UNIDAD 7

Objetivos
-Comprender el mecanismo de accin de cada agente fsico sobre los
microorganismos.
-Conocer el manejo correcto de la autoclave y el horno en el laboratorio.
-Conocer las aplicaciones prcticas de cada uno de los agentes fsicos en
relacin con los microorganismos.
 ACCIN DE LOS AGENTES FSICOS SOBRE LOS MICROORGANISMOS

El control de los microorganismos patgenos se puede realizar por medio del uso de
los agentes fsicos, teraputica antimicrobiana, o por los mecanismos de defensa del
husped.
En la prctica de laboratorio, es necesario conocer la metodologa mediante la cual se
pueda eliminar, controlar y/o disminuir la carga bacteriana de un medio, sustancia,
material o ambiente determinado, para:
-trabajar con cultivos puros
-que los grmenes sean cultivados en medios de cultivo estriles
-tomar las muestras con elementos estriles
-que todo medicamento inyectable est libre de microorganismos
-que las vacunas inactivadas, los elementos de ciruga, entre otros, estn estriles.
La esterilidad indica la ausencia total de formas viables de microorganismos. No
existen grados de esterilidad, es un trmino absoluto.
Es importante destacar que no todos los procedimientos que impliquen el uso de
agentes fsicos, estn destinados a inhibir el desarrollo microbiano, por ejemplo:
algunos agentes fsicos pueden utilizarse para conservar microorganismos, para inhibir
determinados patgenos sin afectar otras formas microbianas, para aislar por medio
de filtros, entre otros.

AGENTES FISICOS

Directo Mechero Bunsen

Seco
Indirecto Horno

A presin Autoclave
1-Calor
Ebullicin
Hmedo Sin presin Vapor fluente
Tindalizacin
Pasteurizacin

, y
Ionizantes
Rayos X
2-Radiaciones
Rayos ultravioletas
No ionizantes
Rayos infrarrojos

3-Filtracin

4- Ultrapresin

5-Ultrasonido

6-Centrifugacin y ultracentrifugacin

7-Fro
1. CALOR

El calor acta por desnaturalizacin de protenas y contribuye a la fusin de

lpidos de membranas.

El calor es el mtodo ms confiable y universalmente aplicado para la esterilizacin.

La destruccin de una poblacin bacteriana por medio del calor es un proceso gradual
y la cintica de destruccin es exponencial. El tiempo requerido para la esterilizacin
est universalmente relacionado con la temperatura de exposicin.
Tres parmetros pueden ser usados para indicar el grado de resistencia al calor que
tienen los microorganismos.

1-El punto trmico letal que es la temperatura ms baja en la cual muere una
poblacin bacteriana en determinado tiempo (10 min).

2-El tiempo trmico letal que es el menor tiempo necesario para matar el 100 % de
una poblacin de microorganismos a determinada temperatura y bajo condiciones
especficas del medio.

3-La reduccin decimal de tiempo, que es el tiempo en minutos necesario para

matar el 90 % de la poblacin. Es una modificacin del tiempo trmico letal, que mide
el 90% de las muertes en vez del total.

Estos parmetros relacionan siempre tiempo y temperatura. Para determinar

experimentalmente estos valores es requisito indispensable que las condiciones sean
bien controladas. Esto es, que la naturaleza del medio y el nmero de
microorganismos permanezcan constantes.
Debido a la elevada temperatura empleada en la esterilizacin por calor, un cambio
mnimo de sta, altera significativamente el tiempo de muerte trmica.
Para el estudio de los mtodos de produccin del efecto letal en los microorganismos
es necesario clasificarlos en dos grandes grupos:
-calor seco que corresponde al fuego directo y al aire caliente y
-calor hmedo, producido por la ebullicin, el vapor de agua a presin (autoclave), la
tindalizacin y la pasteurizacin.

Mecanismos de la lesin trmica

CALOR HMEDO. MECANISMO DE ACCIN

El efecto letal del calor hmedo sobre los microorganismos se atribuye a la
desnaturalizacin y coagulacin de las protenas.

La desnaturalizacin y coagulacin se facilita en presencia de agua, al

romperse los puentes de hidrgeno entre los grupos C = O----HN que
constituyen la estructura secundaria, y tambin se agrega mediante puente
de hidrgeno, una molcula de agua a cada extremo de esas uniones rotas.

Las protenas en soluciones ms diluidas coagulan a menor temperatura que

las concentradas. Existen rupturas en la cadena de ADN y tambin se altera
la integridad funcional de la membrana celular permitiendo la salida de
material celular.
 CALOR SECO. MECANISMO DE ACCIN

Es diferente al mecanismo de accin por calor hmedo.

El calor seco, acta oxidando los constituyentes intracelulares. Son
prioritarios los procesos oxidativos de las protenas, fusin de membranas, y
los efectos txicos por niveles elevados de electrolitos, por sobre la
desnaturalizacin.
En ausencia de agua, el nmero de grupos polares de una cadena peptdica, es
menor y requiere ms energa para abrir las molculas, por lo cual resulta menos
eficiente que el calor hmedo. As, con calor seco se requieren mayores
temperaturas y debido a la lentitud del transporte del calor (conveccin), se
requieren mayores tiempos para producir la muerte microbiana.

