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LABORATORIO AVANZADO
DE FISIOLOGA VEGETAL
Curso 2006-2007
Introduccin
Para el cultivo in vitro de clulas, tejidos u rganos hay una serie de factores que hay que
tener en cuenta. El medio de cultivo debe tener los nutrientes necesarios para que las
clulas vegetales puedan desarrollarse con normalidad: sales inorgnicas, una fuente de
carbono en el caso de no poder realizar fotosntesis, vitaminas en algunos casos y
fitohormonas.
NOTA IMPORTANTE:
Hay que evitar en lo posible la contaminacin de los medios de cultivo por bacterias u
hongos. Es preciso trabajar en las mayores condiciones de esterilidad posibles.
Se trabajar muy cerca de la llama del mechero Bunsen, con la mesa de trabajo MUY
LIMPIA, evitando remover el aire alrededor de las placas en exceso. Hay que limpiarse
bien las manos con jabn y posteriormente se deben enjuagar con etanol 70 %.
Dicho medio bsico hay que suplementarlo con diversos componentes. Las vitaminas
estn preparadas en disoluciones concentradas stock, que, al ser termolbiles, se
esterilizan por filtracin:
Mio-inositol 1 gL-1
Sacarosa 3 %
Para medio slido: agar (Phytogel, Sigma) 0.8 %
Tabla 2. Medios de cultivo a preparar por los distintos grupos de trabajo, en los que se variar la
proporcin de fitohormonas y la presencia o ausencia de kanamicina. Los volmenes de los stock de
fitohormonas se han calculado para preparar 500 mL de medio de cultivo.
DIA 1
Se prepararn las placas con medio de cultivo slido. En primer lugar se proceder a la
preparacin de 500 mL de medio de cultivo lquido MS por grupo (Cada mesa tendr los
cuatro tratamientos indicados). Las sales inorgnicas (macronutrientes y micronutrientes)
vienen mezclados en un preparado comercial (Sigma, M-5524). En un vaso de
precipitado que contenga aproximadamente 400 mL de H2O desionizada, se disuelven
2.15 g del preparado comercial. Seguidamente se aaden 15 g de sacarosa y 0.5 g de
mio-inositol. Una vez disueltos los solutos, la disolucin se ajusta a pH 6.0 y se enrasa
el volumen a 500 mL. En una botella de 1 L (Duran, tapn azul) se echan 4 g de
Phytogel y se vierte con cuidado los 500 mL del medio que se ha preparado. Se
autoclavan en ciclo corto 121C a 105 kPa durante 20 min.
Una vez autoclavados los medios, se tienen que enfriar hasta alcanzar unos 60C. Esta
temperatura permite coger los matraces con la mano, NO TIENEN QUE QUEMAR
AL TACTO. Cuando ha alcanzado la temperatura adecuada, se procede a la adicin de
los componentes termolbiles que han sido esterilizados previamente por filtracin. Se
aaden los correspondientes volmenes de las disoluciones stock: vitaminas 0.5 mL,
fitohormonas o kanamicina segn se indica en la Tabla 2. SIEMPRE CUIDANDO DE
TRABAJAR MUY CERCA DEL MECHERO ENCENDIDO, MANTENIENDO
LA BOCA DE LA BOTELLA CERCA DE LA LLAMA, Y SIEMPRE TRABAJAR
CON LA MAYOR PRESTEZA POSIBLE.
Una vez aadidos los componentes necesarios, la botella se agita por rotacin para
homogeneizar la mezcla, y con la mayor presteza hay que plaquear antes de que se
solidifique el agar.
Se prepararn 15-20 placas Petri con los 500 mL de medio de cultivo estrilizado . HAY
QUE EVITAR DEJAR LAS PLACAS ABIERTAS. CUANTO MS CUIDADO SE
PONGA EN ESTE PASO, MENOS PROBLEMAS DE CONTAMINACIN
HABR.
Las placas se dejan solidificar, se cierran con una tira de Prafilm y ya estarn listas para el
da siguiente.
DIA 2
Se proceder a recolectar los tejidos a cultivar in vitro de plantas de tabaco silvestre y
transgnico. Se cortarn secciones de tallo y hojas con bistur, que seguidamente se
transferirn a tubos Falcon de 50 mL para su esterilizacin.
Esterilizacin
Se aade 15-20 mL de etanol 70%, agitando suavemente durante 3 min. Se enjuaga el
tejido con agua estril y se lava el tejido con otros 15-20 mL de la disolucin
esterilizadora durante 5 min. Para eliminar la leja, se lava el tejido con tres volmenes
de H2O desionizada estril, TRABAJANDO SIEMPRE CERCA DEL MECHERO.
DIA 1
Extraccin de DNA
Cada grupo coge hojas de un solo tipo de plantas: grupos impares (1, 3 y 5) de las
plantas silvestres (WT); y grupos pares (2, 4 y 6) de las plantas transgnicas
(MnSOD). Las hojas se congelan y homogeneizan con ayuda de un mortero en nitrgeno
lquido (N2(l)). Ser suficiente con coger 4 o 5 trozos grandes de hoja. Una vez
obtenido un polvo congelado homogneo, se transfieren 0,1 g a un tubo Eppendorf de
1.5 mL estril, que previamente contiene 600 L del tampn de homogeneizacin o
REAGENT 1 (Nucleon Phytopure, Amersham Biosciences). Se mezcla bien con varias
inversiones del tubo y se aaden 200 L del tampn de dilucin o REAGENT 2. Se
invierte el tubo nuevamente varias veces hasta obtener una mezcla homognea.
