Asam nukleat baik DNA maupun RNA mampu dipotong dengan

menggunakan suatu enzim yaitu nuclease. Enzim nuclease yang mampu

memotong RNA disebut deoksiribonuklease atau Dnase. Beberapa nuclease

hanya memotong urutan asam nukleat yang single strand dan ada pula yang

mampu memotong asam nukleat yang double strand. Nuklease ada dua

macam yakni eksonuklease yang mampu memotong asam nukleat single

strand atau beberapa oligonukleotida pendek yang hanya mengenali salah

satu ujung asam nukleat, yaitu ujung 5 atau ujung 3 sementara daerah

tengah dari sekuens asam nukleat yang mampu mengenali daerah spesifik

pada urutan asam nukleat

Salah satu tujuan untuk memperoleh suatu daerah dalam DNA dalam

suatu genom adalah untuk melakukan perbanyakan (kloning). Untuk

memperoleh suatu urutan DNA tersebut maka dilakukan pemotongan genom

DNA menjadi fragmen-fragmen dengan menggunakan enzim tertentu yang

mamapu memotong ikatan fosfodiaeter pada untaian DNA tersbut yakni

berupa enzim restriksi. Enzim restriksi yang diproduksi oleh bakteri

dinamakan endonuklease yang secara tipikal mampu mengenali 4-8 bp

urutan nukleotida yang spesifik. Urutan nukleotida yang speisfik tersebut

dinamakan restriction sites yang secara umum merupakan sekuens

palindromic (run back) yang pendek dengan pola urutan sekuens yang sama

ketika dibaca pada arah 5 3

 Adapun cara kerja enzim endonuklease tersebut berbeda-beda. Enzim

endonuklease tipe II telah diketahui strukturnya yang sisi katalitiknya

tersusun atas 5 macam protein sekunder dalam bentuk -sheet yang diapit

oleh 2 protein sekunder dalam bentuk -heliks enzim endonuklease tersebut

dapat melakukan scanning pada untaian molekul DNA jika tidak menemukan

restriction yang spesifik. Peristiwa tersebut dinamakan mekanisme sliding.

Mekanisme sliding tersebut melibatkan pergerakan dispanjang lekukan DNA.

Namun enzim restriksi endonuklease tersebut akan mengubah

konformasinya ketika telah sudah mengenali daerah spesifik, maka enzim

tersebut akan memotong dua ikatan gula dioksiribosa dengan fosfat dari

double helix DNA yang berbeda dan menghasilkan gugus 3 hidroksil (OH)

dan gugus 5 fosfat (PO4). Selanjutnya DNA tersebut menjadi fragmen-

fragmen yang sesuai dengan daerah pemotongannya. Enzim endonuklease

tidak selamanya memotong DNA menjadi fragmen yang ujungnya simetris

(blunt ends), namun ada juga yang ujungnya asimetris (sticky ends) pola

potongan simetris atau tidaknya tergantung kinerja enzim endonuklease

Struktur enzim restriksi BamHI yang mengikat DNA. Enzim tersebut

mengenali double strand dari DNA dengan sekuens spesifik 5-GGATCC-3,

yang selanjutnya memecah ikatan fosfodiester antara dua residu G. Hasilnya

adalah dua fragmen yang ujungnya sticky ends

Enzim BamHI ini memiliki kofaktor berupa ion mg2+, sehingga dalam

prosedur protokol restriksi suatu sekuens DNA terkadang diberi MgCl. Kation
bivalen mg2+ dari MgCl tersbut berfungsi dalam proses pemotongan

plasmid yang dibutuhkan untuk meningkatkan aktivitas enzim restriksi.

Adapun kinerja enzim BamHI tersbut mampu memotong ikatan fosfodiester

pada urutan DNA pada sisi:

5 G G-A-T-T-C-C 3

3 C-C-T-A-G G 5

Enzim restriksi tersebut mampu mengenali urutan nukleotida yang sama (G-

G), sehingga BamHI disebut juga sebagai isoschizomer. Hasil potongan oleh

enzim BamHI berupa formasi 5-PO4 dan 3- OH yag bagian terminalnya

berbentuk simetris atau sticky ends.