Ejemplo que pone en evidencia estas diferencias: un cultivo esporulado de Bacillus

anthracis, se destruye con calor hmedo a 120C en 20 minutos, mientras que con
calor seco se necesitan una hora a 170C, o dos horas a 160C.

ESTERILIZACIN
Definicin: es un estado absoluto que indica la falta total de formas viables.

-Calor seco

Directo Mechero Bunsen

Indirecto Horno

Directo-Incineracin
Este mtodo se emplea para destruir animales de laboratorio infectados, esqueletos y
materiales de desecho, en hornos crematorios.
Esterilizacin con la llama del mechero de Bunsen, se emplea en forma rutinaria
para esterilizar el ansa del mango de Kolle, antes y despus de efectuar una siembra.
Las ansas y otros utensilios metlicos se someten a la llama directa hasta
calentarse al rojo.
Flameado, pasando dos o tres veces por la llama del mechero de Bunsen varillas de
vidrio, bocas de tubos, frascos y similares.
Este mismo mtodo pasando los objetos por la llama, es til para esterilizar material
de necropsia, como tijeras y pinzas que se sumergen previamente en alcohol y se
dejan flamear fuera de la llama del mechero para evitar que se destemplen.
Estos mtodos son instantneos y no mantienen la esterilidad en el tiempo.
(Ver temperaturas alcanzadas por el mechero Bunsen, en documento I)

Esterilizacin del ansa del mango de Kolle

Indirecto-Hornos
La esterilizacin por calor seco o aire caliente, se realiza mediante hornos de
esterilizacin.
Para esterilizar se requieren: 160C por dos horas, o 170C durante una hora

Usos
Para elementos de vidrio (placas de Petri, pipetas, erlermeyer) o de metal

No se emplean
Para material de caucho, papel o telas porque se queman, ni tampoco para medios
de cultivo.

Hay que tener en cuenta que el vidrio en el proceso trmico puede variar su tamao
hasta en un 5 % por lo que no es recomendable este proceso cuando es necesario
utilizar el material para mediciones volumtricas exactas.
Dentro de un horno no ventilado se produce una estratificacin del calor. La
temperatura ms alta se encuentra en la bandeja inferior vaca y la ms baja en la
bandeja superior llena. Esta estratificacin es de tener en cuenta cuando se acopian
grandes cantidades de materiales por las distintas temperaturas que existen en
diferentes puntos del horno. Con un sistema de ventilacin forzada se logra
uniformar las temperaturas dentro del horno, solucionando as este problema.

-Calor hmedo

-A presin

Punto de ebullicin
Cuando a un lquido cualquiera, se le aplica calor, se calienta hasta cambiar de estado
y pasar a su forma gaseosa. La temperatura que alcanza un lquido para pasar al
estado gaseoso se llama punto de ebullicin. Este punto no se altera por mucho calor
que se aplique y vemos que cuando el agua llega a los 100C, no aumenta la
temperatura al convertirse en vapor.

Calor de vaporizacin
Mientras el lquido est recibiendo calor, aumenta su temperatura, pero llegado el
punto de ebullicin, se necesita un calor extra, que es usado en vencer la presin que
ejerce la atmsfera sobre la superficie del lquido y poder convertirse en vapor; esta
cantidad extra de calor se llama calor de vaporacin.
Esta cantidad es especfica para cada lquido en particular y sirve para caracterizarlo.
En el caso del agua es de 539 caloras/gramo.

Condensacin
El fenmeno descrito en los prrafos anteriores se produce exactamente en
direcciones opuestas; si el vapor es enfriado llega a convertirse en lquido y en ese
cambio de estado emite exactamente el mismo calor extra que recibi para convertirse
en vapor. Este fenmeno de volver al estado lquido se llama condensacin.
 A presin Autoclave

Ebullicin
Sin presin Vapor fluente
Tindalizacin
Pasteurizacin

Relacin entre presin, volumen y temperatura

Si seguimos analizando el fenmeno de la ebullicin, visto en los prrafos anteriores:
-el agua con presin atmosfrica al pasar al estado de vapor aumenta
considerablemente su volumen
-este aumento es contenido, para el caso de la autoclave, por sus paredes, que al no
poder aumentar el volumen incrementar la presin interna
-al aumentar la presin, hace que el agua cese de ebullir y por el momento se
establece un equilibrio, el que no es ms que un nuevo punto de ebullicin del agua a
esa presin
-se necesita otra vez, cierta cantidad de calor (calor de vaporizacin a esa presin)
para producir ms vapor, y como consecuencia aumentar la presin.
Esta situacin se repetira hasta llegar un momento en que la presin rompera las
paredes de la autoclave, lo cual se evita con una vlvula de seguridad que a cierta
presin deja escapar el vapor, o bien, suprimiendo el suministro de calor de la
autoclave.
Si se suprime el suministro de calor, el vapor se enfra, se condensa y, al reducirse el
volumen (por convertirse el vapor en agua) desciende la presin y la temperatura, lo
cual est de acuerdo con lo referido en el tem condensacin.
Por lo tanto, por medio del calor, podemos controlar la presin, ya que al llegar a cierta
presin se necesita ms calor para pasar al estado gaseoso, y como resultado se tiene
un equilibrio que relaciona la presin y la temperatura, si el volumen ha de permanecer
constante.

