrias Prpuras No Sulfurosas (BPNS) 19
Rubrivivax gelatinosus 21
Carotenides 22
Carotenides em bactrias fotossintetizantes 28
A indstria de processamento de alimentos e os efluente 29
Demanda Bioqumica de Oxignio e Demanda Qumica de Oxignio 38
Produo de biomassa por microrganismos 39
REFERNCIAS 44

CAPTULO 2- CRESCIMENTO FOTOTRFICO DE Rubrivivax gelatinosus EM 55

EFLUENTE DE ABATEDOURO AVCOLA
Resumo 56
Abstract 57
Introduo 58
Mtodos 60
Resultados e Discusso 65
Concluso 72
Referncias 73
 LISTA DE QUADROS

Pgina

Quadro 1 - Tipos de dejetos e subprodutos resultantes das etapas do 32

processamento avcola

Quadro 2 - Caractersticas dos efluentes de abatedouros avcolas 33

 LISTA DE TABELAS

Pgina

Tabela 1 - Anlises microbiolgicas do efluente in natura e aps 65

tratamento

Tabela 2 - Anlises fsico-qumicas do efluente in natura e aps 65

tratamento
 LISTA DE FIGURAS

Pgina

Figura 1 - Curva de crescimento de R. gelatinosus em efluente de 67

abatedouro avcola

Figura 2 - Curva de crescimento de R. gelatinosus em efluente de 68

abatedouro avcola

Figura 3 - Curva de crescimento de R. gelatinosus em meio de Pfennig 68

 CAPTULO 1

CONSIDERAES INICIAIS

Biotecnologia e biorremediao ambiental

Biotecnologia a aplicao dos princpios da cincia e engenharia para o

processamento de materiais por agentes biolgicos. Esta aplicao inclui alguns benefcios

como a reduo da poluio de processos industriais, economia de produo e gerao de

novos produtos (GAVRILESCU & CHISTI, 2005).

Toda transformao ou remoo de contaminantes do meio ambiente por

organismos vivos chamada biorremediao ambiental. Esta definio do processo natural

de tratamento de compostos antropognicos teve origem h 30 anos atrs, em 1975, com

um relatrio intitulado Beneficial Stimulations of Bacterial Activity in Groundwater Containing

Petroleum Products, por R. L. Raymond e colegas de trabalho. Neste trabalho, os autores

relataram que a adio de nutrientes na superfcie do solo aumentava o nmero de

bactrias que degradavam hidrocarbonetos derivados do petrleo, e desse modo,

impulsionava a remoo dos contaminantes (LITCHFIELD, 2005).

De acordo com o Escritrio de Estudos Geolgicos do Departamento do Interior

do Governo Americano (USGS), a biorremediao pode ser definida segundo o American

Heritage Dictionary of the American Language como: O uso de agentes biolgicos tais

como bactrias e plantas, para remover ou neutralizar contaminantes, como poluentes do

solo e da gua.

10
 Martins et al. (2003) definem biorremediao como uma cincia que busca, por

meio de estudo, monitoramento e aplicao da propriedade degradativa dos

microrganismos, a remediao ambiental. Os autores classificam a definio deste processo

em biorremediao in situ (no local) que se d no local contaminado, podendo ser de forma

intrnseca, no qual a cincia pouco interfere. Quando h total ausncia da interferncia da

cincia no processo, ela denominada intrnseca-natural, e no inverso, denominada

intrnseca-auxiliada. Esta interferncia pode ser explicada como o auxlio natureza por

meio da recolocao de microrganismos e outros processos bem prximos dos utilizados

pela prpria natureza para fortalecer a ao dos microrganismos no processo da

biodegradao. Em alguns casos, so aplicadas verdadeiras tcnicas de engenharia,

tambm chamadas de biorremediao engenhada, que vo desde a modificao topogrfica

do local, implantao de novos microrganismos (organismos alctones), implantao de

bioreatores e aplicao de nutrientes. Outra classificao a biorremediao denominada

ex situ em que apenas a parte afetada removida do ambiente contaminado evitando-se

assim um alastramento da contaminao.

O tratamento de efluentes por lodos ativados foi a primeira aplicao da

biotecnologia na biorremediao, por meio do controle da poluio de ambientes aquticos.

Recentemente, microrganismos e enzimas tm sido utilizados em diversas aplicaes

(GAVRILESCU & CHISTI, 2005). A utilizao de microrganismos no saneamento bsico e

ambiental prtica comum desde os primrdios do desenvolvimento dos processos

biolgicos de tratamento de guas residurias e resduos slidos. A capacidade microbiana

de catabolizar diferentes compostos orgnicos, naturais ou sintticos, e inorgnicos,

extraindo desses compostos fontes nutricionais e energticas, o que possibilitou o

11
emprego desses agentes biolgicos pela engenharia sanitria, como soluo aos problemas

gerados pelos dejetos lanados no meio ambiente (VAZOLLER, 2004).

Sabe-se, atualmente, que os microrganismos como bactrias e fungos, alm de

responsveis por importantes transformaes metablicas, pelo controle biolgico de

doenas e pragas, pela fixao biolgica do nitrognio atmosfrico, pela degradao de

resduos vegetais e outros produtos, inclusive txicos, so tambm um manancial de

frmacos, corantes, enzimas e cidos orgnicos, entre muitos outros produtos teis e ainda

inexplorados. Alm de exercerem um papel na sobrevivncia de outras espcies e na

manuteno do equilbrio entre elas, so fontes de produtos que contribuem para o bem-

estar da populao humana, inclusive remediando o mal que a prpria espcie humana

produz ao ambiente. A importncia dos microrganismos para a ecologia e biotecnologia

inquestionvel. So numerosos os processos biotecnolgicos que utilizam microrganismos,

seja para obteno de produtos de valor comercial, seja para, atravs do prprio processo,

chegar-se a um resultado de interesse, como despoluio de um ambiente por

biorremediao ambiental (AZEVEDO, 1998).

Um grupo especial de microrganismos, as bactrias fotossintetizantes,

encontradas em ambientes naturais, tem sido aplicado com grande potencial biotecnolgico,

nos seguintes processos: biorremediao ambiental, produo de substncias antivirais,

produo de biomassa fonte de protenas, vitaminas, ubiquinonas e enzimas (AZAD et al.,

2003; SASAKI et al., 2005).

12
 Metabolismo energtico

O metabolismo um conjunto de atividades celulares com objetivos determinados

constitudo por reaes qumicas catalisadas por enzimas (LEHNINGER, 1993).

O metabolismo pode ser dividido de acordo com dois tipos de origens energticas:

a qumica e a luminosa. Organismos chamados fototrficos utilizam luz como fonte de

energia e incluem as plantas verdes, alguns microrganismos procariontes e eucariontes

alm de um grupo especial chamado bactrias fotossintetizantes. Essas bactrias podem

ser denominadas prpuras ou verdes. O termo autotrfico dado a um grupo de

organismos, exclusivamente os procariontes, capazes de crescer a partir de compostos

inorgnicos, utilizando-se de dixido de carbono (CO2) como fonte de carbono. Muitas

clulas autotrficas obtm a energia que necessitam a partir da luz solar. Organismos que

requerem o carbono na forma orgnica reduzida, como a glicose, so chamados

heterotrficos, incluindo os homens, os animais e algumas bactrias (BROCK, 1994).

O processo fotoautotrfico o metabolismo pelo qual os microrganismos

convertem energia radiante em biolgica e sintetizam compostos utilizando-se apenas de

dixido de carbono ou carbonatos como fonte de carbono, alm de doadores de eltrons. O

termo fotoheterotrfico refere-se utilizao de vrios substratos orgnicos como fonte de

carbono (ERASO & KAPLAN, 2006).

Os microrganismos capazes de utilizar compostos qumicos inorgnicos como

fonte energtica so denominados quimiolitotrficos, enquanto que os quimioheterotrficos

utilizam-se dos compostos qumicos orgnicos (BROCK, 1994).

13
 A fotossntese e as bactrias fotossintetizantes

A fotossntese pode ser caracterizada por reao qumica na presena de luz na

qual a energia luminosa convertida em energia qumica (reao de claro) com a reduo

do CO2 em compostos orgnicos e, por reao de escuro, na qual a energia qumica

usada para a fixao do CO2. A converso da energia luminosa em energia qumica ocorre

com a formao da adenosina trifosfato (ATP) e dependente da presena de pigmentos

luminosos como as clorofilas e as organelas intracelulares, os cloroplastos, presentes em

algas e plantas. As bactrias fotossintetizantes prpuras e verdes utilizam a luz para

formarem ATP, produzindo nicotinamida adenina dinucleotdeo fosfato (NADPH) da reduo

de materiais presentes no meio, como H2S e compostos orgnicos. Nestas bactrias, os

cloroplastos no esto presentes e os principais pigmentos fotossintetizantes so chamados

bacterioclorofilas, responsveis pela absoro da luz e ejeo de eltrons em decorrncia

da excitao luminosa de suas molculas. Em continuidade s reaes de transformao de

energia luminosa em energia qumica, esses eltrons so presos por aceptores (BROCK,

1994).

As bactrias fotossintetizantes possuem diversos tipos de bacterioclorofilas como

a, b, c, d, e, alm de produzirem tambm os pigmentos carotenides (ERASO & KAPLAN,

2006).

As bacterioclorofilas so caracterizadas pelos grupos substituintes do anel

porfirnico constituinte e, tambm, pelos espectros de absoro de luz, sendo que cada

bacterioclorofila absorve luz de um comprimento de onda especfico. Esta luz, quando

absorvida pelas bacterioclorofilas, pode, em contato com o ar, desencadear reaes

14
chamadas fotooxidativas, que causam injria ao aparelho fotossinttico da clula (BROCK,

1994; PONSANO, 2000).

Os carotenides so capazes de absorver luz em comprimentos de ondas

complementares aos das bacterioclorofilas e possuem importante funo no processo

fotossinttico, sendo acessrios complementares para a obteno de energia luminosa e

funcionando, tambm, como agentes fotoprotetores, absorvendo grande parte da luz nociva

e protegendo a clula, alm de realizarem transferncia de energia ao centro da reao para

a posterior utilizao na fotofosforilao, tornando ampla a faixa de espectro efetiva da

fotossntese (PONSANO, 2000).

As bacterioclorofilas e os carotenides, maiores pigmentos absorventes de luz

das bactrias fotossintetizantes anaerbias, so formadores de dois sistemas importantes

para a realizao da fotossntese desses microrganismos: o centro de reao fotoqumico e

os complexos revestidores de luz (LH). Os complexos LH absorvem luz quanta e

transportam a energia para o centro de reao (YURKOV & BEATTY, 1998).

Os procariontes fotossintetizantes diferem-se em dois grupos: as bactrias

prpuras e verdes e as cianobactrias. As cianobactrias realizam fotossntese oxignica,

em que ocorre a produo de oxignio. As bactrias prpuras e verdes realizam fotossntese

anoxignica, na qual no h a produo de oxignio, sendo desprovidas de fotossistema ,

que compreende a fotlise da gua. Estas bactrias utilizam-se de compostos reduzidos de

enxofre, hidrognio molecular, ou simplesmente de compostos orgnicos como doadores de

eltrons, originando compostos oxidados como sulfatos, prtons, compostos orgnicos e

CO2 (BALLONI et al., 1982; BROCK et al., 1994).

