Estructuras de grupos de Adyacencia Matriz de

RyR2
Resumen
En el corazn, la estimulacin elctrica de los miocitos cardacos aumenta la
probabilidad de apertura de los canales de Ca 2 + sensibles al voltaje de
sarcolema y flujo de Ca 2 + hacia las clulas. Esto aumenta la unin de Ca
2+ a los canales activados por ligando conocidos como receptores de
rianodina (RyR2). Sus aberturas causan liberacin de toda la clula de Ca 2
+ , que a su vez provoca la contraccin muscular y la generacin de la
fuerza mecnica requerida para bombear la sangre. En los miocitos que
descansan, RyR2s tambin pueden abrir de forma espontnea dando lugar a
los eventos de liberacion de Ca2+ confinado espacialmente conocidos como
"chispas". RyR2s se organizan en una red para formar grupos en la
membrana del retculo sarcoplsmico de la unin. Nuestro trabajo reciente
ha demostrado que la disposicin espacial de RyR2s dentro de las
agrupaciones influye fuertemente en la frecuencia de las chispas de Ca 2+.
Hemos demostrado que la probabilidad de que una chispa de Ca 2+ se
produzca cuando un solo RyR2 en el grupo se abra espontneamente puede
predecirse a partir de las disposiciones espaciales precisas de RyR2s. Por lo
tanto, la "funcin" sigue de la "estructura". Esta probabilidad est
relacionada con el valor propio mximo (1) de la matriz de adyacencia de la
red de grupo RyR2. En este trabajo, desarrollamos un marco terico para la
comprensin de esta relacin. Se presenta un modelo de red de contactos
estocstico del proceso de iniciacin de chispa de Ca 2+. Se demuestra que
1 determina un umbral de estabilidad para la formacin de chispas de Ca
2+ en trminos de las tasas de transicin de compuerta RyR2. Nosotros
recapitulamos estos resultados por la aplicacin del modelo a las estructuras
de grupo realistas RyR2 informados por super-resolucin estimularon el
agotamiento de emisin de microscopa (STED). La Eigendescomposicin del
modelo de red de contactos de campo medio linealizado revela subdominios
funcionales dentro de las agrupaciones RyR2 con sensibilidades distintas a
Ca 2+. Este trabajo proporciona nuevas perspectivas sobre el proceso de
liberacin de Ca 2+ cardiaco y un mtodo general para inferir las
propiedades funcionales de los grupos de receptores transmembrana de su
estructura.

Resumen del autor

Muchos receptores transmembrana se han mostrado al agregarse en grupos
supramoleculares que mejoran la sensibilidad a los estmulos externos en
una variedad de tipos de clulas. Los avances en la super-resolucin de la
microscopa han permitido a los investigadores estudiar estas estructuras
con suficiente detalle como para distinguir las ubicaciones precisas de los
receptores individuales. En el corazn, los esfuerzos han tenido xito en
sacar imgenes de los canales de la liberacin de calcio, que se encuentran
en grupos de hasta ~ 100 en la membrana del retculo sarcoplsmico de los
miocitos cardacos. Hemos demostrado en un estudio reciente de cmo la
estructura de grupos precisa afecta la frecuencia de eventos de liberacin
espontnea de calcio conocidos como "chispas". Aqu hemos desarrollado un
modelo analtico de la iniciacin de chispas de calcio que ilustra claramente
cmo la estructura controla la probabilidad de chispa. A continuacin se
aplica este modelo a una coleccin de estructuras de grupo del canal
obtenidos utilizando microscopa de super-resolucin, revelando los
gradientes espaciales de las propiedades funcionales de los canales
individuales. Este trabajo proporciona informacin sobre el proceso de
liberacin de calcio en el corazn y un marco para evaluar la
heterogeneidad funcional en las poblaciones de grupos de receptores que
utilizan la informacin estructural solo.

Introduccin
La contraccin mecnica del corazn se produce como resultado de la
liberacin intracelular de Ca 2 + en miocitos cardiacos. Los canales de Ca 2
+ de tipo L (LCC) y un racimo compacto de hasta 100 canales de liberacin
de Ca 2+ -sensible Ca 2+ [ 1 , 2 ], conocidos como receptores de rianodina
(RyR2s), son co-ubicadas en uniones subcelulares discretas dentro de la
clula ( Fig 1A ). Estas unidades de liberacin de Ca 2+ (CRU) estn
formados por profundas invaginaciones de la membrana celular que
contiene los LCC, conocidos como tbulos transversales (TTS), y la
membrana de unin del retculo sarcoplsmico (JSR), una hoja que contiene
la cisterna RyR2s las que se envuelve alrededor de la TT para formar un
estrecho subespacio ~ 15 nm de ancho. Durante el acoplamiento de la
excitacin-contraccin (ECC), la estimulacin elctrica aumenta la
probabilidad de aberturas LCC y afluencia de Ca 2 + en estos subespacios.
La unin de Ca 2+ a los RyR2s de aposicin estrecha [ 3 ] aumenta su
probabilidad de apertura y liberacin de Ca 2+ de almacenamientos de JSR
en un proceso conocido como liberacin de Ca 2 + inducida por Ca 2 +
(CICR). Adems la liberacin de Ca 2 + de RyR2s activa los RyR2s alrededor
a travs de un aumento local en el subespacio de concentracin de Ca 2 +.
La comprensin de este proceso es crtica para nuestra comprensin de la
fisiologa cardiaca en salud y enfermedad.

Los eventos de liberacin aislados conocidos como chispas de Ca 2+

subyacen a la liberacin de toda la clula de Ca 2+ que se produce en cada
latido del corazn cuando los RyR2s se activan por la apertura de los canales
de Ca2+ sensibles al voltaje. Las chispas de Ca 2+ se observan tambin en
los miocitos de descanso cuando se inicia por la apertura espontnea de un
solo RyR2 que desencadena entonces probabilsticamente la liberacin de
Ca 2 + del resto de la agrupacin. Aqu, la probabilidad de que un RyR2 est
en un estado abierto en cualquier punto en el tiempo se conoce como su
probabilidad de apertura, y la probabilidad de que un suficientemente gran
porcentaje de los RyR2s abiertos para una chispa que se produzca ser
referido como la probabilidad de chispa ( pS ).
La probabilidad de chispa es un parmetro fisiolgico importante que, en
parte, controla la frecuencia de chispas [ 4 , 5 ]. Hay evidencia experimental
significativa que no todas las aberturas RyR2 de unin dan lugar a chispas
de Ca 2+ [ 6 - 9 ]. Estas aberturas de no chispas pueden en parte atribuirse
a RyR2s de no unin situados fuera del lugar de la liberacin [ 10 , 11 ]. Sin
embargo, el modelado matemtico sugiere que las aberturas de unin RyR2
pueden dejar de provocar chispas de Ca 2+ y son suficientes para dar
cuenta de las aberturas no chispa [ 4 , 5 , 12 , 13 ]. En apoyo de esto,
experimentos recientes que utilizan nanosensores de Ca 2+ dirigidos al sitio
de liberacin han demostrado localmente elevadas concentraciones de Ca 2
+ en el subespacio debido a las aberturas de unin RyR2 espontneas [ 14 ,
15 ]. Esto tambin es coherente con la observacin de que la mayora de Ca
2+ liberado a travs de las aberturas de no chispa se extruye a travs del
intercambiador Na + / Ca 2+, que se localiza cerca de los cruces [ 15 ]. Por
lo tanto existe evidencia convincente que sugiere que la iniciacin de chispa
de Ca 2+ es probablemente un proceso probabilstico.

