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Microbiologa de

Alimentos

Dpto. Qumica Orgnica

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS


CURSO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS

Tema Pgina

Enterococos 3
Estafilococos 4
Enterobacterias 5
Bacterias esporuladas 11
Bacillus 11
Clostridium 12
Clasificacin e identificacin de hongos y levaduras 14
Anlisis de micotoxinas en alimentos 16
Anlisis de leche fluida 19
Anlisis de leche en polvo 24
Anlisis de mantecas y margarinas 31
Anlisis de helados 38
Anlisis de conservas 43
Recuento de filamentos de hongos en conservas. Cmara de Howard 48
Anlisis de azcar 50
Anlisis de carnes y productos crnicos 53
Anlisis de alimentos deshidratados 68
Anlisis de agua 72

Tablas de NMP 76
Bibliografa 79
Anexo - Bioseguridad 80

2
ENTEROCOCOS

-Objetivos:

-Introduccin de los medios de cultivo y pruebas bioqumicas caractersticas de Enterococcus


faecalis. Pruebas bioqumicas diferenciales de otras bacterias relacionadas.

- Anlisis de las cepas

1) Realizar la tincin de Gram.

2) Prueba de la Catalasa: Se emulsiona un ansa de cultivo en una gota de H2O2 10% sobre
portaobjetos. La efervescencia causada por la liberacin de O2 indica la presencia de catalasa.

3) Sembrar en caldo infusin cerebro corazn o caldo glucosa e incubar a 10, 37, y 45C
durante 48 h.

4) Sembrar en caldo infusin cerebro corazn o caldo glucosa a pH 9,6 e incubar a 37C
durante 48 h.

5) Sembrar en caldo infusin cerebro corazn o caldo glucosa al 6.5 % de NaCl e incubar a
37C durante 48 h.

6) Sembrar en KF Streptococcus agar. Para observar la selectividad del medio estriar sobre
una mitad de la placa una cepa conocida no Enterococcus y en la otra mitad la cepa de
Enterococcus a investigar. Incubar a 37C, 48 h. Las colonias tpicas son pequeas de color
rojo y el medio alrededor de las mismas vira al amarillo.

7) Sembrar en agar bilis-esculina. Incubar a 37C, 48 h. Las colonias tpicas son pequeas y
oscuras y el medio alrededor queda oscurecido.

3
ESTAFILOCOCOS

-Objetivos:

-Introduccin de los medios de cultivo y pruebas bioqumicas caractersticas de


Staphylococcus aureus. Pruebas bioqumicas diferenciales de otras bacterias relacionadas.

- Anlisis de las cepas

1) Realizar la tincin de Gram.

2) Prueba de la Catalasa: Se emulsiona un ansa de cultivo en una gota de H2O2 10% sobre
portaobjetos. La efervescencia causada por la liberacin de O2 indica la presencia de catalasa.

3) Sembrar por estra en agar manita (Medio110 para estafilococos) dos cepas de
Staphylococcus sp. con distintas propiedades bioqumicas. Incubar a 37C, 48 h. Revelar con
solucin saturada de sulfato de amonio o con HCl diluido para evidenciar la gelatinlisis.
Revelar con prpura de bromocresol para la fermentacin del manitol.

4) Sembrar en el medio Baird-Parker por estra dos cepas de Staphylococcus sp. Incubar a
37C, 48 h. Las colonias tpicas de S. aureus son circulares, suaves, convexas, de 2 a 3 mm de
dimetro en placas poco crecidas, de grises a negras, rodeadas de un halo opaco y,
frecuentemente de un halo claro ms externo. Ocasionalmente se encuentran cepas no
lipolticas que no presentan halos. La apariencia puede ser seca y el color menos intenso si
proviene de un alimento congelado o desecado.

5) Prueba de la Coagulasa: Colocar 0,5 ml de plasma, de conejo o humano, citratado, diluido


en solucin fisiolgica, en un tubo de ensayo pequeo. Agregar un ansa de cultivo e incubar a
37C. La aparicin de grumos o cogulos en el trmino de 1 a 4 horas indica que la cepa es
coagulasa (+). Paralelamente hacer un blanco sin sembrar y un testigo con cepa de
estafilococo coagulasa (+).

6) Prueba de la Termonucleasa: Las placas de Baird-Parker en las que se observan colonias


tpicas se colocan en estufa de 60C durante 2 hs para inactivar las nucleasas termosensibles.
Luego de la inactivacin verter en cada placa 10 ml de TDA (agar con ADN y azul de
toluidina) fundido. Incubar a 37C durante 2 a 4 horas. La hidrlisis del DNA se evidencia
por la aparicin de halos claros alrededor de las colonias.

7) Fermentacin de manitol en anaerobiosis


Sembrar en caldo para fermentacin con manitol. Cubrir con vaselina. Incubar a 37C, 48 h.

4
ENTEROBACTERIAS

- Objetivos

-Reconocimiento de los grupos de microorganismos marcadores y patgenos ms importantes


dentro de los miembros de esta familia.
-Introduccin de los medios de cultivo y pruebas bioqumicas caractersticas de estos
microorganismos.
-Aplicacin de tcnicas serolgicas para la identificacin de Salmonella.

- Anlisis de las cepas

MARCADORES

1) Familia Enterobacteriaceae
Se trabajar con una cepa de enterobacteria y otra no enterobacteria.

a) Siembra en agar de aislamiento por la tcnica de vertido en placa. Observacin de


colonias tpicas.

- Con cada una de las cepas 1), a partir de una suspensin bacteriana sembrar 1 ml en una
placa de Petri y volcar agar Bilis Rojo Violeta Glucosa (ABRV-G), fundido y mantenido a
44-46C. Homogeneizar rotando la placa. Confeccionar una sobrecapa de aproximadamente
10 ml del mismo medio fundido, mantenido a 44-46C. Dejar solidificar. Incubar las placas
en posicin invertida a 35-37C durante 21+3 h. Observar las colonias. Se consideran
presuntas unidades formadoras de colonias de enterobacterias las colonias de color
prpura con halo de precipitacin.

b) Confirmacin de colonias tpicas. Caractersticas morfolgicas y pruebas bioqumicas.

- Transferir una colonia tpica de cada una de las placas a tubos de caldo glucosa y agar
nutritivo. Incubar a 35-37 C durante 21+3 h.
- A partir del cultivo, realizar tincin de Gram. Observar al microscopio.
- A partir del agar inclinado realizar la prueba de la oxidasa.
- Observar la fermentacin de glucosa por viraje del indicador cido base.
Las colonias presuntivas que resulten bacilo-cocos Gram negativos no esporulados,
oxidasa negativas y fermentadoras de glucosa confirman la presencia de
Enterobacteriaceae.

2) Coliformes totales
Se trabajar con una cepa de coliformes y otra no coliforme.

a) Siembra en medio lquido (caldo de fermentacin). Observacin de reaccin caracterstica.


Confirmacin en medio slido EMB, colonias tpicas de coliformes totales.

- Con cada cepa 2) sembrar 1 tubo de fermentacin de caldo Lactosa-Verde Brillante-2%


sales biliares, con campanitas Durham. Incubar 35-37C durante 48 h. Se considera reaccin
positiva la produccin de gas en la campanita de Durham.

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- Confirmacin.
A partir de los tubos positivos, estriar una placa de agar EMB (Eosina Azul de Metileno)
segn Levine. Incubar 24 h a 35-37C.
Colonias metlicas, rosadas/rojas o de apariencia mucosa confirman la presencia de
coliformes totales.

b) Siembra en medio slido ABRV-L (agar Bilis-Rojo-Violeta-Lactosa). Observacin de


colonias tpicas. Confirmacin en medio lquido (caldo de fermentacin), reaccin positiva
caracterstica de coliformes totales.

- Con cada una de las cepas 2), a partir de una suspensin bacteriana, sembrar por vertido en
placa 1 ml en una placa de Petri y volcar agar ABRV-L fundido y mantenido a 44-46C.
Dejar solidificar y cubrir con sobrecapa de aproximadamente 10 ml del mismo medio fundido
y mantenido a 44-46C. Dejar solidificar. Incubar las placas invertidas 24 h a 35-37C.
Colonias de color rojo oscuro con halo de precipitacin de sales biliares no menor de 0,5
mm se consideran presuntas unidades formadoras de colonias de coliformes.

- Confirmacin.
Sembrar colonias tpicas del ABRV-L en tubos de fermentacin de caldo Lactosa-Verde
Brillante-2% sales biliares, con campanitas de Durham. Incubar uno a 35-37C. La
produccin de gas en la campanita de Durham confirma coliformes totales.

3) Coliformes a 45C (coliformes fecales)


A partir de los tubos positivos 2) a), inocular un tubo de fermentacin de caldo EC. Incubar
24 h a 45C. La produccin de gas en la campanita de Durham confirma coliformes a
45C.

4) Escherichia coli
Se trabajar con una cepa pura de Escherichia coli y de otra bacteria coliforme.

a) Agar de aislamiento: EMB (agar eosina azul de metileno segn Levine).


Sembrar ambas cepas por estra una placa de EMB segn Levine. Incubar 24 h a 37C.
Colonias con centro negro con o sin brillo metlico verde son caractersticas de
Escherichia coli.

b) Caractersticas morfolgicas y pruebas bioqumicas


A partir de cada cepa
b.1) Realizar tincin de Gram.
b.2) Prueba de oxidasa.
b.3) Inocular un tubo de caldo triptona. Incubar 24 h a 37C.
b.4) Inocular un tubo de caldo Clark y Lubs (RMVP). Incubar 24 h a 37C.
b.5) Inocular por estra un tubo de agar Citrato Simons. Incubar 24 h a 37C.

Investigacin de Indol -Tcnica de Kovacs:


Agregar al cultivo de b.3) 0,2-0,3 ml de reactivo y agitar. Esperar unos minutos.
Coloracin roja en al parte superior del tubo indica formacin de Indol (+).

Investigacin de acidez - Prueba del Rojo de Metilo: Partir el cultivo de b.4) en dos alcuotas,
en una de ellas agregar 5 gotas de reactivo, observar inmediatamente.
Color rojo indica acidez (+).
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Caractersticas del indicador Rojo de Metilo:
pH < 4,4 rojo
4,4 < pH < 6 rango de viraje del indicador
pH > 6 amarillo

Investigacin de acetil metil carbinol - Tcnica de Voges-Proskauer modificada por Barrit.


Sobre la otra alcuota del cultivo de b.5) agregar respetando el orden:
- 0,6ml de - naftol al 5% y
- 0,2ml de KOH al 40%
Agitar el tubo suavemente para exponer el medio al oxgeno atmosfrico y oxidar la acetona
(acetil metil carbinol) y permitir el desarrollo de color. Dejar descansar por lo menos 10-15
minutos.
El mximo desarrollo de color se observa luego de una hora.
Color rosado en la superficie: produccin de acetona (+), VP (+).
Color amarillo o cobrizo: no produccin de acetona, VP (-).

Investigacin de utilizacin de citrato (b.5): Los microorganismos que son capaces de utilizar
el citrato producen cambio de color en el medio (de verde a azul). Se considera citrato (+) el
desarrollo de color azul.

Resultados tpicos de Escherichia coli:


b.1) Bacilo coco Gram negativo sin esporas
b.2) Oxidasa (-)
b.3) Indol (+) (algunas cepas (-))
b.4) Rojo de Metilo (+)
b.4) Voges Proskauer (-)
b.5) Citrato (-)

PATGENOS

Salmonella spp.
Se trabajar con una cepa pura de Salmonella spp. y de otra enterobacteria.

a) Medios slidos (agar) de aislamiento. Observacin de colonias tpicas.

A partir de cada cepa


a) Sembrar por estra en agar Verde Brillante.
b) Sembrar por estra en agar Bismuto-Sulfito.
c) Sembrar por estra en agar Desoxicolato-Citrato (Leifson)
d) Sembrar por estra en agar Salmonella-Shigella.

Incubar las placas invertidas a 37C durante 24 h. Observar las colonias resultantes.

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Colonias tpicas de Salmonella spp.

- Agar VB: colonias pequeas, traslcidas e incoloras u opacas de un color intermedio entre
rosa y fucsia. El medio vira al rojo brillante.
- Agar Bismuto-Sulfito: colonias con centro negro, borde claro, precipitado negro con brillo
metlico alrededor (ojo de conejo u ojo de pez ).
- Agar Leifson: colonias rosa plido hasta incoloras, de 1mm de dimetro.
- Agar Salmonella-Shigella: colonias pequeas, entre incoloras y rosa plido, opacas y
traslcidas. Algunas cepas dan colonias con centro negro (SFe). El medio vira al amarillo.

b) Caractersticas morfolgicas, pruebas bioqumicas, confirmacin serolgica.


A partir de cada cepa
b.1) Realizar tincin de Gram.
b.2) Prueba de oxidasa.
b.3) TSI. Sembrar por puncin y en superficie. Incubar a 37C, 24 h.
b.4) LIA. Sembrar por puncin y en superficie. Incubar a 37C, 24 h.
b.5) BAM. Sembrar por puncin con ansa recta. Incubar a 37C, 24 h. Alternativamente se
puede utilizar caldo urea.
b.6) Prueba de la -galactosidasa: a partir de un cultivo en agar inclinado, tomar un ansa bien
cargada y emulsionarla en 0,2 ml de solucin salina fisiolgica hasta conseguir una
suspensin densa. Colocar un disco de ONPG. Incubar a 37C por 20 minutos. Observar hasta
las 4 horas de incubacin para dar un informe negativo. El color amarillo indica que la
reaccin es positiva.
b.7) Inocular un tubo de caldo triptona. Incubar 24 h a 37C.
b.8) Inocular un tubo de caldo Clark y Lubs (RMVP). Incubar 24 h a 37C.

Resultados tpicos de Salmonella sp.


b.1) Bacilo coco Gram negativo sin esporas
b.2) Oxidasa (-)
b.3) TSI: profundidad: amarillo o negro, con o sin ruptura del agar por formacin de gas/
superficie inclinada: rojo o sin variacin.
Salmonella es lactosa (-), la mayora de las cepas y sacarosa (-), la mayora de las cepas.
b.4) LIA: profundidad: violeta o negro (negro en la mayora de los casos)/superficie
inclinada: violeta Salmonella es lisina decarboxilasa (+)
Excepcin: Salmonella paratyphi A: profundidad: amarillo
superficie inclinada: violeta
b.5) BAM:
- medio sin cambio de color. Salmonella es siempre ureasa (-), lac (-), la mayora de las cepas
- mvil en la mayora de los casos
- indol (-)
- H2S (+) en la mayora de los casos
- sin formacin de gas
b.6) -galactosidasa: (-), sin cambio de color.
b.7) Indol (-)
b.8) Voges Proskauer (-)

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Identificacin serolgica de Salmonella sp.

Toda cepa sospechosa de Salmonella debe identificarse bioqumicamente antes de efectuar el


anlisis serolgico. De lo contrario aglutinaciones positivas podrn ser originadas por otros
grmenes que poseen estrecha relacin antignica (Arizona, Citrobacter).
Las cepas sujetas a examen serolgico debern hallarse en su forma lisa (S), ya que en forma
rugosa (R), pueden perder sus caracteres especficos dando aglutinaciones falsas.

Sueros polivalentes somticos de Salmonella


Los sueros polivalentes somticos son 6: OS-A, OS-B, OS-C, OS-D, OS-E, OS-F.
Composicin:
Los sueros OS-A y OS-B tienen las siguientes aglutininas correspondientes a los grupos
antignicos Kauffman-White que se detallan:

OS-A: OS-B:
Grupo Aglutinina___ Grupo Aglutinina___
A 1,2 y 12 B 1, 4, 5 y 12
C1 6y7 D1 1, 9 y 12
C2 6y8 D2 9 y 46
F 11 E1 3 y 10
G1 1, 13 y 22 E4 1, 3 y 19
G2 13 y 23 L 21
H 6, 14 y 24
C3 8 y 20

Cabe sealar que los sueros OS-A y OS-B permiten identificar alrededor del 98% de los
serotipos ms frecuentes de Salmonella.
Cuando una cepa de Salmonella (identificada previamente por sus caractersticas
bioqumicas), no d aglutinacin con ninguno de los sueros polivalentes somticos, es
necesario tener en cuenta que la cepa puede:
a) presentar antgenos de envoltura V (Salmonella typhi), que inhibe la aglutinacin O.
b) ser un secretorio no incluido en la lista (caso muy excepcional).

Tcnica:

Aglutinacin somtica:
-Preparacin del antgeno: utilizar un cultivo de estras de 24 h de incubacin a 37C.
Suspender el crecimiento de la estra con 1ml de solucin fisiolgica.
-Reaccin: sobre lmina de vidrio depositar una gota de c/u de los 2 sueros polivalentes
somticos y los monovalentes. Colocar al lado de cada suero, una gota de suspensin
antignica. Mezclar con un ansa previamente flameada y enfriada.
-Lectura: debe ser inmediata y no despus de 5 minutos. Las reacciones tardas o dudosas no
deben considerarse.

Aglutinacin flagelar:
-Preparacin del antgeno: a partir de una colonia de Salmonella, hacer un cultivo de 24 h en
caldo. Luego agregar igual volumen de solucin formolada al 5%.
-Reaccin: en distintos tubos de ensayos colocar una gota de cada uno de los sueros
polivalentes y monovalentes ciliares. Agregar en cada uno 0,5 ml de la suspensin antignica.
Incubar en bao mara a 50C.
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-Lectura: se efectuar al cabo de una hora de incubacin. Debe considerarse nicamente la
aglutinacin de tipo ciliar (flculos esponjosos, fcilmente disociables)
Si una cepa de Salmonella (previamente confirmada por su aglutinacin somtica), no
reacciona con ninguno de los sueros ciliares polivalentes hay que tener en cuenta que puede:
a) Tratarse de una variante inmvil
b) Presentar otro tipo de antgeno ciliar no incluido en la lista.

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BACTERIAS ESPORULADAS

Gnero Bacillus

- Objetivo

Observar la morfologa tpica de colonias de Bacillus cereus en medios usados para su


aislamiento y recuento en alimentos; diferenciarlo de otras especies de Bacillus, y realizar las
pruebas bioqumicas tiles para su identificacin.

- Anlisis de las cepas

1) Coloracin de Gram: realizar la coloracin segn la tcnica descripta en la gua de medios


de cultivo. Observar forma y tincin de las clulas vegetativas, forma y disposicin de las
esporas.

2) Utilizacin de azcares: sembrar una ansada del cultivo en cada uno de los tubos de caldo
con azcares (glucosa-xilosa-arabinosa-manitol). Incubar 24-48 h a 37C. Observar la
produccin de cido y/o gas.

3) Reduccin de nitratos: sembrar una ansada del cultivo en caldo nitrato. Incubar 24 h a
37C. Agregar los reactivos y observar.

4) Produccin de acetoina: (VP) sembrar una ansada del cultivo en el medio VP modificado.
Incubar 48 h a 37C. Agregar los reactivos A y B y agitar. Agregar unos cristales de creatina.
Leer el resultado luego de 1 h a temperatura ambiente.

5) Movilidad: inocular por puncin el medio de movilidad. Incubar 24 h a 37C. Observar


crecimiento.

6) Catalasa: sembrar por estra un tubo con agar nutritivo inclinado. Incubar 24 h a 37C
Colocar una ansada del cultivo sobre un portaobjeto y agregar unas gotas de H2O2 al 30%.
Observar.

7) Hidrlisis de gelatina: inocular el medio por puncin. Incubar 24 h a 37C. Enfriar en


heladera y observar el resultado.

8) Hidrlisis de almidn: sembrar una sola estra en agar almidn. Incubar 24 h a 37C.
Agregar solucin de lugol y observar.

9) Hidrlisis de casena: sembrar una estra o cuatro puntos en agar leche descremada o agar
casena. Incubar 24 h a 37C.

10) Lecitinasa: sembrar cuatro puntos en una placa de agar MYP (agar manitol-yema de
huevo-polimixina). Incubar 24 h a 37C .Observar morfologa de las colonias.

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Gnero Clostridium

- Objetivo

Observar la morfologa tpica de colonias de C. perfringens en medios usados para su


aislamiento y recuento en alimentos; diferenciarlo de otras especies del mismo gnero;
familiarizarse con los distintos mtodos de anaerobiosis.

- Anlisis de las cepas

1) Coloracin de Gram: realizar la tcnica descripta en la gua de reactivos y medios de


cultivo. Observar forma y tincin de las clulas vegetativas, forma y disposicin de las
esporas.

2) Coloracin de esporas: realizar la coloracin de verde de malaquita. Observar las esporas.

3) Utilizacin de azcares: sembrar 0,2 ml del cultivo en cada uno de los tubos de caldo con
azcares (glucosa- maltosa-salicina-rafinosa-etc.), sin burbujear. Incubar 48 h a 37C.
Agregar unas gotas de indicador. Observar acidez y/o gas.

4) Reduccin de nitrato/movilidad: sembrar una ansada por puncin en un tubo de agar


semislido de nitrato. Incubar 24 h a 37C. Agregar unas gotas de los reactivos. Observar los
resultados.

5) Hidrlisis de la gelatina: sembrar 0,2 ml del cultivo en el fondo de un tubo con agar
gelatina-lactosa, sin burbujear. Incubar 24 h a 37C. Enfriar en heladera y observar el
resultado.

6) Hidrlisis de almidn: sembrar por estra en agar almidn. Incubar en anaerobiosis 24 h a


37 C. Agregar solucin de lugol y observar los resultados.

7) Leche: sembrar 0,2-0,5 ml del cultivo en un tubo con leche. Incubar 24 h a 37C. Observar
coagulacin y degradacin del cogulo, por digestin de casena. Observar formacin de gas.

8) Hidrlisis de casena: sembrar por estra en agar casena. Incubar en anaerobiosis 24 h a


37C. Observar resultados.

9) Esporulacin: sembrar 0,2 ml del cultivo en caldo Duncan-Strong al fondo y sin burbujear.
Incubar 24 h a 37 C. Realizar tincin de esporas.

10) Prueba de reduccin de sulfito: inocular 0,2 ml del cultivo en agar hierro-sulfito
(SPS/TSN/TSC) fundido y mantenido a 45C. Dejar solidificar e incubar 24 h a 37C.
Observar la formacin de colonias negras en el agar.

11) Lecitinasa: sembrar por estra en agar yema de huevo o similar. Incubar 24 h a 37C.
Observar precipitado alrededor de las colonias.

12) Caldo de hgado con hgado: inocular 0,2 ml del cultivo en el caldo hgado + hgado.
Sellar con vaselina-parafina. Incubar 24 h a 37C. Observar ennegrecimiento y digestin de la
carne (protelisis) o enrojecimiento (sacarlisis) y/o produccin de gas.
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Observaciones: los tubos con medios lquidos se cubren con vaselina o con vas-par (vaselina-
parafina)

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CLASIFICACION E IDENTIFICACION DE MOHOS Y LEVADURAS

I. MOHOS

El estudio de los hongos se basa en las siguientes caractersticas:


a) Si las hifas son tabicadas o no.
b) Si el micelio es claro u oscuro.
c) Si se producen o no esporas sexuales.
d) Tipos de esporas asexuales (esporangiosporas, conidios, artrosporas, blastosporas).
e) Aspecto de los esporangiforos y conidiforos: tipos de ramificacin.
f) Presencia de estructuras y de esporas especiales, estolones, rizoides, clamidosporas, etc.

Plan de trabajo:

Se proveer de distintos hongos que han crecido en un medio apropiado en tubo de ensayo y
con cada uno de ellos se harn microcultivos en la siguiente forma:
a) Se recortan cuadrados pequeos de agar Czapek con una esptula estril.
b) Se colocan sobre un portaobjetos.
c) Se hacen toques en el centro de cada lado con un ansa contaminada con el hongo en
estudio.
d) Se coloca encima un cubreobjetos de mayor tamao que el trozo de agar.
e) Se coloca el conjunto en una caja de Petri estril que contiene algodn hmedo.
f) Se incuba a temperatura ambiente y se hacen observaciones peridicas a partir de las 48 h
para estudiar las distintas fases de crecimiento.

II. LEVADURAS

Para identificar las levaduras deben conocerse sus caractersticas morfolgicas y bioqumicas.
Entre los datos morfolgicos figuran aspecto del cultivo en agar extracto de malta, o en el
medio de Sabouraud, tamao y forma de las clulas vegetativas, formacin del micelio y
pseudomicelio, produccin de ascosporas, tamao y nmero de las mismas. Como datos
bioqumicos interesa:
- habilidad para fermentar azcares.
- utilizacin de fuentes de C y N para su crecimiento (mtodo auxonogrfico).