Condiciones ideales
En una autoclave debe existir, una relacin constante entre presin y temperatura, en
la cual el volumen no vara. Esta relacin se produce slo si el gas que se encuentra
en su interior es vapor de agua saturado, si no hay condensaciones bruscas y hay
buena circulacin del vapor dentro de la autoclave. Si esto se logra, se estara
cumpliendo con las condiciones ideales de una autoclave:
a) absoluta uniformidad de temperatura dentro de la autoclave en cualquier momento y
b) control completo y constante de la relacin tiempo-temperatura.

Autoclave
El modelo clsico es el autoclave utilizado en los laboratorios es el de Chamberland.
ste es uno de los ms sencillos y existen modelos verticales, horizontales y de
diferentes tamaos pero todos con en el mismo principio.
Estn constituidos por una caldera de cobre batido y estaado internamente, sostenido
por una camisa metlica. En su parte inferior lleva una fuente calrica, gas o
electricidad. En las grandes autoclaves industriales el calor es suministrado por
calderas. En la parte superior lleva una tapa que debe poseer los siguientes
elementos:
a) un termmetro indicador de temperatura que generalmente se extiende en el rango
de 100 a 200C.
b) un manmetro (indicador de presin) expresada en libras/pulgada cuadrada, en
kg/cm2, o en atmsferas. A veces el termmetro y manmetro se encuentran en un
solo indicador, teniendo en cuenta la relacin entre ambas.

Relacin entre presin y temperatura

Presin en atmsferas Temperatura en C
0 100
114
1 120
2 135

Presin en lb/pulgadas2
5 109
10 115
12 118
15 121

c) una espita que sirve para eliminar el aire durante el calentamiento, proceso
denominado purga.
d) una vlvula de seguridad que permite el escape del vapor a presin que hay en el
interior, cuando excede la adecuada. En el interior de la autoclave se encuentra un
enrejado y lmina cribada, sobre la cual se apoya el material a esterilizar.
En las autoclaves modernas, se van reemplazando estos elementos por sistemas
automticos que facilitan su manejo y garantizan la mayor eficacia de la esterilizacin
(regulador automtico de temperatura, presin, purgado y tiempo, etc.).

Manejo de la autoclave (sobre un modelo Chamberland)

Hay una serie de pasos bsicos que se deben tener en cuenta para el manejo de
cualquier autoclave y que resultan imprescindibles para lograr una correcta
esterilizacin.

1) Colocar agua corriente hasta el nivel de la lmina cribada. Es importante cambiar el

agua y realizar la limpieza del interior de la camisa en forma peridica y registrarlo con
la fecha.

2) Sobre la rejilla o lmina cribada se colocan ordenadamente los elementos a

esterilizar, dejando espacios entre ellos para permitir la circulacin del vapor.

3) Cerrar la autoclave ajustando las mariposas de a pares, diametralmente opuestas.

4) Abrir la espita y controlar la apertura de la vlvula de seguridad.

5) Conectar la fuente calrica. El agua que est en el interior comenzar a hervir

transformndose en vapor de agua, que ir desalojando el aire, el cual saldr por la
espita.

6) Dejar que salga vapor por la espita, hasta que el chorro sea continuo. Lo que
significar que la autoclave est purgada.
7) Cerrar la espita y dejar que suba la temperatura hasta 121 C. A partir de aqu se
regula la fuente calrica para que la temperatura se mantenga constante y a partir de
aqu se cuentan los 20 minutos que durar la esterilizacin.

8) Cumplido este tiempo, cerrar la fuente calrica y dejar enfriar hasta que temperatura
y presin lleguen a cero. De no ser as, la descompresin rpida puede provocar la
ebullicin y derrame de los medios de cultivo o fisuras en el material de vidrio.

9) Abrir la espita para que entre aire y al autoclave y abrir la tapa. No exponer la cara
ante el calor de la autoclave abierto y retirar los materiales con guantes protectores.
Poner a secar en horno o llevar a control en estufas. No dejar la autoclave cerrada con
materiales adentro.

10) Identificar el material estril, preferentemente con la fecha.

Ventajas del calor hmedo

1) Rpido calentamiento
2) Buena penetracin
3) Corto tiempo de esterilizacin
4) Bajo deterioro del material expuesto (por menor temperatura y menor tiempo)
5) No deja residuo txico
6) Econmico

Elementos a esterilizar
Medios de cultivos, soluciones, recipientes contaminados, material de goma,
Tambin se utiliza para esterilizar ropa de cama o camisolines, y todo elemento que no
resista las altas temperaturas del calor seco.

Mariposa

Camisa metlica

Caldera de cobre batido y

estaado interiormente

Lmina cribada

H2O

Fuente calrica
Controles de esterilizacin

Hay distintos mtodos para controlar la operacin de esterilizacin en autoclave.

-Control qumico, consiste en introducir papeles que contienen sustancias que a
determinada temperatura cambian de color (generalmente a 120 C) por ejemplo de
gris a negro denso. Estos papeles comercialmente se obtienen como cintas adhesivas
y a su vez, sirven para cerrar paquetes. El cambio de color de la cinta, indica que se
lleg a la temperatura indicada.
Desventaja: indican que se ha llegado a 120C, pero no el tiempo durante el cual se
mantuvo esa temperatura.