Enzim BamHI bekerja dengan cara scanning sekuens non spesifik

disepanjang DNA dengan cara meluncur (sliding), setelah itu ketika enzim

tersebut menemukan sekuens spesifik berupa 5 G-G-A-T-C-C 3 maka akan

berupa konformasinya dan sisi katalitiknya bekerja untuk memotong ikatan

fosfodiester anatara nukleotida G menjadi fragmen terpisah

Sebagian besar enzim restriksi mempunyai urutan targer nukleotida,

sedangkan yang lain mengenali urutan yang lebih pendek atau lebih panjang

Pengklonan gen dan rekayasa genetic telah dimungkinkan oleh

penemuan enzim yang bisa memotong molekul DNA pada lokasi-lokasi

spesifik yang jumlahnya terbatas. Enzim itu disebut enzim restriksi,

ditemukan dalam bakteri pada akhir tahun 1960-an. Dialam, enzim ini

melindungi bakteri terhadap DNA yang menyelinap dari organisme lain,

seperti virus atau bakteri lain. Enzim-enzim ini bekerja dengan memotong-

motong DNA asing, suatu proses yang disebut restriksi. Sebagian besar

enzim restriksi ini sangat spesifik, mengenali urutan nukleotida pendek

dalam molekul DNA dan memotong pada titik tertentu di dalam urutan ini.

Sel bakteri ini melindungi DNA-nya sendiri dari restriksi dengan

menambahkan gugus metil (_-CH3) pada adenin adeni atau sitosin didalam

urutan yang dikenali oleh enzim restriksi tersebut. Ratusan enzim restriksi

telah didefinisikan dan di isolasi, dan banyak yang telah tersedia secara

komersial

Gambar diatas merupakan diaram molekul DNA yanag mengandung urutan

pengenalan, atau tempat restriksi, untuk enzim restriksi tertentu, seperti

yang ditunjukkan dalam contoh ini sebagian besar teempat restriksi simetris

: urutan empat hingga delapan nukleotida (disini, enam) yg sama dijumpai

pada kedua untai tetapi menuju kearah yang berlawanan. Enzim restriksi

memotong ikatan fosfodiester kovalen pada kedua untai, sering dalam

bentuk menyerupai tangga, seperti yang diperlihatkan dalam diagram

tersebut. Karena urutan target biasanya muncul (dengan sendirinya) berkali-

kali dalam molekul DNA yang panjang, suatu enzim akan membuat banyak

potonga. Salinan DNA selalu menghasilkan serangkaian fragmen restriksi

yang sama apabila dipaparkan dengan enzim itu. Dengan kata lain, enzim

restriksi memotong molekul DNA dengan cara yang dapat diproduksi

Fragmen restriksi itu berupa fragmen DNA untai ganda dengan

sedikitnya satu ujung untai tunggal, yang disebut ujung lengket. Tonjolan
pendek ini akan membentuk pasangan basa yang berikatan hidrogen dengan