Observaciones microscpicas

Las clulas provenientes de medios lquidos pueden observarse directamente entre porta y
cubreobjetos. Las levaduras provenientes de medios slidos pueden observarse mejor si se
las mezcla sobre el portaobjetos con una gota de nigrosina al 5% en solucin acuosa. La
observacin al microscopio se hace por inmersin.

Coloracin de esporas

Se usa el mismo mtodo que para las bacterias.

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Aislamiento de mohos y levaduras

En el caso de los mohos o las levaduras que se encuentran en un producto mezclados con las
bacterias, para separarlos de stas deben usarse medios de cultivo que favorezcan el
desarrollo de los primeros. En general se obtienen buenos resultados empleando:
- medios a base de infusin de vegetales, con el agregado de azcares, por ej. agar-papa-
glucosa-cido tartrico. El cido tartrico se emplea para llevar el pH a 3,5 pues as se inhibe
el crecimiento de casi todas las bacterias.
- agar papa-dextrosa con agregado de 40 g/g de cloranfenicol.
Los medios deben incubarse a temperatura comprendida entre 20 y 25 C.

15
ANALISIS DE AFLATOXINAS EN ALIMENTOS

Existen dos tipos bsicos de mtodos para el anlisis de aflatoxinas en alimentos:

a) mtodos biolgicos: realizados sobre animales de prueba sensibles al efecto txico (en
este caso generalmente se utilizan patos de un da pero tambin pueden emplearse embriones
de pollo, larvas de peces, etc.).
Son de utilidad para los estudios confirmatorios, particularmente cuando surgen dificultades
analticas en el caso de ciertos alimentos. Pero estos mtodos insumen demasiado tiempo para
el anlisis de rutina como el que se precisa en un programa de control de calidad y para este
fin se requieren mtodos qumicos.

b) mtodos qumicos: el procedimiento para la determinacin de aflatoxinas en un dado


producto consta en rasgos generales de las siguientes etapas:
1) muestreo y preparacin de muestra para el anlisis.
2) desgrasado (es necesario cuando el material contiene ms del 5% de aceite).
3) extraccin de la toxina utilizando un solvente adecuado.
4) purificacin del extracto para eliminar material fluorescente interferente.
5) determinacin de la concentracin, generalmente por cromatografa en placa delgada,
en la cual se observa la fluorescencia caracterstica de estas sustancias con luz
ultravioleta.
Segn el producto que se deba analizar, algunas de estas etapas pueden omitirse.
En algunos productos, especialmente en el caso de granos y semillas, la etapa de muestreo
presenta dificultades. Esto se debe a la falta de homogeneidad de los lotes respecto a la
contaminacin con aflatoxinas, ya que estas se encuentran, por lo general, en una proporcin
muy pequea en los granos y es difcil obtener una muestra representativa en condiciones
prcticas.
La seleccin del mtodo a utilizar depende fundamentalmente del producto y del nmero de
muestras a analizar. Por ejemplo, en algunos casos la etapa de desgrasado puede omitirse y la
eliminacin del aceite se realiza junto con la extraccin, como veremos para el caso del man.
En los casos en que hay interferencia fluorescente es necesario incluir una etapa de
purificacin en columna cromatogrfica.

AFLATOXINAS. REGLAMENTO TCNICO SOBRE LMITES MXIMOS DE


MERCOSUR. GMC RES No 056/94 (RES MS y AS No 110 del 4.04.95)

ALIMENTO AFLATOXINA LIMITE


Leche
Leche fluida M1 0,5 g/l
Leche en polvo M1 5,0 g/kg
Maz
Maz en grano (entero, partido, aplastado, mondado) B1+ B2+ G1+ G2 20 g/kg
Harinas o smolas de maz B1+ B2+ G1+ G2 20 g/kg
Man
Man (sin descascarar, descascarado, crudo o tostado) B1+ B2+ G1+ G2 20 g/kg
Man en ( pasta de man o manteca de man B1+ B2+ G1+ G2 20 g/kg

16
METODO PARA ANALIZAR AFLATOXINAS EN MUESTRAS DE MANI
(AOAC 970.45 1995)
1) Extraccin

1 - Tomar 100 g de muestra molida y colocar en una licuadora junto con 4 g de NaCl, 500 ml
de metanol-agua (55+45) y 200 ml de hexano.
2 - Licuar 1 minuto a alta velocidad.
3 - Filtrar por papel de filtro.
4 - Tomar 25 ml de la solucin metanol-agua (capa inferior) y colocarla en una ampolla de
decantacin con 25 ml de cloroformo.
5 - Tapar la ampolla de decantacin y agitar 1 minuto.
6 - Recoger la capa clorofrmica (inferior) y llevar a sequedad en bao mara bajo corriente
de nitrgeno o en un evaporador rotatorio.
7- Determinar la presencia de aflatoxinas por cromatografa en capa delgada.

2) Determinacin de aflatoxinas por cromatografa en capa fina

Utilizar placas de slica gel G o GF 254 segn Sthal, de 250 micrones de espesor, activadas a
80C durante dos horas. Los sistemas de solventes que se utilizan son: acetona-cloroformo
(1+9) y benceno-acetona-cido actico (80+9+10) a temperatura ambiente.

Se utilizan cubas sin saturar y sin papel.

1 - Tomar el extracto seco con 250 microlitros de cloroformo.


2 - Sembrar en la placa 10 microlitros de la muestra a analizar, 10 microlitros de la muestra
con 10 microlitros de estndar interno y 10 microlitros de estndar.
3 - Correr la muestra durante 45 min (hasta que el solvente est a 5 mm del borde superior de
la placa).
4 - Secar la placa boca arriba y en posicin horizontal preferentemente en la oscuridad.
5 - Observar a la luz ultravioleta.
La ausencia de fluorescencia en los 10 microlitros de muestra sembrada indica menos de 25
microgramos/kg de aflatoxina.

3) Cuantificacin por el mtodo de comparacin visual

1- Sembrar 2, 5 y 10 microlitros de aflatoxina B1 (estndar) y desarrollar el cromatograma.


2- Comparar la intensidad de fluorescencia de las manchas del extracto con la intensidad de
fluorescencia de las manchas del estndar.
3- Aplicar la siguiente ecuacin:

Vs . Cs . Md
Concentracin de aflatoxina (microgramos/kg) = ---------------------
Vx . P

Vs: volumen de estndar (microlitros) cuya intensidad de fluorescencia es igual a la que


presenta un determinado volumen de muestra.

Cs: concentracin del estndar de aflatoxina B1 en microgramos/ml.

17
Md: volumen (microlitros) de la dilucin final del extracto de muestra (para este caso 250
microlitros).

Vx: volumen de muestra (microlitros) cuya intensidad de fluorescencia es igual a la de Vs.

P: masa (g) de la muestra original en el extracto final (en este caso 5 g).

18
ANLISIS MICROBIOLGICO DE LECHE FLUIDA

1) Toma de muestra
Cuando el muestreo de leche fluida se realiza a partir de los tanques o tarros de las granjas
utilizados para el transporte a granel, los tanques de almacenamiento de las centrales lecheras
o los tanques mviles de almacenamiento hay que asegurarse de que se haya mezclado el
contenido hasta hacerlo homogneo. Se vierte entonces una cantidad adecuada de leche en
condiciones aspticas en los recipientes de muestreo, utilizando para ello un cucharn o tubo
de muestreo esterilizado para cada muestra (ICMSF recomienda tomar por lo menos 30 ml de
muestra). Estas muestras se enfran inmediatamente mantenindolas a una temperatura de 0-
4C, y se envan al laboratorio.
Cuando se trata de un producto final envasado (como la leche pasteurizada), es preferible
llevar la muestra al laboratorio sin abrir. Se enfran y se llevan al laboratorio lo ms
rpidamente posible para que puedan comenzar los ensayos antes de que transcurran 36 h.
Previamente al anlisis se mezcla la muestra cuidadosamente agitando o invirtiendo el
recipiente con el fin de lograr una distribucin uniforme de los microorganismos en la
muestra.

2) Preparacin de la muestra
Colocar 1 ml de leche en un tubo de dilucin que contiene 9 ml de agua peptona al 0,1%.
Mezclar bien y realizar las diluciones siguientes tomando siempre 1 ml y transfiriendo este
volumen a 9 ml del medio de dilucin. Se hacen tantas diluciones como sean necesarias.

3) Metodologa de anlisis

a) Recuento microscpico directo (recuento de bacterias totales en leche)


b) Recuento de bacterias aerobias mesfilas
c) Recuento de bacterias psicrotrficas
d) Recuento de coliformes totales
e) Determinacin de coliformes totales
f) Recuento de coliformes a 45C
g) Determinacin de Escherichia coli

a) Recuento microscpico directo (recuento de bacterias totales en leche)


Mtodo de Breed-Newman (APHA, 1976)
El mtodo consiste en contar los microorganismos vivos y muertos de la muestra. La validez
de este mtodo se limita a las muestras con recuentos elevados, mientras que aporta escasa
informacin respecto a las muestras que contienen un nmero reducido de microorganismos

Preparacin de la pelcula
1- Mezclar bien la muestra por agitacin.
2- Transferir 0,01 ml al recuadro de un portaobjeto especial limpio. El recuadro marcado tiene
1 cm de lado.
3- Distribuir el material sobre el recuadro mediante un ansa cuyo extremo forme un pequeo
ngulo recto.
4- Secar el extendido al aire o bien colocndolo sobre una chapa caliente, cuidando que no
sobrepase los 45C.
5- Los extendidos de los alimentos ricos en grasa deben ser desengrasados sumergindolos en
xileno durante 5 minutos.
6- Luego de secar al aire se lo fija sumergindolo en alcohol absoluto durante 2-3 minutos.
19
7- Sin secarlo se lo tie con la solucin colorante sumergindolo durante 30 segundos. El
exceso de colorante es eliminado colocando el borde del portaobjeto sobre un papel
absorbente.
8- Secar cuidadosamente al aire y, una vez seco, sumergir en una cubeta con agua lo
necesario como para que sta no tome color. Secar al aire.

Solucin colorante
Solucin madre al 2% de Azul de Metileno en alcohol absoluto 96. Se toman 30 ml de la
solucin madre y se diluyen con agua destilada hasta 1 litro.

Examen microscpico
La pelcula se examina primero con un objetivo seco de gran apertura y despus con el
objetivo de inmersin.
Se calculan los microorganismos presentes en 1 ml de la porcin de muestra de la siguiente
manera: cuando las clulas de un mismo tipo morfolgico se presentan en racimos, stos se
cuentan como unidades individuales, slo si la distancia entre las clulas es igual o mayor al
doble del dimetro menor de las dos clulas que estn ms prximas entre s; las clulas de
morfologa diferente o con tincin diferente se cuentan como unidades tambin diferentes
independientemente de su proximidad a las dems clulas.
Para examinar una parte representativa de la pelcula, se escoge un campo de partida situado a
la misma distancia de cualquiera de los dos lados (punto medio del preparado sobre uno de
los lados) y dos o tres campos adentro a partir del borde (superior o inferior). Se cuentan los
campos de una serie a travs de la pelcula en forma horizontal, y despus se empieza a contar
desde el centro que habamos tomado como punto de partida una serie de campos separados
en un sentido perpendicular a la primera serie.
Si fuese necesario examinar un nmero mayor de campos, se repite la seleccin de campos
segn la explicacin anterior, partiendo de un punto situado a 2 mm de distancia de la primera
serie elegida. Se contarn entre 30 y 60 campos. Si el nmero de microorganismos es menor
de 30000 bacterias/ml g, se efectuar el recuento de 60 campos. Si es de 30000 bacterias/ml
g a 300000 bacterias/ml g basta el recuento de 20 a 30 campos. Si es mayor a 300000
bacterias/ml g se recuentan tantos campos como fuesen necesarios para obtener 150 a 200
grmenes en la suma de todos ellos.

Clculo
Se calcula el valor promedio de grmenes por campo y se multiplica este valor por el factor
microscpico (FM) y por (la inversa de la alcuota tomada) el nmero recproco de la
dilucin:

RECUENTO Promedio de Recproca de la


MICROSCPICO = microorganismos por campo * FM * dilucin
DIRECTO/ml g

Donde FM = 100/A. A es el rea del campo microscpico (la mayora de los microscopios
para alumnos tienen un dimetro de campo de 0,16 mm). FM = 4970/cm

b) Recuento de bacterias aerobias mesfilas (FIL 100B: 1991)


1- Se vierte 1 ml de cada dilucin por duplicado en placas de Petri y se agrega el agar para
recuento (APC) con 0,1 % de leche en polvo descremada ya fundido y mantenido a aprox. 44-

20
46C. Se mezcla para lograr una distribucin homognea. Siguiendo las mismas indicaciones,
sembrar tres diluciones sucesivas.
2- Cuando las placas estn fras se invierten y se incuban a 30C 1C durante 72h 3h.
3- Se cuentan las colonias y se calcula el valor de recuento total siguiendo las pautas dadas en
el captulo de muestreo. Se seleccionan las placas con recuento entre 25 y 250 colonias, se
multiplica el nmero promedio de colonias contadas en las placas por el factor de dilucin
correspondiente y se informa como UFC de bacterias aerobias mesfilas/ml g.

c) Recuento de bacterias psicrotrficas (APHA, 1992)


Este recuento puede realizase bajo diferentes combinaciones de temperatura/tiempo.
1- Se procede de la misma forma que para el recuento de aerobios (b) pero incubando a 7C
por 10 das (, 21C por 25 horas , 18C por 45 horas). Se informa UFC de bacterias
psicrtrofas /ml g

d) Recuento de coliformes totales (FIL 73 A: 1985)


El recuento de coliformes totales puede realizarse por recuento en placa con medio slido o
en medio lquido (por la tcnica de NMP: nmero ms probable).

d.1) Recuento en placa. Agar Bilis Rojo Violeta- lactosa (ABRV-lactosa)


Sembrar 1 ml de dos diluciones sucesivas por duplicado en placas de Petri. Agregar aprox.
12 ml de agar ABRV fundido a aprox. 44-46C. Mezclar. Dejar solidificar completamente y
agregar entonces 4 ml ms de medio fundido. Dejar enfriar e incubar las placas invertidas a
30C por 22-26 h.
Seleccionar las diluciones que presenten entre 10 y 150 colonias. Contar las colonias rojas
oscuras con dimetro de por lo menos 0,5 mm, caractersticas de bacterias coliformes.
Confirmacin: Tomar entre 5 y 10 colonias del ABRV y transferirlas a tubos de fermentacin
con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares (cada colonia a un tubo distinto).
Incubar a 30C por 22-26 h. Se consideran positivas aquellas colonias que den produccin de
gas.
El resultado se calcula en base al nmero de colonias confirmadas. Se expresa como UFC de
coliformes totales /ml g.
La confirmacin de las colonias es especialmente recomendable para el caso de alimentos que
contengan otros azcares distintos de lactosa.

d.2) Tcnica del nmero ms probable (NMP)


Prueba presuntiva
Inocular por triplicado 1ml de muestra y de las diluciones sucesivas en tubos de fermentacin
con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares. Incubar a 30C por 48 h. Se
consideran positivos aquellos tubos que presenten formacin de gas en la campanita de
Durham.
De ser necesario, inocular 10 ml de muestra en vez de 1 ml. En este caso se utilizarn tubos
doble concentracin de caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares.

21
Prueba de confirmacin
Estriar cada tubo presuntamente positivo en agar EMB (agar eosina azul de metileno).
Incubar a 30C por 22-26 h. Se consideran colonias de coliformes las de aspecto oscuro
rojo/rosado y/o mucoso, con o sin brillo metlico.
Registrar el nmero de tubos positivos de cada dilucin. Con la ayuda de una tabla de
Nmero Ms Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes totales/ml g de muestra,
teniendo en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas.

e) Determinacin de coliformes totales (Basado en Mossel, 1985)


Inocular 1 ml de muestra en 10 ml de caldo triptona peptona de soja (CTS).
Incubar a 20-25C por 5-6 h. Agitar bien y volcar en un tubo que contenga 10 ml de caldo
Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares doble concentrado (con campanita de Durham).
Incubar a 30C 1C durante 18-24 h.
Los tubos en los que no se verifique formacin de gas se consideran negativos. En este caso
se informa ausencia de coliformes totales en 1 ml.
Agitar bien el contenido de los tubos positivos, resembrar por estra en agar EMB. Incubar a
371C por 24 horas. Las colonias tpicas de coliformes son oscuras, rojas-rosadas o
mucosas. Si se verifica crecimiento de estas caractersticas, se informa presencia de
coliformes en 1 ml.

f) Recuento de coliformes a 45C (APHA, 1992)


A partir de los tubos positivos en d.2 (coliformes totales a 30C, por NMP), inocular un tubo
de fermentacin de caldo EC. Incubar 24 h a 45C. La produccin de gas en la campanita de
Durham confirma coliformes a 45C (coliformes fecales).
Registrar el nmero de tubos positivos de cada dilucin. Con la ayuda de una tabla de
Nmero Ms Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes a 45C/ml g de muestra,
teniendo en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas.

g) Determinacin de Escherichia coli (Mossel y Moreno Garca, "Microbiologa de los


alimentos. Fundamentos ecolgicos para garantizar y comprobar la inocuidad y calidad de los
alimentos."; Ed. Acribia, 1985).
Inocular 1 ml de muestra en 10 ml de caldo triptona peptona de soja (CTS).
Incubar a 20-25C por 5-6 h. Agitar bien y volcar en un tubo que contenga 10 ml de caldo
Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares doble concentrado (con campanita de Durham).
Incubar a 30C 1C durante 18-24 h.
Los tubos en los que no se verifique formacin de gas se consideran negativos. En este caso
se informa ausencia de E. coli
Agitar bien el contenido de los tubos positivos, resembrar por estra en agar Mac Conkey.
Incubar a 44C0,1C (preferentemente en bao de agua) durante 30 h. Si existiese
crecimiento tpico (colonias rojas), tomar colonias aisladas y realizarles:
1- Gram
2- Siembra en tubo de fermentacin caldo verde brillante 2% sales biliares con
lactosa. Incubar a 44C por 48 horas.
3- Siembra en caldo triptona. Incubar a 44C por 48 horas
4- Siembra en agar citrato. Incubar a 30C por 48 horas.

Resultados caractersticos:
1- Cocobacilo Gram negativo no formador de esporas.
2- Fermentacin de lactosa a 44C con formacin de gas.

22
3- Produccin de indol a 44C
4- No utiliza citrato

Alternativamente se pueden utilizar las pruebas del IMViC para la identificacin.


De ser posible ensayar el cultivo sospechoso con un sistema de pruebas mltiples (API,
MICRO-ID, o semejantes).
En caso de confirmarse, informar presencia de E. coli en 1 ml de muestra. Indicar las
pruebas de identificacin realizadas.

4) Antibiticos en leche
Durante el tratamiento de la mastitis, se usan antibiticos que pueden aparecer eventualmente
en la leche de los animales bajo tratamiento. Los antibiticos residuales, pueden producir
interferencias en el proceso de fermentacin lctica, que se lleva a cabo para la fabricacin de
quesos y otros productos lcteos.

Investigacin de antibiticos
Un ensayo prctico consiste en calentar 100 ml de leche en un erlenmeyer por 2-5 minutos a
83C (para evitar falsos positivos debido a sustancias inhibidoras naturales en la leche cruda
que la pasteurizacin reduce pero no elimina completamente). Enfriar a 45C y agregar una
cucharadita de yogurt (Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus). Incubar a
45C y examinar a las 2-3 h. Si la leche no ha coagulado es probable la presencia de
antibiticos.

23
ANLISIS DE LECHE EN POLVO

1) Toma de muestra
Para el muestreo, es preferible tomar como muestra los recipientes o paquetes originales, sin
abrir. Cuando haya que muestrear productos a granel, la muestra se tomar en un punto cerca
del centro del recipiente que la contiene, si es posible, quitando la capa superficial de polvo
con un instrumento esterilizado, y extrayendo despus la muestra con una cuchara o varilla
esterilizada. ICMSF recomienda para cada producto a granel tomar no menos de 30 g.

2) Preparacin de la muestra
Con una cuchara estril mezclar el contenido del frasco de leche en polvo. Pesar
aspticamente 10 g de muestra en un erlenmeyer que contenga 90 ml de agua peptona 0,1%
previamente calentada a no ms de 45C. Agitar hasta disolucin de grumos.
Preparar las siguientes diluciones transfiriendo 1 ml a un tubo con 9 ml de agua peptona al
0,1%.
La mayora de las leches en polvo pueden ser disueltas en agua peptona al 0,1% o en solucin
salina de fosfatos tamponada. Las muestras ms insolubles (por ejemplo leches de alta acidez)
se disuelven bien agregando 1,25 % de citrato de sodio a la solucin de fosfatos.

3) Metodologa de anlisis

a) Recuento microscpico directo (recuento de bacterias totales en leche)


b) Recuento de bacterias aerobias mesfilas
c) Recuento de coliformes totales
d) Recuento de coliformes a 45C
e) Recuento de Staphylococcus aureus
f) Determinacin de Salmonella

a) Recuento microscpico directo (recuento de bacterias totales en leche)


Mtodo de Breed-Newman (APHA, 1976)
El mtodo consiste en contar los microorganismos vivos y muertos de la muestra. La validez
de este mtodo se limita a las muestras con recuentos elevados, mientras que aporta escasa
informacin respecto a las muestras que contienen un nmero reducido de microorganismos.

Preparacin de la pelcula
1- Mezclar bien la muestra por agitacin.
2- Transferir 0,01 ml al recuadro de un portaobjeto especial limpio. El recuadro marcado tiene
1 cm de lado.
3- Distribuir el material sobre el recuadro mediante un ansa cuyo extremo forme un pequeo
ngulo recto.
4- Secar el extendido al aire o bien colocndolo sobre una chapa caliente, cuidando que no
sobrepase los 45C.
5- Los extendidos de los alimentos ricos en grasa deben ser desengrasados sumergindolos en
xileno durante 5 minutos.
6- Luego de secar al aire se lo fija sumergindolo en alcohol absoluto durante 2-3 minutos.
7- Sin secarlo se lo tie con la solucin colorante sumergindolo durante 30 segundos. El
exceso de colorante es eliminado colocando el borde del portaobjeto sobre un papel
absorbente.

24
8- Secar cuidadosamente al aire y, una vez seco, sumergir en una cubeta con agua comn lo
necesario como para que sta no tome color. Secar al aire.

Solucin colorante
Solucin madre al 2% de Azul de Metileno en alcohol absoluto 96. Se toman 30 ml de la
solucin madre y se diluyen con agua destilada hasta 1 litro.

Examen microscpico
La pelcula se examina primero con un objetivo seco de gran apertura y despus con el
objetivo de inmersin.
Se calculan los microorganismos presentes en 1 ml de la porcin de muestra de la siguiente
manera: cuando las clulas de un mismo tipo morfolgico se presentan en racimos, stos se
cuentan como unidades individuales, slo si la distancia entre las clulas es igual o mayor al
doble del dimetro menor de las dos clulas que estn ms prximas entre s; las clulas de
morfologa diferente o con tincin diferente se cuentan como unidades tambin diferentes
independientemente de su proximidad a las dems clulas.
Para examinar una parte representativa de la pelcula, se escoge un campo de partida situado a
la misma distancia de cualquiera de los dos lados (punto medio del preparado sobre uno de
los lados) y dos o tres campos adentro a partir del borde (superior o inferior). Se cuentan los
campos de una serie a travs de la pelcula en forma horizontal., y despus se empieza a
contar desde el centro que habamos tomado como punto de partida una serie de campos
separados en un sentido perpendicular a la primera serie.
Si fuese necesario examinar un nmero mayor de campos, se repite la seleccin de campos
segn la explicacin anterior, partiendo de un punto situado a 2 mm de distancia de la primera
serie elegida. Se contarn entre 30 y 60 campos. Si el nmero de microorganismos es menor
de 30000 bacterias/ml g, se efectuar el recuento de 60 campos. Si es de 30000 a 300000
grmenes /ml g basta el recuento de 20 a 30 campos. Si es mayor a 300000 grmenes /ml
g se recuentan tantos campos como fuesen necesarios para obtener 150 a 200 grmenes en la
suma de todos ellos.