-Control biolgico, el ms seguro, consiste en introducir entre los elementos a

esterilizar un tubo con un trozo de papel de filtro o un hilo, embebido en un cultivo de
un microorganismo esporulado, resistente a altas temperaturas como es el Geobacillus
stearothermophilus, fcil de cultivar.
Luego de realizada la esterilizacin se lleva el papel de filtro o el hilo embebido en el
cultivo esporulado, a un medio de cultivo y se incuba 24 h a 56C. La falta de
desarrollo indicar que la esterilizacin ha sido correcta.
Tambin el papel de filtro embebido con el cultivo esporulado, viene en ampollas que
tienen un indicador de pH, como el prpura de bromocresol, que vira al amarillo si el
microorganismo es capaz de crecer.
Desventaja: tener que esperar 24 h antes de poder usar los materiales procesados.

-Control fsico, el sistema ms eficaz es el de termocuplas.ficaz. Consiste en un

electrodo ubicado en el interior de la autoclave que va conectado por fuera a una aguja
inscriptora que registra en un grfico la temperatura en funcin del tiempo de
esterilizacin. Cualquier variacin de temperatura por debajo de la necesaria se debe
agregar como tiempo extra de esterilizacin.
Ventaja: el control de temperatura y presin se registra simultneamente con el
proceso de esterilizacin.
Mantenimiento de la autoclave
Como todo equipo de laboratorio se debe realizar un mantenimiento peridico para
lograr el correcto funcionamiento. Es conveniente anotar estas operaciones en un
cuaderno o registro, para evitar errores:
1) cambiar el agua y limpiar el interior una vez cada quince das.
2) controlar la vlvula de seguridad, espita y manmetro.
3) supervisar el estado de la fuente calrica, y de las mangueras si son a gas.
4) revisar el estado de la junta de cierre y de las mariposas.
Control anual de prueba hidrulica.

-Calor hmedo
Sin presin

Ebullicin
El agua en ebullicin alcanza una temperatura de 100 C a nivel del mar, la cual
destruye en unos 10 min, las formas vegetativas de la mayora de las bacterias y
algunos virus. Las esporas y ciertos virus, como el de la hepatitis humana o el de la
anemia infecciosa equina no son inactivados.
Es un mtodo til para higienizar o disminuir la carga bacteriana en forma rpida y con
equipo sencillo ciertos elementos como jeringas, utensilios varios y an instrumental
de ciruga en casos extremos.

Tindalizacin
Este proceso se conoce tambin como esterilizacin fraccionada. Consiste en tres
calentamientos de 60-80 C durante 30 min, separado por dos incubaciones a 37 C
durante 24 h.
Con el primer calentamiento se destruyen las formas vegetativas del medio a
esterilizar. Con la incubacin las esporas presentes pasan a formas vegetativas que se
destruyen con el segundo calentamiento. Este se repite para asegurar la esterilizacin.
Usos
Sobre elementos en los cuales la alta temperatura pueda alterar sus propiedades,
como por ejemplo hidratos de carbono o leche (principalmente esta ltima debido a la
dificultad de filtracin por sus materias grasas).
Inconveniente
El tiempo que demora, por lo cual es poco usado en el laboratorio.

Pasteurizacin
Es un mtodo de higienizacin mediante el cual se reduce la carga bacteriana en
ciertos productos. No es una tcnica de esterilizacin, ya que se eliminan solamente
las formas vegetativas de los microorganismos. Se aplica a sustancias que no toleran
la temperatura de esterilizacin sin perder sus caracteres organolpticos. Pasteur la
emple por primera vez en la conservacin de vinos y actualmente se utiliza sobre
todo en la industria de la alimentacin (leche y derivados, vino, cerveza). Para
establecer la temperatura y tiempo adecuados, se tiene en cuenta la resistencia de los
patgenos que con mayor frecuencia se encuentran en el producto.
La leche puede transmitir patgenos que son importantes en la salud pblica,
como Mycobacterium bovis, Salmonella ssp., Brucella abortus, enterovirus
como el virus de la poliomielitis, algunos parsitos. Para evitar este problema
tan serio, se determin por ley la obligatoriedad de pasteurizar la leche.
Hay varios tipos de pasteurizacin:
Baja 62C - 30 minutos

Como se mencion,Alta estas72C - 15 segundossolamente reducen la carga de

temperaturas
microorganismos por lo que no se deben descuidar las medidas de higiene que
buscan evitar la contaminacin previa o posterior al proceso.

Uperizacin (UHT)
El calentamiento o temperatura ultraelevada comprende:

-calentamiento indirecto: 6-10 segundos a 135C-150C

-calentamiento directo: 2-3 segundos a 140C-150C

Con este mtodo mueren las formas vegetativas, pero pueden sobrevivir esporas.

Radiaciones
La energa se transmite a travs del espacio en una gran variedad de formas, una de
las cuales son las radiaciones. Dentro de stas se encuentran las electromagnticas
de alta energa o ionizantes y otras de baja energa o no ionizantes.

Radiaciones ionizantes
Comprende a los rayos alfa, beta, gamma y Rntgen (Rayos X).

Mecanismo de accin

Los rayos mencionados poseen suficiente energa para empujar los electrones
fuera de las molculas e ionizarlos, mediante una reaccin en cadena.
Cuando estas radiaciones pasan a travs de las clulas se produce hidrgeno
libre, radicales hidroxilo y algunos perxidos que ocasionan diferentes tipos de
dao intracelular. Como el dao recae en una gran variedad de constituyentes
celulares, las radiaciones ionizantes son poco especficas en sus efectos pero
tienen alto poder de penetracin.