15
 Sabe-se que as bactrias prpuras anoxignicas que realizam fotossntese sob

condies anaerbias na presena de luz possuem um aparato fotossinttico anoxignico,

cuja funo a transformao da energia luminosa em gradiente eletroqumico de prtons

da membrana fotossinttica, o qual pode ser usado para a produo de ATP, o transporte

ativo, a motilidade e outros processos de consumo de energia (DREWS & GOLECKI, 1995).

Segundo Yurkov & Beatty (1998), as bactrias prpuras fototrficas possuem em

adio membrana citoplasmtica um sistema intracitoplasmtico de membrana (ICM). Os

pigmentos dessas bactrias so incorporados ao sistema intracitoplasmtico de membrana.

A luz e a tenso de oxignio regulam a formao da ICM. A ICM induzida quando a tenso

de oxignio baixa e possui um maior desenvolvimento quando ocorre sob condies

anaerbias. Os autores apresentam a existncia de um grupo de bactria que tambm

produz bacterioclorofila a e pigmentos carotenides designado bactria fototrfica

anoxignica aerbia e evidenciam a incapacidade de utilizao da bacterioclorofila no

crescimento anaerbio como o aspecto diferencial deste grupo de microrganismo.

Uma diferena entre as bactrias fotossintetizantes anoxignicas e os organismos

oxignicos o centro de reao, cada espcie possui um tipo especfico. Entretanto,

nenhum destes dois tipos de reaes bacterianas capaz de extrair eltrons da molcula de

gua e muitas espcies podem sobreviver somente em ambientes com baixa concentrao

de oxignio. Para fornecer eltrons para a reduo do CO2, as bactrias fotossintetizantes

anoxignicas devem oxidar as molculas inorgnicas ou orgnicas disponveis em seu

ambiente. Por exemplo, a bactria prpura Rhodobacter sphaeroides pode usar o succinato

para reduzir o nicotinamida adenina dinucleotdeo NAD+ por transferncia reversa do eltron

ligado membrana dirigido por um potencial eletroqumico. Apesar de algumas diferenas,

16
os princpios gerais de transferncia de energia so os mesmos na fotossntese anoxignica

e oxignica (WHITMARSH & GOVINDJEE, 2006).

Como critrios de classificao das bactrias anoxignicas fototrficas pode-se

citar a hibridizao do DNA_rRNA, o tipo de pigmentao, as estruturas dos

lipopolissacardeos, a utilizao dos substratos orgnicos, a morfologia da membrana

intracitoplasmtica, a composio do DNA, lipdeos e quinonas, bem como a assimilao de

sulfato (ERASO & KAPLAN, 2006).

As bactrias fotossintetizantes anoxignicas so sistematicamente encontradas

em duas ordens e em quatro famlias. A ordem Rhodospirillales inclui as famlias

Chromatiaceae (bactrias prpuras sulfurosas) e Rhodospirillaceae (bactrias prpuras no

sulfurosas); a ordem Chlorobiales compreende as famlias Chlorobiaceae (bactrias verdes

sulfurosas) e Chloroflexaceae (bactrias verdes no sulfurosas) (IMHOFF, 1992).

As bactrias prpuras possuem pigmentos fotossintetizantes localizados em

organelas designadas pela membrana intracitoplasmtica, sendo os principais pigmentos as

bacterioclorofilas a ou b, e os carotenides da srie espiriloxantina e espiriloxantina

alternativa. Possuem motilidade, so encontradas em ambientes aquticos e podem ser

subdivididas em prpuras sulfurosas e prpuras no sulfurosas de acordo com a habilidade

ou incapacidade de utilizao do elemento enxofre como doador de eltron na assimilao

fototrfica do dixido de carbono (BALLONI et al., 1982).

As Bactrias Prpuras No Sulfurosas (BPNS) compreendem o grupo mais

diversificado das bactrias prpuras pela grande variedade morfolgica, diferenas na

estrutura das membranas e nos tipos de pigmentos carotenides, alm de apresentar uma

interessante versatilidade energtica (PONSANO, 2000). Devido a estas caractersticas, as

BPNS sero discutidas posteriormente.

17
 Dentre as bactrias prpuras, as Chromatiaceae formam glbulos de enxofre

intracelulares a partir de H2S, exceto Ectothiorhodospira que o deposita extracelularmente.

Intra ou extracelular, o enxofre posteriormente oxidado a sulfato. Nas Rhodospirillaceae, a

oxidao do H2S resulta em sulfato sem a formao intermediria do enxofre elementar, e

restrita a algumas espcies, como exemplo, a bactria Rhodopseudomonas palustris. As

Rhodospirillaceae fotoassimilam os seguintes compostos orgnicos: cidos carboxlicos,

cetonas, lcoois primrios e secundrios, cidos graxos e seus derivados, alm de

compostos aromticos simples. As bactrias fotossintetizantes utilizam ainda, como fonte de

nitrognio, os seguintes compostos: nitrognio amoniacal, nitratos, uria, aminocidos,

peptonas e extrato de levedura; sendo este ltimo fonte de carbono e tambm fator de

crescimento. Os acares quase no so assimilados, exceto aerobicamente no escuro; j

os polissacardeos e os biopolmeros nunca so utilizados (IMHOFF & TRUPER, 1989).

Dentre os fatores de crescimento, as bactrias fotossintetizantes utilizam-se de

vitaminas do grupo B como a biotina, a tiamina, o cido p-aminobenzico, o cido nicotnico

e a niacina. A luz possui influncia determinante sobre o desenvolvimento das atividades

bioqumicas destas bactrias. A intensidade luminosa e sua composio espectral regulam a

quantidade de pigmento fotossintetizante presente na clula. O timo de temperatura para o

crescimento encontra-se na faixa entre 30-35oC e o valor timo de pH entre 7,0 e 8,5

aproximadamente, com exceo para Rhodopseudomonas acidophila em que o pH timo

est ao redor de 5,6 (BALLONI et al., 1982).

Quanto ecologia, as bactrias fotossintetizantes anoxignicas ocupam habitat

aqutico como guas eutrofizadas internas e costeiras, guas residuais zootcnicas e

domsticas, guas termais, solos submersos, onde so, geralmente, influenciadas pela

disponibilidade de luz, compostos reduzidos de enxofre ou produtos finais do metabolismo

18
anaerbio de outros microrganismos e por uma baixa concentrao de oxignio (TRUPER &

IMHOFF, 1992; ERASO & KAPLAN, 2006).

Os microrganismos fotossintetizantes tm sido comumente estudados em

biotecnologia devido eficincia biolgica e capacidade de utilizao da energia luminosa

para a produo de compostos orgnicos. O uso de bactrias fotossintetizantes no

tratamento de resduos da indstria de alimentos, na produo de raes para animais com

alto valor nutricional e no acmulo de carotenides tem sido observado por pesquisadores

(KOBAYASHI & TCHAN, 1973; SASAKI et al., 1978; NOPARATNARAPORN et al., 1983;

NOPARATNARAPORN & NAGAI, 1986; GETHA et al., 1998; KIM & LEE, 2000; PONSANO,

2000; AZAD et al., 2003; PONSANO et al., 2003; COSTA et al., 2004).

As Bactrias Prpuras No Sulfurosas (BPNS)

As Bactrias Prpuras No Sulfurosas (BPNS), que levam esse nome por serem

incapazes de oxidar enxofre a sulfato, constituem o grupo das bactrias fototrficas que, sob

condies anaerbias, possui crescimento fotoheterotrfico, utilizando-se de diversos

substratos orgnicos como acetatos, piruvatos e cidos dicarboxlicos (BALLONI et al.,

1982). Por outro lado, estes microrganismos so capazes de crescer fotoautotroficamente

utilizando-se de hidrognio ou compostos reduzidos de enxofre como doadores de eltrons,

alm do dixido de carbono como carbono de origem. Estes organismos so capazes de

crescer em ambientes com concentraes variveis de oxignio. Muitas espcies so

capazes de crescer quimioheterotroficamente sob condies microaerbicas e aerbicas no

escuro ou na presena de luz. O oxignio inibe a sntese de fotopigmentos nestas bactrias.

Algumas espcies tambm crescem quimiolitotroficamente (ERASO & KAPLAN, 2006).

19
Outras podem realizar metabolismo sob anaerobiose no escuro, usando compostos

qumicos como aceptores de eltrons. So amplamente distribudas na natureza, podendo

ser encontradas em ambientes aquticos marinhos ou de gua doce, em solos midos e em

diversos tipos de efluentes industriais. Possuem a capacidade de degradao da matria

orgnica destes efluentes, principalmente na presena de luz solar ou em ambientes abaixo

da superfcie sob condies anaerbicas em lagoas de depurao (IMHOFF & TRUPER,

1989).

Segundo Holt et al. (1994), existem 26 espcies encontradas em 6 gneros no

subgrupo 3 da classificao das BPNS: Rhodobacter, Rhodocyclus, Rhodomicrobium,

Rhodopila, Rhodopseudomonas e Rhodospirillum. O gnero Rhodocyclus compreende trs

espcies: Rhodocyclus purpureus, Rhodocyclus tenuis e Rhodocyclus gelatinosus.

Atualmente trs novos gneros tm sido citados e englobam um total de 31 espcies

arranjadas em 9 gneros: Rhodoferax, Rubrivivax e Rhodocista.

Pesquisas com hibridizao de DNA-rRNA possibilitaram a transferncia de

Rhodocyclus gelatinosus para o novo gnero Rubrivivax, como Rvi. gelatinosus, cujas

diferenas em nvel molecular no interferem nas caractersticas fisiolgicas desse

microrganismo, permanecendo assim a mesma descrio (HOLT, 1994). Neste trabalho

optou-se por utilizar-se da nova denominao Rubrivivax gelatinosus que j vem sendo

citada em diversos trabalhos (TRUPER & IMHOFF, 1992; YURKOV & BEATTY, 1998;

AGALIDIS et al., 1999; STEIGER et al., 2000).

20
 Rubrivivax gelatinosus

Rubrivivax gelatinosus caracterizada como bactria fototrfica prpura no

sulfurosa pertencente famlia Rhodospirillaceae, no utiliza compostos reduzidos de

enxofre como doadores de eltrons e requer vitaminas como biotina e tiamina para o seu

crescimento. um bacilo Gram-negativo, levemente encurvado ou reto, medindo de 0,4 a

0,7 m por 1 a 3 m. Suas clulas possuem motilidade pela presena de um flagelo polar.

Multiplica-se por fisso binria e encontra-se amplamente distribuda em ambientes naturais

e efluentes industriais. Possui membranas fotossintetizantes revestidas por pequenas

invaginaes em forma de dedo da membrana intracitoplasmtica (IMHOFF & TRUPER,

1989).

