ESCUELA SUPERIOR POLITCNICA AGROPECUARIA DE MANAB

MANUEL FLIX LPEZ

CARRERA AGROINDUSTRIAS

SEMESTRE DCIMO PERODO OCT. 2016/ FEB. 2017

TRABAJO INVESTIGATIVO DE INDUSTRIAS DE

EXTRACTOS

TEMA:
CROMATOGRAFA LQUIDA

AUTOR:
JULIAN. A PALACIOS VALENCIA

FACILITADOR:
ING. FRANCISCO DEMERA LUCAS

CALCETA, NOVIEMBRE 2016

 I. INTRODUCCIN

Angurell et al., (2014) sostienen que la cromatografa comprende un conjunto

de tcnicas que tienen como finalidad la separacin de mezclas basndose en
la diferente capacidad de interaccin de cada componente en otra sustancia.
De forma general, consiste en pasar una fase mvil (una muestra constituida
por una mezcla que contiene el compuesto deseado en el disolvente) a travs
de una fase estacionaria fija slida.

Continuando con la literatura anterior se menciona que la fase estacionaria

retrasa el paso de los componentes de la muestra, de forma que los
componentes la atraviesan a diferentes velocidades y se separan en el tiempo.
Cada uno de los componentes de la mezcla presenta un tiempo caracterstico
de paso por el sistema, denominado tiempo de retencin. Cuando el tiempo de
retencin del compuesto deseado difiere del de los otros componentes de la
mezcla, ste se puede separar mediante la separacin cromatogrfica.

Gutirrez (2002) argumenta que los mtodos cromatogrficos se dividen en dos

grandes grupos: cromatografa lquida, si la fase mvil es un lquido
(denominado eluyente) y cromatografa de gases, cuando la fase mvil es un
gas. En el presente trabajo investigativo se detallar conceptos generales de la
cromatografa liquida y su respectiva clasificacin, entre otros aspectos.

El INP (s.f.) destaca que la cromatografa de lquidos tiene especial aplicacin

en reas como la farmacutica y ciencias de la vida, para la separacin e
identificacin de compuestos.

I.1. OBJETIVOS

I.1.1. OBJETIVO GENERAL

Conocer los fundamentos tericos de la cromatografa lquida mediante

la recopilacin de fuentes bibliogrficas.

I.1.2. OBJETIVOS ESPECFICOS

 Identificar cul es la caracterstica principal de la cromatografa liquida.
Establecer cuales son los tipos de cromatografa lquida existentes y sus
diferencias.
Conocer las aplicaciones de la cromatografa liquida en la industria
alimentaria.

II. MARCO TERICO

 II.1. CROMATOGRAFA LQUIDA

Braithwaite (1985) citado por Acua (2015) indica que la cromatografa lquida
(LC) es una tcnica de separacin en la que la fase mvil es un lquido, puede
desarrollarse en una columna o sobre un plano. La cromatografa lquida en la
actualidad emplea generalmente partculas muy pequeas y una presin de
entrada relativamente alta denominndose entonces cromatografa lquida de
alta eficacia o de alta presin, cuyas siglas provenientes del ingls son HPLC.

La UDP (2015) define a la cromatografa lquida de alta presin (HPLC) o

resolucin como una tcnica que permite separar, aislar e identificar los
analitos de una mezcla de compuestos qumicos (basada en la transferencia de
masa entre la fase estacionaria y la fase mvil), por lo que es utilizada
frecuentemente en bioqumica y qumica analtica para la separacin de
componentes de una sustancia determinada, basndose en diferentes tipos de
interacciones qumicas.

Ozores (2016) argumenta que a diferencia de la cromatografa de gases, la

cromatografa de lquidos de alto rendimiento (HPLC) no est limitada por la
volatilidad o la estabilidad trmica de la muestra. La HPLC es capaz de
separar macromolculas y especies inicas, productos naturales lbiles,
materiales polimricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de
alto peso molecular. Con una fase mvil lquida interactiva, otro parmetro se
encuentra disponible para la selectividad, en adicin a una fase estacionaria
activa. La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que
permite una mayor gama de estas interacciones selectivas y ms posibilidades
para la separacin.

En cromatografa lquida, la fase mvil es un lquido que fluye a travs de una

columna que contiene a la fase estacionaria, se lleva a cabo en una columna
de vidrio. Despus se coloca la muestra por la parte superior y se hace fluir la
fase mvil a travs de la columna por efecto de la gravedad. Para aumentar la
eficiencia en las separaciones, en la cromatografa de alta resolucin; el
tamao de las partculas de fase fija se disminuye hasta los micrones, usando
altas presiones para lograr que la fase mvil pueda fluir (UNAM, 2007).