Clculo
Se calcula el valor promedio de grmenes por campo y se multiplica este valor por el factor
microscpico (FM) y por (la inversa de la alcuota tomada) el nmero recproco de la dilucin

RECUENTO Promedio de Recproca de la


MICROSCPICO = microorganismos por campo * FM * dilucin
DIRECTO/ml g

Donde FM = 100/A. A es el rea del campo microscpico (la mayora de los microscopios
para alumnos tienen un dimetro de campo de 0,16 mm). FM = 4970/cm

b) Recuento de bacterias aerobias mesfilas (FIL 100B: 1991)


1- Se vierte 1 ml de cada dilucin por duplicado en placas de Petri y se agrega el agar para
recuento (APC) con 0,1 % de leche en polvo descremada ya fundido y mantenido a aprox. 44-
46C. Se mezcla para lograr una distribucin homognea.
Siguiendo las mismas indicaciones, sembrar tres diluciones sucesivas.
2- Cuando las placas estn fras se invierten y se incuban a 30C 1C durante 72h 3 h.
3- Se cuentan las colonias y se calcula el valor de recuento total siguiendo las pautas dadas en
el captulo de muestreo. Se seleccionan las placas con recuento entre 25 y 250 colonias, se

25
multiplica el nmero promedio de colonias contadas en las placas por el factor de dilucin
correspondiente y se informa como UFC de bacterias aerobias mesfilas/g.

c) Recuento de coliformes totales (FIL 73 A:1985)


El recuento de coliformes totales puede realizarse por recuento en placa con medio slido o
en medio lquido (por la tcnica de NMP: nmero ms probable).

c.1) Recuento en placa. Agar Bilis Rojo Violeta- lactosa (ABRV-lactosa)


Sembrar 1 ml de dos diluciones sucesivas por duplicado en placas de Petri.
Agregar aprox. 12 ml de agar ABRV fundido a aprox. 44-46C. Mezclar. Dejar solidificar
completamente y agregar entonces 4 ml ms de medio fundido. Dejar enfriar e incubar las
placas invertidas a 30C por 22-26 h.
Seleccionar las diluciones que presenten entre 10 y 150 colonias. Contar las colonias rojas
oscuras con dimetro de por lo menos 0,5 mm, caractersticas de bacterias coliformes.
Confirmacin: Tomar entre 5 y 10 colonias del ABRV y transferirlas a tubos de fermentacin
con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares (cada colonia a un tubo distinto).
Incubar a 30C por 22-26 h. Se consideran positivas aquellas colonias que den produccin de
gas.
El resultado se calcula en base al nmero de colonias confirmadas. Se expresa como UFC de
coliformes totales/g.
La confirmacin de las colonias es especialmente recomendable para el caso de alimentos que
contengan otros azcares distintos de lactosa.

c.2) Tcnica del nmero ms probable (NMP)


Prueba presuntiva
Inocular por triplicado 1ml de muestra y de las diluciones sucesivas en tubos de fermentacin
con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares. Incubar a 30C por 48 h. Se
consideran positivos aquellos tubos que presenten formacin de gas en la campanita de
Durham.
De ser necesario, inocular 10 ml de muestra en vez de 1 ml. Se utilizarn tubos doble
concentrado de caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares.

Prueba de confirmacin
Estriar cada tubo presuntamente positivo en agar EMB (agar eosina azul de metileno).
Incubar a 30C por 22-26 h. Se consideran colonias de coliformes las de aspecto oscuro/
rojo/rosado y/o mucoso, con o sin brillo metlico.
Registrar el nmero de tubos positivos de cada dilucin. Con la ayuda de una tabla de
Nmero Ms Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes totales/g de muestra, teniendo
en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas.

d) Recuento de coliformes a 45C (APHA, 1992)


A partir de los tubos positivos c.2 (coliformes totales a 30C, por NMP), inocular un tubo de
fermentacin de caldo EC. Incubar 24 h a 45C. La produccin de gas en la campanita de
Durham confirma coliformes a 45C (coliformes fecales).
Registrar el nmero de tubos positivos de cada dilucin. Con la ayuda de una tabla de
Nmero Ms Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes a 45C/g de muestra, teniendo
en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas.

26
e) Recuento de Staphylococcus aureus (FIL 145:1990)
Se recomienda realizar el recuento sembrando por duplicado cada dilucin.
En caso de requerir un inculo ms grande por un valor bajo del requisito microbiolgico de
aceptacin, puede hacerse una siembra combinada de la siguiente forma:
Distribuir 1 ml de dilucin 1/10 equitativamente en la superficie de tres placas de agar Baird
Parker perfectamente secas. Distribuir con una esptula de Drigalsky cuidadosamente (tener
la precaucin de enfriar bien la esptula para no matar los microorganismos). Dejar secar las
placas tapadas sin invertir a temperatura ambiente por aproximadamente 15 minutos. Una vez
secas, incubarlas invertidas a 37 1C durante 24-48 h.
Tomar para enumerar placas con no ms de 150 colonias. Seleccionar un nmero
representativo de colonias tpicas y atpicas; y transferirlas a tubos de caldo infusin cerebro-
corazn. Incubar a 37C 35C por 20 a 24 h.
Las colonias tpicas son negras, brillantes y convexas rodeadas de una zona clara,
generalmente un halo opaco rodea a la colonia por dentro de la zona clara.

Identificacin y confirmacin
Sobre los cultivos puros de 20-24 horas, realizar:
- Tincin de Gram
- Catalasa
- Coagulasa (comparar con cepa patrn): Agregar 0,1 ml del cultivo a aprox. 0,3 ml de plasma
de conejo reconstituido en un tubo estril. Incubar a 35-37C. Examinar despus de 4 a 6
horas. El cogulo formado debe ser firme y organizado (3+) o que no se cae al invertir el tubo
(4+).
Realizar un control empleando 0,1 ml de caldo BHI estril en lugar del cultivo. Para que el
ensayo sea vlido, no debe observarse ningn signo de coagulacin.
Complementariamente puede realizarse la prueba de la termonucleasa sobre la misma placa
de Baird Parker.

S. aureus coagulasa positiva son cocos Gram positivos, catalasa positivo, coagulasa positivo
(3 o 4+) y termonucleasa positivo.
Informar UFC de S. aureus coagulasa positivo/ g de muestra. Para realizar el clculo contar
el nmero total de colonias confirmadas en las tres placas.

f) Determinacin de Salmonella (FIL 93 A: 1985)


Preenriquecimiento en medio lquido
Preparar un erlenmeyer con 225 ml de agua destilada con 1 ml de solucin de Verde Brillante
(0,5% en agua, agregar verde brillante al agua; dejar la solucin en la oscuridad por lo menos
un da para autoesterilizar).
Pesar aspticamente 25g de muestra en dicho erlenmeyer. Dejar a temperatura ambiente
durante aproximadamente 1 h sin agitar. Incubar a 37C durante 16-20 h.
Si al cabo de 3 h de incubacin todava no se ha disuelto la leche en polvo, agitar el frasco
para mezclar su contenido.

Enriquecimiento en medio lquido.


Transferir 10 ml de preenriquecimiento a 100 ml de caldo tetrationato (Mller Kauffmann).
Incubar a 43 0,5C durante 18-24 h.
Transferir 10 ml del preenriquecimiento a 100 ml de caldo selenito-cistina. Incubar a 37 1C
durante 18-24 h.

27
Aislamiento en medio slido
A partir de cada uno de los enriquecimientos estriar una placa de agar Verde Brillante-Rojo
Fenol (agar BPLS) y una de agar Bismuto Sulfito (son cuatro placas en total). Incubar las
placas invertidas a 37 1C durante 20-24 h.
De ser necesario, seguir incubando los caldos de enriquecimiento 18-24 h ms y volver a
estriar en los medios de aislamiento.
Si al cabo del perodo de incubacin el crecimiento en las placas fuera escaso, reincubar por
18-24 h adicionales a la misma temperatura.
Examinar las placas para investigar la presencia de colonias tpicas de Salmonella. En agar
BPLS, las colonias son rosadas y el medio circundante rojo brillante. En agar Bismuto Sulfito,
las colonias tpicas son marrones a negras con brillo metlico. Algunas cepas forman colonias
verdosas.

Identificacin y confirmacin
De cada placa seleccionar cinco colonias sospechosas. Estriar en una placa de agar nutritivo
para que desarrollen colonias aisladas. Incubar a 37 1C durante 18-24 h. Al cabo de la
incubacin, seleccionar colonias aisladas para proseguir con las pruebas de confirmacin
bioqumica y serolgica.

Sobre el cultivo puro realizar


- tincin de Gram
- oxidasa
Inocular los cultivos que resulten coco-bacilos Gram negativos y oxidasa negativos en los
siguientes medios.
- TSI: en superficie y en profundidad
- Medio LIA
- Medio para ureasa (puede ser BAM)
- -galactosidasa
- Reaccin de Voges Proskauer
- Reaccin de indol

Consultar TP N2 - Salmonella, para desarrollar los ensayos y consultar los resultados


caractersticos.
De ser posible confirmar el resultado con un sistema de pruebas mltiples.

Confirmacin serolgica
Seguir la tcnica explicada en TP N 2: Enterobacterias Salmonella.
Emplear una cepa patrn de Salmonella para controlar los medios de cultivo y los medios
empleados en las pruebas de confirmacin e identificacin.
Informar ausencia o presencia de Salmonella en la cantidad de muestra empleada en el
anlisis (25 g, en este caso).
Aclarar modificaciones y pruebas bioqumicas realizadas.

28
REQUISITOS MICROBIOLOGICOS DEL CODIGO ALIMENTARIO ARGENTINO
- MERCOSUR

LECHE

Art. 558 (Res. MSyAS N047 del 28.01.98):


...La leche entera pasteurizada, deber responder a las siguientes exigencias:
a) Estar exenta de grmenes patgenos. Esta exigencia no se dar por cumplida si presenta:
1- Recuento total en placa: mayor de 50.000 bacterias mesfilas/cm3 en los meses de abril a
septiembre inclusive y mayor de 100.000 bacterias /cm3 en los meses de octubre a marzo,
inclusive.
2- Bacterias coliformes (recuento en placa con medio agar-violeta-rojo-bilis): mayor de
50/cm3
3- Escherichia coli: presencia en 1cm3. Deber ser confirmada por pruebas bioqumicas.
4- Prueba de la fosfatasa positiva.

Art. 559 (Res. MSyAS N047 del 28.01.98):


Leche entera seleccionada pasteurizada.
Sin haber sido sometida a ningn tratamiento previo, debe presentar un contenido microbiano
no mayor de 500.000 bacterias mesfilas/cm3.
La leche entera seleccionada pasteurizada deber estar exenta de grmenes patgenos. Esta
exigencia no se dar por cumplida si presenta:
1- Recuento total en placa: mayor de 25.000 bacterias mesfilas/cm3 de abril a septiembre,
inclusive y mayor de 35.000 bacterias mesfilas/cm3 de octubre a marzo, inclusive.
2- Bacterias coliformes (recuento en placa con medio agar-violeta-rojo-bilis): mayor de
10/cm3
3- Escherichia coli: presencia en 1cm3. Deber ser confirmada por pruebas bioqumicas.
4- Prueba de la fosfatasa positiva.

Art. 559bis (Res. MSyAS N047 del 28.01.98):


Leche entera certificada pasteurizada.
Sin haber sido sometida a ningn tratamiento previo, no debe presentar grmenes patgenos y
su contenido microbiano no debe ser superior a 10.000 bacterias mesfilas/cm3.
La leche entera certificada pasteurizada deber estar exenta de grmenes patgenos. Esta
exigencia no se dar por cumplida si presenta:
1- Recuento total en placa: mayor de 5.000 bacterias mesfilas/cm3 en el momento de su
recepcin por el consumidor.
2- Bacterias coliformes presencia en 1/cm3
3- Prueba de la fosfatasa positiva.

Art. 559tris (Res. MSyAS N328 del 21.05.97):


Se entiende por leche ultrapasteurizada a la leche, homogeneizada o no, que haya sido
sometida durante por lo menos 2 segundos a una temperatura mnima de 138C mediante un
proceso trmico de flujo continuo, inmediatamente enfriada a menos de 5C y envasada en
forma no asptica en envases estriles y hermticamente cerrados.

29
Deber responder a las siguientes exigencias:

CATEGORIA ICMSF VALORES


1- Recuento de mesfilos totales /cm3: 3 n=5 c=2 m=102 M=103
2- Recuento de coliformes a 30C/cm3: 6 n=5 c=2 m<3 M=10
3- Recuento de coliformes a 45C/cm3: 6 n=5 c=1 m<3 M=10
4- Prueba de la fosfatasa Negativa
5- Prueba de la peroxidasa Negativa

Leche UHT
Res MS y AS N 110 del 4.04.95
GMC Res. N 78/94
MICROORGANISMOS CRITERIO DE ACEPTACION CATEGORIA METODO DE
I.C.M.S.F. ENSAYO
Microorganismos n=5 c=0 m= 100 2 FIL1008: 1991
aerobios mesfilos
viables/ml

Resoluciones MS y AS: N003 del 11.01.95 y N 433 del 25.06.97


Leche en polvo
Criterios microbiolgicos y tolerancias
MICROORGANISMOS CRITERIO DE ACEPTACION CATEGORIA METODO DE
(Codex, Vol. H CAC/RCP 31-83) I.C.M.S.F. ENSAYO
Microorganismos n=5 c=2 m= 30000 M=100000 2 FIL100:A
aerobios mesfilos 1987
viables/g
Coliformes (a 30C)/g n=5 c=2 m= 10 M=100 5 FIL 73A: 1985
Coliformes (a 45C)/g n=5 c=2 m< 3 M=10 5 APHA 1992
Cp. 24
S. aureus coag. pos./g n=5 c=1 m= 10 M=100 8 FIL 60A: 1978
Salmonella spp./25 g n=10 c=0 m= 0 11 FIL 93A: 1985

30
ANLISIS DE MANTECAS Y MARGARINAS

1) Preparacin de la muestra y diluciones: (FIL 73 A:1985)


Colocar en un tubo estril con capacidad para 50 ml, la muestra de manteca o margarina, de
forma de no superar el 50% de la capacidad del tubo.
Fundir la muestra en bao de agua a 45C durante 15 minutos agitando para evitar la
separacin del suero de la grasa.
Transferir con una pipeta precalentada 10 ml de material del material fundido a un erlenmeyer
con 90 ml de agua de dilucin estril a 45C (dilucin 1/10). Homogeneizar por agitacin
evitando la separacin de las fases. Las diluciones sucesivas se efectan transfiriendo 1 ml a
tubos conteniendo 9 ml de agua de dilucin estril a 45C.

Alternativamente se puede trabajar solamente con la fase acuosa y sus diluciones. Permitir la
separacin de las fases (dejar reposar a 45C por no ms de 15 minutos) y tomar de la fase
inferior: 1 ml equivale a 1 gramo de manteca.

2) Metodologa de anlisis

a) Recuento de bacterias psicrotrficas


b) Recuento de bacterias proteolticas
c) Recuento de bacterias lipolticas
d) Recuento de coliformes totales
e) Recuento de coliformes a 45C
f) Determinacin de Escherichia coli
g) Recuento de hongos y levaduras
h) Recuento de Staphylococcus aureus
i) Determinacin de Salmonella

a) Recuento de bacterias psicrotrficas (APHA, 1992)


Este recuento puede realizase bajo diferentes combinaciones de temperatura/tiempo.
Se procede de la misma forma que para el recuento de aerobios empleando agar para recuento
en placa (APC) con 0,1 % de leche en polvo descremada ya fundido y mantenido a aprox. 44-
46C. Se mezcla para lograr una distribucin homognea. Siguiendo las mismas indicaciones,
sembrar tres diluciones sucesivas. Se incuba a 7C por 10 das (, 21C por 25 horas , 18C
por 45 horas). Se informa UFC de bacterias psicrtrofas /ml g.

b) Recuento de bacterias proteolticas (APHA, 1992)


Medio de cultivo: agar para recuento en placa (APC) con leche al 10%.
Sembrar por duplicado 1 ml de por lo menos dos diluciones sucesivas en placas de Petri.
Agregar el agar fundido a 44-46C y mezclar para homogeneizar el inculo en el agar.
Si el recuento esperado es bajo, puede realizarse un recuento combinado distribuyendo 10 ml
de la dilucin 1/10 en tres placas de Petri y agregando luego agar de la misma forma que
antes.
Dejar solidificar. Incubar invertidas a 21 2C durante 72 horas.
Para revelar, si no se observaran directamente los halos de clarificacin, inundar las placas
con HCl 1% o cido actico 10% durante 1 minuto, volcando luego el cido.
Si el recuento se realiz en duplicado, emplear las placas que contengan entre 25 y 250
colonias. Tener en cuenta la dilucin empleada.

31
Si se hizo el recuento combinado, contar el nmero de colonias en las tres placas.
Corresponden al nmero de bacterias proteolticas en 1 g de muestra.
Informar como UFC de bacterias proteolticas /g.

c) Recuento de bacterias lipolticas (APHA, 1992)


Medio de cultivo: agar tributirina
Sembrar por duplicado 1 ml de por lo menos dos diluciones sucesivas en placas de Petri.
Agregar el agar fundido a 44-46C y mezclar para homogeneizar el inculo en el agar.
Si el recuento esperado es bajo, puede realizarse un recuento combinado distribuyendo 10 ml
de la dilucin 1/10 en tres placas de Petri y agregando luego agar de la misma forma que
antes.
Dejar solidificar. Incubar invertidas a temperaturas entre 20 a 30C durante 72 horas.
La hidrlisis de la tributirina se evidencia como una zona clara alrededor de las colonias.
Si el recuento se realiz en duplicado, emplear las placas que contengan entre 25 y 250
colonias. Tener en cuenta la dilucin empleada.
Si se hizo el recuento combinado, contar el nmero de colonias en las tres placas.
Corresponden al nmero de bacterias lipolticas en 1 g de muestra.
Informar como UFC de bacterias lipolticas /g

d) Recuento de coliformes totales (FIL 73 A: 1985)


El recuento de coliformes totales puede realizarse por recuento en placa con medio slido o
en medio lquido (por la tcnica de NMP: nmero ms probable).

d.1) Recuento en placa. Agar Bilis Rojo Violeta- lactosa (ABRV-lactosa)


Sembrar 1 ml de dos diluciones sucesivas por duplicado en placas de Petri.
Agregar aprox. 12 ml de agar ABRV fundido a aprox. 44-46C. Mezclar. Dejar solidificar
completamente y agregar entonces 4 ml ms de medio fundido. Dejar enfriar e incubar las
placas invertidas a 30C por 22-26 h.
Seleccionar las diluciones que presenten entre 10 y 150 colonias. Contar las colonias rojas
oscuras con dimetro de por lo menos 0,5 mm, caractersticas de bacterias coliformes.
Confirmacin: Tomar entre 5 y 10 colonias del ABRV y transferirlas a tubos de fermentacin
con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares (cada colonia a un tubo distinto).
Incubar a 30C por 22-26 h. Se consideran positivas aquellas colonias que den produccin de
gas.
El resultado se calcula en base al nmero de colonias confirmadas. Se expresa como UFC de
coliformes totales /ml g.
La confirmacin de las colonias es especialmente recomendable para el caso de alimentos que
contengan otros azcares distintos de lactosa.

d.2) Tcnica del nmero ms probable (NMP)


Prueba presuntiva
Inocular por triplicado 1ml de muestra y de las diluciones sucesivas en tubos de fermentacin
con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares. Incubar a 30C por 48 h. Se
consideran positivos aquellos tubos que presenten formacin de gas en la campanita de
Durham.
De ser necesario, inocular 10 ml de muestra en vez de 1 ml. Se utilizarn tubos doble
concentracin de caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares.

32
Prueba de confirmacin
Estriar cada tubo presuntamente positivo en agar EMB (agar eosina azul de metileno).
Incubar a 30C por 22-26 h. Se consideran colonias de coliformes las de aspecto oscuro/
rojo/rosado y/o mucoso, con o sin brillo metlico.
Registrar el nmero de tubos positivos de cada dilucin. Con la ayuda de una tabla de
Nmero Ms Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes totales/ml g de muestra,
teniendo en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas.

e) Recuento de coliformes a 45C (APHA, 1992)


A partir de los tubos positivos en d.2 (coliformes totales a 30C, por NMP), inocular un tubo
de fermentacin de caldo EC. Incubar 24 h a 45C. La produccin de gas en la campanita de
Durham confirma coliformes a 45C (coliformes fecales).
Registrar el nmero de tubos positivos de cada dilucin. Con la ayuda de una tabla de
Nmero Ms Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes a 45C/ml g de muestra,
teniendo en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas.

f) Determinacin de Escherichia coli (Mossel y Moreno Garca, "Microbiologa de los


alimentos. Fundamentos ecolgicos para garantizar y comprobar la inocuidad y calidad de los
alimentos."; Ed. Acribia, 1985)
Inocular 1 g de muestra en 10 ml de caldo triptona peptona de soja (CTS).
Incubar a 20-25C por 5-6 h. Agitar bien y volcar en un tubo que contenga 10 ml de caldo
Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares doble concentrado (con campanita de Durham).
Incubar a 30C 1C durante 18-24 h.
Los tubos en los que no se verifique formacin de gas se consideran negativos. En este caso
se informa ausencia de E. coli en 1 gramo.
Agitar bien el contenido de los tubos positivos, resembrar por estra en agar Mac Conkey.
Incubar a 44C 0,1C (preferentemente en bao de agua) durante 30 h. Si existiese
crecimiento tpico (colonias rojas), tomar colonias aisladas y realizarles
1- Gram
2- Siembra en tubo de fermentacin caldo verde brillante 2% sales biliares con
lactosa. Incubar a 44C por 48 horas.
3- Siembra en caldo triptona. Incubar a 44C por 48 horas
4- Siembra en agar citrato. Incubar a 30C por 48 horas.

Resultados caractersticos:
1- Cocobacilo Gram negativo no formador de esporas.
2- Fermentacin de lactosa a 44C con formacin de gas.
3- Produccin de indol a 44C
4- No utiliza citrato

Alternativamente se pueden utilizar las pruebas del IMViC para la identificacin


De ser posible ensayar el cultivo sospechoso con un sistema de pruebas mltiples (API,
MICRO-ID, o semejantes).
En caso de confirmarse, informar presencia de E. coli en 1 ml de muestra. Indicar las
pruebas de identificacin realizadas.

33
g) Recuento de mohos y levaduras (FIL 94 B: 1990)
Sembrar por duplicado 1 ml de por lo menos dos diluciones sucesivas en placas de Petri.
Agregar agar YGC (cloranfenicol-glucosa-extracto de levadura) fundido a 44-46C y mezclar
para homogeneizar el inculo en el agar.
Si el recuento esperado es bajo, puede realizarse un recuento combinado distribuyendo 10 ml
de la dilucin 1/10 en tres placas de Petri y agregando luego agar YGC de la misma forma
que antes.
Dejar solidificar. Incubar sin invertir a 25 1C durante 5 das.
Si se hizo el recuento por duplicado, contar las placas que contengan entre 10 y 150 colonias.
Si hay excesivo crecimiento contar la placa de mayor dilucin an cuando contenga menos de
10 colonias.
Si se hizo el recuento combinado, contar el nmero de colonias en las tres placas.
Corresponden al nmero de mohos y levaduras en 1 g de muestra.
Las colonias sospechosas o dudosas deben confirmarse por observacin microscpica.
Informar el resultado como UFC de mohos y levaduras /g de muestra.

h) Recuento de Staphylococcus aureus (FIL 145:1990)


Se recomienda realizar el recuento sembrando por duplicado cada dilucin.
En caso de requerir un inculo ms grande por un valor bajo del requisito microbiolgico de
aceptacin, puede hacerse una siembra combinada de la siguiente forma:
Distribuir 1 ml de dilucin 1/10 equitativamente en la superficie de tres placas de agar Baird
Parker perfectamente secas. Distribuir con una esptula de Drigalsky cuidadosamente (tener
la precaucin de enfriar bien la esptula para no matar los microorganismos). Dejar secar las
placas tapadas sin invertir a temperatura ambiente por aproximadamente 15 minutos. Una vez
secas, incubarlas invertidas a 371C durante 24-48h.
Tomar para enumerar placas con no ms de 150 colonias. Seleccionar un nmero
representativo de colonias tpicas y atpicas; y transferirlas a tubos de caldo infusin cerebro-
corazn. Incubar a 37C 35C por 20 a 24 h
Las colonias tpicas son negras, brillantes y convexas rodeadas de una zona clara,
generalmente un halo opaco rodea a la colonia por dentro de la zona clara.