A bactria Rvi. gelatinosus naturalmente encontrada em efluente de abatedouro

avcola e em lagoas de estabilizao, possibilitando a aplicao deste microrganismo no

tratamento destes resduos. Muitos estudos tm sido desenvolvidos com esta bactria

envolvendo o seu crescimento em resduos industriais tanto para a realizao do tratamento

biolgico quanto para a produo de clulas proticas (TRUPER & IMHOFF, 1992;

PRASERTSAN et al., 1993; PRASERTSAN et al., 1997; PONSANO, 2000; CHOORIT et al.,

2002; PONSANO et al, 2003).

Rvi. gelatinosus possui crescimento fotoautotrfico quando utiliza-se de

hidrognio molecular como doador de eltrons e CO2 como doador de carbono. Porm,

prefere o modo de crescimento fotoheterotrfico sob condies anaerbicas na presena de

luz e com diferentes substratos orgnicos como doadores de carbono e eltrons, podendo

fotoassimilar acetato, citrato, fumarato, etanol, glicose, lactato, malato, piruvato e succinato.

21
Pode utilizar-se de citrato como nica fonte de carbono para o seu crescimento, sendo este

composto o constituinte principal no enriquecimento seletivo de seu cultivo. Algumas cepas

podem tambm apresentar crescimento sob condies microaerbicas ou aerbicas no

escuro (BALLONI et al., 1982). Esta bactria possui a capacidade de liquefazer a gelatina,

por meio de uma protease extracelular e apresenta temperatura e pH timo de crescimento

de 30oC e 6,5-7,5 respectivamente (HOLT et al., 1994).

Os principais pigmentos fotossintetizantes de Rvi. gelatinosus so as

bacterioclorofilas e os carotenides da srie espiriloxantina alternativa, cujos componentes

principais so esferoidene, hidroxiesferoidene e espiriloxantina. Esses pigmentos

carotenides, alm de responsveis pela colorao de suas colnias, que varia de rosa a

vermelho podem ainda ser utilizados como pigmentantes de raes, devido capacidade de

deposio tissular em alguns animais (PONSANO, 2000; PONSANO et al., 2003).

Carotenides

Os carotenides so pigmentos naturais produzidos por microrganismos e plantas

de grande importncia na medicina e na biotecnologia (BHOSALE, 2004).

Os pigmentos carotenides constituem uma famlia de compostos terpenides

que, pela sua estrutura, possuem a capacidade de absorver luz seletivamente. Podem ser

classificados em dois grupos principais, os carotenos constitudos inteiramente por

hidrocarbonetos, e as xantofilas, derivadas dos carotenos pela adio de funes

oxigenadas, tambm chamadas oxicarotenides (PONSANO, 2000). Possuem diversidades

estruturais com diferentes funes biolgicas como a colorao de espcies especficas,

agentes fotoprotetores de clulas, revestidores de luz e como precursores de alguns

22
hormnios. So usados comercialmente como corantes de alimentos, suplemento em

raes de animais, na indstria de cosmticos e farmacutica e possuem uma significante

importncia como agente anti-oxidante, alm da preveno de doenas crnicas. Muitos

carotenides como o -caroteno, o licopeno, a astaxantina, a cantaxantina e a lutena

podem ser utilizados comercialmente e produzidos por sntese qumica, fermentao ou

isolados de fontes naturais (LEE & SCHIMIDT-DANNERT, 2002).

Os carotenides so constitudos por mais de 600 variantes estruturais

reportados e produzidos por organismos como bactrias, algas, fungos e plantas superiores.

Sua produo natural mundial estimada em 100 milhes de toneladas por ano, sendo a

principal fornecida pela fucoxantina das algas fotossintetizantes marrons. Os mamferos no

esto bioquimicamente capacitados para a biossntese de carotenides, porm, possuem a

capacidade de acumulao ou converso de precursores que obtm da dieta como a

converso de -caroteno em vitamina A, sendo que no plasma humano h a presena do -

caroteno e do licopeno (FONTANA, 2006).

O conhecimento de que os carotenides possuem um importante papel na sade

humana provoca um aumento na procura por alimentos ricos nesses pigmentos. Muitos

carotenides empregados atualmente so sintetizados quimicamente, no entanto, a procura

por alimentos naturais est crescendo continuamente (BHOSALE & GADRE, 2001). Esses

alimentos naturais, fonte de carotenides, incluem extratos de frutas, flores e vegetais,

alguns organismos como as algas Dunaliella, Haematococcus, e Murielopsis, os fungos

Blakeslea trispora, as leveduras Xanthophyllomyces dendrorhous e Rhodotorula glutinis e as

bactrias Sphingomonas sp, Agrobacterium aurantiacum, Flavobacterium, Micrococcus

23
(SILVA et al., 2004), alm das bactrias fotossintetizantes como Rubrivivax gelatinosus

(PONSANO et al., 2003) e Rhodopseudomonas sphaeroides (SASAKI et al., 1978).

O primeiro carotenide a ser sintetizado e comercializado como corante de

alimentos foi o -caroteno, sendo hoje o mais comumente encontrado, alm de outros como

a lutena, a violaxantina, a neoxantina, o -caroteno, a zeaxantina e o licopeno, pois esto

presentes diariamente na dieta de humanos e animais. Em particular, na dieta de frangos,

esto disponveis comercialmente: o apo-8-etil-ster cido carotenico (aposter) e a --

caroteno-44-diona (cantaxantina) como pigmentantes das aves e produtos derivados

(FONTANA, 2006).

O termo pigmentante est associado aos carotenides adicionados raes de

animais com o objetivo de colorao dos tecidos corpreos como a pele e a gordura ou de

seus produtos derivados. A sensao da cor caracterstica de valor marcante na

estimulao do consumidor de carnes e ovos. A adio de pigmentantes como os

oxicarotenides em raes de aves possibilita a colorao da pele, canela de frangos e da

gema de ovos. Esta adio pode ser justificada pelo desejo dos consumidores em

adquirirem produtos de maior colorao (PONSANO, 2000).

Alm da importncia da cor, existe tambm o conceito j popularizado de que os

carotenides so efetivamente saudveis. Como exemplo, pode-se citar a astaxantina que

possui a capacidade 250 vezes superior no combate de radicais livres quando comparado

com o -tocoferol (vitamina E) (FONTANA, 2006).

A demonstrao direta da funo antioxidante dos carotenides tem sido relatada

em alguns estudos. Segundo Krinsky (1989), frangos com encefalomcea foram tratados

com carotenides derivados do etil--apo-8'-carotenide. O tratamento foi baseado na

24
hiptese de que a rancificao da gordura ou a peroxidao dos lipdeos da dieta podiam

causar a encefalomcea nas aves. Concluiu-se que o tratamento com o uso de carotenides

pde conduzir a proteo nesses animais. Alm disso, o autor verificou a importncia do

acmulo dos carotenides nos animais para a sua posterior converso em vitamina A numa

outra pesquisa realizada com dieta de ratos. Grandes doses de -caroteno (100 mg/kg)

foram inseridas na alimentao desses animais durante onze semanas. Sob estas

circunstncias, foi encontrado um aumento de retinol e palmitato de retinol no fgado

acompanhado por uma elevao do retinol no soro sanguneo dos ratos analisados.

Evidencias epidemiolgicas e resultados experimentais sugerem que a dieta com

o uso de carotenides inibe o incio de muitas doenas que envolvem a presena de radicais

livres. Dentre elas, podem-se citar algumas como a arteriosclerose, a catarata, a esclerose

mltipla, a degenerao macular relacionada idade, alm do cncer (BHOSALE, 2004).

Nos animais, a concentrao de carotenides coloridos em determinados tecidos

incluindo a pele, as plumas e as carcaas possui, alm da ao anti-oxidante, a proteo em

sinais de comunicao que envolve a atrao, a advertncia e a camuflagem. Pode-se citar

como exemplo, no peixe Gastrosteus aculeatus, o aumento da colorao alaranjada do

abdmen no macho significando o sinal de acasalamento para a fmea, e para os machos,

indicando defesa de territrio (FONTANA, 2006).

Comercialmente, a produo de carotenides por microrganismos compete com a

sntese por processos qumicos. Eficientes estimulaes na produo desses pigmentos por

microrganismos vm sendo estudadas por Bhosale (2004). O autor descreve diferentes

estimulantes tanto do meio ambiente como do meio de cultura que podem influenciar na

produo de carotenides. A luz, a temperatura, a adio de compostos qumicos, ons

25
metlicos, sais, intermedirios do cido tricarboxlico e solventes so exemplos desses

estimulantes. Por exemplo, a microalga fotoautotrfica Dunaliella sp, produtora de -

caroteno, requer alta intensidade luminosa, adio de sais e nutrientes para o seu

crescimento e sntese de carotenides. O autor sugere tambm diversos agentes qumicos

como aminas, alcalides, antibiticos, alm de solventes incluindo etanol, metanol e

etilenoglicol como aditivos aos cultivos dos organismos para anlise do efeito na sntese de

carotenides. Estudos realizados por Gu et al. (1997) indicaram que estimulantes qumicos

como a piridina estimularam a formao de licopeno em Blakeslea trispora e Phycomyces

blakesleeanus e que a adio de 0,2% (v/v) de etanol ao meio de cultura da levedura

Xanthophyllomyces dendrorhous provocou um aumento na produo de pigmentos

carotenides.

Segundo Bhosale (2004), a produo de carotenides e o seu acmulo so

inteiramente afetados pela intensidade luminosa em algas, fungos e bactrias. No entanto,

esta intensidade varia entre os diferentes organismos sendo que o aumento ou a diminuio

do tempo e da iluminao reflete na produo desses pigmentos. De acordo com o autor, a

elevao da intensidade luminosa provocou alta produo de astaxantina por

Haematococcus pluvialis na presena de sais de ferro, o acmulo de lutena em Muriellopsis

sp foi aumentado de 40% quando o fluxo de densidade do fton variou de 184 para 460

mol fton m-2s-1 e o cultivo da bactria Flavobacterium sp, sob iluminao contnua,

produtora do carotenide zeaxantina, proporcionou um aumento na produo do pigmento

com a variao da intensidade luminosa.

A temperatura um dos mais importantes fatores ambientais que afeta o

crescimento e desenvolvimento dos organismos, incluindo a biossntese de carotenides.

26
Ela tem sido estudada para controlar a concentrao das enzimas envolvidas na produo

desses pigmentos (HAYMANN et al., 1974). Bactrias fotossintetizantes similares a

Chloroflexus aurantiacus crescidas a 55oC produzem -caroteno e hidroxi--caroteno.

Estudos realizados por Hanada et al. (1995) indicaram que o aumento da temperatura

provocou uma variao nos nveis dos pigmentos dessas bactrias. Em contraste, estudos

com a utilizao de baixas temperaturas no crescimento da cianobactria marinha unicelular

Synechococcus sp tambm levaram um aumento nos nveis de carotenides (SAKAMOTO

& BRYANT, 1998).

A produo de carotenides utilizando-se de bactrias pode ser vantajosa em

relao a outros mtodos. Silva et al. (2004), examinando a produo de -caroteno pela

bactria isolada do solo Sphingomonas sp, observaram alta produo do pigmento. A

produo de -caroteno por outros organismos como Dunaliella salina (alga), Blakeslea

trispora (fungo), Phaffia rhodozyma e Rhodotorula glutinis (leveduras) foi significamente

mais baixa do que a apresentada pela bactria. Os autores tambm constataram que a

Sphingomonas sp apresenta habilidade de utilizar-se da lactose como fonte de carbono.

