Pretendeu-se definir o estatuto taxonmico de 16 estirpes que eram

feneticamente congruentes com Acinetobacter DNA group 15 descrito por

Tjernberg & Ursing em 1989. As estirpes foram isolados de uma variedade de
espcimes humanos e animais em lugares geograficamente distantes ltimas
trs dcadas. A anlise taxonmica baseou-se em uma abordagem de
Acinetobacter, abordagem que incluiu a anlise comparativa da seqncia de
limpeza, codificao de protenas genes, perfis de clulas inteiras baseados em
ionizao de dessoro por laser assistida por matriz - tempo de vo
espectrometria de massa (MALDI-TOF MS), um conjunto de testes fisiolgicos e
metablicos in-house, e anlise comparativa de todo o genoma. Com base nas
anlises dos genes rpoB e gyrB, as 16 cepas formaram respectivos clusters
fortemente suportados claramente separados das outras espcies do gnero
Acinetobacter. A distino do grupo ao nvel da espcie foi indicada pelos valores
mdios de identidade de nucletidos de 82% entre as sequncias genmicas
inteiras de duas das 16 estirpes (NIPH 2171T e NIPH 899) e as das espcies
conhecidas. Alm disso, a coerncia do grupo tambm foi apoiada por MALDI-
TOF MS. Todas as 16 cepas foram no-hemolticas e no-gelatinase-
produzindo, crescido a 41 6C e utilizou um nmero bastante limitado de fontes
de carbono. Praticamente todas as estirpes apresentaram uma combinao
nica de caractersticas metablicas e fisiolgicas. Conclui - se que as 16 cepas
representam uma espcie distinta do gnero Acinetobacter, para o qual o nome
Acinetobacter variabilis sp. Nov. proposto para refletir sua marcada
heterogeneidade fenotpica.

No momento da escrita, a classificao formal do gnero Acinetobacter

inclui 33 espcies distintas com nomes vlidos publicados
(http://www.bacterio.net/a/acinetobacter.html) e vrias espcies com nomes
efetivamente publicados aguardando validao (por exemplo, Krizova Et al.,
2014, Smet et al., 2014). A verdadeira diversidade do gnero no nvel da espcie,
no entanto, vai muito alm dessa classificao existente, como indicado por
relatrios sobre grupos de estirpes genomicamente relacionadas que no
pertenceram a nenhuma das espcies nomeadas (Touchon et al., 2014). J os
primeiros estudos taxonmicos de Bouvet & Grimont (1986), Bouvet & Jeanjean
(1989) e Tjernberg & Ursing (1989) revelaram vrios desses taxons putativos
baseados em estudos de hibridao DNA-DNA (DDH), com alguns deles ainda
faltando formal classificao. Um destes taxa, o grupo de DNA 15, foi delineado
por Tjernberg & Ursing (1989) entre os isolados de Acinetobacter recuperados
de espcimes humanos e ambientais recebidos de hospitais e clnicas
ambulatoriais na cidade de Malm, na Sucia. Este grupo abrangeu duas
estirpes, uma isolada da urina e a outra das fezes. Com base na DDH, as duas
estirpes pareciam representar uma nova espcie genmica (gen. Sp.)
Claramente separada da espcie validamente ou provisoriamente nomeada
conhecida na poca. Isolados clnicos humanos genotpicamente congruentes
com essas cepas tm sido relatados, embora raramente, por estudos posteriores
(Nemec et al., 2000, van den Broek et al., 2009). Alm disso, Poirel et al. (2012)
descreveram recentemente um nmero de isolados resistentes a carbapenem
de fezes de bovinos, que pareciam pertencer ao grupo de DNA 15 sensu
Tjernberg & Ursing com base na anlise comparativa do gene rpoB.
O presente estudo teve como objetivo definir o status taxonmico de 16
linhagens que eram genotpicamente congruentes com o grupo de DNA 15 sensu
Tjernberg & Ursing. Para isso, usamos uma combinao de mtodos
taxonmicos, que foi recentemente otimizada para delinear novas espcies no
gnero Acinetobacter (Krizova et al., 2014). Este Acinetobactertargeted, genus-
wide abordagem inclui a anlise de seqncia comparativa de dois
housekeeping, codificao de protenas genes (rpoB e gyrB), clulas inteiras de
perfis com base em matriz de clulas assistida por laser desoro ionizao-
tempo de vo espectrometria de massa MALDI-TOF MS), um conjunto
abrangente de testes fisiolgicos e metablicos internos e anlises comparativas
de genoma completo realizadas em estirpes selecionadas. Os resultados obtidos
revelaram que as 16 estirpes representavam um taxon feneticamente e
filogenicamente coerente, que estava bem separado ao nvel das espcies a
partir de todas as espcies at agora conhecidas do gnero Acinetobacter. Dado
o nmero relativamente elevado de estirpes isoladas em locais diferentes ao
longo de um longo perodo de tempo, consideramos apropriado nomear
formalmente este taxon; O nome Acinetobacter variabilis sp. Nov. , Que
utilizado em todo o texto seguinte.