Identificacin y confirmacin
Sobre los cultivos puros de 20-24 horas, realizar
- Tincin de Gram
- Catalasa
- Coagulasa (comparar con cepa patrn): Agregar 0,1 ml del cultivo a aprox. 0,3 ml de plasma
de conejo reconstituido en un tubo estril. Incubar a 35-37C. Examinar despus de 4 a 6
horas. El cogulo formado debe ser firme y organizado (3+) o que no se cae al invertir el tubo
(4+).
Realizar un control empleando 0,1 ml de caldo BHI estril en lugar del cultivo. Para que el
ensayo sea vlido, no debe observarse ningn signo de coagulacin.
Complementariamente puede realizarse la prueba de la termonucleasa sobre la misma placa
de Baird Parker.

S. aureus coagulasa positiva son cocos Gram positivos, catalasa positivo, coagulasa positivo
(3 o 4+) y termonucleasa positivo.
Informar UFC de S. aureus coagulasa positivo/ g de muestra. Para realizar el clculo contar
el nmero total de colonias confirmadas en las tres placas.

34
i) Determinacin de Salmonella (FIL 93 A: 1985)
Preenriquecimiento en medio lquido
Preparar un erlenmeyer con 225 ml de agua destilada con 1 ml de solucin de Verde Brillante
(0,5% en agua, agregar verde brillante al agua; dejar la solucin en la oscuridad por lo menos
un da para autoesterilizar).
Pesar aspticamente 25g de muestra en dicho erlenmeyer. Dejar a temperatura ambiente
durante aproximadamente 1 h sin agitar. Incubar a 371C durante 16-20 h.

Enriquecimiento en medio lquido.


Transferir 10 ml del preenriquecimiento a 100 ml de caldo tetrationato (Mller Kauffmann).
Incubar a 43 0,5C durante 18-24 h.
Transferir 10 ml del preenriquecimiento a 100 ml de caldo selenito-cistina. Incubar a 371C
durante 18-24 h.

Aislamiento en medio slido


A partir de cada uno de los enriquecimientos estriar una placa de agar Verde Brillante-Rojo
Fenol (agar BPLS) y una de agar Bismuto Sulfito (son cuatro placas en total). Incubar las
placas invertidas a 371C durante 20-24 h.
De ser necesario, seguir incubando los caldos de enriquecimiento 18-24 h ms y volver a
estriar en los medios de aislamiento.
Si al cabo del perodo de incubacin el crecimiento en las placas fuera escaso, reincubar por
18-24 h adicionales a la misma temperatura.
Examinar las placas para investigar la presencia de colonias tpicas de Salmonella. En agar
BPLS, las colonias son rosadas y el medio circundante rojo brillante. En agar Bismuto Sulfito,
las colonias tpicas son marrones a negras con brillo metlico. Algunas cepas forman colonias
verdosas.

Identificacin y confirmacin
De cada placa seleccionar cinco colonias sospechosas. Estriar en una placa de agar nutritivo
para que desarrollen colonias aisladas. Incubar a 371C durante 18-24 h. Al cabo de la
incubacin, seleccionar colonias aisladas para proseguir con las pruebas de confirmacin
bioqumica y serolgica.

Sobre el cultivo puro realizar


- tincin de Gram
- oxidasa
Inocular los cultivos que resulten coco-bacilos Gram negativos y oxidasa negativos en los
siguientes medios.
- TSI: en superficie y en profundidad
- Medio LIA
- Medio para ureasa (puede ser BAM)
- -galactosidasa
- Reaccin de Voges Proskauer
- Reaccin de indol

Consultar TP N2-Salmonella, para desarrollar los ensayos y consultar los resultados


caractersticos.
De ser posible confirmar el resultado con un sistema de pruebas mltiples.

35
Confirmacin serolgica
Seguir la tcnica explicada en TP N 2: Enterobacterias-Salmonella
Emplear una cepa patrn de Salmonella para controlar los medios de cultivo y los medios
empleados en las pruebas de confirmacin e identificacin.
Informar ausencia o presencia de Salmonella en la cantidad de muestra empleada en el
anlisis (25 g, en este caso).
Aclarar modificaciones y pruebas bioqumicas realizadas.

36
REQUISITOS MICROBIOLOGICOS DEL CODIGO ALIMENTARIO ARGENTINO
- MERCOSUR

Manteca
Art. 596
Res MS y AS N 003 del 11.01.95
Criterios microbiolgicos y tolerancias

MICROORGANISMOS CRITERIO DE ACEPTACION CATEGORIA METODO DE


(Codex, Vol. H CAC/RCP 31-83) I.C.M.S.F. ENSAYO
Coliformes totales /g n=5 c=2 m= 10 M=100 5 FIL 73 1985
Coliformes (a 45C)/g n=5 c=2 m< 3 M=10 5 APHA 1992
Cp. 24
S. aureus coag. pos./g n=5 c=1 m= 10 M=100 8 FIL 145 1990
Salmonella spp./25 g n=5 c=0 m= 0 10 FIL 93 1985

Margarina
Art. 551. (Res. 511. 9.4.86)

Deber responder a las siguientes caractersticas microbiolgicas:


Bacterias coliformes: mximo 10/g
Escherichia coli: ausencia en 1 g
Bacterias proteolticas: mximo 50/g
Bacterias lipolticas: mximo 50/g
Hongos y levaduras: mximo 50/g

37
ANALISIS MICROBIOLOGICO DE PRODUCTOS LACTEOS
HELADOS

Los productos lcteos congelados son responsables de algunas intoxicaciones e infecciones


intestinales. Con la denominacin genrica de helados se entiende los productos elaborados
por la congelacin de mezclas lquidas constituidas por leche, leche en polvo, leche
condensada, leche evaporada, manteca, crema de leche, zumos o jarabes de frutas, huevos
frescos, conservados, yemas de huevo, caf, frutas naturales o confitadas, chocolate,
colorantes y dems sustancias de uso permitido. Las mezclas deben ser pasteurizadas. El
origen de las bacterias y otros microorganismos en los helados son las distintas materias
primas con las que se las prepara, utensilios que se emplean en el manipuleo y cualquier
contaminacin que pueda llegar a ellos durante las operaciones.

1) Preparacin de la muestra y diluciones (FIL 73 A: 1985)


Colocar el helado en un bao de agua caliente a 37C, impedir que la muestra exceda esta
temperatura. Agitar para favorecer que se derrita y tomar la muestra de anlisis ni bien se
derrita totalmente.
Pesar 10 g de helado en un erlenmeyer que contiene 90 ml de agua peptona 0,1% estril.
Homogeneizar completamente. A partir de esta dilucin (1/10) preparar las siguientes en
transfiriendo 1 ml a tubos con 9 ml de agua peptona 0,1%. Homogeneizar en agitador.

2) Metodologa de anlisis

a) Recuento de bacterias aerobias mesfilas


b) Recuento de coliformes totales
c) Recuento de coliformes a 45C
d) Determinacin de Salmonella
e) Recuento de Staphylococcus aureus coagulasa positiva
f) Recuento de mohos y levaduras

a) Recuento de bacterias aerobias mesfilas (FIL 100 B: 1991)


1- Se vierte 1 ml de cada dilucin por duplicado en placas de Petri y se agrega el agar para
recuento (APC) con 0,1 % de leche en polvo descremada ya fundido y mantenido a aprox. 44-
46C. Se mezcla para lograr una distribucin homognea. Siguiendo las mismas indicaciones,
sembrar tres diluciones sucesivas.
2- Cuando las placas estn fras se invierten y se incuban a 30C 1C durante 72h 3 h.
3- Se cuentan las colonias y se calcula el valor de recuento total siguiendo las pautas dadas en
el captulo de muestreo. Se seleccionan las placas con recuento entre 25 y 250 colonias, se
multiplica el nmero promedio de colonias contadas en las placas por el factor de dilucin
correspondiente y se informa como UFC de bacterias aerobias mesfilas/ml g.

b) Recuento de coliformes totales (FIL 73 A: 1985)


El recuento de coliformes totales puede realizarse por recuento en placa con medio slido o
en medio lquido (por la tcnica de NMP: nmero ms probable)

b.1) Recuento en placa. Agar Bilis Rojo Violeta- lactosa (ABRV-lactosa)


Sembrar 1 ml de dos diluciones sucesivas por duplicado en placas de Petri.

38
Agregar aprox. 12 ml de agar ABRV fundido a aprox. 44-46C. Mezclar. Dejar solidificar
completamente y agregar entonces 4 ml ms de medio fundido. Dejar enfriar e incubar las
placas invertidas a 30C por 22-26 h.
Seleccionar las diluciones que presenten entre 10 y 150 colonias. Contar las colonias rojas
oscuras con dimetro de por lo menos 0,5 mm, caractersticas de bacterias coliformes.
Confirmacin: Tomar entre 5 y 10 colonias del ABRV y transferirlas a tubos de fermentacin
con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares (cada colonia a un tubo distinto).
Incubar a 30C por 22-26 h. Se consideran positivas aquellas colonias que den produccin de
gas.
El resultado se calcula en base al nmero de colonias confirmadas. Se expresa como UFC de
coliformes totales /ml g.
La confirmacin de las colonias es especialmente recomendable para el caso de alimentos que
contengan otros azcares distintos de lactosa.

b.2) Tcnica del nmero ms probable (NMP)


Prueba presuntiva
Inocular por triplicado 1ml de muestra y de las diluciones sucesivas en tubos de fermentacin
con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares. Incubar a 30C por 48 h. Se
consideran positivos aquellos tubos que presenten formacin de gas en la campanita de
Durham.
De ser necesario, inocular 10 ml de muestra en vez de 1 ml. Se utilizarn tubos doble
concentracin de caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares.

Prueba de confirmacin
Estriar cada tubo presuntamente positivo en agar EMB (agar eosina azul de metileno).
Incubar a 30C por 22-26 h. Se consideran colonias de coliformes las de aspecto oscuro/
rojo/rosado y/o mucoso, con o sin brillo metlico.
Registrar el nmero de tubos positivos de cada dilucin. Con la ayuda de una tabla de
Nmero Ms Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes totales/g de muestra, teniendo
en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas.

c) Recuento de coliformes a 45C (APHA, 1992)


A partir de los tubos positivos b.2 (coliformes totales a 30C, por NMP), inocular un tubo de
fermentacin de caldo EC. Incubar 24 h a 45C. La produccin de gas en la campanita de
Durham confirma coliformes a 45C (coliformes fecales).
Registrar el nmero de tubos positivos de cada dilucin. Con la ayuda de una tabla de
Nmero Ms Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes a 45C/g de muestra, teniendo
en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas.

d) Determinacin de Salmonella
Preenriquecimiento en medio lquido
Preparar un erlenmeyer con 225 ml de agua destilada con 1 ml de solucin de Verde Brillante
(0,5% en agua, agregar verde brillante al agua; dejar la solucin en la oscuridad por lo menos
un da para autoesterilizar).
Pesar aspticamente 50 g de muestra en dicho erlenmeyer. Dejar a temperatura ambiente
durante aproximadamente 1 h sin agitar. Incubar a 371C durante 16-20 h.

39
Enriquecimiento en medio lquido.
Transferir 10 ml del preenriquecimiento a 100 ml de caldo tetrationato (Mller Kauffmann).
Incubar a 43 0,5C durante 18-24 h.
Transferir 10 ml del preenriquecimiento a 100 ml de caldo selenito-cistina. Incubar a 371C
durante 18-24 h.

Aislamiento en medio slido


A partir de cada uno de los enriquecimientos estriar una placa de agar Verde Brillante-Rojo
Fenol (agar BPLS) y una de agar Bismuto Sulfito (son cuatro placas en total). Incubar las
placas invertidas a 371C durante 20-24 h.
De ser necesario, seguir incubando los caldos de enriquecimiento 18-24 h ms y volver a
estriar en los medios de aislamiento.
Si al cabo del perodo de incubacin el crecimiento en las placas fuera escaso, reincubar por
18-24 h adicionales a la misma temperatura.
Examinar las placas para investigar la presencia de colonias tpicas de Salmonella. En agar
BPLS, las colonias son rosadas y el medio circundante rojo brillante. En agar Bismuto Sulfito,
las colonias tpicas son marrones a negras con brillo metlico. Algunas cepas forman colonias
verdosas.

Identificacin y confirmacin
De cada placa seleccionar cinco colonias sospechosas. Estriar en una placa de agar nutritivo
para que desarrollen colonias aisladas. Incubar a 371C durante 18-24 h. Al cabo de la
incubacin, seleccionar colonias aisladas para proseguir con las pruebas de confirmacin
bioqumica y serolgica.

Sobre el cultivo puro realizar


- tincin de Gram
- oxidasa
Inocular los cultivos que resulten coco-bacilos Gram negativos y oxidasa negativos en los
siguientes medios.
- TSI: en superficie y en profundidad
- Medio LIA
- Medio para ureasa (puede ser BAM)
- -galactosidasa
- Reaccin de Voges Proskauer
- Reaccin de indol

Consultar TP N2-Salmonella, para desarrollar los ensayos y consultar los resultados


caractersticos.
De ser posible confirmar el resultado con un sistema de pruebas mltiples.

Confirmacin serolgica
Seguir la tcnica explicada en TP N 2: Enterobacterias -Salmonella
Emplear una cepa patrn de Salmonella para controlar los medios de cultivo y los medios
empleados en las pruebas de confirmacin e identificacin.
Informar ausencia o presencia de Salmonella en la cantidad de muestra empleada en el
anlisis (25 g, en nuestro caso).
Aclarar modificaciones y pruebas bioqumicas realizadas.

40
e) Recuento de S. aureus (FIL 145:1990)
Se recomienda realizar el recuento sembrando por duplicado cada dilucin.
En caso de requerir un inculo ms grande por un valor bajo del requisito microbiolgico de
aceptacin, puede hacerse una siembra combinada de la siguiente forma:
Distribuir 1 ml de dilucin 1/10 equitativamente en la superficie de tres placas de agar Baird
Parker perfectamente secas. Distribuir con una esptula de Drigalsky cuidadosamente (tener
la precaucin de enfriar bien la esptula para no matar los microorganismos). Dejar secar las
placas tapadas sin invertir a temperatura ambiente por aproximadamente 15 minutos. Una vez
secas, incubarlas invertidas a 37 1C durante 24-48 h.
Tomar para enumerar placas con no ms de 150 colonias. Seleccionar un nmero
representativo de colonias tpicas y atpicas; y transferirlas a tubos de caldo infusin cerebro-
corazn. Incubar a 37C 35C por 20 a 24 h
Las colonias tpicas son negras, brillantes y convexas rodeadas de una zona clara,
generalmente un halo opaco rodea a la colonia por dentro de la zona clara.

Identificacin y confirmacin
Sobre los cultivos puros de 20-24 horas, realizar
- Tincin de Gram
- Catalasa
- Coagulasa (comparar con cepa patrn): Agregar 0,1 ml del cultivo a aprox. 0,3 ml de plasma
de conejo reconstituido en un tubo estril. Incubar a 35-37C. Examinar despus de 4 a 6
horas. El cogulo formado debe ser firme y organizado (3+) o que no se cae al invertir el tubo
(4+)
Complementariamente puede realizarse la prueba de la termonucleasa sobre la misma placa
de Baird Parker.

S. aureus coagulasa positiva son cocos Gram positivos, catalasa positivo, coagulasa positivo
(3 o 4+) y termonucleasa positivo.
Informar UFC de S. aureus coagulasa positivo/ g de muestra. Para realizar el clculo contar
el nmero total de colonias confirmadas en las tres placas.

f) Recuento de mohos y levaduras (FIL 94 B: 1990)


Sembrar por duplicado 1 ml de por lo menos dos diluciones sucesivas en placas de Petri.
Agregar agar YGC (cloranfenicol-glucosa-extracto de levadura) fundido a 44-46C y mezclar
para homogeneizar el inculo en el agar.
Si el recuento esperado es bajo, puede realizarse un recuento combinado distribuyendo 10 ml
de la dilucin 1/10 en tres placas de Petri y agregando luego agar YGC de la misma forma
que antes.
Dejar solidificar. Incubar sin invertir a 25 1C durante 5 das.
Si se hizo el recuento por duplicado, contar las placas que contengan entre 10 y 150 colonias.
Si hay excesivo crecimiento contar la placa de mayor dilucin an cuando contenga menos de
10 colonias.
Si se hizo el recuento combinado, contar el nmero de colonias en las tres placas.
Corresponden al nmero de mohos y levaduras en 1 g de muestra.
Las colonias sospechosas o dudosas deben confirmarse por observacin microscpica.
Informar el resultado como UFC de mohos y levaduras /g de muestra.

41
REQUISITOS MICROBIOLOGICOS DEL CODIGO ALIMENTARIO ARGENTINO
- MERCOSUR

Helados

Art. 1078 (Res 2141, 5.9.83): Los distintos tipos de helados debern responder a las
siguientes exigencias microbiolgicas:
I. Helados de elaboracin industrial:
a) Ausencia de grmenes patgenos. Esta exigencia se dar por no cumplida si el
producto presenta:
1. Recuento de bacterias aerobias mesfilas (PCA, 30C, 72 h): mayor de 100000/g
2. Bacterias coliformes: ms de 100/g
3. Bacterias coliformes fecales: ms de 1/g
4. Staphylococcus aureus coagulasa positiva: ms de 500/g
5. Salmonella: presencia en 50 g
6. (Res. 23, 30.01.95): Cuando el recuento de hongos y levaduras supere 100/g slo
podr recomendarse verificar las prcticas de elaboracin y la calidad de las materias
primas utilizadas, no siendo este indicador habilitante para declarar al producto No
Apto para el Consumo.
b) Ausencia de toxinas microbianas.

II. Helados de elaboracin artesanal:


a) Ausencia de grmenes patgenos. Esta exigencia se dar por no cumplida si el
producto presenta:
1. Recuento de bacterias aerobias mesfilas (PCA, 30C, 72 h): mayor de 200000/g
2. Bacterias coliformes: ms de 150/g
3. Bacterias coliformes fecales: ms de 1/g
4. Staphylococcus aureus coagulasa positiva: ms de 500/g
5. Salmonella: presencia en 50 g
6. (Res. 23, 30.01.95): Cuando el recuento de hongos y levaduras supere 100/g slo
podr recomendarse verificar las prcticas de elaboracin y la calidad de las materias
primas utilizadas, no siendo este indicador habilitante para declarar al producto No
Apto para el Consumo.
b) Ausencia de toxinas microbianas.

42
ANLISIS MICROBIOLGICO DE CONSERVAS ALTERADAS (APHA 1992)

1) Preparacin de las latas


- Sacar las etiquetas y guardarlas; numerar las latas del lado que no se va a abrir.
- Registrar los datos del envase; pesar la lata y comparar con lo indicado.
- Examinar el exterior en busca de fallas de suturas, fugas, abolladuras, corrosin, etc.
- Lavar con agua y jabn, enjuagar bien y secar.

2) Apertura de las latas


a) Latas abombadas: deben tomarse precauciones para evitar proyecciones del contenido al
perforar la lata. Se recomienda enfriarlas previamente durante unas horas.
- Desinfectar la tapa bandola con una solucin de hipoclorito 2% durante 15 minutos;
retirar el exceso y secar con toalla estril o en flujo laminar. No flamear.
- Colocar la lata dentro de un recipiente con un poco de hipoclorito de sodio al 2% y cubrirla
con un embudo de vidrio cuyo vstago est cerrado con algodn, a travs del cual pasa una
varilla puntiaguda o punzn (todo el conjunto esterilizado).
- Perforar el centro de la lata con un golpe seco del punzn, y de ser posible, recoger el gas
que emana con un tubo invertido.
- Retirar el embudo cuando las presiones se hayan igualado y abrir la lata en forma normal
con un abrelatas estril. Cubrir la superficie con una placa de Petri estril.

b) Latas no abombadas:
- Desinfectar con hipoclorito 2% durante 15 minutos; retirar el exceso y flamear hasta
sequedad.
- Abrir con abrelatas estril y cubrir con una placa de Petri estril.

3) Toma de material
La tcnica utilizada para obtener material y el punto de donde hay que tomarlo varan segn
la naturaleza del producto.

- Lquidos: con pipeta estril, sembrando directamente en los medios de cultivo.


- Semilquidos: con pipeta de boca ancha, sembrando directamente en los medios de cultivo
o diluyendo con agua estril.
- Slidos en lquidos: tomar de ambas partes; 10 ml del lquido con pipeta estril y 10 g de
slido con esptula estril.
- Slidos: con esptula estril o con sacabocados estril, descargndolo con ayuda de una
varilla de vidrio flameada.

Los lquidos y semilquidos se siembran directamente en los medios, a razn de 1-2 ml cada
10 ml de medio.
Los slidos se transfieren a un recipiente estril de boca ancha de 100 ml, que contiene 50 ml
de agua destilada estril. Se agita para homogeneizar.
Se recomienda guardar parte de la muestra para repetir anlisis en caso necesario.

4) Examen del contenido


Registrar el olor y aspecto del alimento y compararlos con las caractersticas del producto
normal.
Medir el pH.

43
5) Examen microscpico
Tomar material con un ansa y hacer un extendido, secarlo, fijarlo y colorearlo con cristal
violeta. Si el alimento es graso, enjuagar con xilol luego de fijarlo.
Si se dispone de microscopio de contraste de fases, realizar un montaje hmedo, de una
ansada del material con agua, cubrir con cubre-objetos y observar.

6) Cultivo

a) alimentos de pH mayor que 4,6


(Todas las determinaciones se efectan por duplicado)

a.1) Microorganismos aerobios


Sembrar 2 placas de agar triptona-glucosa (GTA) por estra, incubndolas 4 das a 30-35 C y
a 55 C respectivamente. Tambin pueden utilizarse tubos con caldo triptona-glucosa (GTB),
sembrando 1 ml o 1 g del alimento.

a.2) Microorganismos anaerobios


Tomar 2 tubos de medio PE-2 o carne cocida (CMM), calentar en bao Mara 20 minutos,
enfriar y sembrar 1 g o 1 ml del alimento sin burbujear. Sellar uno de ellos con Vas-par
(vaselina-parafina 50-50%) e incubarlo hasta 10 das a 35C .Sellar el otro con agar al 2,5 %
fundido. Dejar solidificar y llevar a bao de 55C para preincubar. Luego incubar en estufa de
55 C, 4 das.

La marcha contina segn se indica en el esquema de la pgina siguiente.

b) alimentos de pH menor que 4,6

b.1) Microorganismos aerobios


Sembrar 2 placas de agar termoacidurans (TAA), por estra e incubarlas a 35 y 55C
respectivamente. O bien sembrar 2 tubos de caldo suero de naranja (OSB) con 1 g o 1 ml de
del alimento e incubarlos 4 das de dichas temperaturas.

b.2) Microorganismos anaerobios


Fundir el agar termoacidurans (TAD) en tubos, enfriar a 45C y sembrar 1 ml del alimento al
fondo sin burbujear. Dejar solidificar, incubar 5 das a 30-35C.

b.3) Hongos
Sembrar por estra una placa de agar para recuento de hongos. Incubar 5-7 das a 28 C.

44
ANLISIS MICROBIOLOGICO DE CONSERVAS DE BAJA ACIDEZ

MARCHA AEROBIA

MUESTRA

GTA/GTB
Aerobiosis
30-35C 55C
(hasta 4 das) (hasta 4 das)

crecimiento + crecimiento +
Examen microscpico Bacilos con o sin
esporas

Cultivo mixto Solo bacilos


Bacilos, cocos, NAMn 55C
hongos y levaduras. (hasta 10 das)
Contaminacin NAMn 30-35C
post-proceso. (hasta 10 das)
crecimiento +
Esporas + Esporas
Contaminacin
post-proceso.