II.2. TIPOS DE CROMATOGRAFA EN HPLC Y

APLICACIONES

En el cuadro 2.1 se muestra los tipos de cromatografa lquida que existen as

como su separacin cromatogrfica.

Cuadro 2.1. Clasificacin de las separaciones cromatogrficas

Tipo de Tipo de fase
Nombre Mtodo de fijacin de la fase estacionaria
fase mvil estacionaria
Particin Lquido Lquido Adsorbida en un slido poroso sostenido en una columna
tubular
Adsorcin Lquido Slido Sostenida en una columna tubular
Papel Lquido Lquido Sostenida en los poros de un papel grueso
Capa delgada Lquido Lquido o slido Slido finamente dividido sostenido sobre una capa de
vidrio: el lquido puede absorberse sobre las partculas
Gel Lquido Lquido Sostenido en los intersticios de un polmero slido
Intercambio Lquido Slido Resina de intercambio inico finamente dividida en una
inico columna tubular

La UNAM (2017) presenta una fundamentacin ms explicativa de cada tipo de

cromatografa liquida:

II.2.1. CROMATOGRAFA DE ADSORCIN

Es la tcnica ms usada para la separacin de compuestos orgnicos neutros,

es adecuada para compuestos no polares probablemente con masas
moleculares inferiores a 5000. Se basa en la afinidad de adsorcin, su fase
estacionaria es la superficie de un slido finamente dividido. El soluto compite
por los sitios sobre la superficie del slido con el disolvente utilizado como
eluyente; la retencin es el resultado de la adsorcin. Las nicas fases que se
utilizan en este tipo de cromatografa son la slice y la almina, siendo la
primera la preferida, la eleccin de la fase mvil es fundamental para el xito de
una cromatografa lquido-slido; variando el disolvente, si este presenta una
alta fuerza de elucin eluir las especies absorbidas ms rpidamente que uno
que tenga un valor ms bajo. La cromatografa de capa fina (TLC) es un
ejemplo especial de cromatografa por adsorcin en la cual la fase estacionaria
es un plano, en la forma de un soporte slido en un plato inerte.

II.2.1.1. APLICACIONES

Es particularmente adecuada para el anlisis de molculas no ionizantes,

insolubles en agua y relativamente simples, que frecuentemente son ismeros
o compuestos muy relacionados. Se utiliza en la separacin de la vitamina D3 y
sus metabolitos las vitaminas A, D y E (y compuestos muy relacionados a estas
vitaminas), muchas drogas de abuso (LSD, por ejemplo), antidepresivos
tricclicos, bloqueadores beta y los PTH aminocidos. Los aceites naturales y
los extractos de esencias se analizan fcilmente y los pigmentos menos
polares de las plantas, tales como los carotenoides y las porfirinas.

II.2.2. CROMATOGRAFA DE PARTICIN

Cromatografa lquido-lquido: la separacin de las sustancias se logra por

migracin diferencial de los solutos. La fase estacionaria de la cromatografa de
particin es un lquido soportado en un slido inerte, el ms usado es el cido
silcico o gel de slice. La fase mvil puede ser un disolvente puro o una mezcla
de disolventes, la polaridad puede ser notablemente diferente a la del lquido
estacionario. Esta consiste en aplicar una gota de la solucin con la mezcla de
substancias a separar en la parte inferior de una tira de papel o en una delgada
capa de un material inerte, como silica gel o celulosa, el papel o material inerte
(denominados soportes) se colocan en un recipiente con un solvente, de
manera que, este los vaya impregnando; el disolvente se elige de manera tal
que uno de ellos se adsorba ms al soporte que el otro; a medida que el
disolvente avance a lo largo del soporte los lquidos suben espontneamente
por capilaridad, aquellos componentes de la muestra que sean ms solubles en
el lquido que queda adsorbido sern retenidos, y los que tengan mayor
afinidad por el que no se adsorbe sern arrastrados por este.
 II.2.2.1. APLICACIONES

Es un poderoso instrumento para la separacin de sustancias estrechamente

relacionadas, ejemplos tpicos son la resolucin de los numerosos aminocidos
formados en la hidrlisis de una protena, la separacin y anlisis de alcoholes
alifticos y la separacin de derivados de azucares.