Muchos estudios han implicado a las chispas de Ca 2+ en las enfermedades

del corazn. Por ejemplo, la frecuencia de chispa se aumenta en la
insuficiencia cardaca [ 7 , 16 ], que se asocia con una disminucin del
contenido de JSR Ca 2+ y, por tanto deteriora de la funcin contrctil [ 17 ].
Las chispas de Ca 2+ pueden causar tambin olas espontneas de Ca 2 +
[ 18 , 19 ] que promueven arritmias celulares [ 20 ]. La heterogeneidad en la
sensibilidad de Ca 2 + de los grupos RyR2 tambin se ha implicado en la
aparicin de alternancia de Ca 2+ arrtmica [ 21 ]. Por lo tanto los factores
que influyen en la probabilidad de chispa de Ca 2+ son propensos a estar
involucrados en los mecanismos de conduccin de disfuncin cardaca
patolgica.

Los avances en las tcnicas de imagen de super-resolucin han permitido el

estudio de la organizacin del receptor de nanoescala en una variedad de
tipos de clulas [ 22 , 23 ]. En miocitos cardacos, microscopa de reduccin
de emisin estimulada (STED) se ha aplicado para estudiar la remodelacin
TT en la insuficiencia cardaca en resolucin nanomtrica [ 24 ]. Dentro de
los sitios cardiacos de liberacin de Ca 2+, RyR2s son conocidos por formar
racimos apretados de estudios de microscopa electrnica en vivo [ 1 ]
( Figura 1B ), que es apoyada por la observacin de que los canales se
organizan en los enrejados llenos de ~ 31 nm de espaciado in vitro [ 25 ].
Estudios de imagen de super-resolucin de los cmulos RyR2 utilizando
microscopa de super-resolucin en miocitos cardiacos han puesto de
manifiesto que son heterogneos en tamao y forma [ 2 ].

Recientemente hemos desarrollado un modelo tridimensional biofsico-

detallado de eventos de liberacin cardacos de Ca 2+, el cual nos
referiremos como el modelo 3D de chispa. La figura 1C muestra un ejemplo
de simulaciones, en los que un canal abierto falla o tiene xito para activar
los RyR2s restantes. Se obtuvieron racimos RyR2 realistas obtenidos
mediante microscopa STED y mostraron que la disposicin espacial precisa
de RyR2s influye crticamente en la probabilidad de chispa [ 4 ]. Grupos ms
grandes, ms compactos exhiben una mayor probabilidad de chispa que las
ms pequeas y fragmentadas. En representacin de grupos RyR2 como una
red bidimensional, se encontr que el valor propio mximo (1) de la matriz
de adyacencia de la red predice la probabilidad de chispa de Ca 2+ de la
agrupacin. Las propiedades de los valores propios y los vectores propios de
la matriz de adyacencia de una grfica han sido ampliamente estudiados, y
1 en particular, se sabe que es una medida de la interconexin de la grfica
[ 26 , 27 ]. 1 se encontr que era un factor de prediccin ms preciso de
probabilidad de chispa que es el nmero total de canales ( n ), que no tiene
en cuenta los aspectos estructurales de la agrupacin. Fig 1D muestra la
relacin entre la probabilidad de chispa, n, y 1 para dos grupos RyR2
analizados anteriormente [ 4 ]. Las dos redes de racimo incrustados tienen
casi la misma probabilidad de chispa, a pesar de una ser mucho ms grande
que la otra. Esto se debe a que la red ms grande contena cuatro espacios
vacos en el interior. Sin embargo, los valores 1 fueron similares para estos
dos grupos y por lo tanto se correlacion consistentemente con probabilidad
de chispa.

Aqu presentamos un modelo analtico del proceso de liberacin de Ca 2+ y

obtenemos la relacin entre 1 y la probabilidad de chispa. El modelo se
aplica a los grupos RyR2 realistas obtenidos mediante el agotamiento de la
emisin estimulada de microscopa (STED). Encontramos a travs de una
eigendescomposicin que algunos grupos RyR2 poseen subdominios
funcionales con distinta sensibilidad a Ca 2+. Este trabajo presenta un
enfoque nico para la comprensin de CICR y proporciona un marco terico
para la comparacin de la funcin fisiolgica de grupos de protenas
basndose nicamente en la informacin estructural.

Resultados
Modelo de red de contacto
En esta seccin, se presentan los resultados utilizando un modelo de red de
contactos (NC) de la activacin del grupo RyR2 donde los canales se acoplan
a travs de interacciones locales con sus vecinos. Los modelos de red de
contactos son ampliamente utilizados para estudiar la propagacin de
enfermedades debido al contacto entre individuos infectados y susceptibles
[ 28 ]. En nuestro modelo, las interacciones en lugar de surgir de la
activacin de Ca 2+ dependiente debido a la afluencia local y difusin de Ca
2 + , que hace que los canales vecinos se abran. Por simplicidad, se supone
que el gradiente de concentracin local de Ca 2+ cerca de un RyR2 abierta
disminuye rpidamente lo suficiente en el espacio de tal manera que slo
RyR2s adyacentes interactan [ 4 , 29 , 30 ]. Cada canal cambia
estocsticamente entre estados abierto y cerrado ( Figura 2A ). Si un canal i
de RyR2 tiene Yi(t) al lado de canales RyR2 que estn abiertos, su tasa de
apertura es Yi( t ), donde es un parmetro constante. Por lo tanto es la
tasa de apertura RyR2 cuando un vecino ms cercano RyR2 est abierto.
Tenga en cuenta que en el modelo biofsico completo de chispa 3D, la tasa
de apertura RyR2 cuando todos los vecinos estn cerrados es muy pequeo
(~ 9 10 -7 ms -1 ). Por lo tanto hemos tomado esta tasa que sea cero en
esta formulacin. El valor de es variado en nuestros anlisis. La tasa de
cierre RyR2, , se supone que es una constante de 0,5 ms -1 . Derivacin del
modelo y parmetros se da en Mtodos y modelos .

El modelo CN es capaz de capturar la dinmica gating de RyR2 durante la

fase de iniciacin de chispas de Ca 2+. Se utiliz la simulacin del algoritmo
estocstico de Gillespie [ 31 ] para simular el modelo CN estocstico. La
figura 2B muestra las huellas del nmero de canales abiertos ( N O ) durante
las simulaciones representativas de la iniciacin de chispa en la chispa 3D y
modelos NC por una celosa de grupo de 7 7. Un nico RyR2 se abre en t =
0, lo cual dispara aberturas de otros canales. El modelo CN reproduce
cualitativamente el comportamiento gating de canal durante la iniciacin de
la chispa. En el modelo de chispa 3D, las chispas Ca 2+ se producen con una
probabilidad mayor que el 95% si un mnimo de cuatro canales se abre. Por
lo tanto, se define este como el nmero mnimo para la iniciacin chispa
xito en ambos modelos. Tambin asumimos que cada RyR2 en el cmulo es
igualmente probable que se abra de forma espontnea, por lo que el primer
canal abierto se elige al azar.