As 16 cepas de Acinetobacter variabilis sp. Nov. Utilizados neste estudo
esto listados na Tabela 1. Destes, 11 estirpes foram recuperadas de uma
variedade de espcimes clnicos humanos em diferentes locais geogrficos ao
longo das ltimas trs dcadas. As restantes cinco estirpes foram recentemente
isoladas de fezes de bovinos de uma explorao leiteira na Frana (Poirel et al.,
2012). A diversidade dos 16 isolados no nvel de deformao foi indicada pela
heterogeneidade da sequncia dos genes rpoB e gyrB (Figura 1) e foi confirmada
por anlise de macro-restrio do ADN genmico (Figura S1, disponvel no
Material Suplementar on-line).
Para determinar a posio taxonmica das 16 cepas dentro do gnero
Acinetobacter, realizamos primeiramente a anlise comparativa da sequncia do
gene bsubunit (rpoB) da polimerase de ARN, que atualmente o melhor gene
taxonmico e filogentico do gene Acinetobacter (Nemec et Al., 2009, 2011,
Krizova et al., 2014). Foram realizados clculos de similaridade e anlise de
agrupamento para a regio que abrange as posies nucleotdicas 2915 a 3775
da regio codificadora de rpoB de Acinetobacter baumannii CIP 70.34T
utilizando BioNumerics 7.1. Software (Applied-Maths) com os parmetros
padro. Os resultados da anlise de agrupamento das sequncias rpoB das 16
cepas de A. variabilis sp. Nov. E as outras espcies do gnero Acinetobacter so
mostradas na Fig. 1 (a). Os valores de similaridade em pares intra-espcies
(expressos como as percentagens de nucletidos idnticos em posies de
sequncia homloga num alinhamento mltiplo) para as estirpes de A. variabilis
sp. Nov. Estavam na faixa de 96,8-100%, enquanto que as semelhanas entre
estas estirpes e os outros membros do gnero tinham valores entre 77,1%
(Acinetobacter qingfengensis ANC 4671T) e 90,0 (Acinetobacter schindleri NIPH
1034T). O carcter distintivo das sequncias rpoB de A. variabilis sp. Nov.
Tambm foi suportado no nvel de protena. As sequencias de aminocidos
(posio RpoB 973-1258) inferidas a partir de sequencias de nucleotdeos foram
idnticas em todas as 16 estirpes, com exceto de NIPH 2171T com uma nica
de aminocidos (1008E. Q), mas diferiram daquelas das outras espcies do
gnero Acinetobacter em pelo menos 13 aminocidos (A. schindleri NIPH
1034T).
A anlise comparativa das sequncias parciais do gene da subunidade B
de ADN girase (gyrB) foi realizada para confirmar a relao genotpica entre as
16 estirpes e a sua separao dos outros membros do gnero com base nas
sequncias de rpoB como descrito (Krizova et al. , 2014). Para obter as
sequncias de gyrB para as estirpes de A. variabilis sp. (59
CGAGTGCGCTCTTACGACGG-39), que foram inferidos a partir das sequncias
genmicas inteiras das estirpes NIPH 2171T (GenBank accession
APRS00000000.1) e NIPH 899 (APPE00000000.1). Estes iniciadores
direccionam-se para a regio delimitada pelas posies 436 e 1234 da sequncia
de codificao gyrB da estirpe NIPH 2171T. As sequncias gyrB obtidas foram
comparadas com as de todas as espcies do gnero Acinetobacter includas na
anlise rpoB excepto para Acinetobacter boissieri e 'Acinetobacter gandensis'
para as quais a sequncia gyrB no estava disponvel (Fig. 1b). Os clculos de
similaridade e anlise de agrupamento foram realizados para uma regio de 759
pb correspondente s posies 456-1214. Os valores de identidade entre o A.
variabilis sp. Nov. As estirpes foram 95,4-100% em contraste com a gama de
74,4% (Acinetobacter nectaris CIP 110549T) a 85,0% (A. schindleri NIPH 1034)
observada entre A. variabilis sp. Nov. E as outras espcies do gnero
Acinetobacter. Esses valores correspondem aos valores de similaridade entre
espcies e entre espcies encontrados em nosso estudo anterior (Krizova et al.,
2014).
