CRIOPRESERVACIN DE SEMEN EN ESPECIE ASNAL

Sebastin Osorio Martnez

Alejandro Patio Prez
Juan Pablo Valencia Gmez
Estudiantes de Tecnologa Agropecuaria

Juan David Montoya Pez

Ing. Agropecuario, M.Sc Ciencias Agrarias
Docente

Juan Esteban Duque

Ing. Agropecuario, M.Sc Ciencias Agrarias
Docente

Informe Prctica #3: Evaluacin de Semen equino para su posterior

criopreservacion
Politcnico J.I.C

POLITECNICO COLOMBIANO JAIME ISAZA CADAVID

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
MEDELLN ANTIOQUIA
2016
INTRODUCCIN
En Colombia, la especie equina es cada da ms importante, debido a su
amplia participacin en el trabajo, en actividades deportivas y de
exposicin, de acuerdo a los diferentes andares. La reproduccin juega
un papel fundamental en el mejoramiento gentico de dicha especie,
por lo cual, la posibilidad de disponer de material seminal de excelente
calidad para procedimientos, como la inseminacin artificial, permite
alcanzar altos estndares de eficiencia reproductiva (Restrepo G. et, al.
2013).
El uso de la inseminacin artificial (IA) en equinos ha progresado en las
ltimas dcadas debido al desarrollo de diferentes metodologas para la
preservacin de semen, tanto en estado fresco, refrigerado como
congelado. A pesar de esto, las tasas de preez que se obtienen cuando
se utiliza semen equino criopreservado frente a semen fresco o
refrigerado, son inferiores y las investigaciones actuales se enfocan
mayoritariamente a obtener mejores resultados (Prado Acua J.P. 2011).
La criopreservacin de semen es uno de los procedimientos ms
importantes en el desarrollo de biotecnologas para la reproduccin
asistida, como la inseminacin artificial (IA) y la transferencia de
embriones. Esta tecnologa permite una mxima distribucin y una
adecuada disponibilidad de material germinal de ejemplares de inters
mediante su conservacin a largo plazo lo cual favorece el mejoramiento
gentico para rasgos de valor comercial en la especie, a travs de la
seleccin y de los cruzamientos dirigidos. Para la especie equina es an
limitado el uso de semen criopreservado, debido a una considerable
reduccin post-descongelacin de su capacidad fecundante respecto al
semen fresco (Usuga A. et, al. 2014).
Actualmente la criopreservacin seminal equina se realiza mediante el
uso de nitrgeno lquido (NL). Las ventajas de usar semen congelado
para ser utilizado en IA son: disminucin de los costos de transporte
(ms barato es trasladar un contenedor de NL que un semental); menor
estrs y costo de transporte de la yegua. Cuando se utiliza NL, se logran
temperaturas de -196C, donde no hay reacciones bioqumicas dentro
de la clula y no se ha comprobado que pueda haber cambios de ndole
gentico. Los principales daos que se generan cuando se congelan
clulas son la formacin de cristales de hielo intracelular y la
descompensacin de electrolitos y solutos (Prado Acua J.P. 2011).
La composicin de los diluyentes para la criopreservacin del semen
equino es determinante en la criotolerancia y la capacidad fecundante
post-descongelacin de las clulas espermticas. Se han explorado
numerosas alternativas para mejorar la fertilidad del semen equino
criopreservado. Se han evaluado crioprotectores alternativos como el
glicerol, el etilenglicol u otras molculas que por su bajo peso molecular
penetran con mayor facilidad las membranas y, por lo tanto, poseen
menor toxicidad osmtica, como la metilformamida (MF) y la
dimetilformamida (DMF). Asimismo, se ha estudiado la suplementacin
de los diluyentes con sustancias proteicas que actan como
crioprotectores extracelulares, tales como la yema de huevo, la
albmina srica bovina, el suero equino, el suero bovino, la protena de
soya, el alcohol polivinlico y la leche descremada ultra-pasteurizada
(Usuga A. et, al. 2014).
Tradicionalmente, la evaluacin del semen se ha basado en el trabajo
manual de personas que, debido a su capacitacin y su experiencia, han
obtenido resultados prcticos y satisfactorios. Con el fin de predecir la
fertilidad del semen equino, el anlisis de rutina es basado en la
evaluacin macroscpica-fsica del eyaculado y en la evaluacin por
microscopa de los espermatozoides; sin embargo, el anlisis
convencional ha sido poco efectivo en la prediccin de la fertilidad del
semen. El anlisis de semen asistido por computador (CASA) ha
permitido una medicin objetiva de muchos parmetros de la movilidad
y la morfologa de semen, ofreciendo mediciones ms confiables,
imparciales y repetibles, respecto al examen visual, pero la aplicacin
prctica del sistema CASA, como parte del mejoramiento en la calidad
de los anlisis del semen del caballo, se ha visto limitada por aspectos,
como la carencia de valores estndar definidos, para lo que es normal y
anormal en el movimiento del espermatozoide, al uso de referentes
seleccionados sin criterios estadsticos (Restrepo G. et, al. 2013).
Es conocido que los procedimientos de congelacin y descongelacin
inducen una serie de efectos nocivos en las clulas espermticas y
consecuentemente una baja tasa de preez. En equinos, se ha
demostrado que en la etapa de post-descongelacin es importante
utilizar procedimientos de seleccin de espermatozoides que permitan
recuperar una poblacin espermtica altamente funcional y condiciones
indispensables para lograr tasas ptimas de concepcin (Cabrera P. et,
al. 2014).
Tanto la refrigeracin como el almacenamiento de semen en NL, pueden
generar daos irreversibles en la membrana plasmtica, causando ya
sea muerte celular o cambios parecidos a los que se ven durante la
capacitacin espermtica, que dificultan o impiden su capacidad para
interactuar con el ovocito (Prado Acua J.P. 2011).
METODOLOGIA
La prctica de criopreservacion se realiz el 14 de octubre del 2016 en el
Politcnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid sede bello, ubicado en el
barrio cabaas. Donde se tomaron los parmetros necesarios para la
criopreservacion del semen equino.
En primer lugar se realiz la colecta del semen en una especie asnal
llamado cachirulo, campen nacional (Ver foto 1). Esta colecta tuvo lugar
en la finca la primavera, vereda el cabildo, municipio de Girardota donde
se desarroll la colecta por medio de vagina artificial, no se maneja
electroyaculador, mano enguantada como se observada en las otras
especies recolectadas anteriormente. Funcionalmente es ms fcil la
colecta y el animal est acostumbrado a la misma.
FOTO #1. Asno criollo cachirulo, campeon nacional.
Se empez adecuando la vagina artificial con agua a una temperatura
de 40C, se instal un filtro y una bolsa donde llega el eyaculado (Ver
foto 2). Tambin se realiz el lavado y secado del pene con agua tibia
para evitar contaminacin en la colecta del semen, contiguo se dispuso
a la yegua amarrada y con la cola vendada para evitar lastimar el pene
del asno a la hora de la monta. (Ver foto 3)