La ventaja de desarrollar el modelo CN es que podemos deducir relaciones

analticas entre el valor propio dominante de la matriz de adyacencia de la
celosa RyR2, 1, y la probabilidad de chispa. Nos demuestran (vase la
ecuacin (9) en Mtodos y Modelos) que para una aproximacin determinista
de campo medio del modelo, probabilidad abierta RyR2 decae a cero cuando

(1)

Esto implica que, en la aproximacin de campo medio, / es un umbral de

estabilidad para 1 en el que la actividad RyR2 cambia de descomposicin
para el crecimiento. Si bien no est claro cmo este umbral relacionado al
comportamiento del modelo estocstico completo CN, esperbamos que el
modelo exhibiera probabilidad de chispa constante cuando 1 = / . Es
decir, para un conjunto de estructuras de grupos cada uno con un valor
diferente de 1 , la probabilidad de chispa sera consistente a travs de las
agrupaciones cuando la tasa de apertura de cada grupo se ajusta a = /
1 . Figura 2C muestra la probabilidad de chispa para una coleccin de 107
agrupaciones RyR2 obtenidas mediante microscopa STED (ver [ 4 ] para los
mtodos de imagen). Para cada simulacin, 1 se calcul para el grupo y
se establece en el valor umbral / 1 . El rango de probabilidades de chispa
en todos los grupos era estrecho (0,14 0,0078). Esto tambin se observ
cuando se utilizan valores de sub-umbral = 0,5 / 1 (0,029 0,0024) y
unos valores de umbral supra- = 2 / 1 (0,28 0,012). Por lo tanto la
probabilidad de chispa es constante cuando se escala inversamente con
1 . Para comparacin, tambin se trazan probabilidad de encendido cuando
se establece en un valor nico en todos los grupos ( figura 2D ). En este
caso, la probabilidad de chispa aumenta con 1 de acuerdo con el modelo
3D chispa (ver Fig 1D ).

El modelo CN fue capaz de predecir con precisin la probabilidad de chispa

Ca 2+ para una gama de geometras de grupo. Se estimaron las
probabilidades de chispa para una coleccin de 15 grupos RyR2 obtenidas
mediante microscopa STED. El valor de se ajust hasta que las
probabilidades de chispa en el modelo CN correlacionados con los del
modelo 3D de chispa ( Fig 2E ). La correlacin mxima se logr para =
0,115 ( R 2 = 0,939), lo que da el valor de / = 4,35. Tenga en cuenta que
el valor terico de 1 para cualquier clster est limitado por arriba por el
nmero mximo de vecinos de canal (4) [ 26 ]. En consecuencia, / =
4,35> 1 implica que el sistema est siempre por debajo del umbral para
cualquier estructura de grupos en condiciones fisiolgicas normales.

El modelo CN tambin predice la probabilidad de chispa para diferentes

tasas de apertura. Para mostrar esto, primero calculamos el pS en el modelo
3D de chispa para un grupo de 7 x 7 con la tasa de apertura reducido por un
factor constante. Luego escalamos = 0.115 por el mismo factor y
determinamos pS en el modelo CN. Esto se repiti para una gama de
factores de escala. Teniendo en cuenta que las tasas de cierre son los
mismos en ambos modelos, podramos comparar directamente pS en los dos
modelos mediante el trazado como una funcin de / , donde es el valor
escalado. Para el modelo 3D de chispa, es el valor utilizado en la
simulacin NC correspondiente. En ambos modelos, la probabilidad de
chispa cay rpidamente a medida que / se acerc a 1 desde la
izquierda, antes de disminuir gradualmente hacia la derecha de 1 . Esto
sugiere que la probabilidad de chispa es ms sensible a la cintica de
activacin peridica RyR2 cuando se eleva la tasa de apertura. A partir de
los datos de esta seccin, llegamos a la conclusin de que el modelo CN es
capaz de predecir con precisin pS en un rango de tasas de apertura y
geometras de racimo.

Difusin de Ca 2+ en el modelo CN
La liberacin cardiaca de Ca 2 + se regula activamente en condiciones
normales y modulada en diversas enfermedades. Para estudiar esta
regulacin, hemos ampliado el modelo CN mediante la derivacin de un
modelo simple de difusin de Ca 2+ entre fuentes de RyR2 Ca 2+. El
parmetro se estima a travs de este modelo de difusin y un modelo
gating de RyR2. Todos los parmetros se tomaron de Walker et al. [ 4 ], a
excepcin del coeficiente de difusin de Ca 2+ ( dC ), que se ajust para dar
= 0,115 como se indica en la seccin anterior.

Un nmero de molculas de sealizacin regula los canales RyR2, afectando

a su tasa de apertura. Esto incluye la fosforilacin de RyR2 por Ca 2+ /
calmodulina dependiente de la protena quinasa II (CaMKII) y la protena
quinasa A (PKA) [ 32 , 33 ] y concentracin de JSR Ca 2 + [ 34 ]. Canalizar el
gating tambin puede ser alterado bajo estrs oxidativo [ 35 ] y por
mutaciones genticas [ 36 , 37 ]. Como se muestra en la figura 3A , / es
inversamente proporcional al constante rango de apertura de canal ( k + ),
lo que refleja el aumento de la frecuencia de chispa de Ca 2+ observado en
tales condiciones [ 7 , 38 , 39 ]. Tenga en cuenta que la tasa de cierre es y
por lo tanto las escalas / linealmente. El aumento de la corriente de
canal unitario ( i RyR ) dio lugar a una disminucin de la / ( Fig 3B ). Este
comportamiento es consistente con la evidencia experimental [ 40 ], en el
que el disminuido iRyR result en la disminucin de la frecuencia de chispa.

El modelo CN tambin era sensible a los parmetros que afectan a la

difusin de iones de Ca 2+ en el subespacio del sitio de liberacin. La figura
3C muestra la dependencia de / en d C . Al aumenta dC, los iones de Ca
2 + son ms propensos a escapar de la nanodominio alrededor del canal
abierto, disminuyendo as la probabilidad de chispa. Aumentando
uniformemente la distancia entre el poro del canal abierto y el sitio de unin
de Ca 2+ vecino aument / fin para disminuir la probabilidad de
encendido ( figura 3D ).

En esta seccin, hemos utilizado un modelo de difusin simple para

investigar los efectos de las perturbaciones a las propiedades biofsicas del
sitio de liberacin, incluyendo la tasa de apertura, corriente de canal
unitario, coeficiente de difusin de Ca 2+, y el espaciamiento entre canales.
El modelo CN sugiere que pequeas modificaciones en estos parmetros
pueden alterar la estabilidad del sistema, lo que conduce a cambios
significativos en la probabilidad de la chispa.

Modelo de campo de CN de media lineal

Hasta este punto, hemos tenido en cuenta la probabilidad de chispa cuando
cada RyR2 es igualmente probable que se abra por primera vez. Una
propiedad emergente del modelo chispa 3D fue que la probabilidad de que
se produzcan chispas variaba con la eleccin de inicial RyR2 [ 4 ]. Los
canales ms cercanos al epicentro de la agrupacin eran ms propensos a
provocar chispas, ya que tienen ms combinaciones posibles de primer,
segundo, tercer, etc. vecinos, a lo largo de la cual las aberturas de los
canales podran propagarse. Del mismo modo, los canales de la periferia de
la agrupacin fueron menos propensos a desencadenar chispas.
Derivamos una representacin de campo medio lineal del modelo CN (LCN)
(ver Mtodos y Modelos) para estudiar cuantitativamente cmo la
probabilidad de chispa depende de la posicin del RyR2 inicial. El modelo
LCN se puede utilizar para calcular el nmero esperado de canales abiertos
como una funcin del tiempo. Razonamos que un mayor nmero esperado
de canales abiertos durante la fase de iniciacin de chispa implicara que las
chispas son ms propensas a ocurrir y por lo tanto se correlacionan con p S .
Usando el modelo de LCN, derivamos una expresin para el nmero
esperado de canales abiertos, E[NO] (vase la ecuacin (15) ), y calcula su
valor para una coleccin de 15 grupos de RyR2. Nos encontramos que E [ N
O ] derivado en el modelo LCN correlacion con p S en el modelo 3D de
chispa ( R 2 = 0,934, figura 4A ). Tenga en cuenta que la ecuacin para E [ N
O ] es dependiente del tiempo, pero los resultados no fueron sensibles a
nuestra eleccin del punto de tiempo t ( R 2 = 0,933 y 0,923 en t = 4 y 12
ms, respectivamente).