Se aplican como mtodo de esterilizacin en el laboratorio denominndose

esterilizacin fra, dado que se produce relativamente poco calor en el material que se
irradia. As es posible aplicarlas a sustancias sensibles al calor y emplearlas en las
industrias farmacuticas y de la alimentacin.

De este grupo los rayos X son letales para los microorganismos y formas superiores
de vida, pero a pesar de tener considerable energa y capacidad de penetracin, no
son prcticos para esterilizar por su elevado costo de produccin en cantidades
suficientes y ser difciles de manejar porque las radiaciones salen en todas
direcciones a partir del punto de origen. Se emplean en microbiologa experimental
para producir mutaciones.

Los rayos gamma tienen mucha energa y son los ms usados; son emitidos por
ciertos istopos radiactivos como el cobalto 60 (60Co). Son similares a los anteriores
pero de longitud de onda ms corta. Resultan cmodos para esterilizar objetos
sensibles al calor, como jeringas de plstico o materiales de considerable
espesor o volumen. Sin embargo se debe contar con una fuente de radiaciones
adecuada y controlada, que no afecte al operador ni elimine radiactividad al medio
(Comisin Nacional de Energa Atmica [Argentina]).
Radiaciones no ionizantes
Comprende a las radiaciones ultravioletas (UV) e infrarrojas (IR). La porcin UV
incluye radiaciones desde 150 a 3900 . Las de mayor eficacia como bactericida son
las de 2650 . La luz solar est parcialmente compuesta por luz UV pero la mayora
de las longitudes de onda corta son filtradas por la atmsfera terrestre (ozono, nubes,
etc.), estando restringidas en la superficie terrestre a una amplitud de 2870 a 3900
por lo que la luz solar tiene accin microbicida pero en grado limitado.

Mecanismo de accin

La luz UV es absorbida por muchos materiales celulares, pero es en los cidos

nucleicos donde causa el mayor dao. Esta absorcin se efecta sobre todo en
las bases pirimdinicas, donde puede formar un dmero entre 2 bases vecinas
(timina) que, a menos que sea desdoblado por enzimas intracelulares
especficas, inhibe la replicacin del DNA.

Estas lesiones del DNA resultan letales, pero pueden ser reversibles al ser
reparadas por:

a) foto-reactivacin: por accin de luz UV de mayor longitud de onda o de la luz

visible, de menor longitud de onda, se reactiva una enzima intracelular, que rompe el
enlace del dmero de timina, volviendo las bases pirimidnicas a su estado original.

b) reparacin en la oscuridad: manteniendo la suspensin bacteriana unas horas

en fro o en medio de crecimiento escaso, se producen dos fases de reparacin:
degradacin y eliminacin del dmero, y posterior reconstruccin de la polimerasa
del DNA.

c) reparacin por recombinacin: en el caso de las bacterias que no pueden

repararse por los mecanismos anteriores, la presencia de dmeros, no dificulta, su
replicacin. Las nuevas cadenas de DNA forman fragmentos, dejando un hueco
cada vez que alcanza un dmero, estos huecos desaparecen luego del
entrecruzamiento entre las nuevas cadenas.

Se pueden obtener lmparas que emiten luz UV en su regin ms efectiva (2600 a

2700 ). Son de uso difundido en quirfanos, salas de envasado de vacunas y
ambientes en general, como as tambin en la industria de la alimentacin para
envases y superficies contaminadas, aunque su efectividad real en estos casos es
discutible, debido a que la luz UV tiene muy poca capacidad de penetrar la materia,
tanto as que una pequea capa de vidrio resta gran capacidad de radiacin.

En cuanto a la radiacin IR es inocua a las sustancias qumicas y, por lo tanto, a los

microorganismos. nicamente causa alargamiento y desdoblamiento molecular y algo
de rotacin, de manera que no les da la energa suficiente para reaccionar. En un
horno al IR, de hecho se transmite suficiente energa para cocinar, pero tales dosis
masivas de IR no se presentan en la naturaleza, excepto cuando existe un flujo de
lava.
Se ha demostrado que la accin directa del sol es debida en gran parte a las
radiaciones actnicas.
Tambin se sabe que haciendo actuar las distintas radiaciones del espectro sobre los
medios de cultivo sembrados, la zona ms activa sobre la vida bacteriana es la del
violeta, siendo las otras poco o nada activas. Pero la accin de la luz solar sobre las
bacterias es compleja y vara considerablemente segn las circunstancias. Como se
mencion, acta por sus rayos actnicos y tambin por los calricos, que ejercen una
accin deshidratante.
xido de etileno: si bien el xido de etileno es una agente qumico, se lo incluye en
este apartado ya que se emplea como esterilizante.
El xido de etileno es un gas muy soluble en agua y explosivo. Al igual que el formol
acta como agente alquilante.
Sustituye los tomos de hidrgeno en radicales NH2, OH, COOH y HS de las
protenas, combinndose en forma irreversible y desnaturalizndolas.
Es muy eficaz tanto frente a formas vegetativas como esporuladas.
Al ser una molcula pequea y no poseer cargas penetra con facilidad en las clulas
sin necesitar del agua para actuar. Constituye un excelente mtodo de esterilizacin
gaseosa para superficies secas, pero su accin es ms lenta que el vapor y ms
costosa. Adems, resulta peligroso por ser explosivo y por su accin como txico
residual.
No est descartada una posible actividad mutagnica y carcinognica, por lo que debe
utilizarse con precaucin.
Usos
Para esterilizar objetos sensibles al calor como materiales plsticos, sondas, jeringas,
cnulas, guantes, instrumental de ciruga (no es corrosivo sobre los metales) y equipos
quirrgicos.
Es de uso habitual en medicina humana y en medicina veterinaria se aplica en la
esterilizacin de materiales destinados a inseminacin artificial y transplante
embrionario.
Su empleo puede hacerse con o sin autoclave de xido de etileno (tambin
denominado estufa de xido de etileno).