FOTO #2. Vagina artificial

FOTO #3. Asno desarrollando el proceso de recoleccin seminal
Obtenido el volumen final se analizaron las caractersticas
macroscpicas del eyaculado (Ver foto 4) y se ejecutaron dos procesos,
el primero fue una pajilla para un envo donde se agreg diluyente
equipro, con una concentracin mnima de 500 millones de
espermatozoides teniendo en cuenta que la temperatura del diluyente
deba de ser igual a la temperatura del semen. Terminado el proceso se
empaco en una nevera de icopor para su posterior viaje.

FOTO #4. Semen en fresco observado en el microscopio durante la

colecta en campo
El segundo proceso fue el transporte del semen para desarrollar la
criopreservacion, en dispositivo utilizado para el transporte de semen
equino llamado equitainer a una temperatura de 8-10C para su
siguiente proceso. Estando en el laboratorio, se realizan las pruebas
microscpicas del eyaculado, como movilidad, vitalidad, morfologa,
integridad de membrana. Luego se realizaron clculos para que cada
muestra tuviera la concentracin necesaria de 10 pajillas y se centrifugo
a 3000 rpm durante un periodo de 30 minutos para separar los
espermatozoides del diluyente de conservacin (Ver foto 5).

FOTO #5. Semen centrifugado durante 30 minutos a 3000 rpm

Posteriormente se agreg el diluyente de conservacin (yema de huevo
5%, DMF 5%, diluyente base 90%) y se llev a la mquina de empaque y
sellado de pajillas con un volumen de 0.5 ml. Terminado este proceso se
revisaron las pajillas obtenidas, ya que algunas no llenaron y otras
quedaron mal selladas (Ver foto 6).

FOTO #6. Mquina de empaque y sellado de pajillas

Teniendo las pajillas, se desarrolla la congelacin mediante dos mtodos.
El primero fue una congelacin rpida con vapores de nitrgeno en el
cual se utiliz una nevera de icopor con un poco de nitrgeno, donde se
introdujeron las pajillas con una base metlica para evitar directamente
el contacto con el lquido. Despus de empezado este mtodo, durante
periodos de 5 minutos se destapaba la nevera y se soplaban los vapores.
El segundo mtodo fue un congelador programable marca Crysalys, un
instrumento que nos permite bajar la temperatura del semen de una
manera controlada evitando un cambio brusco del semen, el cual nos
puede afectar (Ver foto 7). Por ltimo se llev a un contenedor para
conservacin de semen y se deja el tiempo necesario hasta su
utilizacin (Ver foto 8).