Para establecer la relacin entre el E [ N O ] y P S , se compar E [ N O ] con

1 para una coleccin ms amplia de 107 grupos obtenidos a partir de
microscopa STED ( Fig 4B ). Una fuerte correlacin entre estas variables
estaba presente, en contraste con el nmero de canales de la agrupacin,
que no se correlaciona consistentemente con E [ N O ]. Hay que recordar
que estas conclusiones tambin se elaboraron a partir de los datos de la
figura 1D para una coleccin ms pequea de las agrupaciones. Tomados en
conjunto, estos datos sugieren que 1 y E [ N O ] son ambos predictores
exactos de p S , mientras que por s mismo el nmero de canales sin tener
en cuenta las ubicaciones de canal relativos no lo es.

El modelo LCN se utiliz para calcular el vector cuyos elementos son el

nmero previsto de canales abiertos dado cada posible RyR2 de iniciacin.
Denotamos este vectorE [ nO](vase la ecuacin (14) ), donde cada
elemento( E [ nO] )j es el nmero esperado de canales abiertos, dado que
el canal j se abre inicialmente. Tenga en cuenta que nuestro valor nominal
de / est en el rgimen de sub-umbral, lo que implica que E [ N O ] yE
[ nO]tanto la disminucin en el modelo de LCN (ver las ecuaciones ( 15 ) y (
14 )). La Fig 4C muestra cmo( E [ nO] )j fue inicialmente 1, lo que refleja el
primer canal abierto, y decado con el tiempo. Esto ocurri a diferentes
velocidades dentro de un grupo individual, dependiendo de la eleccin de
RyR2 inicial. ( E [ nO] )j decay ms rpidamente para los canales j cerca
del borde en comparacin con los que estn cerca del centro, de acuerdo
con las probabilidades ms bajas de chispa perifricos estimado utilizando el
modelo 3D de chispa ( figura 4D ). Esto es porque los canales cerca del
borde tienen menos canales adyacentes al activador, y por lo tanto es
menos probable que un segundo canal se abrir antes de que los primeros
se cierren. Adems, los canales perifricos tienden a tener menos segundo,
tercero, etc. vecinos que potencialmente pueden ser activadas en
comparacin con los canales centrales.
Llegamos a la conclusin que tanto el nmero esperado de canales abiertos
en el modelo de LCN est fuertemente correlacionado con la probabilidad de
chispa. Este hecho se utiliza para analizar ms a fondo los gradientes
espaciales en la probabilidad chispa que dependen de que RyR2 se abran
inicialmente.

Caracterizacin de los subdominios funcionales por los modos

propios
El modelo LCN puede ser descompuesto en un conjunto de modos propios
independientes tomando la transformada similitud de la matriz de
adyacencia: A = V D V T, donde V es la matriz modal cuyas columnas estn
formadas por un conjunto de vectores propios ortonormales { v 1, v2, . . . ,
Vn}y D es una matriz diagonal de valores propios { 1, 2, ..., n} en orden
descendente. Tenga en cuenta que A es simtrica tal como V -1 = V T . El
modo propio de ith se define por el par i vi, en la que i determina la
velocidad de desintegracin del modo propio en el tiempo y los valores (v i)j
determinan el nmero de miembros del canal j en el modo propio.
Derivamos una expresin para E [nO] como una suma ponderada de los
vectores propios

(2)
donde los pesos bi(T) = e(yo-)t uTvi, con u siendo el vector todo en uno. Una
expresin similar para E [ N O ] est dada por

(3)

dnde . Por lo tanto E[nO]y E[NO] son

esencialmente iguales a las sumas ponderadas de los modos propios. La
derivacin de estas ecuaciones se puede encontrar en Mtodos y modelos.

En la seccin anterior, hemos presentado una prueba ms de la relacin

entre 1 y la probabilidad de chispa, as como gradientes espaciales dentro
del clster en la probabilidad de chispa. Una pregunta natural a
continuacin, para luego formular es: el vector propio dominante (v1)
correspondiente a 1 nos dan informacin acerca de estos gradientes?
Adems, cun importante son otros modos propios?

La distribucin espacial de E[nO]se muestra para la recogida de 10 grupos

RyR2 en la figura 5A . Hemos definido ms, lo que da la
contribucin fraccional del modo propio i a No(t). Descompusimos estos
grupos en sus modos propios y trazamos los valores de ci que corresponde a
los 8 mayores valores propios en la figura 5A . En la mayora de los casos
(grupos (1) - (4), (6), (7), (9)), c 1 fue el nico valor grande, lo que implica
que el modo propio dominante caracteriz el comportamiento del modelo de
LCN. Los grupos (5), (8), y (10), sin embargo, exhiben otro ci significativo
que corresponde a un modo propio subdominante.

Examinando el modo propio dominante de cada grupo, se encontr que para

los grupos caracterizados por slo el modo propio dominante, haba un solo
locus de miembros elevada en el vector propio dominante correspondientes
a los canales j con los valores ms grandes (E[nO])j ( Figura 5C ). Por otra
parte, los gradientes espaciales del modo propio se parecan a la solucin
completa en la figura 5A . Para los grupos con un modo propio subdominante
((5), (8), (10)), sin embargo, el vector propio dominante no caracteriz
plenamente los gradientes espaciales en E[nO]. Para estos grupos, el modo
propio subdominante represent reas de alta E[nO] que no se incluyeron en
el modo propio dominante ( Figura 5D ). Adems, los modos propios
subdominantes fueron insignificantes en los otros grupos.

Para evaluar cuantitativamente qu tan bien los modos propios dominantes

y subdominantes caracterizan probabilidad de chispa, que computa los
coeficientes de correlacin entre el E[nO] y la dominante ( k = 1), la suma de
dominante y subdominante ( k = 2), y la suma del modo propio dominante,
subdominante, y terciario correspondiente a la tercera ms grande c i ( k =
3) ( Fig 5E ). Las agrupaciones que han sido descritos por el modo propio
dominante en general rindieron alta 1 > 0,84, lo que indica que v1 era
suficiente para caracterizar los gradientes espaciales de la probabilidad de
chispa. Para los grupos con modos propios subdominantes significativos, 1
fue menor (<0,68), y se requiere que el segundo modo propio de establecer
una correlacin. Tenga en cuenta que la inclusin del modo propio terciario
no mejor en gran medida la correlacin, lo que sugiere que los dos primeros
modos propios eran ms significativos.

En esta seccin, se caracterizaron los gradientes espaciales dentro del grupo

en la probabilidad de chispa en trminos de los valores propios y los
vectores propios de la matriz de adyacencia. En la mayora de los casos, el
modo propio dominante 1- v1 fue suficiente para aproximar los gradientes.
Los grupos (5), (8), y (10) de la figura 5, sin embargo, posean subdominios
secundarios de canales separados del subdominio dominante por un cuello
de botella (es decir, la morfologa de pesa similares). Estos subdominios
funcionales contenan generalmente canales con menor probabilidad de
chispa que el subdominio dominante. Esto es consistente con la ecuacin
(2), lo que indica que estos subdominios secundarios tambin se
caractericen por una tasa de atenuacin 1 / s > 1 / 1 y por lo tanto se
espera que tengan una menor probabilidad de chispa.