Esta caracterstica pode ser uma soluo para o ndice elevado de lactose no soro ultra-

filtrado, um subproduto da produo de queijo. O cultivo desse microrganismo uma

vantagem adicional significativa porque fornece um uso alternativo para o ultrafiltrado do

soro de queijo.

27
 Carotenides em bactrias fotossintetizantes

Os carotenides presentes nas bactrias fotossintetizantes podem ser amarelos,

vermelhos, marrons ou verdes e, associados s bacterioclorofilas, determinam a colorao

da cultura. Por exemplo, as BPNS, no so prpuras como diz o prprio nome, e sim

castanhas, cor-de-rosa, castanho-vermelhas ou prpura-vermelha, conforme o carotenide

existente (BROCK et al., 1994).

Os carotenides sintetizados pelas bactrias fotossintetizantes podem ser

divididos quimicamente em grupos que incluem as seguintes funes orgnicas: aldedos,

steres, metilteres, cetonas, lcoois, hidrocarbonetos e glicosdeos. Possuem estrutura

qumica diferente dos carotenides produzidos por algas, fungos, plantas superiores e

bactrias no fotossintetizantes com as seguintes caractersticas: geralmente possuem

cadeias alifticas, grupamento hidroxil e metoxil tercirios, dupla ligao entre os carbonos

C3 e C4, sendo que, os oxigrupos conjugados cadeia polinica podem estar ligados ao C2

(sob aerobiose) ou ao C4 (sob anaerobiose), alm disso, o grupo funcional dos aldedos

pode estar presente na posio C20 e os carotenides cclicos possuem normalmente anis

aromticos como grupos terminais (PONSANO, 2000).

O estudo da composio dos carotenides em espcies especficas indica que

existe um grande nmero de carotenides de estruturas qumicas incomuns. Yurkov &

Beatty (1998) descrevem vinte diferentes tipos de carotenides vermelhos e laranjas

encontrados em E. ramosum (bactria fototrfica aerbia anoxignica) dos quais dez foram

purificados e caracterizados estruturalmente. Todos os carotenides purificados continham

40 tomos de carbono e foram classificados em quatro grupos: a) carotenides bicclicos (-

28
caroteno e derivados hidroxilados como zeaxantina, adonixantina, caloxantina e

nostoxantina); b) carotenides monocclicos (bacteriorubixantinal); c) carotenides acclicos

(espiriloxantina); d) carotenides sulfato polares (eritroxantina).

O esferoidene e a espiriloxantina tm sido detectados como os tipos mais

abundantes de carotenides em bactrias prpuras fototrficas, tais como: Rhodobacter,

Roseobacter sp, Rhodospirillum rubrum, Acidiphilium rubrum e Rubrivivax gelatinosus

(TRUPER & IMHOFF, 1992; YURKOV & BEATTY, 1998).

As bactrias da famlia Rhodospirillaceae sintetizam carotenides acclicos C40

com duplas ligaes C-3,4 conjugadas que so modificadas por grupos hidroxilas ou

metanol nas posies C-1 e/ou C-1'. A biossntese de carotenides via espiriloxantina tem

sido estabelecida em diferentes espcies de Rhodospirillaceae. Estudos realizados com

Rhodospirillum rubrum identificaram a espiriloxantina como o principal carotenide

constituinte dessa bactria (STEIGER et al., 2000).

A indstria de processamento de alimentos e os efluentes

O fenmeno da poluio ambiental vem crescendo muito nos ltimos anos. Este

fato, alm de ser assunto discutido por cientistas e ambientalistas, faz parte da preocupao

de toda a sociedade. As indstrias, principais fontes de poluio mundial, tm sofrido um

controle de fiscalizao que incentiva a modificao ou a substituio de processos

intrinsecamente poluentes, com a finalidade de diminuio do impacto ambiental causado

por muitos processos de produo. Este controle refere-se, tambm, ao desenvolvimento de

processos que permitam a remediao dos poluentes produzidos visando uma diminuio

da poluio ambiental (BRITO et al., 2004a).

29
 De acordo com Schoenhals (2006), a dinmica do uso da gua no mundo pelo

setor industrial vem crescendo, segundo os dados: no ano de 1990 o volume total estimado

captado foi de 38 km3/ano, sendo que, efetivamente consumidos 3 km3/ano. Em 2000, o

volume total estimado captado foi de 748 km3/ano, sendo efetivamente consumidos 87

km3/ano. Para o ano 2025, a estimativa de que o volume total captado seja de 1106

km3/ano sendo a previso efetiva de consumo de 146 km3/ano.

Segundo Kroyer (1995), a indstria de alimentos possibilita desde a formao de

produtos, como tambm a emisso de resduos e de subprodutos que provocam o impacto

ambiental. As indstrias de processamento de carnes utilizam uma grande quantidade de

gua desde o abate at as etapas de processamento industrial. Estas guas so

caracterizadas por uma elevada quantidade de matria orgnica e de slidos em suspenso

e podem ser chamadas de efluentes ou guas residurias. De acordo com o autor, os

resduos do processamento da indstria alimentcia possuem algumas caractersticas em

comum como:

a) grande quantidade de matria orgnica como protenas, lipdeos e

carboidratos;

b) grande quantidade de slidos suspensos;

c) alta Demanda Qumica de Oxignio (DQO);

d) alta concentrao de nitrognio;

e) grande variao de pH.

Desde a antiguidade, a carne faz parte da alimentao do homem, o que tornou

necessrio o estabelecimento de prtica de abate animal, cujas tcnicas vm se

aprimorando ao longo dos tempos (SCARASSATI, 2003).

30
 A criao e o processamento industrial de aves podem gerar problemas de

contaminao ambiental por disposio indevida de resduos, podendo ocasionar problemas

graves de comprometimento do ecossistema. Todas as etapas do processamento industrial

contribuem de alguma forma para a carga de resduos poluentes ao meio ambiente. Nesse

caso, os resduos so sangues, vsceras, penas, carnes e tecidos gordurosos, perdas de

processo, detergentes ativos e custicos, dentre outros. O mais significativo o sangue, ao

qual, na rea de abate, juntam-se, ainda, penas, esterco e sujeiras, acarretando numa

poluio maior. As etapas de abate e processamento de aves resultam em grandes

quantidades de dejetos lquidos, semi-slidos e slidos que so poluentes e, por isso,

necessitam de uma adequada separao e tratamento, antes de serem liberados no meio

ambiente (Quadro 1) (FERNANDES, 2004).

As guas descartadas pelas indstrias de carnes so fontes poluidoras do meio

ambiente por possurem uma grande quantidade de matria orgnica, podendo contaminar

lagos e rios quando lanadas e no tratadas adequadamente (ZORATTO et al., 2003).

Devido elevada Demanda Bioqumica Oxignio (DBO) e por serem ricos em protenas, os

despejos lquidos dos abatedouros e frigorficos, so altamente putrescveis, podendo

provocar fortes odores (SCARASSATI et al., 2003).

31
 Quadro 1. Tipos de dejetos e subprodutos resultantes das etapas do processamento avcola

Etapa do processamento Tipo de dejeto ou subproduto

Recepo Fezes, penas e gua de limpeza

Sacrifcio Sangue e gua de limpeza

Escalda/depenamento Penas, sangue/gordura e gua de limpeza

Eviscerao Vsceras, sangue, gordura, pequenos pedaos de carne e

gua de limpeza

Resfriamento Sangue, gordura, pequenos pedaos de carne e gua

Classificao e empacotamento gua de limpeza

Limpeza da planta gua de limpeza

Fonte: FERNANDES, 2004

O Quadro 2 indica as principais caractersticas dos efluentes de abatedouros

avcolas caracterizadas segundo Schoenhals (2006) baseando-se em dados colhidos em

1973 pelo Environmental Protection Agency (EPA) e pelo Centro de Recursos Hdricos e

Ecologia Aplicada (CRHEA) pertencentes Universidade de So Carlos-SP.

32
Quadro 2. Caractersticas dos efluentes de abatedouros avcolas

Anlise Unidade EPA CRHEA

Variao Mdia Mdia

pH 6,3-7,4 6,9 6,8

O.D mg.L-1 0,0-2,0 0,5 2,0

DBO mg.L-1 370,0-610,0 398,0 810,0

DQO mg.L-1 nr nr 460,0

Slidos Totais mg.L-1 nr 650,0 nr

Slidos Fixos mg.L-1 nr 486,0 nr

Slidos Volteis mg.L-1 nr 164,0 nr

Slidos sedimentveis mg.L-1 150,0-200,0 175,5 1,4

leos e graxas mg.L-1 170,0-230,0 201,0 784,0

Fonte: SCHOENHALS (2006)

*nr: no reportado

A agroindstria um setor que possui grande capacidade de gerar renda,

emprego e exportaes para o pas. Dentre os vrios setores agroindustriais, destaca-se o

da avicultura (cujo principal produto o frango, seja inteiro ou em pedaos) devido sua

importncia para a balana comercial do Brasil. De acordo com a Associao Brasileira dos

Produtores e Exportadores de Frangos, em 2002 as exportaes de carne de frango

alcanaram um valor de US$ 1.3 bilho (ABEF, 2002) e, durante o perodo de fevereiro de

2002 a janeiro de 2003 foram responsveis por 41,38% das exportaes do pas (MAPA,

2003).

33
 Outro impacto importante do abate avcola est relacionado ao consumo de gua,

que utilizada em diversas etapas do processamento segundo Scarassati et al. (2003), tais

como:

Escaldagem: as aves so imersas em tanque contendo gua quente na primeira

etapa de lavagem para remover impurezas e sangue para facilitar a retirada das penas.

Depenagem: realizada por ao mecnica em mquinas prprias, acompanhada

de lavagem por meio de chuveiros.

Escaldagem dos ps: as aves so transferidas para outro transportador, onde so

penduradas pela cabea, e passam por processo de escaldagem dos ps e retirada

mecnica das cutculas.

Eviscerao: remoo das vsceras comestveis (fgado, corao e moela),

intestinos e pulmes (extrados vcuo), com posterior lavagem das carcaas.

Pr-resfriamento: as carcaas passam por tanque contendo gua gelada, onde

permanecem cerca de 30 minutos e chegam a atingir uma temperatura de 0 a 5 oC.

Limpeza da planta: etapa importante, que realizada ao final do dia, quando so

utilizados detergentes, todos eles biodegradveis, para evitar problemas na estao de

tratamento de efluentes.

O processamento de um frango para o consumo humano requer a utilizao de

aproximadamente 10-12 litros de gua, sendo que 60% convertida em gua resduria

com pH entre 6,1 e 7,1, alta DQO, grande percentual de slidos, sangue e contedo de

gordura (CHVEZ et al., 2005). De acordo com Fernandes (2004), no Brasil, o consumo

mdio de gua dos frigorficos de aves d-se em torno de 15 litros por ave, enquanto que,

nos Estados Unidos, este valor situa-se em torno de 26 litros por animal. Os sistemas de

tratamentos destes resduos industriais so constitudos por tratamento preliminar e primrio

34
com a finalidade de remoo de partculas grosseiras e de leos e gorduras; o tratamento

secundrio utilizado para a remoo da matria orgnica dissolvida e constitudo por

sistemas de lagoas de estabilizao, aerbios ou anaerbios (BARROS et al., 2000).

