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PRACTICA
N2
DETERMINACION DE LA LONGITUD DE ONDA DOMINANTE EN
ESPECTROFOTOMETRIA

I OBJETIVOS

Conocer el procedimiento de la determinacin de la longitud de onda

dominante en alimentos lquidos transparentes tales como jugos y extractos
vegetales.

II. FUNDAMENTO

La radiacin al incidir sobre una muestra liquida produce el efecto de absorcin

de esta energa por los solutos que se encuentran en la muestra. Esta
absorcin es mxima a una determinada longitud de onda a la que se le
conoce con el nombre longitud de onda determinante.

Los componentes que se encuentren en los alimentos lquidos tienen diferentes

estructuras qumicas, y cada uno de ellas absorbe diferentes cantidades de
energa radiante a diferentes longitudes de onda. De ah que sea necesario
utilizar todas las longitudes de onda dentro del rango de luz visible para
encontrar la longitud de onda dominante de cada muestra.

ESPECTROFOTOMETRIA

La espectrofotometra es el mtodo de anlisis ptico ms usado en las

investigaciones biolgicas. El espectrofotmetro es un instrumento que permite
comparar la radiacin absorbida o transmitida por una solucin que contiene
una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida
de la misma sustancia.

Todas las sustancias pueden absorber energa radiante, aun el vidrio que
parece ser completamente transparente absorbe longitud de ondas que
pertenecen al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la regin del
infrarrojo.

La absorcin de las radiaciones ultravioleta, visibles e infrarrojas depende de la

estructura de las molculas, y es caracterstica para cada sustancia qumica.

Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energa es absorbida; la

energa radiante no puede producir ningn efecto sin ser absorbida.

El color de las sustancias se debe a que stas absorben ciertas longitudes de

onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos
aquellas longitudes de onda no absorbida.

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III. MATERIALES Y METODOS

1. MATERIALES
Muestras: 20ml de jugos y extractos vegetales (muestras) naranja,
limn, espinaca, pia, sandia, tomate.
Espectrofotmetro
Agua destilada
Papel secante
Vasos de 50 ml

FIGURA 1 FIGURA 2

FIGURA 3

2. PROCEDIMIENTO

2.1) Preparacin de la muestra

Se compraron las frutas y vegetales que sern utilizados en las

pruebas. Se lavan y pican y luego se someten aun estrujados o a un
licuado manual o aparatos adecuados. Posteriormente deben ser colados
quedndonos sola y nicamente con la parte liquida de los productos los
cuales se sometern al espectrofotmetro.

2.2) Determinacin de la longitud de onda dominante

1.- Conectar el espectrofotmetro media hora antes de la prueba.

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2.- En una cubeta colocar agua destilada e introducir la cubeta dentro

del espectrofotmetro. Leer el % de transmitancia a 400nm si el
resultado es 100% transmitancia continuar con la prueba.
3.- Colocar la muestra en una segunda cubeta y remplazar la cubeta
con agua dentro del espectrofotmetro y leer la absorbancia y anotar.
4.- Repetir el procedimiento anterior cambiando su longitud de onda
determinante a 420nm, 440nm, hasta alcanzar los 700nm.

2.3) Manejo de datos

1. Construir la grfica Absorbancia vs. Longitud de onda

correspondiente a cada muestra.
2. En cada una de las curvas obtenidas encontrar la longitud de onda
correspondiente a la mxima absorcin.