El anlisis de perturbacin
No est claro cmo se puede determinar si un grupo se caracteriza por un
nico modo propio o pareja dominante-subdominante de modos propios sin
realizar los clculos de descomposicin propia (eigendescomposicin). Por
ejemplo, los grupos de comparacin (6) y (8) en la figura 5 , no es
inmediatamente evidente por qu (8) requiere que ambos modos y (6) no lo
hace. Para entender mejor esta relacin, cercenamos progresivamente la
conexin entre dos subdominios funcionales en la parte superior e inferior
del grupo (6). En la figura 6A , retiramos los canales de este grupo
procediendo de izquierda a derecha a lo largo de la fila de canales indicados
por la lnea de puntos en el cuadro de la lnea de base. Un modo propio
subdominante surgi al eliminar los canales. El modo propio dominante se
mantuvo en el subdominio inferior, mientras que el modo propio
subdominante formado en la regin superior. Tenga en cuenta la formacin
de dos subgrupos disjuntos en el grupo (A4), que tienen modos propios
similares a cuando se conectan por un solo canal en (A3). La formacin de
un subdominio secundaria se demuestra adems por un incremento en el
valor de c i para el modo propio subdominante ( Fig 6B ). En este ejemplo, el
modo propio subdominante apareci despus de la eliminacin de un solo
canal y poco a poco se hizo ms prominente con la eliminacin de canales
adicionales. Por lo tanto, la formacin de un modo propio subdominante
puede ser bastante sensible a las reducciones en la regin de divisin de dos
subdominios posible, cada uno distinguido por diferentes propensiones de
chispas.

A continuacin se investig cmo la probabilidad de chispa sensible da

pequeos cambios en la forma de celosa. La figura 6C muestra una serie de
agrupaciones en las que slo un nico canal se ha suprimido del grupo
original. Como era de esperarse, la eliminacin de un canal a lo largo del
borde superior como en el grupo (C1) donde la probabilidad de chispa es
baja como resultado un pequeo cambio en 1 (1). El descarte de un
canal central como en el grupo (C4) dio como resultado el mayor cambio.
Uno puede esperar que la eliminacin de canales con la mayor probabilidad
de chispa podra causar una mayor disminucin de 1 . Sin embargo, el
canal suprimido en el grupo (C2) corresponde a un elemento mayor en E[nO]
que el canal en (C3), sin embargo, el cambio en 1 fue menor. Esto es
porque el canal en el grupo (C3) tuvo mayor de miembros en el modo propio
dominante. Para ilustrar esto, hemos eliminado sistemticamente cada canal
de uno en uno de la agrupacin de lnea de base y se calcul 1. La Fig 6D
muestra que hubo una relacin consistente entre 1 y el canal desechado j
del elemento correspondiente del vector propio dominante ( v1)j en el
grupo original, pero no ( E [ nO] )j. Por lo tanto el elemento j del vector
propio dominante determina el grado de probabilidad de chispa disminuye
cuando un solo canal j se elimina.

Discusin
Hemos demostrado en trabajos anteriores que la estructura precisa de las
agrupaciones de canales RyR2 influye en las propiedades de liberacin de Ca
2+ [ 4 ]. En particular, la probabilidad de una chispa de Ca 2+ que se
produce cuando un RyR2 se abre de forma espontnea depende en gran
medida de la disposicin de los RyR2s en el subespacio. Esto tiene
implicaciones para el ciclo de Ca 2+ en la clula, como la probabilidad de
encendido de Ca 2+ controla la frecuencia de las chispas de Ca 2+ y la
excitabilidad de la agrupacin [ 5 ]. Una propiedad emergente de este
modelo biofsico-detallado fue que 1 es un fuerte predictor de probabilidad
de chispa de Ca 2+.

Aqu presentamos un modelo similar a los utilizados para estudiar la

propagacin del contagio, tal como en las epidemias de enfermedades
[ 41 ]. En este modelo, un solo RyR2 se abre inicialmente, lo que aumenta la
probabilidad de apertura de sus vecinos a travs de un aumento local en la
concentracin de Ca 2 +. Tras derivar una formulacin de campo medio
linealizada del sistema, hemos demostrado que la probabilidad de apertura
de los RyR2s se extingue cuando 1< / . Por lo tanto 1 gobierna un
umbral de estabilidad para la generacin de chispa. En el modelo
estocstico, la probabilidad de chispa era constante en todos los grupos
cuando 1 = / . Por lo tanto, si se comparan los dos grupos RyR2
diferentes, el grupo con menor valor 1 tendra una menor relacin de /
(es decir, mayor RyR2 significa tiempo de apertura o la velocidad de
apertura) para lograr la misma probabilidad de chispa como el otro grupo.
Esto explica por qu 1 se correlaciona con la probabilidad de chispa de Ca
2+. Cator y Van Mieghem derivan de un modelo de segundo orden CN, con
el que se demostr que el verdadero umbral para el sistema para exhibir los
transitorios exponencialmente largos, de hecho, limitada superiormente por
1 [ 42 ]. Sin embargo, el modelo de primer orden que aqu se presenta fue
suficiente para dar cuenta de la relacin entre 1 y la probabilidad de
chispa.

Se sabe que el valor propio mximo de matriz de adyacencia de un grfico

que est relacionado con el nmero de paseos en el grfico [ 26 ]. En
concreto, si W k es el nmero de posibles mbitos de la longitud k en un
grfico con n vrtices, a continuacin, Wk nk1cuando k es grande.
Adems, W k es proporcional a (u Tv1)2 cuando k es grande. Recordemos que
este trmino tambin aparece en la expresin de c 1 . No es casualidad que
WK y E[NO] estn relacionados. Intuitivamente, un mayor nmero de paseos
implica que hay conjuntos contiguos ms posibles de RyR2s a lo largo de la
cual las aberturas de canal pueden propagarse. Esta es esencialmente la
relacin subyacente entre 1 y la probabilidad de chispa de Ca 2+.

Una descomposicin propia del modelo CN determinaban los siguientes

subdominios RyR2 caracterizados por diferentes probabilidades de chispa,
como se observa en el modelo 3D de chispa. Los Subdominios secundarios
con menor probabilidad de chispa se encuentran en grupos que contienen
dos grupos de canales separados por regiones centrales estrechas ~ 2 - 3
canales de ancho. Esto le da significado a los vectores propios de la modelo,
que definen la pertenencia de los RyR2s a cada subdominio funcional.
Curiosamente, v1 es una medida conocida de vrtice central [ 43 ], lo que
significa que la proporcin de todos los posibles sectores de la longitud k
empieza en el vrtice j es( v1)j / ( UTv1)cuando k es suficientemente grande.
Esto implica que los elementos de v1 indica el nmero relativo de paseos de
celosa a partir de cada canal. Nuestros resultados sugieren que esto es
aproximadamente cierto para grupos que se caracterizan por el modo propio
dominante, ya que los canales con mayores valores de (v1)j tenan una
mayor probabilidad de chispa. Debido a que se considera el comportamiento
transitorio de canal gating durante una ventana de tiempo fijo, la suposicin
de que k es grande (es decir, t es grande) no pueden aguantar, lo que
explica el por qu se observ un modo propio subdominante para algunos
grupos.

Nuestros resultados indican que el sistema est cerca del umbral en

condiciones normales, como la relacin / est cerca del umbral 1 . Por
lo tanto, pequeos cambios en pueden cambiar en gran medida el
comportamiento cualitativo del sistema. Utilizando un sencillo modelo de
difusin de Ca 2+, se determin que la probabilidad de chispa es sensible a
los cambios en los parmetros biofsicos.

La probabilidad de apertura de RyR2 est modulada por una variedad de

factores incluyendo la fosforilacin [ 32 , 33 ], concentracin de JSR Ca 2 +
[ 34 ], el estrs oxidativo [ 35 ], y las mutaciones genticas [ 36 , 37 ]. La
mayor parte de stos aumentan la tasa de apertura del canal y la causa
elevada de la frecuencia de chispa de Ca 2+. Nuestro trabajo reciente [ 4 ] y
otros [ 30 , 44 ] han demostrado que la regulacin RyR2 por la concentracin
de JSR Ca 2+ no es necesaria para la terminacin de la chispa. Por el
contrario, el agotamiento de las reservas de JSR Ca 2+ provoca una
disminucin suficiente de la corriente RyR2 unitaria de tal manera que las
aperturas de los canales no se sostienen. Este mecanismo es compatible con
el modelo actual, as, como lo demuestra el fuerte aumento de / a
medida que iRyR se redujo (vase la figura 3B ), ya que sera debido a la
reduccin del gradiente de concentracin de Ca 2+ desde el interior de la
JSR al subespacio cuando RyR2s abren.