Seguidamente se incuba a 65C durante 10 min con varias agitaciones manuales. Ubicar
el tubo en un bao de hielo durante 20 min.
Para eliminar el DNA de impurezas se aaden 500 L de cloroformo y 100 L de la
Resina de Extraccin Nucleon. ESTA LTIMA, SER DISPENSADA POR LOS
PROFESORES. Se mantienen los tubos a temperatura ambiente durante 10 min, y con
agitacin suave peridica. Seguidamente se centrifugan los tubos a 12000 g, 4C durante
5 min. Se toman 600 L del sobrenadante SIN REMOVER LA INTERFASE CON LA
RESINA. Es MUY importante que los tubos una vez centrifugados se manipulen con
SUAVIDAD, para no volver a mezclar las fases y la resina.
Por ltimo, se procede a precipitar el DNA purificado aadiendo 1 volumen (600 L)
de isopropanol fro (estar almacenado a -20C), invirtiendo suavemente el tubo hasta
que el DNA precipita. A continuacin se centrifugan el tubo a 12000 g durante 5 min
para sedimentar el DNA. Se elimina con cuidado el sobrenadante y el precipitado de
DNA se lava dos veces con 300 L de etanol 70% fro (mantenido en bao de hielo).
Para evitar que flote el precipitado de DNA hay que centrifugar a 12000 g durante 2 min
entre lavados. Para no perder el DNA, lavar el precipitado y eliminar los sobrenadantes
con las pipetas de 200 L (puntas amarillas). Dejar secar el DNA al aire, y cuando est
seco (esperar 10-15 min) se redisuelve el DNA en 25 L de agua MiliRO estril.
Previamente a la realizacin de la reaccin de PCR, se diluye el DNA 1/5 (10 L de la
muestra ms 40 L de H2O) para tener la muestra molde preparada.
Reaccin de PCR
Los profesores elaborarn una mezcla maestra (tubo MM) que contendr todos los
componentes de la mezcla de reaccin de la PCR excepto el molde de DNA (obtenido
por cada grupo) y los cebadores especficos de cada fragmento a amplificar. Para cada
tubo de PCR (utilizar los tubos especiales de 200 L de pared fina estriles), se deben
poner los siguientes componentes en la MM para un volumen de reaccin final de 50 L:
tampn de polimerasa 10X (ya contiene Mg 2+), 5 L; 1 unidad de Taq polimerasa (5
U/L), 0,2 L; dNTPs 10 mM (conc. final 200 M), 2 L; H2O, 27,8 L. A los 35 L
de MM hay que aadir 5 L de cada cebador (total 10 L para la pareja) y 5 L del
molde de DNA. En la Tabla 4 se describen los componentes que hay que aadir en cada
uno de los 8 tubos de PCR que cada grupo ha de preparar.
Dado que cada grupo ha extrado DNA de una sola planta, se compartir por mesa
ambos moldes para que TODOS LOS GRUPOS ENSAYEN TODAS LAS
COMBINACIONES (Tabla 4).
Una vez mezclados los componentes de la reaccin de PCR se introducen los tubos en el
termociclador y se someten al siguiente programa:
Desnaturalizacin 94 5 min
40 ciclos
Desnaturalizacin 94 1 min
Anillamiento 59 45 s
Extensin 74 45 s
Molde de DNA 5 5
Tubos N 1 2
nptII01F 5
nptII02R 5
nptII
Molde de DNA 5 5
Tubos N 3 4
35S01F 5
35S02R 5
35S
Molde de DNA 5 5
Tubos N 5 6
nos01F 5
Nos termin
nos02R 5
Molde de DNA 5 5
Tubos N 7 8
Mezcla Maestra (L) 35 35 35 35 35 35
TOTAL (L) 50 50 50 50 50 50
DIA 2
Anlisis de la PCR: separacin de los fragmentos en gel de agarosa
Los nucletidos se separarn mediante electroforesis no desnaturalizante en gel de
agarosa 2% en tampn TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM Na2EDTA, pH 8.0). Las bandas
correspondientes al cDNA amplificado se visualizarn en un transiluminador con luz
ultravioleta teidos con bromuro de etidio (BrEt).
Fig. 4. Amplificacin por PCR de diversos fragmentos de DNA, utilizando como molde DNA genmico
obtenido de plantas no transgnicas (WT) y plantas transgnicas (MS) de tabaco. Se muestran los
resultados empleando cebadores contra la subunidad pequea de Rubisco (control positivo) y el de dos
componentes de un transgen: gen de resistencia a kanamicina (nptII) y contra el promotor CaMV35S
(utilizado para conseguir un nivel constante de expresin de un gen). En el carril L se muestra la
escalera de DNA de100 pb, que permite determinar el tamao de los fragmentos amplificados (L).