Realizou-se uma anlise comparativa do genoma de todo o genoma nas
sequncias das estirpes NIPH 2171T (n de acesso ao GenBank
APRS00000000.1, tamanho 3,48 Mb, nmero de contigs 23, n de protenas
3348, ndice de ADN G + C 40,7%) and NIPH 899 (APPE00000000.1; size 3.77
Mb, no. De contigs 88, n. De protenas 3731, ADN G + C 39,3%), e outras
espcies do gnero Acinetobacter, que esto todas disponveis a partir do site
NCBI BioProject no. PRJNA183623 (Touchon et al., 2014). As sequncias
genmicas no estavam disponveis para seis espcies (A. boissieri, A.
gandensis, Acinetobacter harbinensis, Acinetobacter kookii, Acinetobacter
puyangensis e A. qingfengensis), que eram claramente genotpicamente
distintas de A. variabilis sp. Nov. Ao nvel da espcie, como mostrado pela
anlise das sequncias rpoB e / ou gyrB (Fig. 1). A mdia de identidade de
nucleotdeo baseada em BLAST (ANIb) foi calculada usando o programa da web
JSpecies (http: // imedea.uib-csic.es/jspecies/) com as configuraes padro
(Richter & Rossello'-Mo'ra, 2009). O valor de ANIb entre as sequncias
genmicas das estirpes NIPH 2171T e NIPH 899 foi de 96,32%, enquanto que
entre estas duas sequncias e as dos outros taxa de Acinetobacter variou de
71,12% (A. nectaris CIP 110549T, n de acesso GenBank AYER00000000.1 ) A
82,09% (Acinetobacter lwoffii NIPH 512T, AYHO00000000.1) (Tabela S1). Estes
valores concordam com o intervalo de limiar (95-96%) proposto para discriminar
entre espcies bacterianas (Richter & Rossello'-Mo'ra, 2009) e suportam ainda
o carcter distintivo de A. variabilis sp. Nov. ao nvel das espcies.
A caracterizao de MALDI-TOF MS de clulas inteiras foi realizada
utilizando um protocolo de extraco padro com base na extraco com
acetonitrilo / cido frmico / gua e cido alfa-hidroxi-cinmico utilizado como
matriz (Krizova et al., 2014). As medies de espectro de massa MALDI-TOF
foram realizadas utilizando um instrumento UltrafleXtreme (Bruker Daltonics),
operado em modo positivo linear sob o controlo do software FlexControl 3.4. Os
espectros de massa foram processados utilizando a verso Flex Analysis verso
3.4 e o software BioTyper verso 3.1 (Bruker Daltonics). Os parmetros dos
mtodos utilizados para calibrao, aquisio e avaliao dos espectros de
massa obtidos foram os descritos (Krizova et al., 2014). Com base na anlise de
MALDI-TOF MS, as 16 estirpes formaram um agrupamento coesivo, embora
bastante heterogneo, que foi separado das estirpes de tipo / referncia das
espcies at agora conhecidas do gnero Acinetobacter (Figura 2a). Todas as
16 estirpes compartilharam seis picos no intervalo de 4,2 a 7,5 kDa (Figura 2b),
mas nenhum destes picos foi nico para A. variabilis sp. Nov. A variabilidade
dentro dos espectros das 16 estirpes resultou da presena de sinais intensos de
estirpes especficos, detectados principalmente na gama de 8,2-9,8 kDa.
Os testes metablicos e fisiolgicos internos foram realizados conforme
descrito anteriormente (Nemec et al., 2009, 2011; Krizova et al., 2014). Os testes
de assimilao e crescimento de temperatura foram realizados em meio mineral
fluido suplementado com fonte de carbono a 0,1% (p / v) e caldo de infuso
cardaca cerebral (Oxoid), respectivamente. A temperatura de cultura foi de 30
uC, salvo indicao em contrrio. Todos os testes foram realizados pelo menos
duas vezes de forma estritamente padronizada e repetidos quando foram obtidos
resultados inconsistentes. As propriedades das 16 cepas Tabela 1 foram
comparadas com as de quase 800 cepas depositadas variabilis sp. Nov. E
fenotpicamente a maioria das espcies similares esto resumidas na Tabela 2.
Descrio de Acinetobacter variabilis sp. Nov.