Un estudio reciente realizado por la imagen Asghari et al. [ 45 ] observaron

regulacin de la estructura de grupos RyR2. Los autores informaron racimos
densos de RyR2s en los enrejados de lado a lado, como se supone en el
presente estudio, as como los arreglos parecidos al ajedrez con mayor
espaciamiento de ~ 37 nm en comparacin con la lnea base de 31 nm. El
aumento de separacin entre canales uniformemente caus un aumento en
/ de 6,3 a 37 nm (vase la figura 3D ). Tenga en cuenta que para
cualquier grfica cuyos vrtices tienen un mximo de m vecinos, 1 < m
[ 27 ]. Por lo tanto 1 <4 para celosas degrupo. Esto sugiere que cualquier
grupo en la disposicin de tablero de ajedrez sera poco probable que exhiba
chispas de Ca 2+ en ausencia de otros cambios. Curiosamente, se observ
separacin de tablero de ajedrez del canal de fosforilacin o despus de la
disminucin de la concentracin citoslica de Mg 2+, ambos de los cuales
aumentan la probabilidad de apertura de RyR2 [ 33 , 34 ]. Por lo tanto el
aumento de la separacin entre canales puede contrarrestar los efectos de
estas condiciones.

Hemos mantenido el foco en la pertinencia de la morfologa del grupo a la

probabilidad de chispa de Ca 2+ cuando un solo RyR2 se abre
espontneamente. La liberacin de Ca 2+ tambin puede ser activada
despus de la excitacin elctrica de la clula debido a afluencia de Ca 2+ a
travs de LCC opuestos ubicados en el tbulo transversal. Tenga en cuenta
que los estudios de modelizacin sugieren que el acoplamiento de fidelidad
entre los LCC y RyR2s sigue siendo fuerte a pesar de baja probabilidad de
chispa [ 4 , 5 , 13 ]. Esto es porque aunque LCC significa tiempo abierto es
ms corto (~ 0,5 ms), la corriente LCC unitaria es aproximadamente el
mismo que el RyR2, por lo general hay varias LCC por grupo RyR2 (la
relacin de RyR2s a LCC es 4-10 [ 46 ]) y las aberturas LCC se sincronizan a
la despolarizacin de la membrana para impulsar la acumulacin local del
Ca 2+ .

El estudio de la estructura subcelular utilizando tcnicas de super-resolucin

requiere una cuidadosa interpretacin de los datos de imgenes en bruto. En
este estudio, hemos generado celosas de grupo RyR2 basado en la
intensidad de fluorescencia usando un algoritmo de umbral uniforme.
Intensidades iguales o superiores a los 95 percentil fueron interpretados
para representar las posiciones RyR2 sobre la imagen completa. Para
evaluar la incertidumbre en los resultados con respecto a nuestra seleccin
de umbral, se analizaron un nico conjunto de imgenes STED utilizando
umbrales de percentiles tanto de 95 como de 98 . En el umbral ms alto,
ms de la seal de fluorescencia se separa por filtracin y por lo tanto los
grupos contienen menos RyR2s. Esto dio lugar a valores ms bajos de 1 y
la disminucin de p S ( figura 7A ). Las grandes diferencias en la probabilidad
chispa despus de usar el umbral ms alto ponen de manifiesto la
sensibilidad del modelo a los mtodos de procesamiento de imgenes. Sin
embargo, an haba una fuerte correlacin entre P S y 1 cuando se utiliza
el umbral ms alto ( figura 7B ). En consecuencia la prediccin cuantitativa
de la probabilidad de chispa aplicando 1 requiere una interpretacin
coherente de los datos de imagen de super-resolucin y en los beneficios de
adicin de una alteracin gradual de los parmetros de anlisis de imagen,
si es posible.

No se consideraron las interacciones dbiles entre RyR2s tales como las que
existen entre vecinos en diagonal adyacentes. Esto da lugar a una
subestimacin de las probabilidades abiertas. Asimismo, no consideramos
las agrupaciones con separacin heterognea entre canales como se
observa en Asghari et al. [ 45 ]. Tambin slo se consideran grupos
conectados individuales que no contienen brechas que dividen el grupo en
subgrupos separados. Asumimos que el gradiente de concentracin de Ca
2+ que rodea a un RyR2 abierta declina con la suficiente rapidez tal que una
insignificante concentracin de Ca 2 + se detecta en subgrupos cercanos, y
por lo tanto provoca la chispa que se produce de forma independiente. Estas
limitaciones podran superarse mediante el uso de una matriz de distancia o
modelo de difusin como en [ 47 ] para calcular el acoplamiento entre entre
RyR2-Ca 2+. Adems, el modelo de LCN es conocido que se desva ms del
modelo exacto cerca del umbral de estabilidad ( / lambda 1 ) [ 48 ]. Se
ha demostrado que la solucin de la media-modelo CN de campo es un
lmite superior determinada sobre las verdaderas probabilidades [ 49 ], y
aunque existen aproximaciones de orden superior [ 42 ] elegimos la
aproximacin de primer orden de campo medio para su sencillez y
manejabilidad analtica.

El modelo CN tambin se puede aplicar a los sistemas biolgicos similares.

Se puede adaptar para estudiar la liberacin de Ca 2 + provocada por una
LCC. La probabilidad de chispa estara relacionada con la fidelidad de
acoplamiento entre LCC y RyR2s. Este modelo podra ser utilizado para
analizar la disposicin de LCC a medida que se dispone de tales datos
experimentales. Tambin se puede aplicar a los estudios de imagen futuros
para comparar la morfologa de grupo de RyR2 para, por ejemplo, identificar
la variabilidad entre especies o remodelacin en las enfermedades del
corazn. Por ejemplo, la reduccin de tamaos de clster RyR2 y morfologa
JSR fragmentada se han observado en modelos de ratn de la taquicardia
ventricular polimrfica catecolaminrgica [ 50 ]. Inositol trifosfato
(receptores IP3Rs) ubicados en el retculo sarcoplsmico se conocen ques e
agregan en pequeas agrupaciones que presentan eventos de liberacin
similar conocido como "bocanadas" de Ca 2+, y los trabajos recientes han
implicado el tamao del clster en la liberacin de medida [ 51 ] y la
probabilidad de disparo [ 52 ]. Los actuales modelos podran utilizarse para
comparar geometras de grupo de IP3R como los reportados en un estudio
reciente [ 53 ]. En el msculo esqueltico, la liberacin de Ca 2+ se coordina
principalmente por LCC-fsica y las interacciones RyR1 RyR1-RYR1 [ 54 ]. Los
estudios de imagen han observado que las agrupaciones RYR1 en las fibras
musculares de contraccin lenta eran por lo general ms pequeas y ms
fragmentadas que en los msculos de contraccin rpida [ 1 , 55 ]. El
modelo que aqu se presenta se podra utilizar para relacionar estas
observaciones con las diferencias conocidas en las propiedades de liberacin
de Ca 2+ de estos tipos de clulas.

