Biotecnologa Animal IX Semestre

BIOTECNOLOGIA ANIMAL

EVALUACIN DE SEMEN BOVINO

Crdenas Hurtado, Rosmery

P.P. Ing. Biotecnolgica Facultad de Ciencias Farmacuticas, Bioqumicas y Biotecnolgicas-
UCSM. - Arequipa 2016

RESUMEN:
La industria de la ganadera bovina ha realizado grandes esfuerzos en beneficio del mejoramiento gentico de las
diferentes razas de bovinos ya sea para produccin de mayor y mejor calidad de leche o carne, valindose para
poder lograrlo realizar estudios a nivel fenotpico, genotipo y biotecnolgico.
Palabras Clave: mejoramiento gentico, fenotpico, genotpico y biotecnolgico.

ABSTRACT:
The cattle industry has made great efforts to benefit the breeding of different breeds of cattle either to produce more
and better quality milk or meat, using to achieve a biotechnological studies phenotypic level, genotype.
Keywords: genetic, phenotypic, genotypic and biotechnological improvements.

INTRODUCCION: clasificacin de los machos para el servicio de monta

Dentro del normal desarrollo de un programa de
mejoramiento animal, la reproduccin juega el papel
ms importante. Debido a que los machos y hembras
deben tener caractersticas fenotpicas y genotpicas
deseables, para poder producir cras que tengan el
linaje deseado. Siendo el macho al que ms se le
evaluara durante el proceso de apareamiento.
Dado que un solo macho se aparea con muchas vacas,
de su calidad seminal depende que las vacas preen y
por consiguiente sea ptima el desarrollo de las cras.
Y debido a este detalle es necesario realizar la
valoracin de la calidad seminal en donde no solo se
analiza, la concentracin espermtica, la motilidad, el
volumen seminal, aspecto, color, pH, sino que
adems sirve para evaluar la forma de los
espermatozoides y establecer el porcentaje de
espermatozoides vivos y muertos (viabilidad),
mediante las tcnicas de tincin de clulas tambin
conocidas de morfologa espermtica.
La valoracin de la calidad seminal, es una de las
herramientas de anlisis ms empleados en la
directa o programas de inseminacin artificial,
gracias al cual se forma una opinin del potencial de
fertilidad del toro, ya que la calidad seminal puede
cambiar bastante y rpidamente, dependiendo de que
el toro este pasando por algn mal o en otro caso se
est recuperando del mismo, pudindose presentar
que afecte la espermatognesis. Por lo tanto los
resultados de los espermogramas deben ser
interpretados teniendo en cuenta la historia del toro,
el examen fsico y predisposiciones genticas, para
as decidir si apto para producir una buena
descendencia.
MARCO TEORICO:
En la actualidad las tcnicas biotecnologas aplicadas
a la reproduccin, la inseminacin artificial ha
demostrado ser la herramienta ms exitosa para la
mejora gentica de los animales de importancia
zootcnica, especialmente en la industria bovina. De
una cuidadosa valoracin de la fertilidad depender la
utilizacin futura del material seminal y el grado de
aprovechamiento de los eyaculados obtenidos a lo
largo de su vida reproductiva, esto es, las dosis
producidas por eyaculado, en funcin del nmero de