Acinetobacter variabilis (va.ri.a9bi.lis, L. masc. Adj. Variabilis varivel,
referindo-se s propriedades fenotpicas heterogneas dependentes da estirpe
da espcie).
As caractersticas fenotpicas correspondem s do gnero (Baumann et
al., 1968), ou seja, coccobacilos Gram-negativos, estritamente aerbios, oxidas
negativos e catalase-positivos, tipicamente ocorrendo em pares, incapazes de
motilidade natatria, capazes de crescer em meio mineral Com acetato como
nica fonte de carbono e amnia como nica fonte de nitrognio e incapaz de
desnitrificao dissimilativa. Positivo no ensaio de transformao (Juni, 1972).
As colnias em gar de soja trptico (Oxoid) aps 24 h de incubao a 30
uC tm um dimetro de 1,0-2,5 mm, cinzento-branco, ligeiramente opaco,
circular, convexo e liso, com margens inteiras. O crescimento ocorre na infuso
cardaca cerebral (Oxoid) a temperaturas variando de 25 uC a 41 uC e at certo
ponto a 44 uC (cerca de um tero das estirpes fracamente positivas). O cido
produzido a partir de D-glucose pela minoria de estirpes. A gelatina no
hidrolisada. A hemlise no observada em meio gar suplementado com
eritrcitos de ovelha, embora algumas estirpes exibam uma descolorao
esverdeada do gar. O acetato eo etanol so utilizados como nicas fontes de
carbono com crescimento visvel em seis (principalmente dois) dias de
incubao. No ocorre crescimento em b-alanina, L-aspartato, citraconato,
gentisato, D-gluconato, D-glicose, histamina, Lhistidina, 4 hidroxibenzoato, L-
leucina, levulinato, malonato, L-ornitina, putrescina, L-tartarato, tricarballyato ,
Trigonelina ou triptamina em 10 dias. Vrios nmeros de estirpes utilizam
transaconito, adipato, 4-aminobutirato, Larabinose, L-arginina, azelato,
benzoato, 2,3-butanodiol, citrato (Simmons), L glutamato, glutarato, DL-lactato,
Dmalato, fenilacetato, L -fenilalanina ou D-ribose dentro de 6 dias (Tabela 2).
A estirpe tipo NIPH 2171T (5CIP 110486T 5UG 26390T 5PH 546T
5CCM 8555T 5 Tjernberg & Nursing 151aT), isolada da urina de um paciente
humano em Malmo, Sucia, nos anos 1980. Foi utilizado como a estirpe de
referncia do grupo de ADN 15 por Tjernberg & Ursing (1989). A estirpe tipo
(NIPH 2171T) cresce fracamente a 44 uC e assimila azelato, benzoato, 2,3-
butanodiol, D-malato e fenilacetato. Produz colnias esbranquiadas de 2,0 mm
de dimetro em gar de soja trptico aps 24 h a 30 C. A estirpe NIPH 2171T
no produz cido a partir de D-glucose nem utiliza transaconitato, 4-
aminobutirato, L-arabinose, L-arginina, citrato (Simmons), L-glutamato,
glutarato, DL-lactato, L-fenilalanina ou D-ribose. O crescimento no adipato
visvel entre o sexto eo dcimo dia de incubao. O padro de cidos gordos
desta estirpe foi publicado por Kampfer (1993). A sequncia genmica completa
est disponvel a partir de NCBI sob o n. APRS00000000. O GenBank nos. Para
o rpoB parcial e 16S rRNA as sequncias de genes da estirpe NIPH 2171T so
EU477119 e KP278590, respectivamente.
Agradecimentos
Agradecemos a todos os doadores listados na Tabela 1 por proviso
generosa de estirpes e Eva Kodytkova (Instituto Nacional de Sade Pblica,
Praga) para reviso lingustica do manuscrito. Os autores tambm agradecer o
Centro de Wadsworth Applied Genomic Technologies Core para Sanger e
prxima gerao de seqenciamento, eo Laboratrio de Bacteriologia do Centro
Wadsworth para a manuteno das novas cepas descritas neste estudo. O
estudo beneficiou da disponibilidade pblica de sequncias do genoma de
Acinetobacter geradas pela Plataforma de Sequenciamento Genmico do
Instituto Broad no projecto colaborativo (NCBI BioProject n. PRJNA183623).
Este trabalho foi apoiado por uma subveno da Fundao de Cincia Checa
(13-26693S) e por MH CZ-DRO [Instituto Nacional de Sade Pblica (NIPH)
75010330].