Ms en general, el modelo podra ser adaptado para complementar los

estudios de imagen de super-resolucin de una amplia gama de receptores
que forman agrupaciones supramoleculares similares en otros tipos de
clulas [ 22 , 23 ]. Un modelo terico general ha sugerido que los grupos de
receptores activados por ligando se comportan cooperativamente [ 56 ].
Ejemplos de las neuronas incluyen microgrupos sinpticos de sintaxina 1
[ 57 ], complejos de receptores de acetilcolina en la postsinapsis
neuromuscular [ 58 ], y los anillos de los receptores de AMPA que se
encuentran en las neuronas del ganglio espiral [ 59 ]. Otro ejemplo son los
inmunorreceptores [ 60 ], que forman grupos para amplificar la iniciacin de
la seal y la transduccin, tal vez por la disminucin de las constantes de
disociacin eficaces de ligandos y efectores transformadores [ 61 ]. Adems,
Greenfield et al. emplearon tcnicas de super-resolucin para investigar la
organizacin espacial de los receptores implicados en la quimiotaxis
bacteriana [ 62 ]. Estos receptores forman grupos en la membrana celular y,
similar a RyR2s, presentan interacciones cooperativas que mejoran la
sensibilidad a las seales qumicas bajas.

Este trabajo presenta una nueva perspectiva sobre la liberacin de calcio

cardaco y, ms en general, pone de relieve la importancia de la variabilidad
subcelular en microdominios para el estudio de sistemas biolgicos a escala
mltiple.

Mtodos y modelos
Declaracin de tica
Todos los procedimientos animales fueron revisados y aprobados por el
Comit Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de
Medicina de Gttingen Zentrale Tierexperimentelle Einrichtung (ZTE). Se
aplic sacrificio de animales como se describe en Wagner et al. [ 24 ].

Modelo de red de contacto

Los modelos de procesos de contacto han sido ampliamente estudiados por
su uso en la enfermedad de modelado y la propagacin de virus informticos
(ver Keeling y EAMS [ 41 ] para una revisin). En el presente trabajo, el
modelo CN representa el canal gating RyR2 de un grupo de canales n. Nos
limitaremos a grupos que estn conectados, es decir, no hay islas separadas
de canales. El modelo se compone de un conjunto de n variables aleatorias
X i ( t ) = 1 si el canal i est abierto en el tiempo t y 0 de otro modo. Si el
canal est abierto, la probabilidad de que se cierre dentro de un paso de
tiempo infinitesimal dt est dada por dt , donde = 0,5 ms-1 es constante.
Si el canal i est cerrado, las transiciones en el estado abierto en el tiempo
dt con probabilidad Y i ( t ) dt , donde Y i ( t ) es el nmero de canales
adyacentes abiertos. es una constante dada por = k+ C , donde k + =
1.107 10-4 M- s-1 es la constante de velocidad de apertura, C es la
elevacin local de la concentracin de Ca 2+ provocada por un vecino
abierto, y = 2,1 es el coeficiente de Hill para la unin de Ca 2+ [ 4 ].

La matriz de adyacencia A se define como una matriz n n, donde el

elemento ( A ) ij = 1 si los canales i y j son adyacentes, y 0 en caso
contrario. El nmero de canales adyacentes abiertos entonces dado por Y i
( t ) = j ( A ) ij X j ( t ). Permite a p i ( t ) = P ( X i ( t ) = 1), la probabilidad
de que el canal i est abierto en el momento t , que obedece a la ecuacin
[48]

(4)
Todo el sistema puede ser representado de forma ms compacta como la
ecuacin matricial

(5)
dnde p( T ) = [ p1( t ) , . . . , Pn( t ) ], u es el vector todo en uno, x(t) =
[ X1(t) , . . . , Xn(t) ] e I es la matriz identidad. Por consiguiente, el sistema
se describe mediante un conjunto de n ecuaciones diferenciales estocsticas
acopladas, cuya solucin es analticamente intratable. Hemos simulado el
modelo CN usando el algoritmo de Gillespie [ 31 ]. La probabilidad de chispa
en el modelo CN se estim mediante la ejecucin de un conjunto de 10.000
simulaciones por punto de datos.

Ca 2+ modelo de difusin
A continuacin incorporamos un modelo simple de difusin de Ca 2+ que se
refieren al modelo CN a la comunicacin basada en Ca 2+ entre RyR2s.
Nosotros usamos la ecuacin de difusin en estado estacionario para una
fuente puntual continua en un volumen semi-infinito para obtener la
concentracin de Ca 2+ detectada por un RyR2 vecino de un solo canal
abierto [ 63 ]

(6)
donde iRyR = 0,15 pA es la corriente unitaria de un solo canal, z = 2 es la
valencia de Ca 2 + , F es constante de Faraday, d C es el coeficiente de
difusin eficaz de Ca 2+ en el subespacio del lugar de liberacin, y r = 31
nm es la distancia entre el poro del canal abierto y el sitio de unin cercano
de Ca 2+.

El coeficiente de difusin de Ca 2+ en el subespacio es desconocida, aunque

las estimaciones de d C en el rango de citosol de 100 a 600 m 2 s -1 [ 64 ].
Las molculas de tamponamiento de Ca 2+, las interacciones electrostticas
con la membrana, y tortuosidad impuesta por los grandes canales RyR2
pueden afectar el movimiento de iones de Ca 2+ [ 65 ]. A la luz de estos
factores, el valor de d C se ajust a de 250 a 146 m 2 s -1 para obtener el
valor nominal de = 0,115 que produce probabilidades de chispa precisos
(ver resultados ).
Modelo de red de contacto de campo medio lineal
Un enfoque comn es derivar una aproximacin de campo medio del primer
momento de X i ( t ) suponiendo que los momentos de orden superior son
iguales a 0 [ 48 ]. Esto produce un conjunto de ecuaciones diferenciales
ordinarias no lineales

(7)
dnde p( T )ahora es el vector de probabilidades abiertas de campo medio.
Este sistema no lineal es difcil de analizar analticamente [ 48 ].
Simplificamos ms el modelo al linealizar las ecuaciones sobre p= 0[ 28 ]

(8)
Nos referimos a esto como el modelo CN de campo linealizado de media
(LCN), que se presta a las herramientas de la teora de sistemas lineales.
Tenga en cuenta que el sistema es estable si y slo si el mximo
(dominante) valor propio de A - I , dada por 1 - , es menor que 0,

(9)
donde 1 es el mximo valor propio (dominante) de A . Por lo tanto, si 1 <
/ , las probabilidades abiertas en la decadencia LCN a 0. De lo contrario,
p( T ) es ilimitada como t . Aunque fsicamente sin sentido, este
resultado implica que las probabilidades abiertas aumentan cuando la
mayora de los canales estn cerrados, o p( T ) 0 (Cerca del origen de
linealizacin).

La descomposicin propia de A est dada por

A = VDVT , (10)
donde V es la matriz modal con columnas formadas por los vectores propios
ortonormales { v1, . . . , Vn} de A, y D es una matriz diagonal de los valores
propios { 1 , ..., n } en orden descendente. Tenga en cuenta que A es
simtrica y por lo tanto V -1 = V T . Combinando las ecuaciones ( 8 ) y ( 10 )
da

(11)
que puede ser reescrito como la suma

(12)
La solucin de este sistema viene dada por
 (13)
Nos referimos a los modos propios como los pares de valores propios,
vectores propios i- vi. Tenga en cuenta que p( T )es esencialmente una
suma de los modos propios. Si la distribucin de probabilidad inicial p( 0 ) =
vi para alguna constante , entonces p( T ) vi para todos t . En otras
palabras, la trayectoria del sistema se caracteriza en su totalidad por la
inesima del modo propio. En general, la contribucin de la inesima de modo
propio se determina por el peso y un factor exponencial dependiente
del tiempo con constante de tiempo 1 / ( i - ).