Con autoclave
En el uso con autoclave se coloca el material a esterilizar dentro de bolsas de
polietileno de no ms de 100 m de espesor, se hace vaco y luego se llena con el gas
que viene comercialmente en garrafas. Se lleva hasta una concentracin 1,5% y la
presin que indica el manmetro debe ser subatmosfrica para que no explote. La
fuente calrica a 41C. Esta es la temperatura de difusin del xido de etileno. Si es
mayor, estalla y si es menor, no esteriliza pues no difunde. Se deja funcionando entre
18 y 24 horas, se apaga, se enfra y se abre.
Se retiran los elementos y se espera 24 horas antes de ser usados.

Sin autoclave
Se preparan los materiales en bolsas de polietileno de espesor no mayor a las 100 m,
y a su vez se coloca dentro de una bolsa de espesor mayor de 100 m, colocando en
su interior una ampolla de Am phrolene (xido de etileno), se cierra la bolsa. As se
coloca en una estufa a 41C, se rompe la ampolla, presionando por fuera de la bolsa.
Luego de 24 horas est el material estril, pero hay que esperar otras 24 horas antes
de poder utilizar el contenido por los residuos txicos.

Filtracin

Se entiende por filtracin el pasaje de un fluido a travs de una sustancia porosa que
retiene los microorganismos contenidos en l.
Este medio es un material fibroso o poroso que contiene poros interconectados entre
s de manera de permitir el paso del fluido.

Mecanismos que interactan en la retencin de partculas

Los slidos suspendidos en un fluido son retenidos por medio de tres mecanismos
bsicos

1. Intercepcin directa o tamiz

En un medio filtrante se puede observar un conjunto de fibras que definen poros o
ranuras a travs de las cuales pasa el fluido. Si las partculas en el fluido son mayores
que los poros o aberturas en el medio filtrante, ellas sern retenidas como resultado de
la intercepcin directa por dichos poros.
La partcula circula por la vena fluida y cuando el entramado de fibras es menor que el
de la partcula, sta quedar retenida. En la prctica, la mayora de las partculas en
suspensin an muy pequeas, son muy irregulares en su forma y de aqu que
puedan hacer un efecto puente sobre la abertura del filtro.

2. Mecanismo de inercia
Las partculas en un fluido en movimiento tienen masa y velocidad, por lo tanto una
cantidad de movimiento asociado a ella, a medida que el lquido y las partculas pasan
a travs del medio filtrante la vena fluida seguir la trayectoria de menor resistencia al
flujo y se desviar alrededor de la fibra. Una partcula impulsada por la vena fluida,
debido a su masa y velocidad, no sigue el trayecto de sta e impacta con la fibra y
queda retenida.

3. Intercepcin por difusin

Es un mecanismo inverso al de la inercia, para partculas extremadamente pequeas.
En este proceso tpico de las partculas sub micrnica, stas se encuentran en choque
permanente con las molculas del fluido. Estos choques frecuentes hacen que las
partculas suspendidas se muevan con movimientos desordenados alrededor de las
lneas de la vena fluida. Estos movimientos que pueden ser observados al microscopio
se llaman movimientos Brownianos. La difusin Browniana es la causa de que las
partculas pequeas se desven de la lnea de flujo aumentando la probabilidad de que
impacten la superficies de las fibras, siendo all retenidas.

Clasificacin de los filtros

Hasta hace poco tiempo era muy comn clasificar a los filtros y a los medios filtrantes
como del tipo de profundidad y de superficie. Esta clasificacin, que peca de
esquemtica, idealiza a los medios filtrantes como de retencin en la masa o seno de
estos para el primer caso, o como si fueran capaces de retener la totalidad del filtrado
por poros inferiores al tamao de las partculas en el segundo caso.
Es decir que en filtros de profundidad actuaran los tres mecanismos de
retencin (tamiz, inercia y difusin), las partculas quedaran retenidas en la superficie
y en el espesor del filtro. En los filtros de profundidad existen varias capas, por ejemplo
las placas filtrantes de amianto y celulosa.
En los de superficie, son las membranas filtrantes.