MUESTRA 1 :SANDIA
15

10

ABSORVANCIA ABSORVANCIA
5

0
200 400 600 800
LONGITUD DE ONDA

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MUESTRA 2: NARANJA
20
15

ABSORVANCIA 10 ABSORVANCIA
5
0
200 400 600 800
LONGITUD DE ONDA

MUESTRA 5: TOMATE
8
6
ABSORVANCIA 4 ABSORVANCIA
2
0
200 400 600 800
LONGITUD DE ONDA

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MUESTRA 3:LIMON
20

15

ABSORVANCIA 10 ABSORVANCIA

0
200 400 600 800
LONGITUD DE ONDA

MUESTRA 4:ZANAHORIA
2

1.5

ABSORVANCIA 1 ABSORVANCIA

0.5

0
200 400 600 800
LONGITUD DE ONDA

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IV RESULTADOS Y DISCUSIONES

CUADRO N 1: VALORES OBTENIDOS EN EL ESPECTOFOTOMRTRO

TRANSMITAN (T)
CA
M1: M2: M3: M4: M5:
nm SANDIA NARANJA LIMON ZANAHOR TOMATE
IA
400 0.2 4.1 0.9 0.1 0.1
420 0.8 4.9 2.7 0.5 0.9
440 0.8 5.0 3.8 0.5 0.9
460 2.0 6.1 5.0 0.9 1.4
480 2.3 6.9 5.1 0.3 0.9
500 2.6 8.0 5.9 0.2 1.0
520 2.8 9.2 6.7 0.2 1.1
540 3.5 10.5 7.5 0.2 1.4
560 4.3 10.6 8.8 0.9 1.9
580 5.9 12.8 9.8 1.4 2.7
600 7.2 13.0 10.1 0.8 3.0
620 9.2 13.9 10.8 0.9 4.0
640 10.4 14.1 11.8 1.1 4.5
660 11.4 14.9 12.2 1.2 5.1
680 12.7 16.1 13.7 1.3 5.6
700 13.6 17.4 14.9 1.5 6.0

DISCUSION: En el cuadro anterior podemos observar los valores que se

obtuvieron al medir con el espectrofotmetro cada una de las muestras.
Notando claramente la variacin de los valores para cada una de las
mismas.

CUADRO N2: VALORES DE ABSORVANCIA

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ABSORVANCI (A)
A
LONGIT M1: M2: M3: M4: M5:
U DE SANDIA NARANJA LIMON ZANAHORI TOMATE
ONDA A
nm
400 2.0457574
2.69897 1.38721614 9 3 3
420 1.5686362 2.045757
2.09691001 1.30980392 4 2.30103 49
440 2.045757
2.09691001 1.30103 1.4202164 2.30103 49
460 2.0457574 1.853871
1.69897 1.21467016 1.30103 9 96
480 1.2924298 2.5228787 2.045757
1.63827216 1.16115091 2 5 49
500 1.2291479
1.58502665 1.09691001 9 2.69897 2
520 1.958607
1.55284197 1.03621217 1.1739252 2.69897 31
540 1.1249387 1.853871
1.45593196 0.9788107 4 2.69897 96
560 1.0555173 2.0457574 1.721246
1.36653154 0.97469413 3 9 4
580 1.0087739 1.8538719 1.568636
1.22914799 0.89279003 2 6 24
600 0.9956786 2.0969100 1.522878
1.1426675 0.88605665 3 1 75
620 0.9665762 2.0457574 1.397940
1.03621217 0.8569852 4 9 01
640 0.85078089 0.9281179 1.9586073 1.346787
0.98296666 A= 2- 9Log T 1 49
660 0.82681373 0.9136401 1.9208187 1.292429
0.94309515 7 5 82
680 0.8632794 1.8860566 1.251811
0.89619628 0.79317412 3 5 97
700 0.8268137 1.8239087 1.221848
0.86646109 0.75945075 3 4 75

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V. CONCLUSIONES

El espectrofotmetro es un instrumento que permite comparar la

radiacin absorbida o transmitida por una solucin que contiene una
cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad
conocida de la misma sustancia.

En la prctica realizada se observ que a cada longitud de onda le

corresponda un espectro de luz diferente para cada una de las pruebas
realizadas a las muestras utilizadas.

La absorbancia, la longitud de onda y la transmitancia son algunos de los

parmetros que utilizamos para realizar clculos y comparaciones de los
valores obtenidos.

VI BIBLIOGRAFIA

F.PINO PEREZ,D.PEREZ.BENDITO.1983.Analisis de Elementos-traza por

espectrofotometra de absorcin molecular uv-visible, Espectrofotometra
UV-visible,Instrumentacion,Capitulo 6,Publicaciones del Monte de Piedad
y Caja de Ahorros de Crdova y Universidad de Sevilla, Imprenta San
Pablo Crdoba, pg. 123.
Romulo Ochoa Luna,1988,determinacin de slice por espectrofotometra
infraroja,Revista de Quimica PUCP,pag 2.
Harol F. Walton,Jorge Reyes ,2005,Analisis Qui,ico e Instrumental
Moderno,,Potenciometriaph medicion,EditorialReverte.S.A Barcelona-
Bogota-Buenos Aires-Caracas-Rio de Janeiro,pag 100.

