6.

Cmo crear vida sinttica

Para qu crear un genoma sinttico?
1. Para definir el nmero mnimo de genes que requiere una clula
2. Para probar que se puede hacer, demostrar que tenemos
conocimientos suficientes para disear un genoma.
3. Porque si no lo podemos hacer es que no lo entendemos.
4. Porque de esto se pueden sacar muchas tecnologas que se pueden
vender para sacar rendimiento econmico.

Aproximacin
Lo que se ha hecho es una analoga de lo que es una
clula con un ordenador, donde el genoma es el
sistema operativo mientras que el citoplasma es el
hardware.
El citoplasma contiene todas las partes
(ribosomas, enzimas, protenas) necesarias
para expresar la informacin contenida en el
genoma.
El genoma contiene toda la informacin
necesaria para producir el citoplasma, el
entorno celular y para reproducirse.
Uno no es posible sin el otro.
Lo que conseguimos es que si cambiamos el genoma, vamos a transformar
la clula.

Pasos a seguir
Lo que pretendan hacer a la hora de crear un genoma sinttico era
sintetizar unos genes, ensamblarlos e ir unindolos hasta crear el genoma
completo. Despus solo faltara introducirlo en una clula y comprobamos
que se expresa correctamente.

POR QU UNA CLULA SINTTICA?

A da de hoy no es posible sintetizar de cero una clula entera, no podemos
ensamblar todos los componentes por separado, es demasiado difcil. Por
eso lo que hacemos es sintetizar un genoma e instalarlo en el citoplasma de
una clula viva, con lo que conseguimos que el genoma que nosotros le
hemos aadido sea el que controla y dirige la clula. As conseguimos una
clula sinttica.

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ESTRATEGIAS
Tenemos dos estrategias diferentes para llegar al objetivo:
1. Un ensamblaje por partes, que ya hemos dicho que hoy en da es
prcticamente imposible.
2. Introducir un genoma sintetizado por nosotros en una clula husped.
De esta forma la clula conseguira tener dos genomas, pero esto no
es estable y no le gusta a la clula por lo que se divide y se separan
los dos genomas, consiguiendo as una clula con el genoma que
nosotros hemos sintetizado.
a. Es muy parecido a cuando fusionamos clulas de ratn y de
humano, que al principio tienen 86 cromosomas, pero es muy
inestable y se van perdiendo fragmentos.
b. Al dividirse se va a perder uno de los genomas al azar, por lo
que despus tenemos que seleccionar las clulas que nos
interesen. Segn se vayan a ir dividiendo las clulas se van a ir
expresando los genes del genoma sinttico y se va a ir
transformando la clula. El problema es que se pueden quedar
restos del otro genoma, por eso al final es necesario secuenciar
para comprobar que realmente el genoma que tenemos se
corresponde solo con el que nos interesa. Es cuestin de
probabilidad por eso lo que hacemos en un gran nmero de
clulas para conseguir por lo menos en un caso lo que nos
interesa.

Mycoplasma genitalium
Este trabajo se hizo por primera vez con la bacteria Mycoplasma genitalium,
ya que tiene el genoma ms pequeo conocido de cualquier bacteria que se
capaz de tener vida de manera independiente. Solo tiene 485 genes
codificantes de protenas y 43 genes de RNA. Adems de esos genes 100
son protenas no esenciales, mientras que todos los genes de RNA s son
esenciales.

PLANTEAMIENTOS
El proyecto fue elaborado por unos estudiantes que se plantearon lo
siguiente antes de empezar:
No saban cmo disear un genoma de cero, por lo que decidieron
sintetizar un genoma que ya saban que funcionaba, que fue el caso
de Mycoplasma genitalium, en esta fase no hubo una seleccin de
genes, solo estn copiando.
Haba que asegurarse de que el genoma completo tena las
secuencias correctas, ya que un error en una base puede suponer un
cambio grande en un gen. Esto tiene que ver con la tecnologa que
usemos, por ejemplo en las PCR por cada 1000 bases hay un error,
pero si tenemos que recuperar un genoma de 1M de bases nos vamos
a equivocar muchas veces, por lo que en la prctica hay que tener
mucho cuidado con estas cosas.
o Para ello volvieron a secuenciar el genoma y corregir unos 30
errores, donde la mayora eran mutaciones letales.
Aadieron una marca de agua a las secuencias, esto es algo que no
ocurre en la naturaleza, lo que les permita detectar el cromosoma
sinttico.

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 Para poder llevarlo a cabo dividieron el genoma en fragmentos de 5-
6kb en cassettes y luego los ensamblaban entre ellos. Una vez
sintetizado el genoma empezaron a plantearse eliminar genes.

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CMO LO ENSAMBLAMOS?

Qumicamente se pueden sintetizar secuencias de DNA pero de menos de

60pb, debido a que cuanto ms larga sea la secuencia mayor va a ser la
probabilidad de generar un error, as que se sintetiza a bases de fragmentos
que se van solapando.
Esto es relativamente fcil, pero tenemos que tener cuidado con las
secuencias repetitivas o alguna mutacin, ya que nos pueden generar
problemas a la hora de ensamblar.

Una vez que lo hemos sintetizado lo que tenemos que

hacer es mezclar las secuencias con la Taq polimerasa
(una polimerasa exonucleasa) y una ligasa que nos van a
ensamblar las secuencias sintticas, as conseguimos las
secuencias circulares.
Hay que asegurarse de que se une de manera
correcta.