Esporas Esporas +
Contaminacin
post-proceso.
Shock trmico
85C 10 min

NAMn NAMn
30-35C 55C
(hasta 4 das) (hasta 4 das)
crecimiento + crecimiento +
Bacillus sp mesfilo Bacillus sp termfilo
Proceso trmico Enfriado insuficiente o
insuficiente temperatura muy alta de
almacenamiento

Crecimiento +
a 30 y a 55C
Bacillus sp. termfilo
facultativo

45
ANALISIS MICROBIOLOGICO DE CONSERVAS DE BAJA ACIDEZ

MARCHA ANAEROBIA

MUESTRA

PE-2 o CMM
Anaerobiosis
30-35C 55C
(hasta 10 das) (hasta 4 das)

crecimiento + crecimiento +
Examen microscpico Examen microscpico

Cultivo mixto Bacilos con o Bacilos largos y delgados de Bacilos cortos


Bacilos, cocos, mohos sin esporas tincin dbil.
y levaduras. Bacillus sp. facultativo
Contaminacin post- Anaerobios termfilos Insuficiente
proceso. productores de SH2 enfriamiento o
Insuficiente enfriamiento o temperatura de
temperatura de almacenamiento
almacenamiento muy alta muy alta

LVA 30-35C LVA 30-35C


(hasta 4 das) (hasta 4 das)
Aerobiosis Anaerobiosis

Crecimiento + Crecimiento +
Bacillus sp. mesfilo Clostridium sp. mesfilo*
Posible contaminacin Posible inadecuado proceso
post-proceso trmico

Crecimiento +
Aerobiosis y anaerobiosis
Examen microscpico

Cultivo puro Cultivo mixto *


Anaerobio facultativo

* Buscar toxina botulnica en el cultivo

46
ANALISIS MICROBIOLOGICO DE CONSERVAS ACIDAS
MARCHA AEROBIA

MUESTRA

TAA o OSB
Aerobiosis

30-35C 55C
(hasta 5 das) (hasta 5 das)

Crecimiento + Crecimiento +
Bacillus sp. mesfilo Bacillus sp. termfilo o
(flat sour) termfilo facultativo
Proceso trmico (flat sour)
insuficiente Enfriamiento insuficiente o
alta temperatura de
almacenamiento

MARCHA ANAEROBIA MOHOS Y LEVADURAS

MUESTRA MUESTRA

TAD PDA o YGC


Anaerobiosis

25C
35C (hasta 5 das)
(hasta 5 das)

Crecimiento +
Anaerobios mesfilos
butricos

47
METODO DE CAMARA DE HOWARD PARA RECUENTO DE FILAMENTOS DE
HONGOS EN CONSERVAS (AOAC 984.29, 1990)

1) Recuentos de hongos en conservas de tomate


Por ser los tomates de naturaleza cida, es ms fcil preparar sus conservas que las de otros
alimentos.
Los tiempos y temperaturas de calentamiento son relativamente bajos.
Si el productor emplea tomates sanos, se obtiene un producto de alta calidad que llena los
requisitos estipulados por las reglamentaciones, pero si no lo son y hay crecimiento fngico
en ellos, el producto no resulta de buena calidad.
El recuento de mohos en cmara de Howard es una forma de conocer la calidad de los
productos terminados. Por este mtodo se determina microscpicamente el porcentaje de
campos que contienen filamentos de hongos en una muestra de conservas de tomates.

2) Materiales
Se emplea un portaobjetos especial en el centro consta de un rectngulo de 15 x 20 mm que
est limitado a cada lado por depresiones y soportes paralelos. Estos estn 0,1 mm ms altos
que el rectngulo el cubre objeto queda apoyado sobre estas barras. El rectngulo, los
soportes y el cubreobjetos tienen superficies planas. Para facilitar la calibracin del
microscopio, el rectngulo tiene dos lneas paralelas separadas 1,382 mm.
Para el recuento de mohos el campo del microscopio debe tener 1,5 mm2 (una circunferencia
de 1,382 mm de dimetro) y debe utilizarse una magnificacin comprendida entre 90 y 125
aumentos totales (fig. 1).

3) Preparacin de la muestra
Tratndose de jugo de tomate o de salsa ketchup la muestra es examinada tal como viene en el
envase. Pesar 20 g de muestra y colocarlo en un vaso de precipitados. Agregar 50 ml de agua
estril y mezclar. En el caso de pur o pasta de tomates se agrega agua para obtener 8,37%-
9,37% de slidos totales, lo cual puede verificarse midiendo el ndice de refraccin a 20C
(1,3447-1,3460). Para facilitar la observacin microscpica se recomienda usar como
diluyente un colorante que se prepara en la forma siguiente: disolver 0,1 g de azul de algodn
en 100 ml de lactofenol (partes iguales de fenol, glicerina, cido lctico y agua). No se
colorean los protoplasmas viejos, pero s los elementos anatmicos del tomate. Debe
limpiarse la cmara de Howard de modo que se produzcan anillos concntricos con los
colores del arco iris, los cuales se pueden observar sosteniendo el portaobjetos en un ngulo
tal que la luz se refleje sobre el cubreobjetos. Los anillos de Newton se deben a la
descomposicin de la luz cuando se adosan perfectamente dos cristales de superficies pulidas.
Sobre el portaobjetos se coloca una porcin de la muestra bien homogeneizada, de modo tal
que cubra exactamente el centro y cuyo espesor sea suficiente para llenar completamente el
espacio existente entre porta y cubreobjetos. Es necesario evitar derrames laterales y en el
preparado no deben quedar burbujas de aire.
La iluminacin debe ser normal ya que demasiada luz impide una observacin adecuada.
La preparacin se lleva al microscopio y se observan 25 campos normalizados. Para tal fin
con el objetivo de 10 aumentos se regula el ocular adecuado (8x, 10x, 12x) de forma tal que
las dos lneas paralelas grabadas en el portaobjetos sean tangentes al campo. Dicho campo
normalizado tiene un dimetro de 1,382 mm y una superficie de 1,5 mm2. Los 25 campos
deben observarse de modo tal que el resultado obtenido sea representativo del total del
preparado (mtodo oficial). La distribucin de campos ideal corresponde a la figura 2. Se
deben examinar por lo menos dos preparados.

48
Cada campo se observa anotando la ausencia o presencia de filamentos fngicos; cuando la
identificacin es difcil se usa un aumento de 200x. Debe usarse el tornillo micromtrico para
observar filamentos en todos los planos del preparado.
En el caso de observarse filamentos cortos, se consideran positivos aquellos campos en los
cuales la longitud agregada de no ms de tres filamentos exceda 1/6 del dimetro del campo.

4) Clculo
Se suman los campos positivos de ambas determinaciones, se multiplica por dos y se obtiene
el porcentaje de campos positivos.

Reglamentacin bromatolgica
En las conservas de tomate se establecen las siguientes tolerancias en el recuento de
filamentos en cmara de Howard (EE.UU. y Canad):
1- Los jugos de tomate examinados, no deben tener ms del 25% de campos positivos.
2- Las latas de tomates, ketchup, los purs de tomates, no deben superar el 60% de campos
positivos.

Reglamentacin Bromatolgica Nacional (CAA)


Todas las muestras de conservas de tomates (jugos, salsas, pur, extracto, ketchup)
examinadas al microscopio por el mtodo de Howard diluidas de tal manera que contengan
8,37%-9,37% de residuo slido, no acusarn ms del 50% de campos con filamentos de
hongos.

figura 1 figura 2

49
ANLISIS MICROBIOLGICO DE AZCAR

Tan pronto se estableci que el azcar puede contener bacterias, levaduras y mohos, que al
proliferar pueden producir deterioro en los alimentos enlatados y en las bebidas sin alcohol en
que se usa, se desarrollaron mtodos adecuados para su recuento.

ANLISIS DEL AZCAR PARA PRODUCTOS ENLATADOS

Los laboratorios de la National Canners Association de USA pusieron a punto una serie de
ensayos, que, junto con otros, nos permiten reconocer la calidad del azcar que se examina.

1) Muestreo
Tomar muestras de 250 g de 5 bolsas de cada lote. Estas muestras deben enviarse al
laboratorio en envases limpios y cerrados.

2) Preparacin de las muestras


Colocar 20 g del azcar en un erlenmeyer estril de 150 ml marcado al nivel de 100 ml.
Agregar agua estril hasta la marca, llevar rpidamente a ebullicin y mantenerla por 5
minutos. Reemplazar el agua evaporada por agua estril.

3) Metodologa de anlisis

a) Esporas del flat sour o fermentacin simple


b) Recuento total
c) Termfilos anaerobios que no producen SH2
d) Termfilos anaerobios que producen SH2

a) Esporas del flat sour o fermentacin simple


Utilizar 5 cajas de Petri y pipetear en cada una 2 ml de la solucin hervida del azcar. Cubrir
y mezclar el inculo con agar triptona glucosa. Incubar las cajas a 55 C durante 48 h.
El recuento combinado de las 5 cajas representa el nmero de esporas en 2 g de azcar
original. Se multiplica esta cuenta por 5 para expresar los resultados como: n de esporas / 10
g de azcar.
Las esporas del flat sour son caractersticas: son circulares y miden de 2 a 5 mm de
dimetro. Tienen un centro tpico opaco y debido a la produccin de cido, en presencia del
indicador, habitualmente estn rodeadas de un halo amarillo. Este halo puede ser
insignificante y an faltar en algunos tipos que producen muy poca acidez. Las colonias sub-
superficiales aparecen como colonias puntiformes. Cuando las cajas tienen un exceso de
colonias y no pueden contarse las colonias tpicas del flat sour se har una segunda caja
usando una dilucin mayor. Para fines prcticos basta hacer notar que los recuentos de las
muestras estn por encima del estndar exigido.

b) Recuento total
El recuento total de esporas termfilas se hace a partir de las mismas cajas de Petri. El clculo
se hace en la misma forma que para las esporas del flat sour incluyendo todas las esporas
visibles.

50
c) Termfilos anaerobios que no producen SH2
Dividir 20 ml de la solucin del azcar en 6 porciones aproximadamente iguales y sembrarlas
en 6 tubos de caldo hgado. Estratificar el medio con agar triptona. Solidificar el medio
inmediatamente por inmersin parcial en agua fra. Cuando se ha solidificado el medio
precalentar a 55C e incubar a esta temperatura por 48 h. En estas condiciones se produce
rotura del agar y formacin de cido. A veces se produce olor a queso.
Es un mtodo cualitativo con una aproximacin cuantitativa lejana. Los resultados se
expresan como + o - . Por ejemplo: +++---.

d) Termfilos anaerobios que producen SH2


Entre ellos predomina el Clostridium nigrificans. Se dividen otros 20 ml de la solucin del
azcar en 6 porciones aproximadamente iguales y se las siembra en agar sulfito. Los tubos
deben ser hervidos por 5 minutos antes de la siembra y enfriados a 55C. Se incuban a esa
temperatura durante 48-72 h. El medio debe estar slido antes de llevarlo a la estufa.
Los microorganismos caractersticos se ponen de manifiesto por formacin de reas negras
tpicas. Se las cuenta en los 6 tubos y multiplica el dato por 2,5; expresando el resultado como
n de esporas de bacterias productoras de SH2 en 10 g de azcar.

Normas aceptadas por la National Canners Association para usar en productos


enlatados

1) Recuento total de esporas termfilas: De 5 muestras de un lote de azcar ninguna debe


tener ms de 150 esporas en 10 g y el promedio de las muestras no debe ser superior a 125
esporas en 10g.

2) Esporas del flat sour: De 5 muestras ninguna debe tener ms de 75 esporas en 10 g y el


promedio para todas las muestras no debe ser superior a 50 esporas en 10 g.

3) Esporas termfilas anaerobias: No ms de 3 de las 5 muestras contendrn de estas esporas


(60%) y de cada muestra no deber haber ms de 4 tubos + de cada 6 (65 %).

4) Esporas de alteracin sulfhdrica: No deber haber ms de 2 muestras + sobre las 5


muestras y cada muestra no deber dar ms de 5 colonias en 10 g (equivalente a 2 colonias
por cada 6 tubos).

51
ANLISIS DEL AZCAR PARA BEBIDAS SIN ALCOHOL

Teniendo en cuenta la flora ms corriente en el azcar industrial, The American Bottlers of


Carbonated Beverages (1953) de USA estableci el siguiente procedimiento de anlisis:

1) Preparacin de las muestras:


Colocar 100 g del azcar en un erlenmeyer de 250 ml, que contenga 102,5 ml de agua
destilada estril. Se deja disolver el azcar.

2) Metodologa de anlisis

a) Bacterias mesfilas
b) Levaduras y mohos

a) Bacterias mesfilas
Pipetear 2,1 ml de la solucin en cada una de dos cajas de Petri. Se cubren y se mezcla el
inculo con aproximadamente 12-14 ml de agar nutritivo. Se incuban las cajas durante 48 h a
30C. Finalizado ese lapso el recuento combinado en ambas cajas representa el nmero de
bacterias en aproximadamente 2,5 g del azcar original. El resultado se expresa por 10 g de
azcar.

b) Levaduras y mohos
Se pipetean 2,1 ml de la solucin de azcar antes preparada en cada una de 4 cajas de Petri.
Se cubren mezclando con 12-14 ml de agar para recuento de mohos ajustado a pH 4,5-4,8
con cido lctico 10 % justo antes de su uso. Se incuban las cajas a 30C durante 2 a 3 das.
Al final de ese lapso el recuento combinado de colonias desarrolladas en la placa representa el
nmero de levaduras y mohos en aproximadamente 5 g de azcar original. Se expresan los
resultados por 10 g de azcar.

Normas aceptadas por The American Bottlers of Carbonated Beverages.

1) Bacterias mesfilas ------------------------------------------------------------ 200/10g

2) Levaduras --------------------------------------------------------------------- 10/10g

3) Mohos -------------------------------------------------------------------------- 10/10g

52
ANALISIS DE CARNES Y PRODUCTOS CARNICOS

1) Preparacin de la muestra y diluciones (APHA 1992)


Se pesan 10 g de la muestra, mezclada aspticamente, en una mezcladora esterilizada y se
aaden 90 ml de agua peptona 0,1%. Se agita a la velocidad 15000-20000 rpm durante 2,5
minutos como mximo.
Se mezcla el alimento homogeneizado, agitndolo; se toma 1 ml con una pipeta y se vierte en
un tubo que contenga 9 ml de agua peptona 0,1%. Homogeneizar cuidadosamente. Las
diluciones sucesivas se preparan transfiriendo 1 ml a tubos conteniendo 9 ml de agua de
dilucin estril.

2) Metodologa de anlisis

a) Recuento de bacterias aerobias mesfilas


b) Recuento de bacterias psicrotrficas
c) Recuento de Enterobacteriaceae
d) Recuento de coliformes totales
e) Determinacin de coliformes totales, coliformes a 45C y Escherichia coli
f) Determinacin de Escherichia coli
g) Determinacin de Salmonella
h) Recuento de Staphylococcus aureus coagulasa positiva
i) Recuento de anaerobios sulfito reductores
j) Recuento de Bacillus cereus
k) Recuento de enterococos
l) Recuento de hongos y levaduras
m)Determinacin de Listeria monocytogenes
n) Determinacin de Escherichia coli O157:H7

a) Recuento de bacterias aerobias mesfilas (ICMSF 1983)


1- Se vierte 1 ml de cada dilucin por duplicado en placas de Petri y se agrega el agar para
recuento (APC) fundido y mantenido a aprox. 44-46C. Se mezcla para lograr una
distribucin homognea. Siguiendo las mismas indicaciones, sembrar tres diluciones
sucesivas.
2- Cuando las placas estn fras se invierten y se incuban a 35+ 1C durante 48 h.
3- Se cuentan las colonias y se calcula el valor de recuento total siguiendo las pautas dadas en
el captulo de muestreo. Se seleccionan las placas con recuento entre 25 y 250 colonias, se
multiplica el nmero promedio de colonias contadas en las placas por el factor de dilucin
correspondiente y se informa como UFC de bacterias aerobias mesfilas/g de muestra.

b) Recuento de bacterias psicrotrficas (APHA 1992)


Aplicar el mismo procedimiento que en a) con las diluciones correspondientes. Incubar a
7+1C por 10 das 16 h a 17+ 1C seguido de 3 das a 7+1C.

c) Recuento de Enterobacteriaceae
Sembrar 1 ml de dos diluciones sucesivas por duplicado en placas de Petri y volcar sobre
ellas agar Bilis Rojo Violeta Glucosa (ABRV-G), fundido y mantenido a 44-46C.
Homogeneizar rotando la placa. Confeccionar una sobrecapa de aproximadamente 10 ml del
mismo medio fundido, mantenido a 44-46C. Dejar solidificar. Incubar las placas en posicin
invertida a 35-37C durante 21+3 h. Observar las colonias. Se consideran presuntas

53
unidades formadoras de colonias de enterobacterias las colonias de color prpura con
halo de precipitacin.

Confirmacin de colonias tpicas. Caractersticas morfolgicas y pruebas bioqumicas.


- Transferir una colonia tpica de cada una de las placas a tubos de caldo glucosa y agar
nutritivo. Incubar a 35-37C durante 21+3 h.
- A partir del cultivo, realizar tincin de Gram. Observar al microscopio.
- A partir del agar inclinado realizar la prueba de la oxidasa.
- Observar la fermentacin de glucosa por viraje del indicador cido base.
Las colonias presuntivas que resulten bacilo-cocos Gram negativos no esporulados,
oxidasa negativas y fermentadoras de glucosa confirman la presencia de
Enterobacteriaceae.

d) Recuento de coliformes totales (APHA 1992)


Sembrar 1 ml de dos diluciones sucesivas por duplicado en placas de Petri.
Agregar aprox. 12 ml de agar ABRV lactosa fundido a aprox. 44-46C. Mezclar. Dejar
solidificar completamente y agregar entonces 4 ml ms de medio fundido. Dejar enfriar e
incubar las placas invertidas a 30C por 22-26 h.
Seleccionar las diluciones que presenten entre 10 y 150 colonias. Contar las colonias rojas
oscuras con dimetro de por lo menos 0,5 mm, caractersticas de bacterias coliformes.
Confirmacin: Tomar entre 5 y 10 colonias del ABRV y transferirlas a tubos de fermentacin
con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares (cada colonia a un tubo distinto).
Incubar a 30C por 22-26 h. Se consideran positivas aquellas colonias que den produccin de
gas.
El resultado se calcula en base al nmero de colonias confirmadas. Se expresa como UFC de
coliformes totales /ml g.

e) Enumeracin de coliformes totales, coliformes a 45C y Escherichia coli (FAO 1992)


e.1) Enumeracin de coliformes totales
Prueba presuntiva
Inocular por triplicado 1 ml de diluciones sucesivas de la muestra en tubos de fermentacin
con caldo Lauril Sulfato. Incubar a 35C por 48 h. Se consideran positivos aquellos tubos que
presenten formacin de gas en la campanita de Durham.

Confirmacin de coliformes totales


Transferir una ansada de los tubos positivos del ensayo anterior a tubos con Caldo Verde
Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares.
Incubar 24 h a 35C. Considerar positivos los tubos con produccin de gas.
Calcular el NMP de coliformes totales/g.

e.2) Confirmacin de coliformes a 45C


A partir de los tubos positivos de Caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares en e.1)
inocular un tubo de fermentacin de caldo EC. Incubar 24 hs a 45,5+0,2C. La produccin de
gas en la campanita de Durham confirma coliformes a 45C. En caso negativo reexaminar a
las 48 h.
Registrar el nmero de tubos positivos de cada dilucin.
Calcular el NMP de coliformes a 45C/g de muestra.

54
e.3) Confirmacin de Escherichia coli
Estriar una ansada de los tubos positivos de EC en e.2) en una placa de EMB. Incubar 18-24 h
a 35C.
Transferir colonias tpicas a AN y efectuar ensayos de confirmacin (IMViC y produccin de
gas de lactosa) o set de pruebas mltiples.
Calcular el NMP de Escherichia coli/g de muestra en base a los tubos de EC confirmados.

f) Determinacin de Escherichia coli en 0,1 g (Mossel 1985)


Inocular 1 ml de la dilucin 1/10 en 10 ml de caldo triptona peptona de soja (CTS).
Incubar a 20-25C por 5-6 h. Agitar bien y volcar en un tubo que contenga 10 ml de caldo
Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares doble concentrado (con campanita de Durham).
Incubar a 30C 1C durante 18-24 h.
Los tubos en los que no se verifique formacin de gas se consideran negativos. En este caso
se informa ausencia de E. coli.
Agitar bien el contenido de los tubos positivos, resembrar por estra en agar Mac Conkey.
Incubar a 44C0,1C (preferentemente en bao de agua) durante 30 h. Si existiese
crecimiento tpico (colonias rojas), tomar colonias aisladas y realizarles:
1- Gram
2- Siembra en tubo de fermentacin caldo verde brillante 2% sales biliares con lactosa.
Incubar a 44C por 48 horas.
3- Siembra en caldo triptona. Incubar a 44C por 48 horas.
4- Siembra en agar citrato. Incubar a 30C por 48 horas.

Resultados caractersticos:
1- Coco bacilo Gram negativo no formador de esporas.
2- Fermentacin de lactosa a 44C con formacin de gas.
3- Produccin de indol a 44C.
4- No utiliza citrato.

Alternativamente se pueden utilizar las pruebas del IMViC para la identificacin.


De ser posible ensayar el cultivo sospechoso con un sistema de pruebas mltiples (API,
MICRO-ID, o semejantes).
En caso de confirmarse, informar presencia de E. coli en 1 ml de muestra. Indicar las
pruebas de identificacin realizadas.

g) Determinacin de Salmonella (ISO 6579: 1993)


Pre-enriquecimiento en medio lquido
Pesar aspticamente 10 g de muestra en un erlenmeyer con 225 ml de agua peptona
tamponada. Agitar para homogeneizar. Incubar a 37C durante 16-20 h.

Enriquecimiento en medio lquido.


Transferir 0,1 ml del preenriquecimiento a 10 ml de caldo Rappaport-Vassiliadis (RV).
Incubar a 42,5-43,5C durante 18-24 h.
Transferir 1 ml del preenriquecimiento a 10 ml de caldo selenito-cistina. Incubar a 36-38C
durante 18-24 h.

55
Aislamiento en medio slido
A partir de cada uno de los enriquecimientos estriar una placa de agar Verde Brillante-Rojo
Fenol (agar BPLS) y una de agar MLCB (manitol-lisina-cristal violeta-verde brillante).
Incubar las placas invertidas a 36-38C durante 20-24 h.
De ser necesario, seguir incubando los caldos de enriquecimiento 18-24 h ms y volver a
estriar en los medios de aislamiento.
Si al cabo del perodo de incubacin el crecimiento en las placas fuera escaso, reincubar por
18-24 h adicionales a la misma temperatura.
Examinar las placas para investigar la presencia de colonias tpicas de Salmonella. En agar
BPLS, las colonias son rosadas y el medio circundante rojo brillante. En agar MLCB, las
colonias tpicas son violetas y, a veces, con centro negro.

Identificacin y confirmacin
De cada placa seleccionar cinco colonias sospechosas. Estriar en una placa de agar nutritivo
para que desarrollen colonias aisladas. Incubar a 36-38C durante 18-24 h. Al cabo de la
incubacin, seleccionar colonias aisladas para proseguir con las pruebas de confirmacin
bioqumica y serolgica.

Sobre el cultivo puro realizar:


- tincin de Gram
- oxidasa
Inocular los cultivos que resulten coco-bacilos Gram negativos y oxidasa negativos en los
siguientes medios.
- TSI: en superficie y en profundidad
- Medio LIA
- Medio para ureasa (puede ser BAM)

Salmonella es lisina decarboxilasa +, ureasa +, lactosa - (la gran mayora de las cepas),
sacarosa - (la gran mayora de las cepas).
De ser necesario, pueden realizarse las pruebas del indol (la mayora de las cepas son -), la
prueba de Voges Proskauer (-), citrato de Simmons (la mayora de las cepas son +), etc.
De ser posible confirmar el resultado con un test de pruebas mltiples.

Confirmacin serolgica
Seguir la tcnica explicada en TP N 2: Enterobacterias-Salmonella
Emplear una cepa patrn de Salmonella para controlar los medios de cultivo y los medios
empleados en las pruebas de confirmacin e identificacin.
Informar ausencia o presencia de Salmonella en la cantidad de muestra empleada en el
anlisis. Aclarar modificaciones y pruebas bioqumicas realizadas.

h) Recuento de Staphylococcus aureus coagulasa positiva (APHA 1992)


Siembra y aislamiento en medio slido
Repartir 1 ml de la dilucin adecuada entre 3-4 placas de agar Baird Parker. Realizar un
recuento combinado. Distribuir el inculo con esptula de Drigalsky para obtener colonias
aisladas. Incubar a 35C durante 48 h.
Considerar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Seleccionar un nmero
representativo de colonias sospechosas y transferirlas a tubos de caldo infusin-cerebro-
corazn (BHI). Incubar a 35C por 24 h.

56
El volumen y las diluciones empleadas dependen de la contaminacin que se espere en la
muestra. Recordar que no se recomienda sembrar ms de 0,2 o 0,25 ml por placa. Tambin
puede realizarse un recuento por duplicado sembrando 0,1 ml por placa.