Clasificacin actual de filtros:

a) de poros deformables
b) de poros fijos o indeformables

a) Los de poros deformables dependen principalmente de los mecanismos de

separacin por inercia o difusin Browniana, ejemplo de este tipo son los fieltros,
placas de amianto y fibras de vidrio no ligadas por resinas. Dichos filtros estn
construidos con un medio filtrante no fijo de espesor suficiente como para retener
partculas de un determinado tamao dentro de su espesor (en profundidad). Los
filtros de poro variable estn sujetos al fenmeno de migracin al medio, esto significa
que partes del mismo medio filtrante se desprendan y continen su recorrido aguas
abajo, contaminando el elemento filtrado.

b) Los filtros de poro fijo consisten en varias capas de un medio filtrante o una sola
capa de mayor espesor de un mismo material. Se fabrican de manera tal que la
estructura del medio no pueda distorsionarse. El tamao del poro puede controlarse
durante su fabricacin, asegurando la retencin cuantitativa de partculas mayores de
un determinado tamao, por mecanismo de intercepcin directo o tamiz, aunque en
algunas circunstancias pueden actuar mecanismos de impacto inercial o intercepcin
por difusin.
Un filtro de superficie o de malla, es uno en el cual todos los poros se encuentran en
un plano nico y, por lo tanto, dependen nicamente del mecanismo de intercepcin
directa para separar partculas de un fluido.
Muy pocos filtros en el mercado pueden ser considerados verdaderos filtros de
superficie (ejemplo: mallas de alambre tejido y telas metlicas).
-Los filtros de amianto-celulosa son de poro deformable, con fibras de amianto
entrecruzadas que ofrecen una gran superficie de filtracin, la cual al no tener un
tamao de poro determinado no se puede decir que sea absoluta para un determinado
tamao de partcula. La funcin de tamiz depende de la estructura del filtro y de la
forma de las partculas a filtrar.
Entre los filtros encontramos las bujas de porcelana o tierra de diatomeas (Pasteur,
Chamberland, Berkefeld); los discos de vidrio y las placas de asbesto-celulosa (discos
Seitz). Las bujas y los discos de vidrio eran utilizados antiguamente pero hoy han
cado en desuso.

Membranas filtrantes son de tres tipos:

- de acetato o nitrato de celulosa
- de filamentos orgnicos y
- nucleares de policarbonatos.
Los filtros de membrana son los ms modernos. Estn compuestos por steres de
celulosa (acetato o nitrato de celulosa) de 150 a 200 m de espesor en 6 a 8 capas y
contienen millones de poros microscpicos de tamao uniforme.
La porosidad puede variar de 0,01 a 10 m. Estos filtros retienen a las bacterias
principalmente por el dimetro del poro y son de poro indeformables; pasan aquellos
microorganismos menores al dimetro utilizado para filtrar. Los virus pasan estos
filtros con facilidad y son utilizados tambin para eliminar la carga bacteriana de
muestras lquidas destinadas al estudio viral.
Tambin se han adaptado a procedimientos microbiolgicos para identificar y
enumerar microorganismos en muestras de agua y alimentos.
Comercialmente se los solicita segn el tamao de poro que se desee.

Sistemas de filtracin
Filtracin con presin positiva
Se realiza introduciendo el lquido a filtrar en un continente de cierre hermtico, que
posee una vlvula de entrada de aire a presin (mediante un compresor). El conducto
de salida del lquido a filtrar es inferior y es transportado hasta el soporte del filtro. ste
consta generalmente de dos partes, una superior y otra inferior colocndose el
elemento filtrante entre ambas. El lquido atravesar el filtro y de la parte inferior del
soporte saldr el lquido filtrado que es conducido al receptor final (puede ser un
erlermeyer).
Todas los elementos utilizados, deben estar estriles previo a la filtracin. Este
sistema puede ser utilizado en filtros de jeringa, que consiste en colocar el lquido a
filtrar en una jeringa
Es recomendable que la jeringa sea de vidrio con pico a rosca para evitar que se
produzcan desacoples al presionar con posible contaminacin al operador. La filtracin
con presin positiva es la ms recomendable para los filtros de membrana.

Filtracin con presin negativa

Para sta es necesario contar con una bomba de alto vaco que estar conectada a un
frasco Kitasato (frasco semejante al erlermeyer con paredes gruesas para resistir el
vaco y una tubuladura lateral y superior), mediante mangueras de goma rgida para
evitar que se colapse. El soporte del filtro (semejante al anterior) es colocado sobre el
kitasato y el lquido a filtrar sobre un receptor superior. El vaco producido por la
bomba har que el lquido atraviese el filtro y sea recibido en el kitasato.

Aplicacin
Es til para esterilizar lquidos como medios de cultivo que no resisten el
tratamiento trmico, sueros u otras sustancias que contengan protenas que se
desnaturalizaran con el calor; azcares (evitando el caramelizado), soluciones de
antibiticos. Tambin para separar productos solubles del crecimiento bacteriano (
toxinas) de los medios de cultivo lquidos.
Las bacterias pueden eliminarse de los lquidos hacindolas pasar a travs de filtros
con poros muy pequeos que impiden el paso de bacterias, pero en general no de los
micoplasmas, ni de virus.
Tienen como inconvenientes que el proceso de filtracin en general suele ser algo
tedioso, ya que es necesario proceder a filtrar sucesivas veces un mismo elemento
para lograr su esterilizacin, pasando desde filtros clarificantes, continuando con otros
de dimetro de poro cada vez menor, hasta lograr utilizar filtros esterilizantes.
Dependiendo de la cantidad y tipo de partculas que posea el elemento original, ser la
cantidad de veces que ser necesario realizar el proceso.
Otras aplicaciones son los filtros absolutos, que son tambin llamados HEPA (High
Efficiency Particulate Air), destinados a la filtracin de aire en el flujo laminar. El filtro
HEPA por definicin es un filtro con una eficiencia mnima del 99,97% en la partcula
ms difcil de filtrar que es la de 0,3 m de dimetro. Consta de una sola hoja de un
papel de celulosa, amianto y vidrio de fibras de dimetro inferiores al micrmetro, este
papel es doblado en muchsimos pliegues que se mantienen separados entre s por
medio de separadores metlicos o de cartulina corrugada.