Cmo se da este proceso?

1. Primero se superponen las dos secuencias.

2. Despus la exonucleasa corta los extremos de algunos de los
fragmentos para que se puedan unir por complementariedad. Tras un
tiempo tenemos que inhibir la exonucleasa para que no elimine
demasiado de las secuencias.
3. Una vez que hibridan, la polimerasa se encarga de rellenar los huecos
que ha generado la exonucleasa.
4. Finalmente la ligasa une los extremos.

Aunque parece fcil, no lo es tanto. Una vez que lo tienes hecho, se puede
conseguir una especie de automatismo, pero hay muchos detalles que hay
que tener en cuenta para que todo salga bien.

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 Mediante los pasos que acabamos de ver se van
haciendo fragmentos de 5-6kb, que
posteriormente se van a ir juntando en E. coli,
mediante recombinacin homloga,hasta llegar al
genoma completo.

Sin embargo, se dieron cuenta que haba un

problema con E. coli y es que no acepta
fragmentos de ms de 72kb, por lo que a partir de
este punto no se podan emplear los BACs para
insertar secuencias.

Cmo se pudo solucionar este problema prctico?

Para solucionar el problema decidieron pegar los fragmentos de 72kb
mediante recombinacin homloga (como se vena haciendo hasta ahora),
pero no en E. coli sino en la levadura Saccharomyces.

Con esta solucin se consiguieron ensamblar todos los fragmentos que

venan de E. coli. Sin embargo, para conseguir que se duplicara en
Saccharomyces se necesitaba una secuencia propia de sta levadura, que
se aadi tambin por recombinacin homloga. El problema es que hemos
aadido una secuencia al genoma que no es lo que nosotros queramos al
principio.
Quitando esta secuencia, el resto del genoma era exacto al original
de Mycoplasma.

Mediante estos pasos de recombinacin

homloga en E. coli y en levadura hemos
conseguido ensamblar todo el genoma
sinttico.

INTERCAMBIO DE GENOMAS

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Ahora tenemos que sacar el genoma sinttico de Saccharomyces y meterlo
en una clula de Mycoplasma.Pero cmo podemos sacar un genoma
completo de una clula sin que se rompa?
Para ello lo que se plantea es utilizar diferentes protenas como
detergentes y proteinasas K, aunque el proceso es complicado pues
no sabemos la concentracin idnea para no romper las histonas.

PROBLEMAS
Es problema es que Mycoplasmagenitaliumse divide muy lento, por lo que
hace difcil comprobar si realmente funciona. Es por esta razn por la que se
acaba introduciendo el genoma en otro organismo, uno que se divida ms
rpido pero perteneciente al gnero mycoplasma ya que el codn STOP UGA
codifica para triptfano en estas bacterias.
Los organismos iban a tener distintos genomas, pero eran bastante
similares por lo que pensaron que no era tan grave.

Plantearon aadir el opern Lac Z al genoma donador para poder diferenciar

entre las clulas recipientes que lo tuvieran y las que no. Las colonias azules
eran aquellas que expresaban Lac Z y por tanto tenan el genoma donado.
Como ya hemos explicado antes, se tiene que secuenciar el genoma
para comprobar que realmente todo ello es de mycoides y no hay
mezcla entre dos genomas. Adems de la secuenciacin vieron que
haba antgenos de mycoides expresndose en la membrana.
Adems hicieron un anlisis protemico y concluyeron que estas
clulas presentaban el mismo patrn que las originales. Tenan la
misma forma, formaban los mismo tipos de colonias, etc.

Lo que pasa es lo siguiente:

El mayor miedo que tenan era que se dieran procesos de recombinacin

entre los dos genomas, pero eso no ocurria pesar de que la homologa
entre los genomas era relativamente alta.
El experimento para ver si se quitaban los genomas lo hicieron con
los genomas naturales solo para probarlo.

Otro problema es que se cambiaran patrones epigenticos, como las

metilaciones provocando que cambiase el metabolismo. Para ello hicieron
pruebas para comprobarlo:

Con esto se dieron cuenta de que s podan llevar a cabo el experimento.

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RESULTADOS
Al final lo que ha pasado es que hemos cogido el genoma de una especie, lo
hemos sintetizado y lo hemos estado pasando por otras especies para
ensamblarlo, comprobarlo etc. Lo que nos indica que de verdad el genoma
es el sistema operativo por lo que crear organismos sintticos es una
posibilidad real, ahora solo necesitamos tener el conocimiento suficiente
para crear lo que necesitamos.

Por qu es til?
Porque podemos utilizar y crear algunos organismos que hagan cosas
interesantes para conseguir un propsito que queramos. Las posibilidades
biotecnolgicas detrs de esta tecnologa es muy importante, adems de
que nadie puede decirte que no lo patentes pues lo has creado a travs de
un ordenador.

Watermark
Proponen poner una marga gentica para los genomas sintticos. Writen in
new DNA code biologically neutral. (Esto es un ejemplo de un proyecto, no
creo que lo pregunte)

Objetivos a corto plazo:

- Generalizar las herramientas para poder usarlas con cualquier otra
bacteria
- Minimizer el genoma del mycoplasma
- Racionalizar el orden del genoma
- Entender lo que hace cada gen esencial
- Ser capaces de modelar una clula de forma computacional
- Crear clulas desde cero y utilizarlas para nuevas aplicaciones:
combustibles, compuestos farmacuticos, textiles...