Identificacin y confirmacin
Sobre los cultivos puros de 24 h realizar:
- Tincin de Gram
- Catalasa
- Coagulasa
- Termonucleasa (en la misma placa de Baird - Parker)
Sembrar en paralelo una cepa patrn para comparar con un positivo.

Para realizar los clculos tener en cuenta las diluciones y las alcuotas sembradas. Aclarar las
modificaciones y pruebas bioqumicas realizadas.
Informar UFC de S. aureus coagulasa positiva / g de muestra.

i) Recuento de anaerobios sulfito reductores (Mossel 1982 mod)


Se siembran 2 tubos con agar TSC, fundido deaireado y mantenido a 44-45C con dos
diluciones consecutivas (1/10 y 1/100 preferentemente).
Al sembrar, tener la precaucin de introducir la pipeta hasta el fondo del tubo. Comenzar a
eliminar el volumen de homogenato o dilucin indicado, a medida que se va retirando la
pipeta y describiendo crculos para homogeneizar.
Los tubos preparados se incuban a 35-37C por 18- 20 h.
Se cuentan las colonias negras por tubo (de ser posible se cuentan tubos que tengan entre 30+
10 colonias) Se expresa el nmero de UFC de anaerobios sulfito reductores por gramo de
muestra de acuerdo al factor de dilucin utilizado.

j) Determinacin de Bacillus cereus (APHA 1992)


Medio de cultivo: agar manitol-yema de huevo-polimixina (MYP). Sembrar en superficie 0,1
ml de dos diluciones por duplicado con un rastrillo para cada dilucin. Despus de sembrar
dejar secar e incubar por 20 24 h a 30C+ 2oC.
Transferir un nmero representativo de colonias tpicas a agar nutritivo. Incubar 24-48 h a
37C. En estos cultivos puros ensayar:
- Gram
- catalasa
- tincin de esporas
- fermentacin de glucosa (en caldo rojo fenol en anaerobiosis)
- caldo nitrato
- caldo Voges-Proskauer modificado

Calcular el nmero de colonias de B. cereus teniendo en cuenta las diluciones empleadas y las
colonias confirmadas. Informar como UFC de B. cereus/g.

k) Recuento de enterococos (APHA 1976)


Colocar 1ml de dos diluciones sucesivas en placas de Petri por duplicado. Volcar sobre las
mismas 10 a 15 ml de Agar KF con TTC. Incubar 48 h a 35+1C. Contar todas las colonias
rojas y/o rosas. Confirmar entre 5 y 10 colonias transfiriendo a Caldo BHI e incubando 24 h a
35C. Realizar Gram, catalasa, crecimiento en Agar Bilis Esculina, crecimiento en BHI NaCl
6,5% y en BHI a 45C.
Informar UFC de enterococos/g.
57
l) Recuento de mohos y levaduras (ISO 13681: 1995)
Sembrar por duplicado 1 ml de por lo menos dos diluciones sucesivas de la muestra en placas
de Petri. Agregar agar glucosa-extracto de levadura con oxitetraciclina y gentamicina fundido
a 44-46C y mezclar para homogeneizar el inculo en el agar.
Dejar solidificar. Incubar sin invertir entre 20 y 25 C durante 5 das.
Contar las placas que tengan menos de 150 colonias.
Informar el resultado como UFC de mohos y levaduras /g de muestra.

m) Determinacin de Listeria monocytogenes (USDA, FSIS. Laboratory Communication


N57, revised 1989)

m.1) Enriquecimiento
Enriquecimiento primario:
Colocar 25 ml (o g) de muestra en 225 ml de caldo UVM. Homogeneizar durante 2 minutos.
Incubar por 20 a 24 horas a 30C.
Enriquecimiento secundario:
Transferir 0,1 ml del cultivo anterior a un tubo con 10 ml de caldo Fraser. Incubar 26 + 2
horas a 35C.
Comparar la coloracin de los tubos incubados con uno sin sembrar. Observar tubos
oscurecidos o ennegrecidos por la hidrlisis de esculina. Si el tubo no muestra oscurecimiento
se informa como "Ausencia de L. monocytogenes en 25 g".
En caso de muestras sospechosas de haber causado enfermedad, debe continuarse el anlisis
estriando en agar de aislamiento y reincubando el caldo Fraser por otras 24 horas para realizar
otro aislamiento.

m.2) Aislamiento en medio slido


A partir de los tubos oscurecidos estriar placas de agar MOX (*). Incubar 24-48 horas a
35C. Las colonias tpicas estn rodeadas de una zona negra por hidrlisis de la esculina.
Complementariamente pueden emplearse otros medios de aislamiento:
- Agar MMA (Mc Bride Modificado): se incuba en condiciones anaerbicas a 35C por 24-48
horas. Las colonias tpicas aparecen azul-gris o gris verdoso observadas con iluminacin de
Henry con luz incidente a 45.
- Agar PALCAM: se incuba a 35C por 24-48 horas. Las colonias tpicas son de color gris
verdoso con halo negro-parduzco (por hidrlisis de la esculina), sobre fondo rojo (porque no
fermenta manitol).
- Agar Oxford: se incuba por 24-48 horas a 35C. Las colonias tpicas estn rodeadas de una
zona negra por hidrlisis de la esculina.
(*) En el caso del agar MOX utilizar hisopo estril para sembrar la mitad de la placa y estriar
la otra mitad en ngulo recto.

m.3) Seleccin de colonias y reestriado en agar de hemlisis


Picar sucesivamente 5 colonias sospechosas de agar MOX.
Estriar este inculo en una placa de agar base sangre con sobrecapa del mismo agar con 0,4%
de sangre de caballo (las placas deben ser finas para visualizar bien la hemlisis).
Incubar durante la noche a 35C.
Las placas se examinan con luz fluorescente. Sostener la placa en ngulo recto a la luz
fluorescente.

58
Seleccionar colonias tpicas de Listeria monocytogenes: colonias translcidas de 1 a 2 mm de
dimetro con una delgada zona de -hemlisis alrededor de la colonia y completo
aclaramiento del medio por debajo.
Las colonias caractersticas bien aisladas se pican y se transfieren a un tubo de caldo BHI y a
un tubo de agar para movilidad (alternativamente puede emplearse agar SIM) por puncin con
ansa recta. Incubar durante la noche a 20-25C.
Sobre los cultivos ensayar:
- Tincin de Gram
- Catalasa
- Movilidad tpica:
En agar, observar lnea de siembra difusa con forma tpica de sombrilla invertida.
Del caldo: por la gota pendiente o en fresco.
Si se trata de una cepa bien aislada y pura, bacilo corto Gram positivo no formador de
esporas, catalasa (+), de movilidad caracterstica y hemoltica; se procede a la identificacin.

m.4) Identificacin
A partir de cultivos puros, realizar pruebas para diferenciar L. monocytogenes de las otras
especies hemolticas
- Camp Test
- Fermentacin de ramnosa
- Fermentacin de xilosa

Camp Test
Se realiza sobre una placa de agar sangre. Se inocula en forma de fina estra un cultivo fresco
de Staphylococcus aureus y otra lnea paralela de un cultivo fresco de Rhodococcus equi. En
forma transversal se estran, tambin como finas lneas y sin llegar a atravesar las estras ya
hechas, cepas de Listeria monocytogenes, L. seeligeri, L. ivanovii (las tres hemolticas) y L.
innocua (no hemoltica).
Una reaccin Camp positiva se observa por aumento de la hemlisis en la zona cercana a S.
aureus o R. equi.

Resultados caractersticos:

Especies Camp Test Xilosa Ramnosa


S. aureus R. equi
L. monocytogenes + - - +
L. seeligeri + - + -
L. ivanovii -/+ + + -

Se pueden realizar las siguientes pruebas complementarias (reaccin caracterstica de Listeria


spp.):
- Hidrlisis de esculina (+)
- Utilizacin de glucosa: medio O/F (+)
- Fermentacin de manitol (-)
- Reduccin de nitrato (-)
- Rojo de Metilo- Voges Proskauer (+/+)
- Oxidasa (+)

59
n) Determinacin de E. coli 0157:H7 (USDA, FSIS. Laboratory Communication #38,
revisin 4)

n.1) Enriquecimiento
Pesar 65 g en 225 ml de caldo EC modificado con novobiocina. Agitar para homogeneizar.
Incubar a 35C por 18-24 horas.
Incluir por lo menos un control positivo por cada grupo de muestras ensayadas. El inculo
debe ser de aproximadamente 30-300 UFC por el volumen total de enriquecimiento.
Se registrarn todas las reacciones observadas en el control.

n.2) Test de screening


Se emplean dispositivos comerciales de ensayos rpidos para demostrar la presencia de cepas
con antgeno O157 en el caldo de enriquecimiento n.1).
Para las muestras negativas se informa ausencia de Escherichia coli O157:H7 en 25
gramos.
Las muestras positivas se continan analizando.

n.3) Aislamiento en medios slidos


El caldo de enriquecimiento positivo en n.2) se diluye con diluyente fosfatado Butterfields.
Se inoculan placas de agar MSA-BCIG con 0,1 ml de diluciones 10-4, 10-5, 10-6 y 10-7.
Distribuir homogneamente con esptula de vidrio. Incubar a 42C durante la noche.
Las colonias caractersticas de Escherichia coli O157:H7 son blancas (sorbitol negativas) y
no son fluorescentes (-glucuronidasa negativas).
Preparar un juego de PRS-MUG y EMB para cada muestra sospechosa. Dibujar sobre el
vidrio, en la parte de atrs de la placa, una grilla de 12 secciones y numerarlas.
Tomar aproximadamente 12 colonias sospechosas y estriar en la zona central de la seccin de
EMB y hacer una puncin en la zona correspondiente de PRS-MUG.
Incubar las placas a 35C durante la noche
Colonias tpicas:
Examinar los pares de placas. Se continan analizando solamente aquellos aislados que den
colonias caractersticas en ambos medios.
Las colonias caractersticas de Escherichia coli O157:H7 resultan:
Agar PRS-MUG: colonias sin cambio de color (color amarillo significa que ferment
sorbitol) y sin fluorescencia a la luz UV (-glucuronidasa negativas).
Agar EMB: colonias oscuras con o sin brillo metlico.

n.4) Confirmacin serolgica de antgeno O157.


Las colonias que resultan sospechosas se ensayan para detectar el antgeno O157. Se estudian
las colonias que crecieron en PRS-MUG.
Se contina la identificacin para los aislados O157 positivos.

n.5) Confirmacin
Se realizan las siguientes pruebas (reaccin caracterstica de Escherichia coli O157: H7):
- TSI (amarillo/amarillo, H2S negativo)
- Fermentacin de sorbitol (negativo)
- Fermentacin de celobiosa (negativo)
- Caldo triptona (indol positivo)
- Medio RM-VP (RM: positivo; VP: negativo)
- Citrato de Simmons (negativo)

60
- Lisina decarboxilasa (positivo) *
- Ornitina decarboxilasa (positivo)*
- Medio decarboxilasa base (negativo)
- Medio movilidad (+/-)
Todos los medios se incuban a 35C. Los azcares deben leerse a las 24 horas.

*Los caldos decarboxilasa deben llevar un sello de vaselina. Los positivos son prpura
(medio bsico por decarboxilacin) y el negativo es amarillo (por acidificacin por
fermentacin de la glucosa del medio).

n.6) Serologa de antgeno H7


Sobre los aislados que hayan dado reacciones tpicas de Escherichia coli O157: H7, realizar
una prueba de aglutinacin para H7.

61
REQUISITOS MICROBIOLGICOS DEL CDIGO ALIMENTARIO ARGENTINO
-MERCOSUR-
ANEXO I

Texto de los artculos 156 tris, 255 y 302 del Cdigo Alimentario Argentino (segn la
modificacin/ inclusin por la Resolucin Conjunta SPyRS/ SAGPyA N 79/04 y 500/04).

Art 156 tris: Los productos preparados a base de carne picada, tales como chacinados
frescos embutidos o no embutidos, y otras preparaciones a base de carne picada (albndigas,
empanadas, pasteles, arrollados o similares) precocidas o no, una vez cocidos y listos para
consumir, ya sea que se dispensen inmediatamente despus de finalizada la coccin, en el
establecimiento elaborador o sean enviados a domicilio, debern responder a las siguientes
especificaciones microbiolgicas:

Criterio complementario

Determinacin Resultados Mtodo de Anlisis

ICMSF o equivalente
Microorganismos de los
n=5 c=2
Recuento de aerobios Alimentos-Vol I-Tcnicas de
m=104 M=105 anlisis microbiolgicos-Parte II-
mesfilos/g
Enumeracin de microorganismos
aerobios mesfilos- Mtodos de
Recuento en Placa

ICMSF o equivalente
n=5 c=2 Microorganismos de los
Recuento de coliformes/g Alimentos-Vol I-Tcnicas de
m=100 M=500 anlisis microbiolgicos-Parte II-
Bacterias coliformes

ICMSF o equivalente
Microorganismos de los
E. coli/g Ausencia/g Alimentos-Vol I-Tcnicas de
anlisis microbiolgicos-Parte II-
Bacterias coliformes

ICMSF o equivalente
Microorganismos de los
Recuento de S. aureus n=5 c=1 Alimentos-Vol I-Tcnicas de
coagulasa +/g m<100 M=500 anlisis microbiolgicos-Parte II-
S. aureus- Recuento de
estafilococos coagulasa positiva

62
Criterio obligatorio

Determinacin Resultados Mtodo de Anlisis

USDA-FSIS Gua de Laboratorio


de Microbiologa-captulo 5
n=5 c=0 Deteccin, aislamiento e
E. coli O157: H7/NM identificacin de E. coli
Ausencia/65 g
O157:H7/NM en productos
crnicos o equivalente

n=5 c=0 Manual de Bacteriologa Analtica


Salmonella spp. de FDA (BAM) Captulo 5
Ausencia/25 g Salmonella o equivalente
Podrn investigarse otros microorganismos cuando las circunstancias lo hicieran necesario.

Art. 255: Con la designacin de carne triturada o picada, se entiende la carne apta para
consumo dividida finamente por procedimientos mecnicos y sin aditivo alguno.
Debe prepararse en presencia del interesado salvo en aquellos casos en los que por la
naturaleza del establecimiento o volumen de las operaciones sean autorizados expresamente
por la autoridad competente.
La carne picada fresca deber responder a las siguientes especificaciones microbiolgicas:
Criterio complementario

Determinacin Resultados Mtodo de Anlisis

ICMSF o equivalente
Microorganismos de los
Recuento de aerobios n=5 c=3 Alimentos-Vol I-Tcnicas de
anlisis microbiolgicos-Parte II-
mesfilos/g m=106 M=107 Enumeracin de microorganismos
aerobios mesfilos-Mtodos de
Recuento en Placa

ICMSF o equivalente
n=5 c=2 Microorganismos de los
Recuento de E. coli/g Alimentos-Vol I-Tcnicas de
m=100 M=500 anlisis microbiolgicos-Parte II-
Bacterias coliformes

ICMSF o equivalente
Microorganismos de los
Recuento de S. aureus n=5 c=2 Alimentos-Vol I-Tcnicas de
coagulasa +/g m=100 M=1000 anlisis microbiolgicos-Parte II-
S. aureus-Recuento de
estafilococos coagulasa positiva

63
Criterio obligatorio

Determinacin Resultados Mtodo de Anlisis

USDA-FSIS Gua de Laboratorio


de Microbiologa-captulo 5
n=5 c=0 Deteccin, aislamiento e
E. coli O157: H7/NM identificacin de E. coli
Ausencia/65 g
O157:H7/NM en productos
crnicos o equivalente

n=5 c=0 Manual de Bacteriologa Analtica


Salmonella spp. de FDA (BAM) Captulo 5
Ausencia/10 g Salmonella o equivalente
Podrn investigarse otros microorganismos cuando las circunstancias lo hicieran necesario.

Art. 302: Se entiende por chacinados, los productos preparados sobre la base de carne y/o
sangre, vsceras u otros subproductos animales que hayan sido autorizados para el consumo
humano, adicionados o no con substancias aprobadas a tal fin. Los chacinados frescos
debern responder a las siguientes especificaciones microbiolgicas:

Criterio complementario

Determinacin Resultados Mtodo de Anlisis


ICMSF o equivalente
Microorganismos de los
Alimentos-Vol I-Tcnicas de
Recuento de aerobios n=5 c=3 anlisis microbiolgicos-Parte
mesfilos/g m=106 M=107 II-Enumeracin de
microorganismos aerobios
mesfilos-Mtodos de Recuento
en Placa
ICMSF o equivalente
n=5 c=2 Microorganismos de los
Recuento de E. coli/g Alimentos- Vol I-Tcnicas de
m=100 M=500 anlisis microbiolgicos-Parte II-
Bacterias coliformes
ICMSF o equivalente
Microorganismos de los
Recuento de S. aureus n=5 c=2 Alimentos- Vol I- Tcnicas de
coagulasa +/g m=100 M=1000 anlisis microbiolgicos-Parte II-
S. aureus- Recuento de
estafilococos coagulasa positiva

64
Criterio obligatorio

Determinacin Resultados Mtodo de Anlisis

USDA-FSIS Gua de Laboratorio


de Microbiologa- captulo 5
n=5 c=0 Deteccin, aislamiento e
E. coli O157: H7/NM identificacin de E. coli
Ausencia/65 g
O157:H7/NM en productos
crnicos o equivalente

n=5 c=0 Manual de Bacteriologa Analtica


Salmonella spp. de FDA (BAM) Captulo 5
Ausencia/10 g Salmonella o equivalente
Podrn investigarse otros microorganismos cuando las circunstancias lo hicieran necesario

65
SE.NA.SA PRODUCTOS DE LA PESCA MATERIAS PRIMAS
(Decreto 42.38/68)
Pescados, moluscos Moluscos valvados Crustceos Vacuna Porcina Tripas naturales
no valvados, y escaldados
crustceos crudos
AEROBIOS MESOFILOS 1.000.000 col/g 800.000 col/ g 500.000 col/ g 1.000.000 col/g 1.000.000 col/g 5.000.000 col/ g
ENTEROBACTERIAS 200 col/g 500 col/ g 200 col/g 500 col/ g 1000 col/ g 10.000 col/g
COLIFORMES 100 col/ g 200 col/ g 100 col/g 300 col/ g 500 col/ g 5000 col /g
ESTREPTOCOCOS
100 col/ g 100 col/g 100 col/g No considerar No considerar 5000 col /g
GRUPO D

66
CLOSTRIDIOS
20 col/ g 20 col/g 20 col/g 20 col/g 20 col/g 100 col/g
SULFITOREDUCTORES
Bacillus cereus No considerar No considerar No considerar No considerar No considerar No considerar
LACTOBACILOS No considerar No considerar No considerar No considerar No considerar No considerar
FLORA MICOTICA TOTAL 600 col /g 200 col/g 200 col/g 1100 col/ g 1100 col/g 1100 col/g
LEVADURAS 500 col/g 100 col/g 100 col/g 1000 col/ g 1000 col/ g 1000 col/ g
Escherichia coli Ausente en 0,1 g Ausente en 0.1 g Ausente en 0.1 g Ausente en 0.1 g Ausente en 0.1 g Ausente en 0.1 g
Salmonella sp. Ausente en 25 g Ausente en 25 g Ausente en 25 g Ausente en 25 g Ausente en 25 g Ausente en 25 g
Staphylococcus aureus < 100 col/ g < 100 col/ g < 100 col/ g < 100 col/ g < 100 col/ g < 100 col/ g
COAGULASA +
SE.NA.SA Embutidos frescos Embutidos secos Salazones secas Salazones Chacinados Subproductos
(Decreto 42.38/68) Chorizos, salchichas y Salame, salamn, Bondiola, jamn hmedas cocidos comestibles
longanizas parrilleras. longaniza, chorizos crudo, panceta, Jamn, paleta, lomo Salchicha tipo Viena, Extracto de carne,
espaoles, etc. pastrn, etc. de cerdo cocido. salchichn, gelatina.
mortadela, morcilla,
matambre, etc.
AEROBIOS MESOFILOS 30.000.000 col/ g No considerar* 800.000 col/ g 10.000 col/ g 10.000 col/ g 10.000 col/ g
ENTEROBACTERIAS 25.000 col/ g 2.000 col/ g 200 col/ g 200 col/ g 200 col/ g 100 col/ g
COLIFORMES 10.000 col/ g 1.000 col/ g 100 col/ g 100 col/ g 100 col/ g 100 col/ g
ESTREPTOCOCOS
10.000 col/ g 200.000 col /g 100 col/ g 100 col/ g 100 col/ g 100 col/ g
GRUPO D
CLOSTRIDIOS
100 col/ g 50 col/ g 20 col/ g 20 col/ g 20 col/ g 20 col/ g

67
SULFITOREDUCTORES
Bacillus cereus No considerar 400 col/ g 400 col/ g 400 col/ g 400 col/ g 400 col/ g
LACTOBACILOS No considerar Sin lmite Sin lmite No considerar No considerar No considerar
FLORA MICOTICA TOTAL 2.200 col/ g No considerar 1.100 col/ g 1.100 col/ g 200 col/ g 200 col/ g
LEVADURAS 2.000 col/ g Sin lmite 1.000 col/ g 1.000 col/ g 100 col/ g 100 col/ g
Escherichia coli Ausente en 0,1 g Ausente en 0.1 g Ausente en 0.1 g Ausente en 0.1 g Ausente en 0.1 g Ausente en 0.1 g
Salmonella sp. Ausente en 25 g Ausente en 25 g Ausente en 25 g Ausente en 25 g Ausente en 25 g Ausente en 25 g
Staphylococcus aureus < 100 col/ g < 100 col/ g < 100 col/ g < 100 col/ g < 100 col/ g < 100 col/ g
COAGULASA +

*Debe predominar la flora de maduracin


ANALISIS MICROBIOLOGICO DE ALIMENTOS DESHIDRATADOS

1) Preparacin de la muestra y diluciones


Pesar aspticamente 10 g del alimento en un Erlenmeyer con 90 ml de agua peptona 0,1%
estril y homogeneizar bien.
Tomar con pipeta estril 1 ml de esta primera dilucin y pasar a un tubo con 9 ml de agua
peptona 0,1% para obtener la dilucin 1/100. De ser necesarias ms diluciones, realizarlas en
tubos conteniendo 9 ml de agua peptona 0,1%.

2) Metodologa de anlisis

a) Recuento de bacterias aerobias mesfilas


b) Recuento de coliformes totales
c) Recuento de Clostridium perfringens
d) Determinacin de Salmonella
e) Recuento de Staphylococcus aureus coagulasa positiva
f) Determinacin de Bacillus cereus

a) Recuento de bacterias aerobias mesfilas.


1- Se vierte 1 ml de cada dilucin por duplicado en placas de Petri y se agrega el agar para
recuento (APC) fundido y mantenido a aprox. 44-46C. Se mezcla para lograr una
distribucin homognea.
2- Cuando las placas estn fras se invierten y se incuban a 37 C durante 48 h.
3- Se cuentan las colonias y se calcula el valor de recuento total siguiendo las pautas dadas en
el captulo de muestreo. Se seleccionan las placas con recuento entre 25 y 250 colonias, se
multiplica el nmero promedio de colonias contadas en las placas por el factor de dilucin
correspondiente y se informa como UFC de bacterias aerobias mesfilas/ g de muestra.

b) Recuento de coliformes totales


b.1) Medio lquido
Medio de cultivo: caldo verde brillante 2% de sales biliares o caldo Mc Conkey.
Como trabajo de rutina se usan 2 tubos por cada dilucin. Si fuera necesaria ms precisin,
realizar el NMP usando series de 5 tubos. Sembrar:
2 tubos con 10 ml de la dilucin 1/10 (1g) en caldo doble concentracin.
2 tubos con 1 ml de la dilucin 1/100 (0,1g) en caldo simple concentrado.
2 tubos con 1 ml de la dilucin 1/100 (0,01g) en caldo simple concentrado.
Incubar a 37C por 48 h.
Confirmacin: estriar cada tubo presuntamente positivo en agar EMB. Incubar a 37C 24 h.
Se consideran colonias de coliformes las de aspecto oscuro/ rojo/rosado y/o mucoso, con o sin
brillo metlico.
Registrar el nmero de tubos positivos y calcular el nmero de bacterias coliformes por
gramo de producto empleando las tablas de NMP.

b.2) Recuento en placa


Medio de cultivo: Agar Bilis Rojo Violeta-Lactosa (ABRV-L).
Sembrar dos placas de la dilucin 1/10 y dos placas de la dilucin 1/100 agregando una
sobrecapa del agar al medio solidificado. Incubar 24 h a 35C. Seleccionar las diluciones que
presenten entre 10 y 150 colonias. Contar las colonias rojas oscuras con dimetro de por lo
menos 0,5 mm, caractersticas de bacterias coliformes.
68
Confirmacin: Tomar entre 5 y 10 colonias del ABRV y transferirlas a tubos de fermentacin
con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares. Incubar a 30C por 22-26 h. Se
consideran positivas aquellas colonias que den produccin de gas. El resultado se expresa
como UFC de coliformes totales/g.

c) Recuento de Clostridium perfringens


Siembra y aislamiento
Sembrar 1 ml de la dilucin 1/10 en el fondo de dos bolsitas plsticas. Volcar a travs del
cuello de cada una 30 ml de agar TSN. Homogeneizar bien el inculo rotando la bolsita
mientras se mantiene presionado el cuello.
Dejar solidificar el agar en un separador. Incubar a 37C por 24 h.
Se puede sembrar en placas de Petri e incubar en anaerobiosis. Tambin puede realizarse por
NMP en forma similar al recuento de anaerobios sulfito reductores realizado en el anlisis de
carnes y productos crnicos.

