Separacin

cromatogrfica de
pigmentos
Prctica 10
Operaciones Bsicas
de Laboratorio I

Universidad de Alicante

1
ndice.
Objetivos

Proceso experimental

Resultados

Discusin

Cuestiones

Conclusiones

Bibliografa

Objetivos.

2
 En esta prctica, pretendemos extraer los diferentes pigmentos
vegetales (-caroteno y clorofilas) de la espinaca deshidratada mediante
la separacin cromatogrfica en columna por gravedad (extraccin
slido-lquido), por lo que intentaremos aprender a utilizar de manera
correcta esta tcnica. Adems, cuantificaremos la cantidad de clorofila
presente en las hojas de dicho vegetal mediante espectrofotometra.

Por otro lado, aprenderemos la tcnica de cromatografa de capa fina,

en la cual podremos observar la distinta afinidad de los pigmentos
colocados sobre la placa cromatogrfica, y as poder calcular (con los datos
necesarios medidos durante el proceso experimental) el parmetro inverso
al tiempo de retencin.

Proceso experimental.

La cromatografa es un conjunto de tcnicas basadas en el principio

de retencin selectiva, cuya finalidad es la separacin de los distintos
componentes de una mezcla, permitiendo de este modo la determinacin
de las cantidades de dichos componentes.

Las diferencias entres los coeficientes de particin de los compuestos

dan como resultado diferencias sobre la fase estacionaria (sustancia que
permanece fija e inmvil durante el procedimiento de la cromatografa.
Ejemplo: gel de slice), y por lo tanto una separacin en funcin de los
tiempos de retencin de cada componente de la mezcla, el cual vara
dependiendo de la naturaleza de sta.

Las funciones bsicas y principales de la cromatografa son la

separacin de componentes de una mezcla, de manera que se
obtengan sustancias ms puras que las iniciales para su posterior uso.
Adems la cromatografa tiene como finalidad el anlisis cualitativo y
cuantitativo de stas.

En cuanto a las tcnicas cromatogrficas purificadoras, podemos

destacar la cromatografa en columna con sus diferentes variables (de
adsorcin, en fase reversa, de permeacin en gel y de intercambio
inico). En cuanto al anlisis , las tcnicas ms utilizadas son la
cromatografa de gases, la cromatografa lquida de alta resolucin
(HPLC) y la cromatografa en capa fina. Todas estas tcnicas
cromatogrficas se basan en las distintas afinidades de los
componentes de analito por un medio mvil (gas o lquido) y una fase
estacionaria a travs de la cual circulan.

La primera parte de la prctica consistir en realizar la cromatografa de

adsorcin por gravedad. Para ello, hemos pesado 5,0040,001g de hojas
deshidratadas de espinaca. Preparamos una disolucin constituida por 30,00,1ml de
ter y 8,00,1 ml de cetona. Colocamos tanto las hojas de espinaca pesadas y la
disolucin en un mortero, donde mezclaremos los componentes y los trituraremos
hasta obtener una masa ms o menos homognea, que ser decantada en un vaso de

3
 precipitados (evitando que las hojas ms grandes que se han quedado sin triturar se
depositen en l).

Por otro lado se preparar el tubo en el que se va a llevar a cabo esta

cromatografa: Pesamos 9,01 0,01g de slice (fase estacionaria) y
prepararemos la columna utilizando como disolvente una mezcla de acetona-ter
constituida por 5,00,1ml de acetona y 50,00,1ml de ter.

Vertimos el disolvente por la columna, hasta que ocupe aproximadamente 15 cm de sta, y

a continuacin depositamos la slice poco a poco (se va depositando por su propio peso
sobre el fondo), repartindolo de forma homognea y ayudndonos de una varilla sin que
queden huecos de aire, ya que podran afectar al resultado de la prctica.

El siguiente paso, una vez que tenemos preparada la columna, es echar un poco de arena
que quedar depositada sobre la superficie de slice (unos 2 3 mm de altura).