FOTO #7. Congelador programable marca Crysalys.

FOTO #8. Contenedor para la congelacin de semen.
Para la descongelacin se pararon las pajillas a un bao Mara por un
tiempo de 1 minuto, y se realizaron pruebas microscopias de pos-
congelacin, morfologa y movilidad.
 RESULTADOS
1. resultados del anlisis arrojado por el sistema CASA del semen fresco.

Animal: , Cachirulo
Especie: Asnal
Referencia: 0360
Fecha (da/mes/ao): 14/10/2016
Centro: Laboratorio de Biotecnologa Animal

Orden (14/10/2016 10:45:45a.m.)

Concentracin
104,22 M/mL 260,55 M/muestra Volumen ( mL): 2, 50

Concentracin
Total Porcentaje (%)
M/mL M/muestra
Mviles 779 87,33 91,02 227,54

Concentraci
Progresividad Total Porcentaje (%) n
M/muestra
M/mL
Progresivos (PR) 592 66,37 69,17 172,92
No progresivos (NP) 187 20,96 21,85 54,62
Inmviles (IM) 113 12,67 13,20 33,01

Concentraci
Velocidad Total Porcentaje (%) n
M/muestra
M/mL
Rpidos 560 62,78 65,43 163,58
Medios 119 13,34 13,90 34,76
Lentos 100 11,21 11,68 29,21
Inmviles (IM) 113 12,67 13,20 33,01

Concentraci
Velocidad y progresividad Total Porcentaje (%) n
M/muestra
M/mL
Rpido progresivo 101 11,32 11,80 29,50
Medio progresivo 491 55,04 57,37 143,42
No progresivo 187 20,96 21,85 54,62
Inmvil 113 12,67 13,20 33,01
 12,67% 12,67% 12,67%
Velocidad y progresividad
11,32%
20,96% 11,21% 20,96%

66,37% 13,34% 62,78% 55,04%

Progresivos (PR) Rpidos Rpido progresivo

No progresivos (NP) Medios Medio progresivo

Inmviles (IM) Lentos No progresivo

Inmviles (IM) Inmvil

Progresividad Velocidad

Media Inmviles (IM) Lentos Medios Rpidos Unidades

rea de la cabeza 28,76 29,36 28,20 26,37 29,23 mm2

Media de velocidad Media Lentos Medios Rpidos Unidades

Velocidad curvilnea (VCL) 141,93 32,50 62,74 178,88 mm/s

Velocidad lineal (VSL) 53,33 11,92 25,49 66,94 mm/s

Velocidad media (VAP) 112,44 20,06 45,02 143,87 mm/s
ndice de linealidad (LIN) 37,57 36,69 40,62 37,42 %
ndice de rectitud (STR) 47,43 59,45 56,62 46,53 %
ndice de oscilacin 79,22 61,71 71,75 80,43 %

Media de otros parmetros Media Medios Rpido Unidades

progresivo
Amplitud lateral de la cabeza (ALH) 3,96 2,66 4,36 mm
Frecuencia de batida (BCF) 6,13 6,03 6,11 Hz

Total Porcentaje M/mL M/muestra

(%)
Hiperactividad 163 18,27 19,04 47,61
Comentarios:
Analista: INVESTIGACION ANIMAL, GRUPO
 Total Concentracin
Porcentaje
Clulas redondas 0,98 M/mL

Recorridos circulares 548 61 ,43 %

2. resultados del anlisis arrojado por el sistema CASA del semen post descongelacin.
Animal: , Cachirulo
Especie: Asnal
Referencia: 0360
Fecha (da/mes/ao): 14/10/2016
Centro: Laboratorio de Biotecnologa Animal

Orden (14/10/2016 02:08:56p.m.)