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espermatozoides viables y, en definitiva, su mayor o
menor rentabilidad. Este es un punto de suma
importancia, debido a que un pequeo nmero de
toros seleccionados es utilizado para inseminar una
extensa poblacin de hembras, con lo que los fallos
en la seleccin de estos sementales tendran como
consecuencia importantes prdidas econmicas. As,
Figura 1Morfologa del espermatozoide.
el conocimiento de la fertilidad o de la capacidad
fecundante de cada toro se convierte en uno de los
principales objetivos en la produccin de semen
bovino. Un requisito indispensable para el desarrollo
de esta biotecnologa es que el semen utilizado
mantenga su capacidad de fertilidad despus de haber
sido criopreservado en tanques de criogenizacin.
Morfologa:
El espermatozoide maduro es una clula
altamente diferenciada. Est formado por:
Cabeza, que contiene el ncleo y aporta la
informacin gentica.
Pieza intermedia, que contiene las
mitocondrias, fuente de energa.
IX Semestre
Flagelo, que proporciona la movilidad
necesaria para el traslado al lugar de
fecundacin y asegura la adecuada
orientacin de la cabeza para penetrar las
cubiertas del ovocito.
a) Cabeza:
La cabeza del espermatozoide es de forma
oval al observarla frontalmente, y piriforme
cuando la observacin es lateral, siendo ms
gruesa en la base y adelgazando hacia la
punta. Su tamao aproximado oscila entre 3,7
y 4,7 micras de longitud y 2,5 a 3,2 micras de
anchura, por 1 a 1,5 micras de espesor. La
razn longitud/anchura vara entre 1,3 y 1,8.
En la cabeza del espermatozoide se sitan el
ncleo y el acrosoma, recubiertos ambos por
la membrana plasmtica.
El ncleo ocupa la mayor parte de la cabeza.
Es una masa de DNA haploide que se
fusionar con el ncleo del ovocito en el
momento de la fecundacin. Su cromatina se
ha condensado intensamente a fin de
disminuir el volumen de la cabeza, lo que
facilita la movilidad del espermatozoide a
travs de los diferentes fluidos y estructuras
que debe atravesar. Adems protege al
genoma de daos durante el trayecto.
El ncleo est delimitado por una
membrana doble, la membrana nuclear.
A nivel de insercin del flagelo, el ncleo
est ligeramente deprimido formando la
foseta de implantacin.
El acrosoma es una estructura membranosa,
situada entre el ncleo y la membrana
plasmtica, adopta la forma de capuchn.
Est envuelto por la membrana acrosmica:
La porcin adherida a la envoltura
nuclear por su parte interna es la
membrana acrosmica interna.
La membrana plasmtica por su parte
externa, membrana acrosmica externa.
El acrosoma se forma a partir del aparato de
Golgi y contiene una gran concentracin de
hidratos de carbono y enzimas lisosmicas
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como la hialuronidasa. Hay tambin una
enzima proteoltica llamada acrosina. El
papel de estas enzimas en la fecundacin es
el facilitar el reconocimiento y penetracin
del espermatozoide a travs de las envolturas
del ovocito. Para ello es necesario que se
produzcan una serie de cambios en el
espermatozoide, conocidos como
capacitacin, y que culminan en un proceso
de modificacin del acrosoma en la llamada
reaccin acrosmica. El lquido seminal
impide la capacitacin por su accin
decapacitante. Es por ello que dicho proceso,
indispensable para una correcta fecundacin
del ovocito, se produce en el tracto genital
femenino donde el espermatozoide se libera
del lquido seminal.
La membrana plasmtica recubre
estrechamente el acrosoma y la regin
postacrosmica. Delimita una escasa
cantidad de citoplasma. En la zona donde
parece unirse con la membrana nuclear se
define una depresin, el anillo posterior. Este
anillo parece dividir la cabeza en dos partes.
Hacia delante se encuentra la membrana
temporal, que participa activamente en la
reaccin acrosmica al fusionarse con la
membrana acrosmica externa.
Hacia atrs se extiende la zona de
membrana estable.
b) Cuello:
El cuello es la unin entre la cabeza y el
flagelo y es una zona compleja y de gran
importancia, que soporta algunas estructuras
esenciales:
La pieza conectiva que tiene un denso
capitel.
La placa basal, adaptada en su forma a la
fosa de implantacin.
A partir del capitel se extienden hacia atrs 9
densas columnas segmentadas de 1 a 1,5
micras de largo, que forman una especie de
embudo, y se continan en sus extremos con
las nueve fibras externas densas del flagelo.
IX Semestre
El centriolo proximal est situado bajo la
placa basal y a la entrada de ese embudo, pero
formando un ngulo de 70-80 grados con el
eje del flagelo. Posee la estructura tpica de
nueve tradas tubulares. El par central de
microtbulos del axonema flagelar puede
llegar por delante hasta el interior de la pieza
de conexin, incluso hasta el centriolo
proximal. Generalmente en los
espermatozoides maduros falta el centriolo
distal, el orientado segn el eje del flagelo,
pero residuos de sus nueve tripletes pueden