Identificacin y confirmacin
Pasar un nmero representativo de colonias sulfito reductoras a tubos con 10 ml de caldo
tioglicolato. Incubar 24 h a 37C observando si hay crecimiento vigoroso entre 4 y 6 horas
con produccin de abundante gas. A partir de tubos con buen crecimiento realizar:
- Tincin de Gram
- Licuacin de la gelatina en tubos con discos de gelatina-carbn. Sembrar 0,2 ml en el
fondo de los tubos conteniendo el medio previamente deaireado. Incubar a 37C por 18 h.
- Movilidad y reduccin de nitrato en agar semislido Nitrato-Movilidad-Buffereado.
Sembrar por puncin e incubar por 24 h a 37C.
- Fermentacin de la lactosa en medio para fermentacin de azcares. Sembrar 0,2 ml en el
fondo de tubos previamente deaireados. Incubar a 37C por 24 h.

Informar como UFC/g de muestra o NMP/g de muestra de acuerdo a la tcnica empleada.


Tener en cuenta para los clculos las diluciones empleadas y el nmero de colonias
confirmadas.

d) Determinacin de Salmonella
Pre-enriquecimiento en medio lquido
Pesar aspticamente 25g de muestra en un erlenmeyer con 225 ml de agua peptonada
tamponada. Agitar para homogeneizar. Incubar a 37C durante 16-20 h.

Enriquecimiento en medio lquido.


Transferir 1 ml de caldo de pre-enriquecimiento a 10 ml de caldo tetrationato (Mller
Kauffmann). Incubar a 42,5-43,5C durante 18-24 h.
Transferir 1 ml de caldo de pre-enriquecimiento a 10 ml de caldo selenito-cistina. Incubar a
36-38C durante 18-24 h.

Aislamiento en medio slido


A partir de cada uno de los enriquecimientos estriar una placa de agar Xilosa-Lisina-
Desoxicolato (agar XLD) y una de agar Bismuto Sulfito. Incubar las placas invertidas a 36-
38C durante 20-24 h.
De ser necesario, seguir incubando los caldos de enriquecimiento 18-24 h ms y volver a
estriar en los medios de aislamiento.
Si al cabo del perodo de incubacin el crecimiento en las placas fuera escaso, reincubar por
18-24 h adicionales a la misma temperatura.
69
Examinar las placas para investigar la presencia de colonias tpicas de Salmonella. En agar
XLD, las colonias son rojas y con centro negro en la mayora de los casos. En agar Bismuto
sulfito las colonias son marrones a negras con brillo metlico.

Identificacin y confirmacin
De cada placa seleccionar cinco colonias sospechosas. Estriar en una placa de agar nutritivo
para que desarrollen colonias aisladas. Incubar a 36-38C durante 18-24 h. Al cabo de la
incubacin, seleccionar colonias aisladas para proseguir con las pruebas de confirmacin
bioqumica y serolgica.

Sobre el cultivo puro realizar


- tincin de Gram
- oxidasa
Inocular los cultivos que resulten coco-bacilos Gram negativos y oxidasa negativos en los
siguientes medios:
- TSI: en superficie y en profundidad
- Medio LIA
- Medio para ureasa (puede ser BAM)

Salmonella es lisina decarboxilasa +, ureasa +, lactosa - (la gran mayora de las cepas),
sacarosa - (la gran mayora de las cepas).
De ser necesario, pueden realizarse las pruebas del indol (la mayora de las cepas son -), la
prueba de Voges Proskauer (-), crecimiento en caldo KCN (no crece), etc.
De ser posible confirmar el resultado con un sistema de pruebas mltiples.

Confirmacin serolgica
Seguir la tcnica explicada en TP N 2: Enterobacterias-Salmonella
Emplear una cepa patrn de Salmonella para chequear los medios de cultivo y los medios
empleados en las pruebas de confirmacin e identificacin.
Informar ausencia o presencia de Salmonella en la cantidad de muestra empleada en el
anlisis. Aclarar modificaciones y pruebas bioqumicas realizadas.

e) Recuento de Staphylococcus aureus coagulasa positiva


Siembra y aislamiento en medio slido
Transferir 0,1 ml de la dilucin adecuada a una placa de agar Baird Parker. Realizar un
duplicado. Distribuir el inculo con esptula de Drigalsky para obtener colonias aisladas.
Incubar a 35C durante 44-48 h.
Considerar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Seleccionar un nmero
representativo de colonias sospechosas y transferirlas a tubos de caldo infusin-cerebro-
corazn (BHI). Incubar a 35C por 24 h.
El volumen y las diluciones empleadas dependen de la contaminacin que se espere en la
muestra. Incluso puede realizarse un recuento combinado sembrando un volumen mayor y
repartido en varias placas. Recordar que no se recomienda sembrar ms de 0,2 0,25 ml por
placa.

70
Identificacin y confirmacin
Sobre los cultivos puros de 24 h realizar:
- Tincin de Gram
- Catalasa
- Coagulasa
- Termonucleasa (en la misma placa de Baird-Parker)
Sembrar en paralelo una cepa patrn para comparar con un positivo.

Para realizar los clculos tener en cuenta las diluciones y las alcuotas sembradas. Aclarar las
modificaciones y pruebas bioqumicas realizadas.
Informar UFC de S. aureus coagulasa positiva/g de muestra

f) Determinacin de Bacillus cereus (APHA 1992)


Medio de cultivo: agar manitol-yema de huevo-polimixina (MYP). Sembrar en superficie 0,1
ml de dos diluciones por duplicado con un rastrillo para cada dilucin. Despus de sembrar
dejar secar e incubar por 20 o 24 h a 30C+ 2oC.
Transferir un nmero representativo de colonias tpicas a agar nutritivo. Incubar 24-48 h a
37C. En estos cultivos puros ensayar:
- Gram
- catalasa
- tincin de esporas
- fermentacin de glucosa (en caldo rojo fenol en anaerobiosis)
- caldo nitrato
- caldo Voges-Proskauer modificado

Calcular el nmero de colonias de B. cereus teniendo en cuenta las diluciones empleadas y las
colonias confirmadas. Informar como UFC de B. cereus /g de muestra.

71
ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUA

1) Toma de muestra y preparacin de las diluciones


Utilizar frascos estriles de capacidad adecuada para la cantidad de agua necesaria para
realizar los anlisis. Si se supone la presencia de cloro o cloraminas en el agua, agregar 100
mg de tiosulfato de sodio por litro de muestra en los frascos antes de su esterilizacin. Si
pudieran hallarse presentes metales pesados proceder de igual forma empleando 572 mg de
EDTA por litro de muestra. Realizar diluciones decimales sucesivas empleando como
diluyente agua peptona 0,1% (9060. St. Meth. 18th Ed. 1992).

2) Metodologa de anlisis

a) Recuento total de bacterias aerobias mesfilas


b) Recuento de coliformes totales
c) Determinacin de coliformes totales por el mtodo de filtracin por membrana
d) Determinacin de E. coli por el mtodo de filtracin por membrana
e) Determinacin de Estreptococos fecales
f) Determinacin de P. aeruginosa
g) Determinacin de anaerobios esporulados sulfito reductores

a) Recuento total de bacterias aerobias mesfilas


Sembrar en Agar para Recuento en Placa (APC). En la mayora de las aguas potables los
recuentos adecuados se logran sembrando 1 y 0,1 ml del agua tal cual y 1 y 0,1ml de la
dilucin 1/100. Realizar como mnimo dos placas por dilucin de diluciones sucesivas.
Incubar a 37oC por 24hs. Informar UFC de aerobios mesfilos/ml (9215. St. Meth. 18th. Ed.
1992).

b) Recuento de coliformes totales


A) Ensayo presuntivo
A1 - Determinacin de coliformes totales por la tcnica de fermentacin en tubos mltiples
(NMP)
Se inoculan series de 5 tubos de por lo menos 3 diluciones decimales sucesivas (generalmente
10, 1 y 0,1 ml). Si el inculo es igual o mayor a 10 ml se utiliza el medio de concentracin
adecuada para no diluir los nutrientes. Se incuban 24-48 h a 35oC.

A2 - Determinacin de coliformes totales por ensayo de Ausencia-Presencia


Sembrar la cantidad adecuada de agua en frascos con igual volumen de Caldo Lauril Sulfato
de doble concentracin. Incubar 24-48 h a 35C. Produccin de gas y/o cido y/o crecimiento
abundante se confirman como en (1). Se informa ausencia o presencia de coliformes totales
en el volumen de agua sembrada.

(1) - Ensayo de confirmacin:


Los tubos o frascos que producen gas y/o crecimiento abundante en A1 y en A2 se transfieren
con ansa a tubos de fermentacin de Caldo Verde Brillante Bilis Lactosa. Se incuban 48 h a
35oC. Los tubos que producen cido en (1) se computan para el clculo del NMP. En el caso
de que en A1 fueran positivos todos los tubos de dos diluciones consecutivas se confirman
slo los de la serie ms diluida y se computan todos los positivos para el clculo.

72
Esquema del mtodo 9221. Standard Methods 18th. Ed. 1992.

Inocular tubos de fermentacin para NMP (A1) o


frascos para Ensayo de Ausencia-Presencia (A2)
con Caldo Lauril Sulfato. Incubar por 24 h a 35C.
(1) (2)
Crecimiento con produccin de cido y/o gas +.
Produccin de cido y/o gas -.
Transferir para confirmacin a Caldo Verde
Incubar 24 h ms (48 h en total).
Brillante Bilis Lactosa. Incubar 48 h a 35C.

(a) (b) (a) (b)


Produccin de gas +. Produccin de gas -. Produccin de gas + Gas -, cido -.
Transferir a Agar ENDO Ausencia de y/o cido +. Seguir Ausencia de
o Mac Conkey. coliformes como en (1). coliformes
Incubar 24 h a 35C.

(1.1) (1.2)
Colonias tpicas o atpicas. Colonias no tpicas.
- Transferir a Caldo Lauril Sulfato. Ausencia de coliformes
Incubar 24-48 h a 35C.
- Transferir a Agar nutritivo inclinado.
Incubar 24 h a 35C a 1.2.

(a) (b)
Produccin de gas -. Gas +
Ausencia de coliformes Tincin de Gram del AN:

Bacilos Gram Mezcla de bacilos Esporas y/o bacilos Gram +.


Ensayo completo Gram y Gram +. Ensayo completo
Presencia de coliformes Repetir desde 1.1. Ausencia de coliformes

(1) (a) - Ensayo completo:


Para establecer con certeza la presencia de coliformes y para obtener datos de control de
calidad se debe usar el Ensayo Completo en por lo menos el 10% de los tubos positivos en los
ensayos anteriores. Se puede utilizar una doble confirmacin en Caldo Verde Brillante Bilis
Lactosa o sembrar cada tubo positivo de (1) en Agar Endo o Agar Mac Conkey. Incubar 24 h
a 35C. Las colonias tpicas en Agar Endo son rosas o rojas con brillo metlico y las atpicas
son rosas o rojas sin brillo metlico, otras colonias se consideran negativas. Las colonias
tpicas en Agar Mac Conkey son rojas rodeadas de un halo de precipitacin.
De cada placa se pica una o ms colonias y se transfieren:
a.1.1. Caldo Lauril Sulfato. Incubar 24-48 h a 35C.
a.1.2. Agar Nutritivo inclinado (No necesario en agua de bebida). Incubar 24 h a 35C.
La produccin de gas en Lauril Sulfato y la presencia de cocobacilos Gram - en el cultivo de
Agar Nutritivo indican: Presencia del grupo coliforme (Ensayo completo).
Si no se produce gas en los tubos de Caldo Lauril Sulfato, ajustar el clculo del NMP.

73
c) Determinacin de coliformes totales por el mtodo de filtracin por membrana
(Directiva 95/131 CEE)
Se filtra por membrana la cantidad necesaria de agua y se coloca el filtro en 25 ml de Caldo
Lauril Sulfato. Se incuba 4 h a 30oC y 14 h a 37oC. Si hay produccin de cido y/o gas y/o
crecimiento abundante, confirmar como en (1). Se determina ausencia o presencia del grupo
coliforme en el volumen filtrado.
Si se desea hacer recuento colocar el filtro sobre un pad estril embebido en el medio de
cultivo (Caldo Lauril Sulfato para filtracin por membrana), incubando de igual forma. Las
colonias amarillas se confirman como en (1). Se pueden determinar UFC de coliformes
totales/volumen de agua.

d) Determinacin de E. coli por el mtodo de filtracin por membrana


Proceder como en 4) e incubar 4 h a 30oC y 14 h a 44oC (Directiva 95/131 CEE).
Produccin de cido y/o gas y/o crecimiento abundante se confirma estriando en agar Endo.
A las colonias aisladas se les realizan las pruebas de IMViC y/o set de pruebas mltiples. Se
informa ausencia o presencia de E. coli en el volumen filtrado (9225 E. St. Meth. 18th Ed.
1992). Si se desea hacer recuento se procede como en 4), incubando 4 h a 30C y 14 h a 44C.
Las colonias amarillas se confirman por pruebas de IMViC y/o set de pruebas mltiples. Se
informa UFC de E. coli por volumen de agua filtrada.

e) Determinacin de Estreptococos fecales (Mtodo APHA 1984)


Filtrar por membrana la cantidad necesaria de agua y colocar el filtro en cajas de Agar KF.
Incubar 48 h a 37C.
Confirmacin: Aislar las colonias tpicas en placas de Agar Cerebro Corazn. Incubar 24 h a
35C.
De las colonias aisladas realizar: Gram, catalasa, siembra en Agar Bilis Esculina (48 h a
35C), siembra en Agar Infusin de Corazn (24 h a 35C), siembra en Caldo Infusin de
Corazn 6,5% de NaCl (24 h a 37C).
Informar ausencia o presencia de Estreptococos fecales en el volumen filtrado.

f) Determinacin de P. aeruginosa (Norma DIN 38411)


Enriquecimiento:
a) Filtrar por membrana la cantidad adecuada de agua y colocar el filtro en 25 ml de Caldo
Verde de Malaquita.
b) Colocar la cantidad adecuada de agua en igual volumen de Caldo Verde de Malaquita
doble concentrado.
Incubar 48 h a 37oC.
Aislamiento: Si se observa crecimiento en el caldo de enriquecimiento sembrar por estra en
placas de Agar Cetrimida. Incubar 48 h a 42oC.
Confirmacin: de las colonias de Agar Cetrimida sembrar en:
Agar F (formacin de fluorescena), Agar P (formacin de piocianina) y Agar Acetamida.
Realizar la prueba de oxidasa.

g) Determinacin de anaerobios esporulados sulfito reductores (Norma DIN 38411)


Se siembra la cantidad adecuada de agua en igual cantidad de Caldo Diferencial para
Clostridios (DRCM) doble concentrado. Se recubre con parafina lquida y se pasteuriza el
conjunto 20 minutos a 70C. Se incuba como mnimo 48 h a 37C. La mayora de los cultivos
pueden reconocerse al cabo de 3-4 das pero es conveniente prolongar las observaciones una
semana o ms, ya que la germinacin de las esporas puede tardar bastante tiempo.

74
REQUERIMIENTOS MICROBIOLGICOS DEL CAA

Art. 982 Agua potable de suministro pblico y de uso domiciliario.


Art. 983 Agua de bebida potabilizada envasada.
Bacterias mesfilas (APC 24 h a 37C): mx. 500UFC/ml
Bacterias coliformes (NMP 48 h a 37C en Caldo Lauril Sulfato o Caldo Mac Conkey): igual
o menor que 3 /100ml.
E. coli: ausencia en 100ml
P. aeruginosa: ausencia en 100ml

Art. 985 Agua mineral natural.


No debe tener:
Parsitos en 250 ml.
E. coli en 250 ml.
Estreptococos fecales en 250 ml.
P. aeruginosa en 250 ml.
Anaerobios esporulados sulfito reductores en 50 ml.

75
Tabla I. - Nmero ms probable (N.M.P.) de bacterias coliformes por 100 ml de la muestra, sembrando porciones en no ms de tres diluciones

Combinacin de tubos sembrados 10, 1 y 0,1 ml respectivamente


Nmero de tubos positivos
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
0 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5
10 ml 1 ml 0.1 ml 0 0 1 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5

0 1 0 .. 4,9 4,9 4,7 4,6 4,6 4,6 4,6 4,6 4,5 4,4 4,4 4,4 4,4 4,4 4,3 4,2 4,2 4,2 4,2 4,2 4,1 4,1 4,0 4,0 4,0 4,0
0 1 1 .. .. 9,7 .. 9,3 9,2 9,2 9,2 9,1 .. 8,9 8,8 8,8 8,8 8,7 .. 8,5 8,5 8,4 8,4 8,4 .. 8,1 8,1 8,1 8,1 8,0
0 2 0 .. .. .. 9,5 9,5 9,4 9,4 9,3 9,3 9,1 9,1 9,0 9,0 8,9 8,9 8,7 8,7 8,6 8,6 8,5 8,5 8,3 8,3 8,3 8,2 8,2 8,2
0 2 1 .. .. .. .. 14 14 14 14 14 .. 14 14 14 14 13 .. 13 13 13 13 13 .. 12 12 12 12 12
0 3 0 .. .. .. .. .. .. .. .. .. 14 14 14 14 14 14 14 14 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13

1 0 0 6,9 6,5 6,4 6,1 6,0 6,0 6,0 5,9 5,9 5,7 5,7 5,6 5,6 5,6 5,5 5,4 5,4 5,3 5,3 5,3 5,2 5,1 5,1 5,1 5,1 5,1 5,1
1 0 1 .. .. 13 .. 12 12 12 12 12 .. 12 12 12 12 11 .. 11 11 11 11 11 .. 10 9,9 9,9 9,9 9,9
1 1 0 .. 14 14 13 13 13 13 13 13 12 12 12 12 12 12 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 10
1 1 1 .. .. 22 .. 20 20 20 20 19 .. 19 19 18 18 18 .. 18 17 17 17 17 .. 16 16 16 16 16
1 1 2 .. .. .. .. .. 28 27 27 27 .. .. 26 25 25 25 .. .. 24 24 24 23 .. .. 22 22 22 22

1 2 0 .. .. .. 21 21 21 21 20 20 19 19 19 19 19 19 18 18 18 18 18 18 17 17 17 17 17 17
1 2 1 .. .. .. .. 29 29 28 28 28 .. 27 26 26 26 26 .. 25 25 24 24 24 .. 23 23 23 23 23
1 3 0 .. .. .. .. .. .. .. .. .. 28 28 27 27 27 27 26 26 25 25 25 25 24 24 24 24 23 23
1 3 1 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 36 36 35 35 35 .. 33 33 33 32 32 .. 31 31 30 30 30
2 0 0 .. 30 30 24 24 23 23 22 22 20 20 20 20 19 19 18 18 18 17 17 17 16 16 16 16 15 15

2 0 1 .. .. 95 .. 52 50 48 46 45 .. 38 38 37 36 35 .. 32 31 31 30 30 .. 27 27 27 26 26
2 0 2 .. .. .. .. .. 95 91 87 83 .. .. 65 63 61 59 .. .. 50 49 48 47 .. .. 42 41 40 40
2 0 3 .. .. .. .. .. .. 140 140 130 .. .. .. 95 92 90 .. .. .. 72 71 69 .. .. .. 58 57 56
2 1 0 .. .. 240 69 66 62 57 54 51 45 43 42 41 40 39 35 34 34 33 33 32 29 29 29 28 28 28

76
2 1 1 .. .. .. .. 140 130 120 110 110 .. 81 77 74 72 69 .. 57 56 54 53 51 .. 46 45 45 44 43

2 1 2 .. .. .. .. .. 210 190 180 170 .. .. 120 120 110 110 .. .. 85 83 80 78 .. .. 66 65 64 62

Ferramola, Examen bacteriolgico de aguas,1947


2 1 3 .. .. .. .. .. .. 280 260 240 .. .. .. 160 150 150 .. .. .. 110 110 110 .. .. .. 87 86 84
2 2 0 .. .. .. .. 300 240 200 180 160 110 100 98 93 89 85 69 67 65 63 61 59 52 51 50 49 48 47
2 2 1 .. .. .. .. .. 690 450 360 300 .. 170 160 150 140 140 .. 100 100 97 94 91 .. 77 75 73 71 70
2 2 2 .. .. .. .. .. .. 1.100 700 510 .. .. 230 210 200 190 .. .. 140 140 130 130 .. .. 100 99 96 94

2 2 3 .. .. .. .. .. .. .. 1.400 920 .. .. .. 290 270 260 .. .. .. 170 170 160 .. .. .. 130 130 120
2 2 4 .. .. .. .. .. .. .. .. 1.600 .. .. .. .. 350 340 .. .. .. .. 210 200 .. .. .. .. 150 150
2 3 0 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 340 280 240 210 190 140 130 130 120 110 110 90 89 86 84 81 79
2 3 1 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 690 410 290 220 .. 190 180 170 160 160 .. 120 120 120 110 110
2 3 2 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 1.100 700 510 .. .. 250 230 220 210 .. .. 160 150 150 140

2 3 3 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 1.400 920 .. .. .. 300 280 270 .. .. .. 190 180 180


2 3 4 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 1.600 .. .. .. .. 360 340 .. .. .. .. 220 210
2 3 5 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 420 .. .. .. .. .. 250
2 4 0 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 370 300 270 240 220 160 150 150 140 140 130
2 4 1 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 690 470 390 330 .. 210 200 190 190 170

2 4 2 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 1.100 700 510 .. .. 260 240 230 220


2 4 3 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 1.400 920 .. .. .. 310 290 280
2 4 4 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 1.600 .. .. .. .. 370 350
2 4 5 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 430
2 5 0 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 390 330 290 260 240

2 5 1 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 720 480 400 350


2 5 2 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 1.100 700 540
2 5 3 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 1.400 920
2 5 4 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 1.600
Tabla II. - Nmero ms probable (N.M.P.) de bacterias coliformes por 100 ml de la muestra, sembrando porciones en no ms de tres diluciones

Combinacin de tubos sembrados 10, 1 y 0,1 ml respectivamente


Nmero de tubos positivos
3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
0 1 1 2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5
10 ml 1 ml 0.1 ml 0 0 1 0 1 2 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5

0 1 0 .. 3,3 3,3 3,2 3,2 3,2 3,1 3,1 3,1 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9
1 0 0 4,1 3,9 3,9 3,8 3,7 3,7 3,6 3,6 3,6 3,6 3,6 3,5 3,5 3,5 3,5 3,4 3,4 3,4 3,4 3,4 3,3 3,3 3,3 3,3
1 1 0 .. 8,1 8,0 7,7 7,7 7,7 7,4 7,4 7,4 7,3 7,3 7,3 7,2 7,1 7,1 7,1 7,1 7,0 6,9 6,9 6,9 6,8 6,8 6,8
1 2 0 .. .. .. 12 12 12 12 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 10
1 2 1 .. .. .. .. 16 16 .. 16 15 15 15 15 .. 15 15 15 15 15 .. 14 14 14 14 14

1 3 0 .. .. .. .. .. .. 16 16 16 16 16 16 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 14 14
1 3 1 .. .. .. .. .. .. .. 20 20 20 20 20 .. 19 19 19 19 19 .. 18 18 18 18 18
2 0 0 11 10 10 9,8 9,8 9,7 9,3 9,3 9,2 9,1 9,1 9,1 8,9 8,8 8,8 8,7 8,7 8,7 8,5 8,5 8,4 8,4 8,3 8,3
2 0 1 .. .. 16 .. 15 15 .. 15 14 14 14 14 .. 14 14 14 14 13 .. 13 13 13 13 13
2 1 0 .. 17 17 16 16 16 15 15 15 14 15 15 14 14 14 14 14 14 13 13 13 13 13 13