II.2.3. CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO

El disolvente por lo general es agua y las especies a separar son iones, es muy
utilizada en la qumica inorgnica, tambin se usa para la separacin de
aminocidos y otros cidos y bases orgnicas. Est basada en la atraccin
entre iones del soluto y puntos cargados que existen en la fase estacionaria, el
intercambio inico es un proceso en el cual ocurre un intercambio de iones de
signo igual entre una solucin y un slido esencialmente insoluble en contacto
con la solucin. La fase estacionaria es una resina de intercambio inico que
contiene grupos cargados, teniendo la propiedad de separar especies
ionizadas (cationes o aniones); la fase mvil es generalmente una solucin
amortiguadora de pH.

Dentro de los intercambiadores se encuentran: arcillas y las ceolitas, as como

resinas sintticas, estas ltimas pueden ser usadas para intercambio de
cationes se usan: resinas cidas fuertes las cuales contienen grupos de cidos
sulfnico y resinas cidas dbiles con grupos de cido carboxlico. En el caso
de intercambiadores aninicos, contienen grupos funcionales bsicos
adheridos a la molcula de polmero generalmente son aminas. La fase
estacionaria es una resina de intercambio inico que contiene grupos cargados,
teniendo la propiedad de separar especies ionizadas (cationes o aniones); la
fase mvil es generalmente una solucin amortiguador de pH.

II.2.3.1. APLICACIONES
Se utiliza en los analizadores para aminocidos, se ha aplicado a una gran
variedad de sistemas orgnicos y bioqumicos incluyendo frmacos y sus
metabolitos, sueros, conservantes de alimentos, mezclas de vitaminas,
azcares y preparaciones farmacuticas.

II.2.4. CROMATOGRAFA EN GEL

Es una tcnica de caracterizacin de polmeros que proporciona la distribucin

completa de pesos moleculares de una muestra y sus distintos promedios. El
fraccionamiento se basa, por lo menos en parte, en el tamao y la forma
molecular de las especies de la muestra, tambin se le conoce como
cromatografa de permeacin en gel, cromatografa de exclusin y
cromatografa de tamizado molecular. Se efecta en una columna por el
mtodo de elusin. La fase fija est formada por partculas polimricas o de
slice que contienen una red uniforme de poros por los que pueden penetrar las
molculas de pequeo tamao. Las molculas de tamao grande se excluyen
totalmente y son eluidas en primer lugar, mientras que las de pequeo tamao
tienen acceso a todo el volmen poroso y son las ltimas que se eluyen, los
factores que determinan la separacin de las molculas son el tamao del
poro, el tamao de la partcula y el flujo de elucin. Los diferentes tipos de
partculas usadas deben ser estables, mecnica y qumicamente, tener bajo
contenido en grupos inicos, uniformidad de poro y tamao. Los compuestos
pueden ser derivados de dextranos (Sephadex), derivados de agarosa
(Sepharosa), derivados de acrilamidas (Biogel P) y esferas de vidrio. Hay
diferentes tamaos de partcula para un gel: a menor tamao mayor resolucin
y menor gasto en la columna.

II.2.4.1. APLICACIONES

Se emplea en la separacin de protenas de alimentos, determinacin de

glucosa y fructosa en zumos de fruta, as como para la separacin de
compuestos de alto peso molecular- protenas y polmeros, cidos grasos,
azucares.
 II.2.5. CROMATOGRAFA PLANA

La separacin se produce sobre una capa de un slido finamente dividido que

se ha fijado sobre una superficie plana, es un mtodo notablemente simple y de
bajo costo. Es una tcnica de separacin en la que la fase estacionaria est en
forma de plano o sobre un plano, ste puede ser un papel, que est
impregnado con una sustancia que acte de fase estacionaria o una capa de
partculas slidas extendida sobre un soporte, tal como una placa de vidrio. La
cromatografa plana tiene como fase mvil un lquido y como fase estacionaria
un lquido o un slido dispuestos sobre una superficie plana.

II.2.5.1. APLICACIONES

Se utiliza para separar e identificar los componentes de pequeas muestras de

substancias inorgnicas, orgnicas y bioqumicas, se usa en determinadas
aplicaciones con una finalidad didctica, tambin para la separacin de
muestras clnicas y bioqumicas as como en otras aplicaciones analticas
generales por su gran sencillez y bajo costo.