komplementernyayang berupa bentangan untaian tunggal dari molekul DNA

lain yang dipotong oleh enzim yang sama. Gabungan yang dibentuk dengan

cara ini hanya bertahan untuk sementara. Karena hanya sedikit ikatan

hidrogen yang menyatukan fragmen-fragmen itu. Akan tetapi penggabungan

DNA ini dapat dibuat permanen dengan enzim DNA ligase, yang menyegel

untai tersebut dengan mengkatalis pembentukan ikatan fosfodiester

Enzim-enzim restriksi (restriction enzymes) adalah suatu jenis enzim

yg memiliki kemampuan untuk memotong pita nukleotida tanpa merusak

basa nitrogen. Enzim restiksi pertama dikenali pada E. Coli dan tampaknya

digunakan untuk merusak bahan genetik bakteriofag tertentu yang

menginfeksinya dengan cara memotongnya. Mekanisme ini dianggap

sebagai usaha mempertahankan diri dari serangan bakteriofag. Enzim ini

tidak memotong plinukleotida disembarang posisi melainkan di posisi yang

memiliki urutan nukleotida tertentu. Tempat yang dipotong ini disebut

restriction side. Pada dasarnya hasil pemotongan enzim ini dapat dibagi dua

kelas yaitu hasil dengan ujung tumpul (blunt end) dan hasil dengan ujung

runcing (sticky end). Disebut ujung tumpul karena kedua pita ADN pada

fragmen hasil potongan memiliki panjang yang sama, sedangkan disebut

ujung runcing karena kedua ujung hasil potongan tidak berakhir dengan

panjang yang sama

 Enzim restriksi diberi nama berdasar nama bakteri asalnya, misalnya

enzim EcoRI berasal dari genus Eschericia (E), yang memiliki nama yang

spesifik coli (co), dan strain RY13 (R), dan enzim ini adalah yang pertama di

identifikasi dari strain tersebut (I). Sekarang telah ditemukan ratusan jenis

enzim restriksi dengan tempaat pemotongan yang berbeda-beda, senuanya

diisolasi dari berbagai jenis atau strain bakteri

Enzim restriksi endonuklease adalah enzim-enzim bakteri yang dapat

mengenali dan memotong sekuens nukleotida tertentu didalam nukleotida

DNA beruntai ganda. Enzim-enzim tersebut memotong DNA menjadi

fragmen-fragmen dengan panjang yang bervariasi, bergantung berapa

banyak situs enzim yang dikenali enzim tersebut berada didalam molekul

DNA. Sebagian enzim restriksi endonuklease yang diguanakan untuk

pengklonaan biasanya mampu mengenali sekuens pasangan basa 4-8

nukleotida dan melakukan pemotongan didalam nukleotida tersebut. Banyak

pula enzim restriksi yang dapat mengenali sekuens yang disebut palindrom.

Palindrom adalah sekuens yang identik jika dibaca dalam arah 5-3 pada

kedua untai molekul DNA.

Enzim ini mempunyai kekhususan karena hanya memotong DNA untai

ganda yang mempunyai urutan nukleotida tertentu. Enzim restriksi

nukleotida dibedakan menjadi tiga tipe, yaitu tipe I, tipe II, tipe III. Enzim

restriksi tipe I enzim nuklease yang kompleks, misalnya enzim yang ada

pada E.coli B (disebut enzim EcoB), dan E.coli K12 (disebut enzim EcoK).

Enzim ini mempunyai aktivitas endonuklease sekaligus metilase dan

memerlukan ATP, Mg 2+, dan S-adenosil metionin sebagai kofaktor. Aktivitas

restriksi dan modifikasi (metilasi) terletak pada sub unit yang berbeda. Enzim

endonuklease restriksi tipe I juga mempunyai aktivitas Atpase. Enzim ini

mengenali urutan nukleotida tertentu. Endonuklease tipe II mempunyai

perbedaan mendasar dengan tipe I karena enzim tipe II pempunyai

spesifitas. Daerah yang dikenali dan daerah yang dipotong enzim tersebut

bersifat spesifitas dan terletak pada bagian yang sama. Enzim ini sangat

stabil dan hanya memerlukanMg2+ sebagai kofaktor. Enzim restriksi

endonuklease tipe II dapat dibedakan atas urutan nukleotida yang dikenali

yaitu berupa urutan empat, lima atau enam basa yang spesifik, sampai saat

ini telah ratusan macam tipe II yang berhasil diisolasi dari bermacam-macam

bakteri. Contohnya enzim EcoRI yang diisolasi dari bakteri Escherichia coli

RY13. Enzim endonuklease restriksi tipe II merupakan kelompok enzim yang

banyak digunakan dalam teknologi DNA rekombinan (rekayasa genetik)

untuk memotong DNA secara spesifik. Endonuklease tipe III juga memotong

DNA pada bagian yang spesifik tetapi pada daerah yang bedekatan dengan

daerah pengenalannya. Enzim ini juga memerlukan ATP dan Mg2+ untuk

aktivitasnya, tetapi tidak mempunyai aktifitas Atpase serta tidak memrlukan

S-adenosil metionin sperti enzim endonuklease restriksi tipe I. Salah satu

contoh endonuklease restriksi tipe III adalah enzim Hgal, yang mengenali

basa nukleotida 5-GACGC-3, tetapi memotong urutan basa pada urutan

kelima atau urutan kesepuluh yang dikenali tersebut. Enzim tipe ini sangat

jarag digunakan dalam teknologi DNA rekombinan