A continuacin, abrimos la llave hasta que el nivel del disolvente alcance justo al superficie
del nivel de arena colocado anteriormente (en ese momento se impedir que siga saliendo
disolvente cerrando la llave). Seguiremos aadiendo disolvente y decantndolo hasta que
el color de la arena disminuya como podemos observar en la siguiente imagen.

El siguiente paso es aadir la disolucin de hojas

deshidratadas de espinacas con una pipeta Pasteur
para proceder a la cromatografa (aproximadamente 2
ml de esta). La disolucin se deber de aadir con
cuidado poco a poco apoyando la pipeta en las
paredes del tubo para que no se rompa la capa de
arena debido a la velocidad de cada de la disolucin.
A continuacin, volvemos a abrir el tubo para
dejar caer disolvente, de manera que la
disolucin de espinacas pasar a
posicionarse debajo de la capa de arena.
Procederemos a lavar la arena con ms
disolucin de ter-acetona hasta que se
retire el color
verde ocasionado
por el paso de la
disolucin de espinacas, y suministramos ms
de este disolvente para as conseguir que se
deslice la fase amarilla producida por la
separacin de pigmentos. En el momento que
sta llegue al final del tubo, se recoger y se
apartar en un tubo de ensayo.

En este momento, se est estableciendo un

equilibrio entre el soluto adsorbido en la fase
estacionaria y el disolvente eluyente que fluye
por la columna. Como causa de que cada unos
de los componentes que constituyen la mezcla
establecen interacciones distintas con la fase

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estacionaria y la mvil, son transportados a diferentes velocidades, de
forma que as se consigue la separacin.

As, de manera similar a otros tipos de cromatografa, las diferencias en las

velocidades de desplazamiento a travs del eluyente corresponden con
diferencias en los tiempos de elucin por la pate inferior de la columna para
cada uno de los componentes de la muestra original, los cuales sern
recogidos en tubos de ensayo diferentes.

En cuanto al eluyente, su grado de polaridad afecta directamente a las

velocidades relativas con las que los distintos componentes de la mezcla se
mueven en la columna. Los disolvente polares compiten de forma ms
eficiente con las molculas polares de una mezcla por los lugares polares
del adsorbente. Por lo tanto, debido a esto, cuanto ms polar sea un
disolvente, ms rpidamente se desplazar la mezcla por la columna, de
manera que si elegimos un disolvente demasiado polar, la elucin puede ser
tan rpida que generalmente habr poca separacin de los componentes de
la mezcla. Si por el contrario el disolvente tiene poco carcter polar o es
apolar, los compuestos no eluirn por la columna. Por lo tanto, se debe de
elegir un eluyente adecuado para poder llevar a cabo con xito la
cromatografa en columna. A menudo se utiliza un gradiente creciente de
polaridad para la elucin.

En la imagen de la izquierda, podemos

observar como est bajando el pigmento amarillo (constituidos por -
carotenos) y su retiracin en un tubo de ensayo.
En el momento en el que se acaba de depositar el pigmento amarillo, se
cambia el tubo de ensayo y se empezar a depositar lquido intermedio, de
color amarillo/transparente, el cual contendr algunos pigmentos de -
caroteno y de disolvente.
Cuando se acabe de consumir la disolucin de acetona-ter que hemos
estado suministrando hasta ahora para que se produjera el deslizamiento de

5
los pigmentos por el tubo, la sustituimos por acetona y cambiaremos el tubo
de ensayo nuevamente. En este momento tendremos ya 3 tubos de ensayo:
1 disolucin con -carotenos.
2 disolucin con -carotenos en menos medida y disolvente.
3 disolucin intermedia con disolvente.
Posteriormente, al aadir la acetona, empezarn a deslizarse los pigmentos
de color verde intenso correspondientes con la clorofila de la espinaca.
Cuando stos lleguen al final del tubo, se retirarn en un 4 tubo de ensayo,
que contendr pigmentos de clorofila.