Muitos efluentes de abatedouros avcolas so tratados por meios fsico-qumicos

utilizando-se de grandes quantidades de produtos qumicos e de energia para secar o

resduo e gerar uma quantidade de 20 gramas de lodo por litro de gua. Esta deposio de

lodos dificultosa, limitando o uso desta tcnica (CHVEZ et al., 2005). O tratamento

aerbio dos dejetos gerados por esses efluentes limitado devido necessidade de alto

consumo de energia para a aerao (DEL POZO et al., 2000).

Muitos procedimentos tm sido desenvolvidos com o objetivo de minimizar o

impacto causado pelos efluentes ao meio ambiente. De acordo com Brito et al. (2004a), esses

procedimentos podem ser classificados conforme relacionados:

Mtodos fsicos: subdivide-sem em diversas categorias, sendo a primeira representada pela

separao de fases para a remoo de material slido como: sedimentao, decantao,

filtrao, centrifugao e flotao. A segunda categoria representada pelos mtodos de

transio de fases, caracterizada pela transformao das formas fsicas das substncias

como: destilao, evaporao, precipitao fsica, cristalizao. A terceira categoria est

representada pelos mtodos de transferncia de fase, destacando-se os procedimentos de

extrao por solventes e a absoro. A ltima categoria est representada por processos de

separao molecular, isto , processos de filtrao utilizando-se de membranas seletivas.

Neste grupo so encontradas as tcnicas de hiperfiltrao, ultrafiltrao, osmose reversa e

dilise.

35
 Mtodos qumicos: so bastante variados e dependem, exclusivamente, das caractersticas

do efluente. Como exemplos: a neutralizao cido-base, a clorao, a precipitao qumica,

a eletrlise e os mtodos oxidativos, utilizando oznio. A clorao um dos mtodos qumicos

mais utilizados para o tratamento de gua destinado ao consumo humano, em que o cloro

atua como desinfetante e oxidante; no entanto, a presena de compostos orgnicos na gua

pode levar formao de compostos organoclorados, podendo ser o produto final do

tratamento mais txico que o efluente de origem, acarretando em uma desvantagem para este

mtodo.

Mtodos fotoqumicos: tcnica fundamentada na formao de OH- (radical hidroxila), que

apresenta alta capacidade para oxidar substratos de interesse. A formao desta espcie

resulta da reao da gua com a vaga eletrnica (lacuna) produzida em algumas substncias

como os semicondutores metlicos de TiO2 ou ZnO, sob efeito de radiao ultravioleta. Alm

da formao do radical hidroxila, espcies podem ser diretamente reduzidas pelo eltron ou

oxidadas pela lacuna.

Mtodos trmicos: como exemplo, a incinerao, que um processo consistente na

utilizao de substrato poluente como fonte de energia, alcanando a mineralizao completa

dos poluentes. A incinerao um processo extremamente caro para implementao, sendo

utilizado em casos mais especficos, como por exemplo, o lixo hospitalar.

Mtodos biolgicos: consistem na remoo de compostos constitudos por carbono, em que

a coagulao de slidos coloidais e a estabilizao da matria orgnica podem ser

conseguidas biologicamente por meio de microrganismos, principalmente bactrias, capazes

de converter os compostos orgnicos coloidais e dissolvidos em vrios gases e biomassa

(BRITO et al., 2004b). Podem ser classificados em dois tipos:

36
a) Processos aerbicos: caracterizados pela utilizao de microrganismos na presena de

oxignio. Como exemplo, pode-se citar o sistema de lodos ativados, em que os

microrganismos contidos num tanque de aerao so capazes de transformar as substncias

contaminantes em CO2 e biomassa microbiana no txica. O nitrognio orgnico

transformado em amnio ou nitrato, enquanto o fsforo orgnico transformado em

ortofosfato.

b) Processos anaerbicos: caracterizados pela utilizao de microrganismos capazes de

realizarem a degradao das substncias na ausncia de oxignio podendo produzir dixido

de carbono e metano alm de amnia e gs sulfdrico. A biodegradao sob condies

anaerbias tem sido objeto de interesse nos ltimos anos, em funo da capacidade de certos

microrganismos transformarem um grande nmero de compostos clorados em espcies

menos txicas. O sistema combinado anaerbio-aerbio aumenta significativamente a

eficincia do processo de tratamento permitindo uma reduo da rea ocupada pelas

estaes de tratamento e o tempo de residncia.

Dentre os processos de tratamento biolgico encontram-se:

a) Lagoas de estabilizao: sistema de fornecimento natural de oxignio por meio

de desenvolvimento de algas e microrganismos em lagoas construdas com a finalidade de

degradao microbiana dos compostos orgnicos poluentes, e converso a dixido de

carbono e gua (MARTINS et al., 2003). So os seguintes os sistemas das lagoas de

estabilizao: lagoas facultativas, sistemas de lagoas anaerbias seguidas por lagoas

facultativas, sistemas de lagoas aeradas seguida por lagoas de decantao. Estes sistemas

possuem desvantagens como a dificuldade de satisfazer padres de lanamento bem

restritos, devido simplicidade operacional, o descaso na manuteno (crescimento de

vegetao), a necessidade de remoo de algas do efluente para o cumprimento de padres

37
rigorosos, a variao no desempenho, de acordo com as condies climticas, alm da

possibilidade de desenvolvimento de insetos (ZORATTO et al., 2003).

b) Lodos ativados, filtros biolgicos, lagoas aeradas e valos de oxidao: a

degradao microbiana de compostos orgnicos poluentes ocorre por meio do metabolismo

aerbio, facilitado pela disponibilidade artificial de oxignio em reatores ou em lagoas,

realizando uma converso a dixido de carbono e gua (MARTINS et al., 2003). um dos

mtodos de tratamento biolgico mais utilizados com eficincia de remoo na DBO e DQO

(MELCHIOR et al., 2003). Possuem desvantagens como a necessidade de alto consumo de

energia para a aerao (DEL POZO et al., 2000).

Demanda Bioqumica de Oxignio (DBO) e Demanda Qumica de Oxignio

(DQO)

A expresso Demanda Bioqumica de Oxignio (DBO), utilizada para exprimir o

valor da poluio produzida por matria orgnica oxidvel biologicamente, corresponde

quantidade de oxignio que consumida pelos microorganismos do esgoto ou guas

poludas, na oxidao biolgica, quando mantida a uma dada temperatura por um espao de

tempo convencionado. Essa demanda pode ser suficientemente grande, para consumir todo

o oxignio dissolvido da gua, o que condiciona a morte de todos os organismos aerbios

de respirao subaqutica. O teste de Demanda Qumica de Oxignio (DQO) baseia-se no

fato de que todos os compostos orgnicos, com poucas excees, podem ser oxidados pela

ao de um agente oxidante forte em meio cido. Uma das limitaes, entretanto, o fato

de que o teste no diferencia matria orgnica biodegradvel e matria orgnica no

38
biodegradvel, a primeira determinada pelo teste de DBO. A DQO possui como vantagem o

tempo de teste, que realizado em poucas horas, enquanto o teste de DBO requer no

mnimo 5 dias (perodo de incubao) (DEBERDT, 2006).

Produo de biomassa por microrganismos

Uma alternativa de reduo na quantidade de efluentes, quando possvel, a sua

reutilizao. As operaes de reciclagem podem estar relacionadas com o retorno do

efluente ao processo de produo (quando contm quantidades significativas de algum

insumo), transferncia para outro processo (quando o resduo de um processo serve de

insumo para outro) e processamento para a obteno de energia (incinerao). Um exemplo

das possibilidades de diminuir o volume de efluentes por meio da implementao de

operaes de reciclagem dado pela indstria de papel e celulose Selenga (Rssia). Nesta

indstria, a utilizao de processos biolgicos e fsico-qumicos possibilitou a reutilizao

dos efluentes atingindo o desejado estado de descarga zero. Ou seja, a indstria consegue

produzir aproximadamente 173.000 toneladas de madeira por ano, sem emitir efluentes para

o meio ambiente (BRITO et al., 2004a). Um mtodo de recuperao ambiental dos efluentes

industriais de processamento de alimentos a possvel utilizao do subproduto gerado na

bioconverso do resduo em clulas proticas (GETHA et al., 1998).

Considerando que o desenvolvimento industrial de baixo custo associado

produo de alimentos proticos de alta qualidade so difceis metas de realizao para o

sucesso na aqicultura, clulas proticas de microalgas tm sido utilizadas como alimento

essencial para o estgio larval de peixes e mariscos e as leveduras tm sido consideradas

39
substitutas das algas em filtros alimentadores. Porm, a produo das clulas proticas por

microalgas e leveduras no tem sido utilizada extensivamente como dieta na aqicultura

quando comparada s bactrias fotossintetizantes. A utilizao dessas bactrias possui

algumas vantagens como: a maior digestibilidade da parede celular bacteriana, a

constituio celular rica em protenas, carotenides, cofatores biolgicos e vitaminas, alm

de apresentarem-se disponveis em subprodutos de resduos agrcolas. Estudos mostraram

que a adio de bactrias fotossintetizantes como fonte alimentar estimulou um crescimento

de zooplnctons muito maior do que o apresentado pela adio de algas verdes, alm disso

so muito teis para o crescimento de camares. Grandes danos econmicos foram

supridos com a adio de bactrias fotossintetizantes em tanques de camares afetados por

uma doena na brnquia (KIM & LEE, 2000).

De acordo com Prasertsan et al. (1993), as bactrias fotossintetizantes podem ser

utilizadas no tratamento de resduos, alm disso, possuem alto valor nutricional, suas

clulas so fontes de protenas e vitaminas. Os autores realizaram estudos com Rvi.

gelatinosus em efluente de processamento de peixe e observaram crescimento sob

condies anaerbias e na presena de luz com uma produo de biomassa de 4 g l-1 e uma

reduo de 78% na DQO.

Peixes alimentados por clulas de bactrias fotossintetizantes apresentaram

aumento significativo no peso e na taxa de sobrevivncia quando comparados dieta

normal utilizada (KOBAYASHI & TCHAN, 1973). Alm disso, a suplementao com

carotenides em raes animais intensificou a colorao da gemas de ovos em frangos e da

pele de carpas e de camares (NOPARATNARAPORN & NAGAI, 1986).

Segundo Prasertsan et al. (1997), a bactria fotossintetizante Rvi. gelatinosus

possui as seguintes caractersticas: habilidade de crescimento em efluente de

40
processamento de peixe, capacidade de degradao da matria orgnica de efluentes e

uma produo de biomassa constituda por protenas (40 a 69%), carotenides (0,09 a 80

mg/g de peso seco), vitamina B12 (30 a 79 mg/kg de peso seco ), alm de bacterioclorofilas

e aminocidos essenciais.