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LONGITUD DE ABSORVANCIA LONGITUD DE ABSORVANCIA

ONDA (nm) ONDA (nm)
400 0.2 100 4.1
420 0.8 120 4.9
440 0.8 440 5.0
460 2.0 460 6.1
480 2.3 480 6.9
500 2.6 500 8.0
520 2.8 520 9.2
54 3.5 540 10.5
0560 4.3 560 10.6
580 5.9 580 12.8
600 7.2 600 13.0
620 9.2 620 13.9
640 10.4 640 14.1
660 11.4 660 14.9
680 12.7 680 16.1
700 13.6 700 17.4

ANEXOS

TABLA N1 : MUESTRA DE SANDIA TABLA N2: MUESTRA DE NARANJA

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TABLA N3: MUESTRA DE LIMON TABLA N4:MUESTRA DE

TOMATE

LONGITUD DE ABSORBANCIA
LONGITUD DE ABSORVANCIA
ONDA (nm)
ONDA (mn)
400 0.1
400 0.9
420 0.9
420 2.7
440 0.9
440 3.8
460 1.4
460 5.0
480 0.9
480 5.1
TABLA N5:MUESTRA DE ZANAHORIA 500 1.0
500 5.9
520 1.1
520 6.7
LONGITUD DE 540
ABSORVANCIA 1.4
540 7.5
560 1.9
560 8.8ONDA (nm)
580 9.8400 0.1580 2.7
420 0.5600 3.0
600 10.1
440 0.5620 4.0
620 10.8
640 460
11.8 0.9640 4.5
480 0.3660 5.1
660 12.2
500 0.2680 5.6
680 13.7
520 0.2700 6.0
700 14.9
540 0.2
560 0.9
580 1.4
600 0.8
620 0.9
640 1.1
660 1.2
680 1.3
700 1.5

MTODOS FOTOMTRICOS DE ANLISIS

1. NATURALEZA DE LA RADIACIN ELECTROMAGNTICA

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La Radiacin Electromagntica es una forma de Energa radiante que se

propaga en forma de ondas. En este fenmeno ondulatorio se define:

a) Longitud de onda (l): es la distancia entre dos mximos de un

ciclo completo del movimiento ondulatorio. Se expresa, segn el S.I. en
nanmetros (nm) y sus equivalencias son: 1nm = 1mm =10 A0 = 10-9 m.

b) Frecuencia (n): es el nmero de ciclos por segundo. Es inversa a

la longitud de onda. Su frmula es: n = c/l, y se mide en ciclos por segundo o
hertzios.

c) Fotones: la luz est formada por fotones, y estos son paquetes

discontinuos de E. La E de un fotn depende de la frecuencia y de la longitud
de onda, segn la siguiente expresin: E = h x n = h x c/n (h = Cte. de Planck
= 6,62.10-27erg/seg.). La Energa Electromagntica se mide el Ergios. La
relacin entre la longitud de onda y la Energa es inversa, por lo tanto a menor
longitud de onda mayor Energa y viceversa.

d) Espectro Electromagntico: cubre un amplio intervalo de E

radiante, desde los rayos g de longitud de onda corta hasta las ondas de radio,
de longitud de onda larga. Se divide en varias regiones, las ms interesantes
para nosotros son:

Regin Ultravioleta: l = 10-380 nm

Regin Visible: l = 380-780 nm

Regin Infrarroja: l = 780-30.000 nm

En la Regin Visible, la luz se descompone en colores. La luz blanca contiene

todo el espectro de longitudes de onda. Si interacciona con una molcula
puede ser dispersada o absorbida.

2. FENMENOS DE INTERACCIN ENTRE LUZ Y MATERIA

A. FENMENO DE ABSORCIN

Cuando una partcula que se encuentra en estado de reposo o estado

fundamental interacciona con un haz de luz, absorbe E y se transforma en una
partcula en estado excitado. La molcula absorbe la E de la onda y aumenta
su energa, y ese aumento de energa es igual a la E de la Radiacin
Electromagntica absorbida (E = h.n). La partcula en estado excitado tiende a

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volver de forma espontnea a su estado de reposo desprendiendo la

E absorbida en forma de calor.

Espectro de Absorcin. Cada especie absorbente, que recibe el nombre de

cromgeno, tiene un determinado espectro de absorcin. El espectro de
absorcin es un grfico donde se representa en ordenadas la Absorbancia y en
abcisas la longitud de onda. La medida de la cantidad de luz absorbida por una
solucin es el fundamento de la espectrofotometra de absorcin.

Por eso es importante trabajar a la longitud de onda a la que la sustancia

estudiada absorbe la mayor cantidad de luz (a mayor cantidad de luz, mayor
cantidad de sustancia).

B. FENMENO DE EMISIN

Algunos compuestos, tras ser excitados por la luz, vuelven al estado

fundamental produciendo la emisin de energa radiante. En este caso, lo que
se mide es la energa emitida y, en este fenmeno se basa la fotometra de
llama o la fluorescencia.

3. LEYES DE ABSORCIN

Cuando un haz de luz pasa a travs de un medio, se registra una cierta prdida
de intensidad, debido a la absorcin por parte de la sustancia.