Como ya se ha terminado el
proceso de cromatografa, se limpia
el tubo que hemos utilizado
mediante filtracin al vaco para as
poder retirar la slice junto a la
arena fcilmente.

A continuacin, para poder

realizar posteriormente el
anlisis cuantitativo de los
pigmentos de clorofila y -
carotenos, llevaremos a cabo
la medida del espectro de
adsorcin para la fraccin de
clorofila y -carotenos entre
400 y 700 nm en un
espectrofotmetro.
Para ello, ha sido necesario diluir previamente la clorofila,
exactamente 6,20,1 ml de esta con 6,00,1 ml cetona, por lo que el volumen total de
la disolucin de clorofila pasa a ser de 12,20,1ml.

La tercera y ltima parte de la prctica, consiste en la realizacin de una

cromatografa de capa fina. Para ello, tomaremos una placa de
cromatografa de capa fina en la que realizaremos dos marcas con un
lpiz para saber posteriormente donde hay que colocar las muestras a
analizar (aproximadamente a 1 cm del extremo inferior).
Con la ayuda de un capilar de vidrio, depositamos un poco de cada
extracto obtenido en la
placa, situados todos a la misma altura. Los extractos depositados son:
1 -caroteno
2 clorofila
3 disolucin de espinaca inicial
A continuacin, desarrollamos la placa empleando como cmara de
elucin en el que
habr una pequea cantidad del eluyente (disolucin ter-acetona, 1ml
cetona+ 10ml
ter). Se retira dicha placa antes de que el frente de elucin llegue al
final de sta.

Marcamos con un lpiz el nivel que ha ascendido cada pigmento.

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 Estos seran los esquemas del proceso de cromatografa de
adsorcin por gravedad y de cromatografa de capa fina:

Esquema 1- Cromatografa de adsorcin por gravedad.

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 8
Esquema 2- Cromatografa de capa fina.
anlisis
cuantitativo
clorofilas y -
Medida del espectro de adsorcin para la fraccin de clorofila y - carotenos
carotenos entre 400 y 700 nm en un espectrofotmetro.
Cuando se acaba el disolvente, se sustituye por acetona (15 cm). procedimiento
cromatogrfico
La disolucin resultante a partir de este punto ser incolora y contendr parte 2
los restos de disolvente ter-acetona. Se apartar en un 3 tubo de
ensayo.
Comienzan a descender lso pigmentos de clorofila, que sern recogidos
cuando lleguen al final del tubo con el 4 tubo de ensayo.
Vertemos 2 ml disolucin espinacas con cuidado, por las pareces del tubo para disminuir la
velocidad de cada. procedimiento
Dejamos la llave abierta hasta situar el disolvente a la altura de la arena. cromatogrfico
Seguimos aadiendo de ste hasta que la arena se vuelva incolora. , parte 1
Se sigue aadiendo don acetona-ter (15cm tubo). Se van diferenciando los pigmentos y
descendiendo el amarillo de carotenos.
Se sigue administrando disolvente si es necesario.
Se retira primer tubo de ensayo con disolucin amarilla (carotenos)
Se retira segundo tubo de ensayo con disolucin amarilla/transparente intermedia.
preparacin
9g gel de slice
5 ml cetona columna
50 ml ter
Primero aadimos los 55 ml de disolvente. Luego el gel de slice poco a poco,
repartindolo de forma homognea. Finalmente aadimos la fina capa de arena.
preparacion
5 gramos de espinacas pesados con exactitud muestra
30mL eter de petrleo
8 mL de acetona
Triturar muestra hasta obtencion mezcla homognea.
 9
0,02 0 700
0,2 0,1 680
0,69 0 660
0,35 0 640
0,25 0,01 620
0,22 0,01 600
0,13 0,01 580
0,15 0,01 560
0,17 0 540
0,19 0,01 520
0,22 0,07 500
0,49 0,38 480
0,82 0,53 460
1,08 0,53 440
1,16 0,47 420
1,04 0,3 400
clorofila carotenos Blanco
Absorbancia Absorbancia -
longitudes de onda. de las
Medidas de las distintas absorbancias de los pigmentos para cada una
ANLISIS CUANTITATIVO.
Resultados.
final
Retirar antes de que el frente de elucion llegue al final de la placa.
inicio
cromatogra
Colocar placa de cromatografia fina(silice) marcada en el eluyente de eter- fa capa
acetona. fina
Se observa que los pigmentos empiezas a ascender, cada uno una
determinada longitud por la placa.
preparaci
Con un capilar( diferente cada vez) depositar una gota de lcada uno de os n
extractos descritos:
1 -carotenos II
2 clorofila
Disolucin inicial de espinacas
preparaci
n
Realizar 2 marcas a lpiz en la placa de cromatografa de capa fina a 1 cm I
del extremo inferior.
Grfica obtenida:

1.4

1.2

0.8 f(x) = - 0x + 2
Medidas absorbancia pigmentos (nm) R = 0.49

0.6

0.4
f(x) = - 0x + 1.12
R = 0.63
0.2

0
350400450500550600650700750

Blanco (Longitud de onda, nm)

La linea naranja corresponde a los carotenos, mientras que la verde a la

clorofila

Para calcular la concentracion de clorofila en las hojas de espinaca se

utilizar la ley de Lambert-Beer.
Siendo el coeficiente de absortividad molar a 652nm de 34,5mLmg -1cm-1.
Conociendo la ecuacin A=ECl donde A es la absorbancia E el coeficiente de
absortividad molar C la concentracion y l la longitud del tubo de ensayo
introducido en el espectofotometro, que en este caso es de 1cm,
sustituimos y obtenemos un valor de 0,024mg/ml de clorofila.

ANLISIS CUALITATIVO.

Cromatografa de capa fina:

Rr(1)= h1/D= 0cm/4= 0.
Rf(2)= h2/D= 2,85cm/4= 0,7125.

Discusin.

En la grfica anterior, podemos observar que en la columna del

caroteno, en las ltimas medidas de las absorbancias ( 560nm, 580nm,
600nm, 620nm y 680nm), obtenemos valores muy pequeos en la
absorcin de este pigmento. En realidad, estos valores deberan de ser
0, por lo que esto quiere decir que o la separacin no ha sido del todo
correcta, o ha habido algn error a la hora de la medida de las absorbancias,
aunque los valores son mnimos, y al tratarse de los carotenos no nos

10
suponen ningn problema a la hora de desarrollar el resto de la prctica y
de realizar los clculos necesarios.

Por otro lado, con la clorofila nos ha pasado algo parecido. Para las
absorbancias de 560nm, 580nm, 600nm, 620nm, hemos obtenido valores
bajos de clorofila cuando deberan de ser nulos. En este caso, se puede
deber a un poco de clorofila que no se ha separado bien u otro
pigmento de las espinacas (hay posibilidades de que se trate de
xantofilas). Sin embargo, al igual que nos ocurra con los carotenos, este
error es muy pequeo y no afecta ni a los resultados ni al desarrollo de
la prctica.

Cuestin.

Respondiendo a la pregunta que se formula en el guin de prcticas,

esta longitud de onda no sera adecuada para una muestra que tambien
contuviese carotenos debido a que estos no absorben luz a esta longitud de
onda, como se muestra en la grfica anterior.

Conclusin.

Para concluir con la prctica, podemos decir que hemos sido capaces
de determinar y responder todas las cuestiones y objetivos planteados,
tanto la determinacin de la clorofila presente en una determinada masa
de hojas de espinaca deshidratada como el manejo de las distintas
tcnicas cromatogrficas que hemos utilizado a lo largo de este
procedimiento.
Los resultados parecen haber sido precisos y correctos, tanto las
grficas obtenidas como la cantidad de clorofila y el parmetro inverso al
tiempo de retencin en la cromatografa de capa fina.

Bibliografa.

Guin prctica 10.

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