Concentracin
41,54 M/Ml 103,86 M/muestra Volumen ( mL): 2, 50

Concentracin
Total Porcentaje (%)
M/mL M/muestra
Mviles 542 60,83 25,27 63,18

Concentraci
Progresividad Total Porcentaje (%) n
M/muestra
M/mL
Progresivos (PR) 320 35,91 14,92 37,30
No progresivos (NP) 222 24,92 10,35 25,88
Inmviles (IM) 349 39,17 16,27 40,68

Concentraci
Velocidad Total Porcentaje (%) n
M/muestra
M/mL
Rpidos 263 29,52 12,26 30,66
Medios 98 11,00 4,57 11 , 42
Lentos 181 20,31 8,44 21,10
Inmviles (IM) 349 39,17 16,27 40,68

Concentraci
Velocidad y progresividad Total Porcentaje (%) n
M/muestra
M/mL
Rpido progresivo 182 20,43 8,49 21,22
Medio progresivo 138 15,49 6,43 16,09
No progresivo 222 24,92 10,35 25,88
Inmvil 349 39,17 16,27 40,68
 Concentracin
Clulas redondas 2,15 M/mL

39,17% 35,91% 39,17% 29,52% 39,17%

Velocidad y progresividad
20,43%

15,49%
24,92% 20,31% 11,00% 24,92%

Progresivos (PR) Rpidos Rpido progresivo

No progresivos (NP) Medios Medio progresivo
Inmviles (IM) Lentos No progresivo
Inmviles (IM) Inmvil
Progresividad Velocidad

Total Porcentaje (%
Recorridos circulares 233 26 ,15 %

Media Inmviles (IM) Lentos Medios Rpidos Unidades

rea de la cabeza 27,38 29,24 26,87 26,82 26,88 mm2

Media de velocidad Media Lentos Medios Rpidos Unidades

Velocidad curvilnea (VCL) 92,13 29,41 66,62 142,34 mm/s
Velocidad lineal (VSL) 60,38 10,41 39,18 99,87 mm/s
Velocidad media (VAP) 78,30 17,60 51,98 126,91 mm/s
ndice de linealidad (LIN) 65,54 35,40 58,80 70,16 %
ndice de rectitud (STR) 77,11 59,16 75,36 78,69 %
ndice de oscilacin 84,99 59,84 78,03 89,16 %

Media de otros parmetros Media Medios Rpido Unidades

progresivo
Amplitud lateral de la cabeza (ALH) 2,60 2,10 2,76 mm
Frecuencia de batida (BCF) 7,78 6,52 8,23 Hz

Total Porcentaje M/mL M/muestra

(%)
Hiperactividad 95 10,66 4,43 11 , 07

Comentarios:
Analista: INVESTIGACION ANIMAL, GRUPO
La relacin de los resultados de las evaluaciones del seminal en fresco y
post descongelacin no mostr significantes diferencias, solo una
diferencia del 27% en movilidad y un 30% en vitalidad (aun as son
resultados ampliamente ptimos para su utilizacin).

DISCUSIN
Se encuentran resultados muy similares a los de mir et al (2009) en su
evaluacin de los efectos de dilucin y centrifugacin en la vitalidad y la
estructura de motilidad en semen congelado de burro cataln por medio
del software de anlisis SAS statical package reporto movilidades de
semen hasta del 72% 24 horas despus y 42% 72 horas despus del
tratamiento de centrifugacin y dilucin. Brinsko et al inform
centrifugacin y la eliminacin parcial de plasma seminal que es
beneficioso en el almacenamiento refrigerado de semen de caballo,
especialmente para eyaculados con mala refrigeracin y la tolerancia de
almacenamiento. Llevndolo a colacin con los resultados de este
estudio muestra que la vitalidad de los espermatozoides del burro
colectado despus de almacenamiento es mayor cuando es diluida o
cuando el plasma seminal es parcialmente eliminado por centrifugacin.
Montoya et al (2016). Estudio la congelacin de semen de asnos criollos
colombianos de 5 distintos predios dedicados a la cra de asnos criollos
colombianos, un total de 5 animales y un total de 10 muestras de
eyaculado recogidos por animal. Analizados por medio del sistema
CASA. Doy una movilidad mayor en este caso de 92%, una vitalidad del
88% y una integridad altamente superior de 63%.

Toscano et al (2014). Realizo evaluaciones de congelacin de semen de

burro mexicano, caracterizando mejores resultados en dilucin con
equipro centrifugado, dando resultados semejantes, en fresco con
vitalidad y movilidad progresiva de 76% y post descongelacin una
vitalidad del 67% y movilidad del 35%. Rota et al (2008) indicaron que la
remocin del plasma seminal en burros Amiata, durante la
criopreservacin no parece ofrecer ninguna ventaja sobre el uso del
semen diluido, lo que concuerda con los resultados del presente trabajo.
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFIA.
Alexandra Usuga Suarez, Juan David Montoya Pez, lvaro David
Celis, Giovanni Restrepo Betancur, Andrs Antonio Henao. (2014).
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CABRERA, P.; SNCHEZ, R. & RISOPATRN, J. (2014). Seleccin

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