Se llama TRANSMITANCIA (T) a la relacin entre la luz incidente y la luz

transmitida:

T = Is / I0 ; %T = (Is / I0 ) x 100.

Se puede perder intensidad por la interaccin con la cubeta o el solvente. Para

evitar este error se hace una primera medida con una solucin de referencia o
BLANCO, que contiene todos los posibles compuestos que intervienen en la
lectura menos el que vamos a medir. Todas las medidas que se hagan con
posterioridad sern referidas a esta medida inicial y se harn en la misma
cubeta que se utiliz en la medida del blanco.

La Transmitancia se usa poco, se emplea ms la Absorbancia (A) porque la

relacin entre A y la concentracin de una solucin es directamente
proporcional y la de la T es inversamente proporcional.

La relacin entre la absorbancia y la transmitancia es la siguiente:

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- Si el %T = 100 A = 2-log T = 2-log 100 = 0

- Si el %T = 0 A = 2-log 0 =

En los aparatos que se usan actualmente se presentan absorbancias, pero el

aparato lo que mide realmente es %T que luego transforma a absorbancia.

3.1. LEY DE BEER

La absorbancia de una solucin es directamente proporcional ala

concentracin y a la longitud del paso de la luz.

A = e . b. c

Siendo:

A: absorbancia. No tiene unidades.

e: el coeficiente de extincin molar, tambin llamado coeficiente de absorcin.

Es constante para un compuesto dado siempre que se fijen condiciones de
longitud de onda, de pH, de temperatura, de solventes, etc. Sus unidades son
1/ (mol/cm).

b: es la longitud de paso de la luz, en cm.

c: es la concentracin del absorbente. Se mide en mol/L.

La aplicacin prctica de la Ley de Beer es, que conociendo la absorbancia de

una sustancia podemos averiguar su concentracin y esto lo podemos hacer de
dos formas:

1. Por comparacin con una solucin conocida: si tenemos 2

soluciones, una problema (P) y una estndar (S), podemos establecer la
siguiente relacin matemtica entre ellas:

2. A travs de una curva de calibracin: la curva de

calibracin es la representacin grfica en un eje de coordenadas de la
Absorbancia (eje de ordenadas) frente a la Concentracin (eje de abcisas). Se
ensayan varias soluciones de concentracin conocida y se determinan sus A,
construyndose la curva de calibrado, que es una recta. Una vez ensayadas las
soluciones problemas, su concentracin se averigua por interpolacin de las A
de las soluciones problema en la curva de calibracin.

Hay que tener en cuenta la LINEALIDAD, que es el intervalo de

concentraciones del cromgeno entre las cuales existe una relacin lineal entre
Absorbancia y Concentracin.

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Cuando la concentracin del cromgeno sobrepasa los lmites de linealidad

se deja de cumplir la Ley de Beer, convirtindose la recta en una curva. La
lectura de la Absorbanciafuera de los lmites de linealidad se traduce en una
concentracin falsamente baja de cromgeno. En esta situacin, hay que diluir
la muestra para que su concentracin entre en los lmites de la linealidad.

Empleo de los Factores de

Calibracin: Para reactivos estables y sistemas fotomtricos estables, este
factor se puede mantener constante, siendo slo necesario ensayar las
muestras problema multiplicando la A resultante por el factor F.

4. ESPECTROFOTMETRO

Se distinguen dos tipos de aparatos:

Fotmetro o Colormetro: se caracterizan porque utilizan filtros que solo

permiten el paso de una determinada longitud de onda.

Espectrofotmetros: utilizan cromadores. Con ellos se obtiene un haz de luz

monocromtico cuya longitud de onda se vara a voluntad. Los
monocromadores pueden ser de dos tipos: prismas y redes de difraccin.

Monocromador de Prisma

2.2. COMPONENTES DEL ESPECTROFOTMETRO

1. Fuente de luz: proporciona energa radiante en forma de luz visible o no

visible.

Tipos de lmparas:

- Lmparas de filamento de tungsteno: se utilizan para

longitudes de onda del espectro visible y el ultravioleta prximo. Son fuentes
de un espectro continuo de energa radiante entre 360-950 nm.

- Lmparas de filamentos de haluros de tungsteno: son

de mayor duracin y emiten energa radiante de mayor intensidad.

- Lmparas de Hidrgeno y Deuterio: producen un

espectro continuo en la regin ultravioleta entre 220-360 nm.

- Lmparas de vapores de Mercurio: Emiten un espectro

discontinuo o espectro de lneas que se utilizan para calibracin de longitudes
de onda, se emplean solo para espectrofotmetros y cromatografa HPLC.