Ultrapresin
Tanto la alta como la baja presin no parecen producir muerte de bacterias. As
cuando cultivos de E.coli sometidos a presiones de ms de 1000 atmsferas (atm) o
cultivos de B. subtilis a 12.000 atm, no producen grandes prdidas celulares.
Sin embargo, los microorganismos parecen no sobrevivir a los cambios bruscos de
presin; el fraccionador de Ribi, produce la ruptura celular, primero creando alta
presin y despus expulsndolas a travs de un pequeo orificio que est sujeto a
presin atmosfrica normal. Este proceso depende de la formacin de burbujas de gas
intracelulares para su efecto.

Ultrasonido
El odo humano capta ondas sonoras con una frecuencia (en vibraciones por segundo)
entre 12 y 32.000 Hertz (Hz). Mediante osciladores snicos se pueden lograr
vibraciones con una frecuencia que puede llegar a 200.000 Hz por segundo. Esto
proporciona una tcnica til para lisar clulas bacterianas y obtener sus fracciones
(extraccin de sus componentes). No suele ser utilizada como mtodo de esterilizacin
ya que quedan muchas clulas vivas.
El fundamento radica en que el sonido al pasar a travs de un lquido provoca cambios
de presin, los cuales, si el sonido es suficientemente intenso, generan cavidades en
el lquido. Las cavidades, que tienen un dimetro de 10 nm, aumentan su tamao
hasta que se colapsan violentamente, producindose altas velocidades y presiones
locales del orden de las 1000 atm. Durante este violento estadio la clula se
desintegra.

Centrifugacin y Ultracentifugacin

La centrifugacin diferencial y la centrifugacin por gradiente de densidad son

mtodos que se utilizan para separar de los tejidos o materiales del husped a los
virus previamente concentrados.
Una muestra concentrada de virus se siembra sobre un gradiente de densidad lineal
de sacarosa o glicerol formado previamente, y durante la centrifugacin los virus
sedimentan como banda a una velocidad determinada, fundamentalmente por el
tamao y peso de la partcula viral. Las muestras se juntan perforando un orificio en el
fondo del tubo de la centrfuga. La banda de virus purificado puede determinarse por
mtodos pticos, marcando con radioactividad al virus o analizando su infectividad.
Los virus pueden purificarse tambin por centrifugacin a altas velocidades en
gradientes de densidad de cloruro de cesio, tartrato de potasio, citrato de potasio o
sacarosa. Las partculas de virus emigran hacia una posicin de equilibrio donde la
densidad de la solucin iguala a su densidad de flotacin, y las partculas virales
forman una banda visible. La anda de virus puede ser recogida por puncin a travs
del fondo del tubo de plstico de la centrfuga, analizndose su infectividad.
La ultracentrifugacin se utiliza como mtodo de medicin de tamao de los virus.
Si se suspenden partculas en un lquido y se le deja reposar, se sedimentarn en el
fondo del tubo con una velocidad que ser proporcional a su tamao. En una
ultracentrfuga, fuerzas de ms de 100.000 veces la gravedad, pueden ser empleadas
para conducir a las partculas hacia el fondo del tubo. La relacin entre el tamao de
una partcula y su velocidad de sedimentacin permite la determinacin del tamao de
la partcula viral.

Frio
Las temperaturas inferiores a la ptima para el desarrollo disminuyen la actividad
microbiana y, si son bastante bajas, cesa al igual que el metabolismo.
Las temperaturas bajas son tiles para preservar cultivos, los cuales pueden
almacenarse durante largos perodos a temperaturas de refrigeracin (4 a 7C).
Muchas bacterias, y sobre todo muchos virus, se mantienen con xito congelados a
temperaturas de -20 a -70 C.
En estos procedimientos el enfriamiento inicial mata a cierta parte de la poblacin,
pero los sobrevivientes permanecen viables durante largo tiempo. A esto se debe que
las bajas temperaturas, an excesivas, no se pueden emplear como mtodo de
esterilizacin. Temperaturas como -196 C (nitrgeno lquido) son usadas para
conservar cultivos de microorganismos.
Los microorganismos mantenidos a bajas temperaturas, se consideran en
latencia, ya que no desarrollan actividad metablica detectable. En esa condicin
se basa la aplicacin de bajas temperaturas en la conservacin de alimentos.
El proceso de congelamiento y descongelamiento repetidos produce un efecto
ms destructivo sobre los microorganismos. Este efecto parece depender de dos
fenmenos, uno menor, la formacin de cristales de hielo que producen lesiones
sobre las membranas, otro aparentemente ms importante, la formacin de
cristales de hielo extracelular causa la salida del agua desde el interior de la
clula, dando como resultado aumento de la concentracin intracelular de
electrlitos y desnaturalizacin de las protenas. Con la lesin de la membrana
celular se produce la salida de compuestos intracelulares y por ende la muerte celular.