estar unidos a la cara interna de las columnas
segmentadas. En la regin del cuello, y por
fuera de la pieza de conexin pueden
encontrarse algunas mitocondrias orientadas
longitudinalmente, que a veces emiten
prolongaciones que se extienden entre las
columnas segmentadas.
c) Flagelo:
El flagelo es una larga estructura filiforme de
aproximadamente 50 m de longitud. Est
recubierto por una vaina fibrosa en su
primera fraccin y luego solo por la
membrana flagelar.
Posee una constitucin interna comn a la
mayora de los flagelos del reino animal. En
el eje est el axonema formado por dos
microtbulos centrales nicos, rodeados por
nueve pares de microtbulos regularmente
distribuidos. Son los microtbulos A y B.
Esta estructura se conoce como axonema
9+2. Cada microtbulo A posee dos brazos en
gancho formados por la protena dineina, la
cual puede hidrolizar las molculas de ATP,
produciendo la energa necesaria para
impulsar el espermatozoide. Pero el flagelo
de los espermatozoides humanos se
diferencia de otros en que el axonema est
rodeado por nueve fibras densas externas, lo
que lo convierte en un modelo 9+9+2. Se
considera que el axonema es el componente
motor y que las fibras densas externas son
estructuras que dan firmeza al flagelo.
El flagelo se diferencia en tres regiones:
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La pieza intermedia mide de 5 a 7 m. El
axonema est en esta regin rodeado por
las fibras densas. Se caracteriza por una
vaina de mitocondrias orientadas
circularmente y dispuestas extremo con
extremo para formar una espiral cerrada.
Las mitocondrias producen la energa
necesaria para el movimiento en forma
de ATP.
La pieza principal mide unas 45 m de
longitud. El axonema conserva el mismo
aspecto en todo el trayecto pero las fibras
densas se modifican, disminuyendo
progresivamente de dimetro y sus caractersticas sean normales, incrementa la
desapareciendo en un orden bien
establecido, as por ejemplo las fibras 3 y
8 se incorporan a las columnas
longitudinales de la vaina fibrosa.
La pieza terminal est formada slo por diluido y sometido a estrs durante el proceso de
el axonema, recubierto por la membrana
flagelar. Adems el axonema pierde su
disposicin circular para hacerse
desordenada.As, el estudio de la
motilidad espermtica, la concentracin
espermtica y las anomalas
morfolgicas que anteriormente se
hacan de manera subjetiva, pueden
realizarse hoy en da mediante el uso de
mtodos computarizados de anlisis. La
incorporacin de estos mtodos
informticos atena en gran parte el
factor subjetivo del anlisis seminal y
garantiza una mejor correlacin con la
capacidad fecundante del
espermatozoide. Tras todo lo dicho, cabe
destacar que hasta el momento no se ha
conseguido un mtodo de evaluacin
seminal in vitro, que al utilizarlo solo o
en combinacin con otros sea capaz de
predecir de forma segura la capacidad
fecundante de una muestra de semen. Sin
embargo, debido a que la valoracin in
vitro de la calidad seminal es muy
importante en la valoracin androlgica
de los machos y es, adems, el mejor
indicador del grado de conservacin del
IX Semestre
semen congelado-descongelado, se han
dedicado grandes esfuerzos al diseo de
tcnicas que midan la capacidad
fecundante del semen fresco y
congelado. Los parmetros clsicamente
usados para conocer la calidad seminal
de un eyaculado son los que siguen:
Concentracin:
Existe una alta correlacin significativa entre el
nmero de espermatozoides inseminados y la
fertilidad del toro. La presencia de un mayor
nmero de espermatozoides, siempre y cuando
posibilidad de fertilizacin. Este aspecto es
crucial en el caso de los toros con baja
concentracin espermtica, o en los casos en que
se utiliza semen descongelado, que ha sido
congelacin-descongelacin, provocando un
dao irreversible en un porcentaje elevado de
espermatozoides. La fertilidad de un toro usado
en IA, entre otras razones, depender
bsicamente del nmero de espermatozoides
normales que se utilicen al inseminar. Existe una
variabilidad muy grande en la concentracin de
un eyaculado a otro, y de un toro a otro, siendo
importante conocer el nmero de
espermatozoides por eyaculado, ya que de este
parmetro depende el nmero de hembras a
inseminar. La concentracin puede calcularse por
varios mtodos a partir de la muestra de semen.
Entre estos mtodos, destacan la
espectrofotometra, la colorimetra, la citometra
de flujo y el uso de cmara de recuento celular,
como las de Brker, Neubauer o Thoma. La
espectrofotometra, tcnica usada en nuestro
laboratorio, es un mtodo indirecto, que mide la
luz monocromtica absorbida por las partculas
en suspensin o los espermatozoides. Esta
densidad ptica de la muestra es comparada
frente a una curva estndar patrn previamente
validada, y permite, as, conocer el nmero de
espermatozoides.
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Motilidad: Pajilla congelada.