Ponsano et al. (2003) investigaram a composio qumica da biomassa produzida

por Rvi. gelatinosus em efluente de abatedouro avcola e encontraram 67,6% de protena,

27,6% de carboidrato 0,6 % de lipdeos e 4,2% de cinzas. Neste trabalho, os autores

concluram que a biomassa da bactria possui uma composio qumica adequada, alm de

aminocidos essenciais, que favorecem a sua utilizao como aditivo em raes para aves.

Kim & Lee (2000) executaram trs diferentes tipos de fermentao anaerbia com

a bactria fotossintetizante Rhodopseudomonas palustris para a produo de biomassa a

ser utilizada na alimentao de peixes. Os autores obtiveram uma biomassa com 72-74% de

protena e uma composio de cido esterico e cido olico maior do que a encontrada por

Chlorella e levedura. Alm disso, foi estimado um custo de US$ 79/kg clula seca para a

produo de biomassa por R. palustris baseado na metodologia de fermentao anaerbia

utilizada. Este custo projetado foi maior do que o realizado por algas, porm quando

comparado um processo de larga escala ordenado este custo pode ser superado. Como

concluso, a produo de biomassa pela bactria foi apresentada como uma alternativa

vivel para a aqicultura.

Estudos com o cultivo de bactrias fototrficas em efluentes agroindustriais

demonstraram uma produo de biomassa rica em protenas (65% de protena crua), alm

de aminocidos essenciais, vitamina B12, pigmentos carotenides e cido flico (SASAKI et

al., 1981; NOPARATNARAPORN et al., 1983).

41
 Balloni et al. (1987) estudaram o crescimento e avaliaram a produo de

biomassa pelas bactrias fotossintetizantes Rhodospirillum fulvum e Rhodopseudomonas

palustris em meio sinttico e em efluentes industriais (refinaria de acar e abatedouro de

sunos). Os autores encontraram diferentes utilizaes para a biomassa produzida por esses

microrganismos quando crescidas em meio sinttico tais como ingredientes em raes para

peixes e fertilizantes. Alm disso, o processo de obteno de biomassa nos efluentes

mostrou-se eficiente com capacidade despoluente podendo trazer benefcio econmico para

o tratamento desses resduos industriais.

Hu & Gao (2003) estudaram a optimizao de crescimento e composio de

cidos graxos da microalga Nannochloropsis sp sob condies fotoautotrficas enriquecida

com CO2 e em condies mixotrficas com adio de acetato. Foi possvel uma produo de

biomassa rica em cidos graxos e protenas. De acordo com os autores, os cidos graxos

produzidos por microalgas podem possuir valores nutritivos para a sade de animais e

humanos.

Segundo uma pesquisa realizada por Fontana (2006), a levedura

Xanthophyllomyces pode ser cultivada em caldo de cana bruto e uria ou em bagao de

cana hidrolisado para a produo de astaxantina. O autor revela que a vinhaa, um

subproduto poluidor da indstria sucro-alcooleira, quando adicionada ao cultivo, possui

efeito benfico, aumentando o teor de astaxantina.

Considerando:

a necessidade de tratamento das guas residurias da indstria de abatedouro

avcola;

a habilidade da bactria fotossintetizante Rubrivivax gelatinosus, natural deste

ambiente, em crescer e degradar a matria orgnica desse efluente e produzir biomassa;

42
 a possibilidade da utilizao da biomassa constituda por pigmentos carotenides

e componentes nutricionais na rao de aves para a promoo da colorao de produtos de

avicultura e melhoria do desempenho zootcnico das aves,

o presente trabalho teve como objetivos estudar o crescimento fotoheterotrfico

de Rvi. gelatinosus em resduo de abatedouro avcola e desenvolver uma metodologia para

a produo da biomassa da bactria neste substrato, utilizando equipamentos industriais.

O efluente foi inicialmente tratado por meio das tcnicas industriais de filtrao,

desnatamento e pasteurizao, seguido da adio do inculo de Rvi. gelatinosus. Aps o

perodo de cultivo, foram realizadas as operaes de microfiltrao e liofilizao, para gerar

a biomassa da bactria. A produtividade e a capacidade despoluente do processo

desenvolvido foram determinadas.

O captulo 2, intitulado Crescimento fototrfico de Rubrivivax gelatinosus

em efluente de abatedouro avcola teve como objetivos: caracterizar o crescimento de R.

gelatinosus em efluente de abatedouro avcola, determinar a produtividade do processo de

obteno de biomassa nesse substrato e avaliar a capacidade despoluente do processo

de cultivo da bactria no efluente. O crescimento da bactria no substrato foi caracterizado

pelas curvas de crescimento dadas pela leitura ptica (absorvncia) em espectrofotmetro

e tcnica de gravimetria (peso seco g l-1). A produtividade do processo de obteno de

biomassa foi obtida por meio da frmula: produtividade = g de biomassa (massa seca)/ l-1

d-1 e a capacidade despoluente de cultivo da bactria no efluente foi realizada pela anlise

Demanda Qumica Oxignio (DQO). O trabalho foi escrito segundo as normas da revista

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54
 CAPTULO 2

CRESCIMENTO FOTOTRFICO DE Rubrivivax gelatinosus

EM EFLUENTE DE ABATEDOURO AVCOLA

55
 Crescimento fototrfico de Rubrivivax gelatinosus em efluente de abatedouro avcola

Clariana Z. Paulino, Elisa H. G. Ponsano*

Departamento de Apoio, Produo e Sade Animal, Curso de Medicina Veterinria,

Universidade Estadual Paulista. P. O. Box 341, Araatuba-SP, Brasil 16050-680

Resumo

Rubrivivax gelatinosus uma Bactria Prpura No Sulfurosa (BPNS) que apresenta

a capacidade de realizar a biorremediao de guas residurias e, ao mesmo tempo, produzir

pigmentos carotenides. Os objetivos desse estudo foram a caracterizao da curva de

crescimento da bactria no efluente de abatedouro avcola em nvel de 1% (v/v) de inculo, a

determinao da produtividade do processo de obteno de biomassa e a avaliao da capacidade

de remoo da Demanda Qumica Oxignio do processo. R. gelatinosus apresentou maior

crescimento no oitavo dia de cultivo (Absorvncia = 1.177; peso-seco = 0.18 g l-1), produtividade

de 0.085 g biomassa (massa seca) l-1 d-1 e uma reduo de 91% na DQO do efluente de

abatedouro avcola.

Palavras-chaves: Rubrivivax gelatinosus; biomassa; bactria prpura no sulfurosa; Demanda

Qumica Oxignio; produtividade.

56
 Phototrophic growth of Rubrivivax gelatinosus in poultry slaughterhouse wastewater

Clariana Z. Paulino, Elisa H. G. Ponsano

Support, Production and Animal Health Department, College of Veterinary Medicine, So

Paulo State University. P. O. box 341, Araatuba SP, Brazil - 16050 680

Abstract

Purple nonsulfur phototrophic bacterium Rubrivivax gelatinosus was used to promote the

bioremediation of poultry slaugtherhouse wastewater. The aims of this study were to characterize

the bacterium growth curve in that effluent at 1% (v/v) inoculum level, to determine the

productivity of the biomass production process and to evaluate the Chemical Oxygen Demand

removal activity of the process. R. gelatinosus showed the highest growth on the 8th day of

cultivation (Absorbance = 1.177; Dry weight = 0.18 g l-1), productivity was around 0.085 g

biomass (dry weight) l-1 d-1 and the COD of the poultry slaugtherhouse wastewater decreased in

91%.

Keywords: Rubrivivax gelatinosus; biomass; purple nonsulfur bacteria; Chemical Oxygen

Demand; productivity.

Corresponding author. Tel. +55 18 3636-3270; fax: +55 18 3622-6487

E-mail address: elisahgp@fmva.unesp.br (Elisa H. G. Ponsano)

57
 1. Introduo

Biotecnologia a aplicao dos princpios da cincia e engenharia para o processamento de

materiais por agentes biolgicos (Gavrilescu and Chisti, 2005). O tratamento de efluentes por lodos

ativados foi a primeira aplicao da biotecnologia na biorremediao, por meio do controle da

poluio de ambientes aquticos. Atualmente, microrganismos e enzimas tm sido utilizados em

diversas aplicaes (Gavrilescu and Chisti, 2005). So numerosos os processos biotecnolgicos que

utilizam microrganismos, seja para obteno de produtos de valor comercial, seja para, atravs do

prprio processo, chegar-se a um resultado de interesse, como despoluio de um ambiente por

biorremediao ambiental (Azevedo, 1998). Este processo um caminho atrativo, pois promove

alm da purificao de efluentes, a utilizao deste prprio recurso, como por exemplo, a utilizao

de subprodutos na produo de novos alimentos (Zheng et al., 2005).

Bactrias fotossintetizantes, tambm chamadas fototrficas, podem ser encontradas em rios,

lagos e sistemas de tratamento de efluentes. Estas bactrias, quando crescem anaerobicamente na

presena de luz utilizando-se de compostos orgnicos como fonte de carbono so classificadas

fotoheterotrficas (Choorit et al., 2002).

Uma caracterstica do metabolismo de bactrias fototrficas a habilidade de crescer em

diferentes condies e meios, utilizando-se de diversos substratos (Imhoff, 1992). A aplicao do

potencial biotecnolgico deste grupo de microrganismo inclui: a biorremediao de efluentes, a

produo de substncias, tais como antivirais, clulas proticas, enzimas e a remoo de metais

pesados em guas poludas (Azad et al., 2003).

A bactria fotossintetizante Rubrivivax gelatinosus caracterizada como Bactria Prpura

No-Sulfurosa (BPNS), sendo incapaz de oxidar enxofre (So) a sulfato (SO42-) e, sob condies

anaerbias, na presena de luz, seu modo de crescimento predominante o fotoheterotrfico, no qual

58
utiliza substratos orgnicos como acetatos, piruvatos e cidos dicarboxlicos. Por outro lado,

microrganismos fototrficos so capazes de crescer utilizando-se de hidrognio ou compostos

reduzidos de enxofre como doadores de eltrons, alm do dixido de carbono como fonte de carbono

(Eraso and Kaplan, 2006).

R. gelatinosus apresenta a habilidade de crescer em efluente de abatedouro avcola e produzir

biomassa constituda por pigmentos carotenides fotossintetizantes ricos em protenas e aminocidos

essenciais para aves que, quando adicionados s raes desses animais, promovem uma maior

colorao a gemas de ovos e carcaas de frangos (Ponsano et al., 2003). Os carotenides so

importantes pigmentos naturais produzidos por alguns microrganismos e tm exercido funes

fundamentais na medicina e biotecnologia, tais como: a colorao de espcies especficas, agentes

fotoprotetores de clulas, precursores de alguns hormnios e so tambm usados comercialmente

como corantes de alimentos, suplementos em raes de animais e na indstria de cosmticos (Lee

and Schmidt-Dannert, 2002). A produo e o acmulo de carotenides variam com o tipo de

microrganismo e podem ser afetados pela irradiao de luz em algas, fungos e bactrias (Bhosale,

2004). O aumento ou a diminuio do tempo e da intensidade de luz interfere na produo de

carotenides, sendo que esta produo geralmente associada com o crescimento do microrganismo

ou com o aumento da atividade enzimtica para a biossntese de carotenides (Bhosale, 2004).

