Informe Dicroismo circular

Ariel Pinto M., Paulina Vilches L.

Analisis y deconvolucin de expectros:

Se realiz una grfica con los espectros obtenidos del espectrmetro de una protena
X, de la cual se obtuvieron expectros de la protena nativa, de la protena denaturada,
renaturada sin ATP y renaturada con ATP.

Fig. 1:Grafico de espectros en funcin de la longitud de onda. Espectro CD de protena en

estado nativo, denaturado y renaturado en presencia de ATP y ausencia de ATP.

Posteriormente se hizo la conversin de los datos para obtener la elipticidad molar del
peso del residuo y se grafic, dando una imagen similar a la anterior.
 Fig.2:Grafico de elipticidad molar ([]MRW) en funcin de la longitud de onda. Elipticidad molar
de los espectros CD de protena en estado nativo, denaturado y renaturado en presencia de
ATP y ausencia de ATP.

Finalmente se obtuvo los porcentajes de estructura secundaria a travs de la base de datos

K2D3 [1], donde se obtuvo las estructuras secundarias tipo random, sabana-, vuelta- y -
helice

Nativa
Denaturacii n sin ATP
40
Denaturacii n con ATP

30
Porcentaje (%)

20

10

0
Alfa-hlice Lmina-beta Vuelta-beta Random

Tipo de estructura

Fig. 3: grfica de porcentaje de protena versus tipo de estructura asociada a esta.

1.- Qu puede inferir de la comparacin del espectro de la protena nativa con el de la

protena desnaturada?

Es posible inferir que efectivamente la protena sufre denaturacin, puesto que los valores del
espectro disminuyen de manera lineal a medida que disminuye la longitud de onda, y no
presenta similitud en forma con el espectro de la protena nativa. Esta forma del espectro es la
que permite determinar la presencia y contenido de estructura secundaria de una muestra, y si
se tiene un espectro sin forma alguna implica que esa muestra no presenta algn tipo de
estructura secundaria, ya sea alfa-hlice o lmina-beta.

2.- Deduzca si el proceso de denaturacin es reversible o no, a partir de la comparacin de los

espectros y el contenido de estructura secundaria, de la protena en estado nativo y renaturada.

Observando los espectros de la estructura nativa, la renaturada con y sin ATP, se tiene que los
tres coinciden de manera muy similar desde los 250 nm hacia los 210 nm aproximadamente.
Luego las dos renaturaciones presentan variacin con respecto al espectro nativo, siendo la
renaturacin con ATP la ms similar al espectro nativo. De esta manera se puede deducir que
efectivamente la renaturacin es reversible por la similitud de los espectros.

3.- Sabiendo que esta protena tiene un sitio de unin para ATP, qu puede inferir del efecto de
la unin de ATP en el plegamiento y estabilidad de la protena al comparar el espectro y
contenido de estructura secundaria de la protena renaturada en ausencia y presencia de ATP.

Como el espectro de renaturacin con ATP es el ms similar al especto nativo con respecto a la
de renaturacin sin ATP, se puede inferir que la unin de ATP a la protena genera un estado
que favorece el plegamiento, generando una conformacin intermediaria y una distribucin
tridimensional de tomos y enlaces que permite que el plegamiento se realice con mayor
facilidad.

4.- En la medicin de la protena en GdmCl 6M, solo se pudo llegar hasta 215 nm en el barrido
(a menor longitud de onda el voltaje del PM lleg a su mximo de 1000 V). Por qu cree que
ocurri esto si con las otras muestras se lleg hasta 190 nm?

El que llegara a los 215nm es debido a que se ha llegado a la mxima diferencia de potencial
del espectrofotmetro (1000V), luego de eso, el equipo arroja un error debido a que son
inciertas las mediciones, este error se puede deber a que gracias a la alta concentracin y junto
con las estructuras que hay en el medio, por ejemplo, hasta los 205 igual es capaz de absorber
an por la presencia de algunas -helices que absorben hasta alrededor de 205nm, pero
despus hay estructuras denaturadas y lee errticamente porque probablemente comenz a
leer la absorbancia que obtiene el agente denaturante a su alta concentracin.

- Desplegamiento de una protena seguido por dicrosmo circular:

Con los datos de los espectros de dicrosmo circular de la denaturacin en funcin de la

concentracin de cloruro de guanidinio se construy el siguiente grfico:

Fig. 4: Grafico de espectros de denaturacin en funcin de la longitud de onda, a diferentes

concentraciones molares de GdmCl. Barrido realizado entre 215 y 240 nm.
Luego se calcul la fraccin de la protena denaturada (FD) en relacin a la concentracin de
cloruro de guanidinio [GdmCl] a 222 nm, tomando en cuenta que la concentracin 0M de
[GdmCl], ser tomado como limite inferior y la concentracin 6M de [GdmCl] ser 1.

Tabla 2: Tabla donde se relaciona la fraccin de la protena denaturada en relacin con la

concentracin de cloruro de guanadinio
[GdmCl]1/2 (M) CD222 (grados) FD
0 -14733,9 0
0,75 -14733,9 0
1,5 -14512,8915 0,0256
2,5 -14291,883 0,0512
3 -13273,681 0,1691
3,5 -11733,755 0,3473
4 -8070,426 0,7715
5 -6218,3637 0,9859
6 -6096,435 1

Con estos datos se hizo una curva de denaturacin relacionando la concentracin de cloruro de
guanadinio con la fraccin de protena denaturada con los datos obtenidos a 222nm tal como
muestra la tabla 2, dando datos del estado pre-denaturado y post-denaturado.

Fig. 4: Fraccin de protena denaturada a las distintas concentraciones de GdmCl. Y

destacando estado pre-denaturado (Linea roja) y estado post-denaturado (lnea azul)

Gracias a estos datos se pudo obtener la pendiente y el punto de interseccin de las

regresiones lineales de los estados pre y post denaturacin, los que se pusieron en la tabla 3:

Tabla 3: pendiente (m) y puntos de interseccin (Y) de los estados predenaturado(n) y post
denaturado (D)
 YD -0,0069
mD 0,0220
Yn 0,9153
mn 0,0141

Se hizo ajuste cuadrtico con la herramienta solver de Excel y se obtuvo los siguientes
valores:

Con estos valores, se realiz un ajuste por mnimos cuadrados (a travs de la siguiente
funcin) para la fraccin de protena denaturada, as se tiene el ajuste de la fraccin
denaturada en funcin de la concentracin de GdmCl:

2287,81([ GdmCl ]3, 67)

(0,0069 0,022 [GdmCl]) (0,915 0,014 [GdmCl]) e 592, 42

y 2287,81([ GdmCl ]3, 67)

1 e 592, 42

Con esta funcin se pudo encontrar los valores de la concentracin necesaria de GdmCl para
obtener igual fraccin de protena denaturada como nativa sean iguales (0,5)

Tabla 4: Valores optimizados de [GdmCl]1/2 y m a travs de herramienta solver.

[GdmCl]1/2 (M) m (cal/M)

3,67 2287,81

Con estos seis parmetros contenidos en la tabla 3 y 4, es posible construir un grafico que
representa el ajuste de la curva de denaturacion. Para esto, se utilizan concentraciones
crecientes de GdmCl en 0,1 M.