La motilidad es uno de los parmetros ms
importantes de la analtica seminal. Hasta hace
pocos aos el estudio de la motilidad espermtica
se haca exclusivamente mediante mtodos
semicuantitativos. Estos mtodos evalan el
porcentaje de espermatozoides mviles, as como
el tipo de movimiento que presentaba la media de
MTODOS:
una poblacin espermtica. Estas medidas
ofrecen una descripcin general de la motilidad
espermtica, pero la exactitud y precisin estn
limitadas por las condiciones del sistema de
medida y por la destreza del observador. A pesar
de ello, la valoracin subjetiva de la motilidad
hecha por personas experimentadas es de gran
valor, debido a que la informacin se presenta de
forma inmediata, al tiempo que es un mtodo
econmico y de fcil ejecucin.
Cmara de Newbauer.
Lminas portaobjetos.
Cubreobjetos.
Pipeta de glbulos rojos
Pinzas.
Colorante de Giemsa
a. Descongelacin de Pajilla de semen
Se tom la pajilla que estaba almacenada en
el tanque de criogenizacin, luego con mucho
cuidado se introdujo a bao Mara
debidamente temperado a 37C y se le dejo
aproximadamente de 30-45 segundos.

Viabilidad:
La rotura de la membrana plasmtica est
claramente asociada con la prdida de viabilidad
celular, pero una membrana plasmtica intacta
no siempre indica que la clula sea viable. El
procesado del semen, incluida su Figura 2 Descongelamiento de semen a 37C
criopreservacin, es estresante para el
espermatozoide y afecta, primeramente, a sus b. Evaluacin de motilidad
membranas. Los daos que pueden producirse en Teniendo la muestra se tom una gota de
stas pueden ser modificaciones en su semen y se deposit en una lmina de vidrio
organizacin, permeabilidad y composicin y se le pone el cubreobjetos. Evalundose la
lipdica. Las membranas espermticas que movilidad progresiva del espermatozoide
pueden verse afectadas por la criopreservacin movindose en lnea recta de un lado a otro y
incluyen la membrana plasmtica, la membrana rpidamente.
externa del acrosoma y las membranas
mitocondriales.

MATERIALES Y METODOS
MATERIALES:
Bao Mara a 37C.
Microscopio.
Tanque de criogenizacin.

Figura 3 Descongelamiento de la pajilla de semen

de toro.

c. Concentracin de espermatozoides

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De igual manera se tom una gota de semen
y se le diluyo en agua destilada en un factor
de dilucin 1:200 esta es realizada en una
pipeta de glbulos rojos, luego es cargada en
una cmara de Newbauer. Evalundose de
esta forma la cantidad de espermatozoides
que encontramos en un mL de semen
Figura 4 Dilucin de semen 1:200
d. Viabilidad:
Se tom aun gota de semen de la pajilla y se
le coloco en una lmina portaobjetos y se
realiz un frotis para luego adicionarle el
colorante de Giemsa las cuales solo teirn a
la clulas que estn muertas. Evalundose as
el porcentaje de espermatozoides vivos en la
muestra analizada
Figura 5 Tincin con Giemsa
e. Morfologia:
Se realiz un frotis de la muestra de semen y
luego se le colorea usando el colorante de
Giemsa. De esta manera se realiza con ayuda
del microscopio la evaluacin de los
espermatozoides anormales pudindose
IX Semestre
identificar mediante a sus malformaciones a
nivel de cabeza y cola.
RESULTADOS
Se logr observar las motilidad de los
espermatozoides sin necesidad del uso de
microscopio ya que se observ la formacin
de espuma que nos indicaba que los
espermatozoides estas vivos.
Figura 6 Vista de la formacin de espuma por los
espermatozoides
Tambin se observ en el microscopio a
40X
Figura 7 Motilidad de espermatozoides a 40X
Concentracin de espermatozoides: se
lograron observar espermatozoides con la
dilucin 1:200 y se contabilizo 6.1 x106
espermas contados en total.
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Figura 10 vista de identificacin de espermatozoides 40X

Figura 8 Vista de espermatozoides a 40X en la cmara de
Newbauer Se realiz la observacin de las anomalas que
presentaban los espermas a nivel morfolgico como
Viabilidad: se logr distinguir los
anomalas en su cabeza y/o cola. Obteniendo como
espermatozoides vivos de los muertos
resultado un 7% de deformaciones en la cabeza y un
utilizando el colorante Giemsa
9% a nivel de cola.