Em abatedouros avcolas, as etapas de processamento requerem a utilizao de guas

principalmente durante a escalda, depenagem, eviscerao, lavagem e resfriamento das carcaas

(Cardoso et al., 2003). Estas etapas geram guas residurias, caracterizadas pela alta concentrao de

matria orgnica, incluindo lipdeos, protenas e slidos em suspenso que, quando descartadas,

podem contaminar o ambiente de rios e lagos (Chvez et al., 2005). Uma das mais importantes

aplicaes da biotecnologia a reduo da poluio ambiental atravs do tratamento de efluentes

(Chvez et al., 2005). Uma opo para a reduo da carga poluente do efluente de abatedouro

59
avcola gerada pelo processo industrial o tratamento biolgico representado pelo cultivo da

bactria fototrfica R. gelatinosus (Ponsano et al., 2003).

Dentro desse contexto, os objetivos deste estudo foram caracterizar o crescimento de R.

gelatinosus em efluente de abatedouro avcola, determinar a produtividade do processo de obteno

de biomassa nesse substrato e avaliar a capacidade despoluente do processo de cultivo da bactria no

efluente.

2. Mtodos

2.1 Microrganismo

A cultura de Rubrivivax gelatinosus foi isolada do efluente de abatedouro avcola,

caracterizada com base em testes morfolgicos e bioqumicos (Ponsano, 2000) e armazenada em

meio de Pfennig semi- slido (Pfennig, 1974).

2.2. Meio de cultivo

O meio de cultivo utilizado para o preparo do inculo de R. gelatinosus foi o meio de Pfennig

lquido (Pfennig, 1974) adicionado das solues vitamnicas de biotina 0.0015% e tiamina 0.005%.

Composio do meio de Pfennig (g l-1 gua destilada) (Pfennig, 1974):

KH2PO4 0.5; NH4Cl 0.4; MgSO4.7H2O 0.4; NaCl 0.4; CaCl2.2H2O 0.05; Na2S2O3.5H2O 0.2;

citrato de ferro III 0.005; acetato de sdio1.0; extrato de levedura 0.5; soluo de microelementos

1.0 ml; gar bacteriolgico 12.0. O pH 7.0, ajustado com soluo de NaOH 5.0 M; Esterilizao a

121oC por 15 minutos, antes da adio das solues de microelementos e vitaminas.

60
 Soluo de microelementos (mg l-1 gua destilada): ZnSO4.7H2O 10.0; MnCl2.4H2O 3.0;

H3BO3 30.0; CoCl2.6H2O 20.0; CuCl2.2H2O 1.0; NiCl2.6H2O 2.0; Na2MoO4.2H2O 3.0. Esterilizao

a 121oC por 15 minutos.

Solues vitamnicas: soluo de biotina 0.0015%: 1.5 mg de biotina; 100 ml de gua

destilada. Soluo de tiamina 0.005%: 5.0 mg de tiamina-HCl; 100 ml de gua destilada.

Esterilizao por filtrao em membrana Millipore 0.22 m.

2.3. Substrato

O efluente de abatedouro avcola utilizado como substrato para o crescimento microbiano foi

coletado de manh na empresa Frango Sertanejo, localizada no municpio de Guapiau- SP, aps

passar pelas operaes industriais de gradeamento, decantao e flotao. O resduo foi mantido em

gales de plstico, a 25oC, sob abrigo de luz por aproximadamente 3 horas antes de iniciar o

tratamento com a finalidade de conservao, evitando-se a proliferao de microrganismos e

alteraes fsico-qumicas.

2.4. Determinao da curva de crescimento de R. gelatinosus

2.4.1. Preparo do efluente (substrato)

O efluente foi inicialmente tratado seguindo as seguintes etapas: filtrao em filtro rpido de

200 mesh (Gardena 1731) com vazo de 3000 l h-1, para a retirada de partculas grosseiras,

desnatamento (desnatadeira Turbinave) com presso de 2 kgf cm-2 e vazo de 500 l h-1, para a

61
remoo da gordura e pasteurizao (tanque de pasteurizao lenta Incomar) durante 30 minutos a

650C, para a eliminao de microrganismos competidores do crescimento e agentes patognicos.

Os parmetros de filtrao, desnatamento e pasteurizao do efluente foram padronizados de

acordo com as anlises microbiolgicas e fsico-qumicas do resduo in natura e aps o tratamento.

As anlises microbiolgicas realizadas para verificar a eficincia dos processamentos trmicos

incluram as seguintes anlises: contagem global (CG), contagem de coliformes totais (CT) e

coliformes fecais (CF), contagem de bolores e leveduras (BL), contagem de Staphylococcus aureus e

pesquisa de Salmonella sp (Vanderzant and Splittstoesser, 1992). As anlises fsico-qumicas para a

verificao das operaes de tratamento do efluente abrangeram: medida de pH, slidos totais,

turbidez, leos e gorduras (Standard, 1998).

2.4.2. Preparo do inculo

Uma alada de uma cultura de R. gelatinosus proveniente de meio de Pfennig semi-slido foi

transferida para um tubo de ensaio de 30 ml contendo o mesmo meio na forma lquida, que foi

mantido sob anaerobiose, a 30 20C e luminosidade de 1.400 200 lux, durante 10 dias. Este

cultivo foi utilizado como inculo para a determinao das curvas de crescimento da bactria no

efluente (absorvncia x tempo e peso seco x tempo) e no meio sinttico de Pfennig (absorvncia x

tempo).

62
2.4.3. Preparo da curva de crescimento

Para a determinao das curvas de crescimento da bactria, 1% (v/v) do inculo preparado foi

transferido para 10 tubos de ensaio de 30 ml com tampas de rosca. Estes tubos foram mantidos sob

anaerobiose, a 30 2oC e 1.400 200 lux, durante 10 dias. Nesse perodo, a cada dia, o contedo de

um tubo de ensaio foi utilizado para a leitura ptica em absorvncia a 600 nm em espectrofotmetro

(Femto 432) e para a determinao da densidade bacteriana por gravimetria. Para a determinao

gravimtrica, cinco ml das amostras dos tubos de ensaio foram centrifugados (centrfuga Revan 5500

A) a 3000 rpm, durante 20 minutos. Em seguida, o sobrenadante foi descartado e, ao resduo

restante, foram adicionados cinco ml de gua destilada para promover uma ressuspenso. O novo

contedo foi centrifugado a 3000 rpm, durante 20 minutos e, aps a centrifugao, o sobrenadante

foi novamente descartado. Cinco ml de gua destilada foram adicionados ao resduo final e, aps a

homogeneizao, todo este volume foi transferido para cadinhos de porcelana livres de umidade e de

pesos conhecidos, e mantidos em estufa a 105oC at a obteno de peso constante.

2.5. Determinao da produtividade do processo de obteno da biomassa de R. gelatinosus

2.5.1. Preparo do cultivo

Um inculo de R. gelatinosus preparado inicialmente em meio de Pfennig (conforme citado

anteriormente) foi adicionado com 1% (v/v) a 100 l do efluente tratado. O cultivo foi realizado em

colunas de vidro sob temperatura ambiente (30 20C), luminosidade fornecida pela luz do dia e por

lmpadas incandescentes (100 W) e fluorescentes (40 W), durante 10 dias.

63
2.5.2. Preparo da biomassa

O cultivo foi concentrado por meio de microfiltrao em sistema com unidade de filtrao de

0.75 m2, porosidade de 0.2 micra, vazo de 1.5 m3 h-1 e presso de 1.5 bar (Frings). Em seguida, o

retentado obtido foi centrifugado (centrfuga Beckman J 6M) com velocidade de 4.200 rpm durante

20 minutos a 10oC. O permeado foi descartado e o resduo obtido foi congelado e submetido

liofilizao (liofilizador Liobras L 101) a -400C durante 24 horas, at dar origem a uma biomassa em

forma de p, de cor prpura avermelhada.

2.5.3. Produtividade do processo de obteno de biomassa

A produtividade do processo de obteno foi obtida de acordo com Aiba (1982) atravs da

frmula:

Produtividade = g de biomassa (massa seca) l-1 d-1

2.6. Determinao da capacidade despoluente do processo de obteno de biomassa de R.

gelatinosus

A capacidade despoluente do cultivo da bactria fotossintetizante R. gelatinosus foi medida

atravs da anlise de Demanda Qumica de Oxignio (DQO) pelo mtodo da oxidao do cido

cromossulfrico (COD cell test - Merck ) no substrato cru e no permeado gerado pelo processo de

microfiltrao do cultivo.

64
3. Resultados e Discusso

3.1. Anlises microbiolgicas e fsico-qumicas do substrato in natura e aps tratamento

Os resultados das anlises microbiolgicas e fsico-qumicas do substrato in natura e aps

tratamento podem ser visualizados nas Tab. 1 e 2, respectivamente.

Tabela 1 - Anlises microbiolgicas do efluente in natura e aps tratamento

Contagem Coliformes Coliformes Bolores e Salmonella sp Staphylococcus

global totais fecais Leveduras (em 25g) aureus
UFC/ml UFC/ml UFC/ml UFC/ml

Substrato 1.9x1011 1.1x1010 > 1.1x1010 2.7x106 ausncia negativo

in natura

Substrato tratado <1.0 3.6x104 zero 5.0x101 ausncia negativo

o
(60, 65 e 75 C), <1.0 zero zero <1.0
respectivamente <1.0 zero zero <1.0

Tabela 2 - Anlises fsico-qumicas do efluente in natura e aps tratamento

pH Slidos totais Turbidez leos

-1
(mg l ) (UT) e gorduras
(mg l-1)

Substrato 5.5 1.872 85 2.56 x 103

in natura

Substrato 6.8 1.036 55 278

tratado

65
 Com base nos resultados das anlises microbiolgicas, encontrados na Tab. 1, o parmetro de

pasteurizao escolhido como ideal foi de 65oC/30 minutos. O cultivo realizado no efluente tratado

dessa maneira apresentou colorao vermelho acastanhado, cor caracterstica resultante do

desenvolvimento de R. gelatinosus e produo de pigmentos, o que indica sua capacidade de

crescimento frente a competidores que possam ter restado aps o processo trmico, bem como a

preservao de nutrientes necessrios ao metabolismo da bactria. De acordo com os resultados das

anlises fsico-qumicas apresentados na Tab. 2, houve uma diminuio dos slidos totais, da

turbidez e de leos e gorduras e um aumento de pH em decorrncia do tratamento aplicado ao

efluente. possvel observar que o tratamento realizado contribuiu para a reduo de partculas

slidas, fornecendo um substrato mais lmpido, facilitando a passagem de luz para o crescimento da

bactria fotossintetizante R. gelatinosus. O aumento de pH pode ser explicado pelo processo

adequado de desnatamento que provocou a remoo da gordura (cidos graxos), alm da eficincia

da pasteurizao que possibilitou a eliminao de microrganismos como bolores e leveduras,

normalmente encontrados em ambientes cidos. Pode-se dizer que as anlises microbiolgicas e

fsico-qumicas indicaram um tratamento do resduo adequado para o crescimento do microrganismo

(Paulino et al., 2005).