2 1 1 .. .. 24 .. 22 22 .. 21 21 20 20 20 .. 20 19 19 19 19 .. 19 18 18 18 18
2 2 0 .. .. .. 23 23 23 21 21 21 21 21 21 20 20 20 20 20 20 19 19 19 19 19 19
2 2 1 .. .. .. .. 30 30 .. 28 28 28 27 27 .. 26 26 26 26 26 .. 25 25 24 24 24
2 3 0 .. .. .. .. .. .. 29 29 29 29 28 28 27 27 27 27 27 26 26 25 25 25 25 25
2 3 1 .. .. .. .. .. .. .. 37 36 36 36 36 .. 34 34 34 33 33 .. 32 32 31 31 31

2 4 0 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 35 35 35 35 34 34 33 33 33 32 32 32
2 4 1 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 43 43 42 42 42 .. 40 40 39 39 39
2 5 0 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 42 41 41 41 40 40
2 5 1 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 49 49 48 48 48
2 5 2 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 57 56 56 56

3 0 0 .. 34 33 28 27 27 24 24 23 23 23 23 21 21 21 21 21 20 19 19 19 19 19 19

77
3 0 1 .. .. 95 .. 53 51 .. 40 39 39 38 37 .. 34 33 33 32 32 .. 29 29 29 29 28
3 0 2 .. .. .. .. .. 95 .. .. 65 64 62 60 .. .. 51 50 49 48 .. .. 43 42 41 40

Ferramola, Examen bacteriolgico de aguas,1947


3 0 3 .. .. .. .. .. .. .. .. .. 95 92 90 .. .. .. 73 71 69 .. .. .. 59 58 57
3 1 0 .. .. .. 71 66 63 46 45 44 43 42 41 37 36 36 35 35 34 32 31 31 30 30 30

3 1 1 .. .. .. .. 140 130 .. 81 78 75 72 70 .. 59 57 56 54 53 .. 47 46 46 45 44
3 1 2 .. .. .. .. .. 210 .. .. 120 120 110 110 .. .. 85 83 81 78 .. .. 67 65 64 63
3 2 0 .. .. .. .. 300 240 110 100 98 93 89 85 69 67 65 63 61 59 51 50 49 48 47 46
3 2 1 .. .. .. .. .. 700 .. 170 160 150 140 130 .. 100 100 97 94 91 .. 77 75 73 71 69
3 2 2 .. .. .. .. .. .. .. .. 230 210 200 190 .. .. 140 140 130 130 .. .. 100 99 97 94

3 2 3 .. .. .. .. .. .. .. .. .. 290 270 260 .. .. .. 170 170 160 .. .. .. 130 130 120


3 2 4 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 350 330 .. .. .. .. 210 210 .. .. .. .. 150 150
3 2 5 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 420 .. .. .. .. .. 240 .. .. .. .. .. 180
3 3 0 .. .. .. .. .. .. .. 340 280 240 210 190 140 130 130 120 110 110 92 89 86 83 81 79
3 3 1 .. .. .. .. .. .. .. .. 690 460 370 320 .. 190 180 170 160 160 .... 120 120 120 110 110

3 3 2 .. .. .. .. .. .. .. .. .. 1.100 700 530 .. .. 250 230 220 210 .. .. 160 150 150 140
3 3 3 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 1.400 920 .. .. .. 300 280 270 .. .. .. 190 180 180
3 3 4 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 1.600 .. .. .. .. 360 340 .. .. .. .. 220 210
3 3 5 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 420 .. .. .. .. .. 250
3 4 0 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 370 300 270 240 220 160 150 150 140 140 130

3 4 1 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 710 470 390 330 .. 210 200 190 180 170


3 4 2 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 1.100 700 540 .. .. 260 240 230 220
3 4 3 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 1.400 920 .. .. .. 310 290 280
3 4 4 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 1.600 .. .. .. .. 370 350
3 4 5 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 430

3 5 0 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 390 330 290 260 240


3 5 1 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 720 480 400 350
3 5 2 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 1.100 700 540
3 5 3 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 1.400 920
3 5 4 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 1.600
MPN index and 95% confidence limits for various combinations of positive results when
various numbers of tubes are used. (Inocula of 0.1, 0.01, and 0.001 g)

3 Tubes per dilution 5 Tubes per dilution

95% Confidence 95% Confidence


limits limits
Combination MPN index Lower Upper MPN index Lower Upper
of positives per g per g

0-0-0 <3 <0.5 <9 <2 <0.5 <7


0-0-1 3 <0.5 9 2 <0.5 7
0-1-0 3 <0.5 13 2 <0.5 7
0-2-0 - - - 4 <0.5 11
1-0-0 4 <0.5 20 2 <0.5 7
1-0-1 7 1 21 4 <0.5 11
1-1-0 7 1 23 4 <0.5 11
1-1-1 11 3 36 6 <0.5 15
1-2-0 11 3 36 6 <0.5 15
2-0-0 9 1 36 5 <0.5 13
2-0-1 14 3 37 7 1 17
2-1-0 15 3 44 7 1 17
2-1-1 20 7 89 9 2 21
2-2-0 21 4 47 9 2 21
2-2-1 28 10 150 - - -
2-3-0 - - - 12 3 28
3-0-0 23 4 120 8 1 19
3-0-1 39 7 130 11 2 25
3-0-2 64 15 380 - - -
3-1-0 43 7 210 11 2 25
3-1-1 75 14 230 14 4 34
3-1-2 120 30 380 - - -
3-2-0 93 15 380 14 4 34
3-2-1 150 30 440 17 5 46
3-2-2 210 35 470 - - -
3-3-0 240 36 1,300 - - -
3-3-1 460 71 2,400 - - -
3-3-2 1,100 150 4,800 - - -
3-3-3 >1,100 >150 >4,800 - - -

FAO, Manual of Food Control Quality. Microbiological Analysis, 1992.

78
BIBLIOGRAFIA

Adams, M.R. & Moss, M.O. Food Microbiology. The Royal Society of Chemistry,
Cambridge, 1995.
AOAC, Official Methods of Analysis, 1995
APHA."Compendium of Methods for the microbiological examination of foods",1st Ed.
(1976), 3rd Ed (1992).
Brock, T.D. & Madigan, M.T. Microbiologa, 6 Edicin. Prentice Hall Hispanoamericana.
Mxico, 1993.
de la Canal, J.J. Cdigo Alimentario Argentino, 1995
Doyle, M.P., Beuchat, L.R. & Montville, T.J. (Eds.). Food Microbioloy. Fundamentals and
Frontiers. ASM Press, Washington D.C., 1997.
FAO, Manual of Food Quality Control. 4. Rev.1. Microbiological analysis, 1992
ICMSF, "Microorganismos en los Alimentos. Vol. I. Tcnicas de anlisis microbiolgico".
Ed. Acribia 1983
ICMSF Microorganisms in Foods. 1. Their significance and methods of ennumeration, 2nd
Ed. University of Toronto Press, 1978.
ICMSF Microbial Ecology of Foods. Volume 1: Factors affecting life and death of
microorganisms. Volume 2: Food commodities. Academic Press, New York, 1980.
(Edicin en castellano: Editorial Acribia, 1985).
ICMSF Microorganisms in Foods. 2. Sampling for microbiological analysis: principles and
specific applications, 2nd Ed. Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1986.
ICMSF Microorganisms in Foods. 5. Microbiological Specification of Food Pathogens,
Blackie, London, 1996.
Normas FIL-IDF: 73A:1985; 93A:1985; 94B:1990; 45:1990
Mossel y Moreno Garca, "Microbiologa de los alimentos. Fundamentos ecolgicos para
garantizar y comprobar la inocuidad y calidad de los alimentos."; Ed. Acribia, 1985.
Pitt, J.I. & Hocking, A.D. Fungi and Food Spoilage. 2nd Ed., Blackie Academic &
Professional, London, 1997.
St. Methods for the examination of water and waste waters. APHA 18th ED, 1992
USDA, FSIS, Microbiology Division Beltsville, MD. Method for the isolation and
identification of Listeria monocytogenes from processed meat and poultry products
Vanderzant, C. & Splittstoesser, D. (Eds.). Compendium of methods for the microbiological
examination of foods 3rd Ed. APHA, 1992.

79
ANEXO - BIOSEGURIDAD

REGLAS BSICAS DE HIGIENE Y SEGURIDAD PARA ALUMNOS DE LABORATORIOS DE


QUMICA Y BIOLOGA - PAUTAS DE ACTUACION EN CASOS DE EMERGENCIAS
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES - SERVICIO DE HIGIENE Y SEGURIDAD
_____________________________

Las prcticas que se realizan en los laboratorios presentan riesgos propios de cada actividad.
Las reglas bsicas aqu indicadas son un conjunto de normas destinadas a proteger la salud de
los alumnos y a evitar accidentes y contaminaciones tanto dentro del mbito de trabajo, como
hacia el exterior.

Es un elemento clave en la seguridad la informacin que permita reconocer y minimizar o


evitar los riesgos presentes en el laboratorio. Ser fundamental respetar la metodologa de
cada tcnica, y trabajar con cuidado y en forma ordenada.

MEDIDAS GENERALES

1. Se deber conocer la ubicacin de los elementos de seguridad en el lugar de trabajo, tales


como: matafuegos, salidas de emergencia, mantas ignfugas, lavaojos, gabinete para
contener derrames, accionamiento de alarmas, etc.
2. No se debe comer, beber, fumar o maquillarse en el laboratorio.
3. No se debe guardar alimentos en heladeras que contengan drogas o preparados.
4. Se debe utilizar vestimenta apropiada para realizar trabajos de laboratorio, guardapolvo
abrochado (preferentemente de algodn y de mangas largas) y zapatos cerrados. Evitar el
uso de accesorios colgantes (aros, pulseras, collares, etc.). Llevar el cabello recogido.
5. Las mesadas de trabajo, deben estar despejadas, sin libros, ni abrigos ni objetos
personales. Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada persona es
responsable directa de la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes.
6. Las manos deben lavarse cuidadosamente despus de cualquier manipulacin de
laboratorio y antes de retirarse del mismo.
7. Se deben utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias qumica o
material biolgico. Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deber
tocar objetos, ni superficies, tales como: telfono, lapiceras, manijas de cajones o puertas,
cuadernos, etc.
8. No se permite correr en los laboratorios.
9. No se deben bloquear las rutas de escape o pasillos con bancos, sillas, equipos, mquinas
u otros elementos que entorpezcan la correcta circulacin.
10. De aviso inmediato al docente responsable si encuentra instalaciones elctricas y de gas
precarias o provisorias.
11. No utilice equipos (Ej. Rotavap, columnas de destilacin, sonicadores, hornos etc.) sin
haber recibido entrenamiento previo y sin supervisin durante su uso.
12. Toda herida o abrasin, an los pequeos cortes que puedan producirse durante el trabajo
prctico deben ser informados al Docente. Los laboratorios cuentan con un botiqun de
primeros auxilios con los elementos indispensables para atender casos de emergencia.
13. Respete las seales de advertencia. (ej.: riesgo elctrico, alta temperatura, radiaciones,
etc.)

80
14. Todo residuo generado debe colocarse en los recipientes destinados para tal fin segn las
indicaciones del docente (ver Pautas para Gestin de Residuos).

LABORATORIOS DE QUMICA

1. No se permite pipetear con la boca.


2. Siempre que sea necesario proteger los ojos y la cara de salpicaduras o impactos se
utilizarn anteojos de seguridad, viseras o pantallas faciales u otros dispositivos de
proteccin. Cuando se manipulen productos qumicos que emitan vapores o puedan
provocar proyecciones, se evitar el uso de lentes de contacto.
3. No utilice el contenido de un recipiente que no este identificado. Los envases que
contengan agentes qumicos deben adecuadamente etiquetados con la denominacin del
compuesto y el tipo de riesgo (Ej.: corrosivo, txico, inflamable, oxidante, radiactivo,
explosivo o nocivo).

4. Cuando sea necesario manipular grandes cantidades de materiales inflamables (ms de 5


litros) deber tenerse a mano un extintor apropiado para ese material en cuestin.
5. Al almacenar sustancias qumicas se debe considerar las incompatibilidades que dan lugar
a reacciones peligrosas. Consultar con el Docente.

81
6. No almacenar en estantes sobre mesadas sustancias corrosivas y en caso de cidos o
lcalis concentrados (mayor de 2N) deben ser mantenidos en bandejas de material
adecuado.
7. Las prcticas que produzcan gases, vapores, humos o partculas, y que puedan ser
riesgosas por inhalacin deben llevarse a cabo bajo campana.
8. Se debe verificar la ausencia de vapores inflamables antes de encender una fuente de
ignicin.
9. No se debe trabajar con materiales inflamables o solventes sobre llamas directas o cerca
de las mismas. Para calentamiento, slo se utilizarn resistencias elctricas o planchas
calefactoras blindadas. Se prestar especial atencin al punto de inflamacin y de
autoignicin del producto.
10. Est prohibido descartar lquidos inflamables o txicos o corrosivos por los desages de
las piletas, sanitarios o recipientes comunes para residuos. Se deben seguir las pautas
para la gestin de residuos.
11. Los cilindros de gases comprimidos y licuados deben estar en posicin vertical sujetos
con correas o cadenas a la pared en sitios de poca circulacin, de ser posible fuera del
lugar de trabajo, protegidos de la humedad y fuentes de calor.
12. El material de vidrio roto no se depositar con los residuos comunes. Ser conveniente
envolverlo en papel y ubicarlo en cajas resistentes,
13. Todo recipiente que hubiera contenido agentes qumicos puede ser descartado junto a los
residuos comunes vaciado totalmente, enjuagado apropiadamente y sin etiquetas.
14. Est terminantemente prohibido hacer experimentos no autorizados por el Docente. No
substituya nunca un producto qumico por otro en una prctica.

LABORATORIOS DE BIOLOGIA

1. Leer Reglas Bsicas para Laboratorios de Qumica.


2. Se deben utilizar mascarillas descartables cuando exista riesgo de produccin de
aerosoles (mezcla de partculas en medio lquido) o polvos durante operaciones de pesada
de sustancias txicas o biopatgenas, apertura de recipientes con cultivos despus de
agitacin, etc.
3. Est prohibido descartar material biolgico por los desages de las piletas, sanitarios o
recientes comunes para residuos. En cada caso se debern seguir los procedimientos
establecidos para la gestin de residuos.
4. La superficie de trabajo se deber descontaminar una vez terminadas las tarea o luego de
cada derrame de material viable, utilizando productos probadamente efectivos contra los
agentes con que se trabaja.
5. El derrame o cada de muestras contaminadas, diluciones y medios sembrados o
inoculados ser informada al docente de inmediato. Se proceder a tratar el rea afectada
con la solucin desinfectante que corresponda, la cual se dejar actuar y se recoger con
papel absorbente que ser luego descartado con los residuos patognicos.
6. En caso de rotura del recipiente de vidrio que contiene microorganismos, proceder de
igual forma pero no tocar los residuos antes que el desinfectante haya actuado.
7. Cuando proceda a la limpieza de una superficie con alcohol, verifique que no haya
mecheros encendidos.
8. Consulte con el Docente si el material biolgico debe ser descontaminado previo a su
descarte en recipiente de residuos patognicos (bolsa roja).

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PAUTAS PARA LA GESTIN DE RESIDUOS PELIGROSOS Y PATOGNICOS

Peligrosos (cidos, lcalis, oxidantes, corrosivos, guantes, trapos, etc.):


Los residuos lquidos se debern acumular en bidones provistos por el Servicio de Higiene y
Seguridad. Mantenerlos tapados. No mezclar sin consultar al Docente.
Los residuos slidos se debern acumular en bolsas negras dentro de cajas provistas por el
Servicio de Higiene y Seguridad. No tirar residuos domsticos.

Patognicos (tips, guantes, cajas de petri, etc.):


Los residuos biolgicos (sangre, tejidos animales o humanos y todo el material que haya
estado en contacto con ellos) se debern acumular en bolsas rojas dentro de cestos con tapa
provistos por el Servicio de Higiene y Seguridad. Quedan exceptuados los elementos corto-
punzantes (agujas, hojas de bistures), que se recogern en contenedores especiales.

ANTE CUALQUIER DUDA CONSULTE CON EL DOCENTE

La seguridad la disfrutamos todos. Actuemos responsablemente

PAUTAS DE ACTUACIN EN CASO DE EMERGENCIAS

En caso de accidente, avisar inmediatamente al Docente.

) EMERGENCIAS MDICAS

Si ocurre una emergencia tal como cortes o abrasiones, quemaduras o ingestin accidental de
algn producto qumico, txico o peligroso, se deber proceder en la siguiente forma:
1. A los accidentados se les proveer los primeros auxilios
2. Se da aviso al Departamento de Seguridad y Control (Int. 311 Emergencias)
3. El Docente responsable del turno o una autoridad del Departamento, deber
completar el Formulario de Incidentes y enviarlo al Servicio de Higiene y Seguridad
para su conocimiento y evaluacin.

CENTROS PARA REQUERIR AYUDA MEDICA


S.A.M.E. Telfono 107
Hospital Pirovano
Av. Monroe 3555 Tel. 4542-5552 / 9279

INTOXICACIONES:
Hospital de Nios. Dr. R. Gutirrez
Snchez de Bustamante 1399. Capital Federal. Tel: 4962-6666.
Hospital de Nios. Dr. P. de Elizalde
Av. Montes de Oca 40 Tel. 4307-7491 Toxicologa 4300-2115
QUEMADURAS:
Hospital de Quemados
P.Goyena 369 Tel. 4923-4082 / 3022

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OFTALMOLOGA
Hospital Santa Luca
San Juan 2021 Tel. 4941-7077
Hospital Dr. P. Lagleyze
Av. Juan B. Justo 4151 Tel. 4581-0645 / 2792

1. Quemaduras.
Las pequeas quemaduras producidas por material caliente, baos, placas o mantas
calefactoras, etc., se trataran lavando la zona afectada con agua fra durante 10-15 minutos.
Las quemaduras ms graves requieren atencin mdica inmediata. No utilices cremas y
pomadas grasas en las quemaduras graves.

2. Cortes.
Los cortes se tienen que lavar bien, con abundante agua corriente, durante 10 minutos como
mnimo. Si son pequeos y dejan de sangrar en poco tiempo, lvalos con agua y jabn y
tpalos con una venda o apsito adecuados. Si son grandes y no paran de sangrar, requiere
asistencia mdica inmediata.

3. Derrame de productos qumicos sobre la piel.


Los productos qumicos que se hayan vertido sobre la piel han de ser lavados inmediatamente
con agua corriente abundante, como mnimo durante 15 minutos. Es necesario sacarle toda la
ropa contaminada a la persona afectada lo antes posible. El lavado es muy importante para
reducir la gravedad y la extensin de la herida. Requiere asistencia mdica.

4. Actuacin en caso de producirse corrosiones en la piel.


Por cidos. Sacar o cortar lo ms rpidamente posible la ropa. Lavar con agua corriente
abundante la zona afectada. Neutralizar la acidez con bicarbonato sdico durante 15-20
minutos. Esperar la asistencia mdica.
Por lcalis. Lavar la zona afectada con agua corriente abundante y luego con una solucin
saturada de cido brico. Secar y esperar la asistencia mdica.

5. Fuego en el cuerpo.
Si se te incendia la ropa, pide ayuda. El afectado no correr, tiene que tirarse en el suelo y
rodar sobre si mismo para apagar las llamas. Es tu responsabilidad ayudar a alguien que se
est quemando. Cubrirlo con una manta antifuego, conducirlo hasta la ducha de seguridad, si
est cerca. No utilices nunca un extintor sobre una persona. Una vez apagado el fuego,
mantener a la persona tendida, hasta que llegue la asistencia mdica.

6. Actuacin en caso de producirse corrosiones en los ojos.


En este caso el tiempo es esencial (menos de 10 segundos). Cuanto antes se lave el ojo,
menos grave ser el dao producido. Lavar los dos ojos con agua corriente abundante durante
15 minutos como mnimo en una ducha de ojos, o con solucin fisiolgica. Es necesario
mantener los ojos abiertos con la ayuda de los dedos para facilitar el lavado debajo de los
prpados. Es necesario recibir asistencia mdica, por pequea que parezca la lesin.

7. Actuacin en caso de ingestin de productos qumicos.


Antes de cualquier actuacin concreta pide asistencia mdica. Si el paciente est
inconsciente, ponerlo en posicin inclinada, con la cabeza de lado. Si est consciente,
mantenerlo apoyado. No dejarlo slo. No provocar el vmito si el producto ingerido es
corrosivo.

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8. Actuacin en caso de inhalacin de productos qumicos.
Identificar el vapor txico. Si se trata de un gas, utilizar el tipo adecuado de mscara para
gases durante el tiempo que dure el rescate del accidentado. No arriesgarse. Conducir
inmediatamente la persona afectada a un sitio con aire fresco. Requiere asistencia mdica lo
antes posible. Ante el primer sntoma de dificultad respiratoria, iniciar la respiracin artificial
boca a boca.

) INCENDIOS

1. Fuego en el laboratorio.
Mantenga la calma.
Informe al docente responsable.
Se dar aviso inmediatamente al Dpto. de Seguridad y Control (Interno 311) informando el
lugar y las caractersticas del siniestro

2. Fuegos pequeos
Si el fuego es pequeo y localizado, y sabe utilizar un extintor, trate de apagarlo utilizando un
extintor adecuado, arena, o cubriendo el fuego con un recipiente de tamao adecuado que lo
ahogue.
Retirar los productos qumicos inflamables que estn cerca del fuego.
No utilices nunca agua para extinguir un fuego provocado por la inflamacin de un solvente.

3. Fuegos grandes
Si el fuego es de consideracin, no se arriesgue y manteniendo la calma ponga en marcha el
plan de evacuacin. Apague los equipos elctricos y cierre las llaves de gas y ventanas.
Acate las indicaciones de los brigadistas.
Evacue la zona por la ruta asignada.
No corra, camine rpido, cerrando a su paso la mayor cantidad de puertas. No utilice
ascensores. Descienda siempre que sea posible.
No lleve consigo objetos, pueden entorpecer su salida.
Si pudo salir por ninguna causa vuelva a entrar. Deje que los equipos especializados se
encarguen.

) DERRAME MAYORES DE PRODUCTOS QUMICOS

Avise al Departamento de Seguridad y Control (int. 311 Emergencias)


Atender a cualquier persona que pueda haber sido afectada.
Notificar a las personas que se encuentren en las reas cercanas acerca del derrame.
Buscar los elementos en el Gabinete para contener derrames.
Coloque la cinta de demarcacin para advertir el peligro.
Evacuar a toda persona no esencial del rea del derrame.
Si el derrame es de material inflamable, apagar las fuentes de ignicin, y las fuentes de
calor.
Evite respirar los vapores del material derramado, si es necesario utilizar una mscara
respiratoria con filtros apropiados al tipo de derrame.
Ventilar la zona.
Utilizar los elementos de proteccin personal tales como equipos de ropa resistente a
cidos, bases y solventes orgnicos y guantes.
Confinar o contener el derrame, evitando que se extienda. Para ello extender los cordones
en el contorno del derrame.
Luego absorber con los paos sobre el derrame.

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Deje actuar y luego recoger con pala y colocar el residuo en la bolsa roja (patognicos) o
negra (peligrosos) y cirrela.
Si el derrame es de algn elemento muy voltil deje dentro de la campana hasta que lo
retire para su disposicin.
Disponer la bolsa con los residuos (consultar al Servicio de Higiene y Seguridad, int. 275)
Lave el rea del derrame con agua y jabn. Seque bien.
Cuidadosamente retire y limpie todos los elementos que puedan haber sido salpicados por
el derrame.
Lave los guantes, la mscara y ropa.

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Fecha: ..................................................................

Declaro haber ledo las REGLAS BSICAS DE HIGIENE Y SEGURIDAD EN LABORATORIOS


DE QUMICA Y BIOLOGA PROCEDIMIENTOS ANTE EMERGENCIAS que aparecen en la
gua de Trabajos Prcticos de la Materia
................................................................................................
Turno de Laboratorio: ........................................

Firma:...................................................................

Aclaracin:............................................................
L.U. N: ...............................................................

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