RECOMENDACIONES
Se recomienda realizar un buen anlisis de la
viabilidad espermtica ya que es el componente
principal para la identificacin de la fertilidad.
Actualmente la evaluacin convencional es subjetiva
y se ve afectada por la experiencia del evaluador.
Se recomienda trabajar con la hoja des
especificaciones de los espermatozoides ya que si se
trabajaba con una pajilla nacional esta necesita
incubarse a 38C y no a 37C.
Figura 9 Vista de espermatozoides teidos con Giemsa a 40X
REFERENCIA BIBLIOGRAFICA
En esta obtuvimos luego de realizar el
recuento de espermatozoides vivos y 1. Evaluacin asistida por computador de la
muertos en 10 zonas a nivel microscpico viabilidad espermtica en humanos
obteniendo: Disponible en:
Un 27% de clulas muertas y un 73% de http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=s
ci_arttext&pid=S1909-97622012000200003
clulas vivas, esto gracias al uso del
colorante de Wright que coloreo a las
2. Evaluacin de Semen Congelado
clulas muertas de nuestra muestra de Disponible en:
semen. http://www.laboratorioazul.com.ar/Evaluaci
onSemen/EvalSemen.aspx
Morfologa: se logr distinguir los
espermatozoides segn su forma y se 3. Evaluacion de semen bovino congelado,
logr observar espermas con dos cabezas, Disponible en:
dos colas, colas enrolladas y cabezas http://www.engormix.com/MA-ganaderia-
planas. carne/genetica/articulos/evaluacion-semen-
bovino-congeleado-t4454/103-p0.htm

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CUESTIONARIO

1. Indique el volumen y la concentracin de semen y espermatozoides en ovinos, caballos y gatos:

Animal Volumen (mL) Concentracin (109/mL)

Ovinos 1.0 1.10

Caballos 60.0 0.15

Gatos 0.05 1.50

2. Indique cual es el porcentaje de espermatozoides vivos y muertos, motiles aceptable en semen fresco y semen
congelado en vacunos, porcinos, ovinos, equinos y perros:
Porcinos:

Vacunos:

Ovinos:

Equinos:

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Perros:

3. Indique otros mtodos de anlisis para motilidad, morfologa y viabilidad en semen congelado:
Motilidad
Los porcentajes de motilidad total y motilidad progresiva espermtica fueron determinados en cada
experiencia con un analizador espermtico asistido por ordenador (CASA). Con este tipo de anlisis se
espera obtener medidas correctas de la motilidad espermtica que proporcionen informacin precisa acerca
del estado funcional del axonema y de las membranas espermticas

Viabilidad celular

La tincin de eosina-nigrosina24 fue empleada para las muestras a tiempo 0, mezclando en el porta objetos
una gota de semen y otra del colorante, siendo extendida con un cubre. La lectura fue hecha con
microscopio de campo claro con objetivo de 40x. Se evaluaron 100 espermatozoides y se hizo el
porcentaje de clulas vivas (sin colorante), y el de las clulas muertas (con colorante).
Las cuatro categoras de espermatozoides originadas por la DS:
o Espermatozoides muertos con acrosoma intacto.
o Espermatozoides muertos con acrosoma separado (FAR).
o Espermatozoides vivos con acrosoma intacto.
o Espermatozoides vivos con acrosoma separado (TAR).

4. Explique sobre el porcentaje de motilidad en semen sexado

La exhibicin de la motilidad progresiva es una medida aproximada de la viabilidad del semen, La calidad y
estructura funcional del semen sexado ha sido evaluada y demostraron que muestras de semen bovino no sexado
presentaron mejores niveles de calidad, incluyendo motilidad y mayor porcentaje de membrana celular y
acrosoma intactos en comparacin con muestras de semen sexado (tanto X como Y; p0.05). Por lo tanto, a pesar
de que los procesamientos del sexado de semen las caractersticas espermticas, no afectaron significativamente
la fertilizacin y la tasa de desarrollo embrionario