3.2. Determinao da curva de crescimento de R. gelatinosus

Na curva de crescimento de R. gelatinosus em que o substrato utilizado foi o efluente tratado

(Fig. 1), no se observa a presena da fase de adaptao (lag). Este comportamento pode ser

explicado devido capacidade da bactria em utilizar-se rapidamente dos nutrientes presentes no

efluente tratado, sendo estes suficientes para o crescimento do microrganismo, tornando

desnecessria a presena da fase lag normalmente encontrada em crescimentos bacterianos. Alm

66
disso, os processos de tratamento do substrato como o desnatamento, a filtrao e a pasteurizao

utilizados neste trabalho mostraram-se adequados, pois preservaram os nutrientes necessrios para o

crescimento microbiano. Da mesma forma, estudos realizados por Azad et al. (2003) indicaram que

a remoo de partculas slidas no resduo de processamento de sardinhas no alterou os nutrientes

essenciais nem afetou o crescimento de Rhodovulum sulfidophilum no substrato.

1,4
1,2
Absorvncia (600nm)

1
0,8
0,6 y = -0,0254x 2 + 0,3608x - 0,0817
0,4 R2 = 0,9083
0,2
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Dias

Figura 1. Curva de crescimento de R. gelatinosus em efluente de abatedouro avcola

Na curva de crescimento de R. gelatinosus em meio sinttico Pfennig (Fig. 3), observa-se a

presena da fase de adaptao da bactria ao meio de cultura e o consequente aumento dos dias de

cultivo para a adaptao e crescimento da bactria. Considerando que R. gelatinosus encontrada

naturalmente em ambiente de efluente de abatedouro avcola, pode-se dizer que ocorre uma maior

adaptao e crescimento da bactria neste substrato quando comparados ao crescimento em meio

sinttico apenas (Ponsano et al., 2003).

Na curva de crescimento de R. gelatinosus (peso seco x tempo), utilizando-se o efluente

tratado como substrato (Fig. 2), o crescimento medido por meio do valor de peso seco (g l-1) da

clula bacteriana apresentou resultado semelhante quando comparado aos valores de absorvncia

67
(Fig. 1), o que comprova a eficincia da metodologia empregada, alm da capacidade da bactria em

crescer sob as condies descritas no efluente tratado.

0,21
0,18
0,15
Peso seco (g/l)

0,12
0,09 y = -0,0015x 2 + 0,0197x + 0,1109
0,06 R2 = 0,828
0,03
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Dias

Figura 2. Curva de crescimento de R. gelatinosus em efluente de abatedouro avcola

0,7
0,6
Absorvncia (600nm)

0,5
0,4
0,3
0,2 y = 0,2051Ln(x) + 0,0082
0,1 R2 = 0,6855

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Dias

Figura 3. Curva de crescimento de R. gelatinosus em meio de Pfennig

O crescimento de R. gelatinosus em efluente avcola apresentou pico mximo ao redor do

oitavo dia com valores de absorvncia e peso seco iguais a 1.177 e 0.18 g l-1, respectivamente (Fig. 1

e 2). No inculo utilizando apenas meio de Pfennig, R. gelatinosus apresentou estabilidade de

crescimento entre o 5 e o 7 dia, com valor mdio de absorvncia de 0.478 (Fig. 3). No foi possvel

realizar a curva de crescimento de R. gelatinosus com valores de peso seco no meio de Pfennig

68
devido ao menor crescimento microbiano apresentado pela bactria nesse substrato quando

comparado ao efluente de abatedouro avcola.

Azad et al. (2003) utilizou a bactria fototrfica Rhodovulum sulfidophilum em efluente de

processamento de sardinha objetivando a produo de biomassa. Os valores de biomassa (g l-1)

foram apresentados em nveis de 10, 20 e 30% de inculo sob duas condies de cultivo bacteriano:

em efluente de sardinha + meio de glutamato (GMM) e somente no efluente. A primeira condio

apresentou maiores valores de biomassa aps 3 dias de cultivo e, em nenhuma delas foi possvel

observar a presena da fase lag (Azad et al., 2003). Neste estudo, o autor pde concluir que o

crescimento da bactria desenvolvido no efluente de processamento de sardinha era mais expressivo

quando o inculo era preparado em GMM do que quando recebia o inculo preparado com o prprio

resduo.

Getha et al. (1998) mencionou o crescimento da bactria fototrfica prpura no sulfurosa

Rhodopseudomonas palustris em efluente de processamento de sagu na proporo 50% (v/v)

efluente/meio de cultura e encontrou uma produo de biomassa de 2.5 g l-1 observada aps 4 dias de

cultivo. Prasertsan et al. (1997), inoculando a bactria fotossintetizante Rhodocyclus gelatinosus em

efluente de pescado em nvel 10% (v/v), sob anaerobiose e luminosidade de 3.000 lux, obteve uma

produo de 6.4 g l-1 de biomassa. Em estudos apresentados por Takeno et al. (1999), a bactria

fotossintetizante Rhodobacter sphaeroides IL 106 cultivada em guas residurias provenientes da

produo de ostras gerou uma produo de 3.32 g l-1 de biomassa, contendo carotenides e

ubiquinona, aps 4 dias de cultivo.

Comparando os valores de biomassa encontrados neste experimento com os citados por

diferentes autores, pode-se dizer que a produo de massa celular em peso seco (g l-1) apresenta

valores distintos de crescimento em diversos substratos e diferentes condies de cultivo nos

microrganismos fototrficos.

69
3.3.Determinao da produtividade de obteno da biomassa de R. gelatinosus

A partir de 100 litros de resduo de abatedouro avcola, a produtividade do processo de

obteno de biomassa de R. gelatinosus alcanou um valor de 0.085 g de biomassa (massa seca) l-1

d-1.

A produtividade, apesar de baixa, foi maior do que a encontrada por Ponsano (2000) que

observou uma produtividade de 0.063 g de biomassa (massa seca) l-1 d-1pela bactria R. gelatinosus

em resduo avcola sem a utilizao do sistema de microfiltrao. A introduo do sistema de

microfiltrao neste estudo promoveu uma concentrao da amostra com uma melhor recuperao

de biomassa, possibilitando o aumento da produtividade do processo utilizado e, alm disso, tornou-

se um aspecto diferencial no quesito produtividade quando comparado ao estudo realizado por

Ponsano (2000).

Zheng et al. (2005), utilizando a levedura C. utilis OZ 993 em resduo de leo de salada para

produo de biomassa como origem protica para utilizao em rao, observou uma produtividade

de 0.96 kg biomassa kg-1 leo-1 d-1. C. utilis freqentemente cultivada em resduos de

processamentos industriais para a produo de biomassa microbiana devido capacidade de utilizar

rapidamente compostos de carbono (Zheng et al., 2005). Cultivos da microalga Scenedesmus

obliquus realizados sob controle de ciclos simulados de luz e temperatura em resduo de gua

residuria artificial produzido em laboratrio atravs da adio de nutrientes qumicos alcanaram

uma produtividade de biomassa de 39.3 e 25.2 mg l-1 d-1 nas diluies de 30 e 40%, respectivamente,

em estudos realizados por Voltolina et al. (2005).

A partir dos resultados apresentados, pode-se inferir que a produtividade do processo de

obteno de biomassa de C. utilis mais expressiva do que a produzida do processo descrito neste

estudo, enquanto que a microalga Scenedesmus obliquus demonstra o inverso. Pode-se dizer que a

70
capacidade de produo de biomassa varia entre os microrganismos, e que as bactrias

fotossintetizantes possuem um metabolismo com menor capacidade de produo de biomassa

(Balloni et al., 1982).

Um outro fator capaz de influenciar a produtividade de obteno da biomassa em

microrganismos fototrficos a intensidade luminosa (Bhosale, 2004). Bhosale (2004) exemplifica a

levedura Rhodotorula glutinis como um microrganismo capaz de promover uma maior produo de

carotenides e um maior crescimento com a elevao da intensidade luminosa.

3.4. Determinao da capacidade despoluente de R. gelatinosus

O cultivo de R. gelatinosus em nvel de 1% (v/v) inculo/efluente tratado, possibilitou uma

reduo de 91% de DQO no efluente de abatedouro avcola.

Cultivos preparados com inculo de 10% (v/v) de Rhodopseudomonas palustris em meio

sinttico/resduo sagu promoveram uma reduo de 77% na DQO do efluente de sagu (Getha et al.,

1998). Estudos realizados por Prasertsan et al. (1997) utilizando a bactria R. gelatinosus em

efluente de pescado observaram uma reduo de 66% e 46% na DQO depois de 5 e 7 dias,

respectivamente. Sob diferentes condies de cultivo, Rhodovulum sulfidophilum cultivada em

resduo de processamento de sardinha com inculo de 15% (v/v), apresentou uma reduo de 76 e

68% na DQO aerobicamente no escuro e anaerobicamente na presena de luz, respectivamente. Sob

condies aerbicas no escuro com inculo de 15% (v/v) a 200, 300 e 400 rpm de agitao, a

reduo de DQO foi de 78, 69 e 73%, respectivamente (Azad et al., 2001).

Choorit et al. (2002), para promover crescimento bacteriano com uma maior reduo de DQO

no resduo de processamento de ltex, misturou culturas de bactrias prpuras no sulfurosas e

obteve reduo de 57% de DQO aps 40 horas de cultivo com culturas mistas, enquanto que, com

71
culturas isoladas, havia conseguido uma reduo na faixa de 20-33%. Uma significante diminuio

de contedos poluentes foi observada quando Safonova et al. (2004) utilizou combinao de alga-

bactria para o biotratamento de resduos industriais, obtendo uma reduo de 51% da DQO. Estes

resultados foram comparativamente menores do que o promovido por R. gelatinosus neste estudo.

Alm disso, a proporo de inculo utilizada (1%) neste trabalho foi menor do que a dos trabalhos

apresentados dentro desse contexto.

A utilizao da biomassa de R. gelatinosus para a promoo da pigmentao de produtos de

avicultura poder torn-los mais atrativos para o consumidor, possibilitando a substituio dos

pigmentos sintticos normalmente utilizados. Alm disso, o cultivo da bactria pode ser proposto

como uma alternativa para o tratamento despoluente nas indstrias avcolas geradoras de resduos

aquosos industriais.

4. Concluso

O tratamento do efluente mostrou-se adequado para o crescimento de Rubrivivax gelatinosus

no substrato. A curva de crescimento da bactria no substrato tratado indicou maior crescimento

celular no oitavo dia de cultivo. Os valores de produtividade alcanados foram compatveis com o

esperado para o crescimento de bactrias. O processo de cultivo realizado foi capaz de promover a

reduo da carga poluente do resduo de abatedouro avcola.

72
 Agradecimentos

Os autores agradecem a Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo Fapesp

pelo financiamento (03/06786-4), a Universidade Estadual Paulista - Unesp pela formao

acadmica e a empresa Frango Sertanejo de Guapiau-SP pelo fornecimento do resduo.

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