Precauciones:

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- Las subidas y bajadas bruscas de tensin producen sufrimiento de la

lmpara y cambios en las lecturas de la Absorbancia.

- La lmpara tiene una vitalidad limitada y se debe vigilar para que funcione
bien el aparato.

(03/10/01)

2. Rendija de entrada: tiene como funcin reducir al mximo la luz difusa y

evitar que la luz dispersa entre en el sistema de seleccin de longitud de onda.

3. Monocromadores. Pueden ser:

- Prismas: son fragmentos con forma de cua de un

material que permite el paso de la luz. Ej. De vidrio para trabajar en el espectro
visible o cuarzo para trabajar en el ultravioleta lejano.

- Redes de difraccin: son un gran nmero de lneas

paralelas situadas a distancias iguales entre s y son hendiduras sobre un vidrio
o una superficie metlica. Cada una de estas hendiduras se comporta como un
pequeo prisma.

4. Rendija de salida: tiene como funcin impedir que la luz difusa atraviese la
cubeta de la muestra, que provocara desviaciones a la Ley de
Beer. (04/10/01)

5. Cubeta: es el recipiente donde se coloca la muestra para la medicin.

Pueden ser de distintos tipos y tamaos (cuadradas, rectangulares, redondas).
Se obtienen mejores resultados usando cubetas de bordes paralelos. Si se
utilizan cubetas redondas se deben marcar e introducir en el aparato siempre
en la misma posicin. Suelen estar fabricadas en vidrio o en plstico.

6. Detector. Puede ser de dos tipos:

Fotoclulas o clulas fotovoltaicas:

Es una lmina de Cobre sobre la que se extiende una capa de Selenio o de

xido de Cobre. A sto se le conoce como semiconductor. Sobre el
semiconductor hay una capa de metal transparente que sirve de electrodo. La
luz incide sobre el Selenio y ste desprende electrones, que pasan a la placa de
Cobre originando una diferencia de potencial por existir carga negativa sobre el

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Cobre y positiva sobre el Selenio. El conjunto se conecta a un ampermetro que

seala el paso de corriente.

Caractersticas: son resistentes; econmicas; sensibles desde el ultravioleta

hasta los 1.000 nm. de longitud de onda; no se requiere batera externa, ni
vaco,...; la corriente producida es directamente proporcional a la Energa que
llega y tienen efecto fatiga, es decir, que presentan una subida inicial de
corriente, que luego decrece progresivamente hasta el equilibrio. Por eso hay
que esperar entre 30-60 segundos entre una lectura y otra.

Fototubos multiplicadores:

Un fototubo multiplicador es un tubo que contiene un ctodo que emite

electrones de forma proporcional a la Energa que incide sobre l. Tiene un
nodo que recoge los electrones y la corriente se multiplica varias veces al
chocar los electrones sobre sucesivos nodos que van teniendo un voltaje
superior al precedente. La seal se amplifica en cientos o miles de veces.

Caractersticas: el tiempo de respuesta es muy rpido, no tienen efecto

fatiga tan altos como la anterior y son muy sensibles.

7. Medidor: son sistemas de lectura de la Energa elctrica que recoge el

detector y que puede ser lectura directa (se utiliza una clula fotovoltaica) o
puede ser amplificadores de seal como en el caso del fototubo multiplicador.
Los actuales aparatos incorporan lectura digital y clculos automticos de
concentraciones con relacin a las curvas de calibracin.

4.2 TIPOS DE APARATOS

ESPECTROFOTMETRO DE HAZ SIMPLE: es igual que la

descripcin dada para el espectrofotmetro en general. Consta de los mismos
elementos (Ej. Bilirrubinmetro: para determinar bilirrubina directa en capilar).

ESPECTROFOTMETRO DE DOBLE HAZ EN EL ESPACIO:

todos los componentes estn duplicados, menos la lmpara y el medidor. Dos
haces de luz pasan al mismo tiempo por los distintos componentes separados
en el espacio. Esto compensa las variaciones de intensidad de luz y de
absorbancia.

ESPECTROFOTMETRO DE HAZ DOBLE EN EL

TIEMPO: utilizan los mismos componentes que el espectrofotmetro de haz
simple. Dos haces de luz pasan por los mismos componentes pero no al mismo

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tiempo. Emplean un Chopper consistente en un interruptor rotativo del haz

luminoso colocado a continuacin de la rendija de salida. Un sistema de
espejos dirige la porcin de luz reflejada por el chopper a travs de una
cubeta de referencia y de ah al detector comn. El detector lee
alternativamente el haz procedente de la muestra y el de la cubeta de
referencia. Esto compensa la variacin de energa radiante.

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