Definimos E [ nO( T ) ] como el vector cuyos elementos ( E [ nO( T ) ] )i da el

nmero esperado de canales abiertos en el momento t dado que el canal i es
abierto inicialmente. Este se calcula tomando la suma de los elementos de
p( T )en la ecuacin (13)

(14)
Suponemos que en un grupo RyR2 de reposo, cada canal experimenta la
misma concentracin de Ca 2+ y por lo tanto es igualmente probable que
inicie una chispa. El nmero total esperado de canales abiertos cuando el
primer canal abierto es elegido al azar se puede calcular mediante el
establecimiento de p( 0 ) para la distribucin uniforme y otra vez sumando
todos los elementos de p( T )

(15)
Fig 1. Las chispas de Ca2 + son eventos fortuitos que ocurren en los
sitios de liberacin en el miocito cardiaco. (A) Seccin transversal de la
estructura del sitio de liberacin. Invaginaciones profundas en la membrana
celular conocido como tbulos transversales se renen con el JSR para formar
un subespacio estrecho que contiene un grupo de RyR2s (azul), que liberan
Ca 2 + dentro de la clula. Las flechas indican la direccin de flujo de Ca 2+. (B)
Grupo de ejemplo RyR2s que forman un entramado lleno. (C) simulaciones
representativas del modelo de chispa 3D que muestra el nmero de canales
abiertos ( N S ) de un total de 49. Despus que un solo canal se abre en t = 0,
se tiene xito probabilsticamente ( azul ) o no ( rojo ) para desencadenar una
chispa . El recuadro muestra la fase de iniciacin de la chispa. (D) Relacin
del tamao de grupo ( n , tringulos ) y el valor propio mximo
( 1 , crculos ) con probabilidad de chispa de Ca 2+ en el modelo 3D chispa
[4]. Dos redes de racimo incrustados se muestran para ilustrar que las
agrupaciones RyR2 pueden exhibir iguales probabilidad de chispa de Ca 2+ a
pesar de las diferencias en el nmero de canales debido a las diferencias en
la forma.
Fig 2. El modelo de red de contactos reproduce el canal gating RyR2
durante la iniciacin de chispa de Ca2 +. (A) modelo de red de contacto
esquemtico que muestra (i) un diagrama de la estructura de la red RyR2 a
partir de la fig. 1 (B) con lneas de conexin de canales adyacentes y (ii) el
modelo de Markov que representa cada canal con estados cerrados (C) y (O)
abiertos. La tasa de apertura de cada canal i escala con el nmero de canales
adyacentes abiertos Yi (t). (B) Simulaciones de ejemplo que muestra el
modelo CN ( rojo ) y el modelo 3D de chispa ( azul ) comportamiento gating
de RyR2 durante la fase de iniciacin de la chispa. La generacin de chispa
se considera exitoso si N O 4 (lnea discontinua). (C) Probabilidades de
chispa para una coleccin de clsteres RyR2 107 STED informadas para el
umbral (en el centro), sub-umbral (inferior), y supra-umbral de los valores
(superiores) de . (D) Probabilidades de chispa cuando el valor de se
establece en valores constantes en todos los grupos. (E) se ajust al valor
nominal de 0.115ms-1 para maximizar la correlacin con probabilidades de
encendido del modelo 3D de chispa |para una coleccin de 15 grupos
representativos ( R 2 = 0,939). (F) la probabilidad de chispa ( p S ) de una
celosa de 7 x 7 de RyR2s en funcin de / en la NC ( rojo ) y los modelos
3d de chispa ( azul ) (vase el texto para ms detalles). El modelo CN est en
el rgimen de sub-umbral cuando / est a la derecha de 1 (lnea de
puntos negro).
Fig 3. La dependencia de / en las propiedades biofsicas del sitio
de la liberacin de Ca2 + cardiaca
La dependencia (A) del rango constante de apertura RyR2, (B) la corriente
unitaria RyR2, (C) coeficiente de difusin de Ca 2+ efectivo, y (D) distancia
entre poro del canal y el sitio de unin cercano a Ca 2+. Las lneas de puntos
rojos indican los valores nominales de los parmetros de Walker et al. [4], a
excepcin de dC , que se ajust para dar = 0,115 como se determina en la
Fig 2E.
Fig 4. El nmero previsto de canales abiertos en el modelo CN de
campo de media linealizada (LCN) predice la probabilidad de chispa.
(A) Nmero previsto de canales abiertos (E [ N O ]) del modelo LCN en t = 8
ms fuertemente correlacionado con p S del modelo 3D de chispa ( R 2 =
0,934). Los datos mostrados para una coleccin de 15 grupos. (B) E [ N O ]
tambin se correlacion con 1 ( rojo ), pero no con el nmero de canales en
el grupo ( n , negro ). Los puntos de datos son de la coleccin de 107
agrupaciones. (C) Dependencia del tiempo de la cantidad esperada de

canales abiertos para los diferentes iniciadores RyR2s ( ) en el borde

de la agrupacin ( azul ), en el interior ( rojo ), y la media (E [ N O ], negro )

para el clster mostrado en el panel siguiente. (D) Mapas de calor de

( izquierda ) y p S estimado utilizando el modelo 3D de chispa ( derecha )
ilustra gradientes dentro de un clster en la probabilidad de chispa.
Figura 5. Gradientes espaciales intra-grupo en la probabilidad de
chispa se caracterizan por uno o dos modos propios. Los datos se
muestran por 10 grupos obtenidos a partir de la microscopa STED. (A)

gradientes espaciales en . (B) Contribuciones fraccionales a modo

propio para E [ N O ] que corresponde a los 10 mayores valores propios de la
matriz de adyacencia. (C) Modo propio dominante ( ) correspondiente
a 1. (D) Modo propio subdominante correspondiente al segundo
mayor bi. Los valores negativos mostrados como 0 para mayor claridad. (E)

Los coeficientes de correlacin entre los valores de desde el panel (A)

y el (1) modo propio dominante, (2) suma de los modos propios dominantes y
subdominantes, y (3) suma de modos propios dominante, subdominante y
terciario. Escalas de color en todos los paneles son los mismos que en la Fig
4D.
Figura 6. Anlisis de perturbacin de la estructura de la red. Modos
propios (A) dominante ( parte superior ) y subdominante ( parte inferior ) de
seis variaciones de grupos (6) en la Fig. 5. En las agrupaciones (A1) - (A4), los
canales se eliminan progresivamente de izquierda a derecha a lo largo de la
fila indicada por la lnea de puntos en el tablero de la lnea de base. (B) Los
valores de los pesos de modo propio c i al eliminarse los canales. (C) La
eliminacin de un nico canal indicado por las flechas caus reducciones que
varan en 1dependiendo de su posicin. El cambio en 1 en comparacin
con el grupo de lnea de base (Delta 1 se muestra) para cada grupo (C1) -

(C4). Mapas de calor muestran en cada caso. (D) Cambio en 1 al

retirar un solo canal j de la agrupacin de lnea de base. es elemento

correspondiente del canal en el vector propio dominante ( rojo ) y

es su elemento en ( azul ) en el grupo de lnea de base. 1 es de

nuevo el cambio de 1 al retirar el canal j . Escalas de color de mapas de
calor son las mismos que en la Fig 4D.
Figura 7. La dependencia de 1 y la probabilidad de chispa de Ca2 +
en la interpretacin de imgenes de grupo RyR2. (A) Cambios de
porcentaje en la probabilidad de la chispa y 1 para una coleccin de grupos
reconstruidos a partir de imgenes STED despus de elevar el umbral de

intensidad de fluorescencia del percentil 95 ( , ) al percentil 98 (

, ). (B) Relacin entre 1 y p S cuando las estructuras de grupo se

determinan en el percentil 95 ( negro ) y 98( rojo ).