II.2.6. CROMATOGRAFA EN PAPEL

Se utilizan papeles especiales de elevada pureza, es una tcnica muy sencilla,

se utiliza una tira de papel de filtro (Whatman n1) como soporte para la
separacin, el mecanismo que interviene en la separacin fundamentalmente
de reparto. La fase estacionaria est constituida por el agua absorbida sobre
las molculas de celulosa del papel. La fase mvil se selecciona
empricamente, se emplean mezclas consistentes en compuestos orgnicos,
agua y otras especies (cidos, bases, agentes complejantes) que modifiquen la
solubilidad de los compuestos de la muestra.

II.2.7. CROMATOGRAFA EN CAPA FINA

Se realiza en placas de vidrio o plstico recubiertos con una capa delgada de
partculas finamente divididas contenidas en la fase estacionaria. El mecanismo
predominante es la adsorcin. Los materiales ms usados han sido: gel de
slice, almina, celita, poliamidas. La fase mvil el disolvente a utilizar debe
reunir una serie de caractersticas: inerte frente a los componentes de la
muestra y de la fase estacionaria, elevada pureza, adecuada viscosidad y
tensin superficial, bajo punto de ebullicin para facilitar el secado de las
placas, econmico y baja inflamabilidad y toxicidad.

El HPLC se utiliza para: deteccin y cuantificacin de sacarina benzoatos,

cafena y aspartame en refrescos; deteccin de ciclomato en jugos de fruta;
separacin de esteres de cidos grasos por fase inversa y con argentacin de
columnas( Silicato de Al con Ag); separacin de triglicridos por la longitud de
la cadena y el grado de instauracin por fase inversa y detector de dispersin
luminosa, para el estudio de aceites y grasas adulteradas; determinacin del
contenido de vitamina A y sus precursores ( y caroteno) en margarina y
aceites de hgado por fase inversa; determinacin del contenido en vitamina D
en leche en polvo y cereales por fase normal.

II.3. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA HPLC

En el cuadro 2.2 se describen las ventajas y desventajas que proporciona esta

tcnica de separacin.

Cuadro.2.2. Ventajas y desventajas de la HPLC

Ventajas Desventajas
Velocidad de anlisis Instrumentacin costosa
Alta resolucin Difcil anlisis cualitativo
Resultados cuantitativos Detector universal y sensible
Buena sensibilidad Elevado costo de operacin
Automatizacin Experiencia indispensable:
Amplio espectro de aplicaciones
Fuente: Ibarra y Beck (2015)

II.4. CROMATGRAFO HPCL

La HPLC utiliza un equipo con ventajas significativas:

Figura 2.1. Representacin bsica de un cromatgrafo de lquidos de alta presin

En este mtodo se usan columnas de dimetros muy reducidos, rellenas de

materiales especiales pulverulentos, cuyas partculas tienen un tamao

entre 30-40 m y con frecuencia hasta de 5 o 6 m, con una distribucin

de 2 m. Este tipo de columna es muy eficaz, pero ofrece una gran
resistencia al flujo de la fase mvil, o sea una gran cada de presin. Por lo
que se emplean sistemas de bombeo de alta presin que hagan fluir la
fase mvil a velocidad a travs de la columna. La cantidad de fase
estacionaria dentro de la columna es pequea, por lo tanto la muestra debe
ser pequea en 1 y 10 mg (Ibarra y Beck, 2015).

Si la presin de entrada a la columna no es muy elevada, la muestra se

introduce en la cmara de inyeccin mediante una jeringa de alta presin, a
presiones ms elevadas se utilizan las vlvulas de inyeccin. La columna a
pesar de su repetido uso, presenta un escaso deterioro, aunque en algunos
casos es necesario regenerarla. Un detector colocado a la salida de la
columna, proporciona un registro continuo de la composicin del lquido que
sale, lo que permite obtener un cromatograma y que se utiliza para
identificar y cuantificar los componentes de la muestra (Ibarra y Beck,
2015).

III. CONCLUSIONES

La principal caracterstica que describe a la cromatografa lquida es la

fase mvil, la cual debe ser un lquido. Esta fase fluye a travs de una
columna (generalmente de vidrio) hacia una segunda fase denominada
estacionaria.
 Cada tipo de cromatografa presenta mtodos de fijacin de fase
estacionaria y mecanismos de funcionamiento diferentes, destacando
as la importancia de llevar a cabo correctamente los procedimientos y
requerimientos en cada tcnica estudiada.
La cromatografa lquida posee una amplia diversidad de aplicaciones,
sin embargo su estudio enfatiza en reas de qumica, bioqumica,
industria alimentaria y farmacutica.

BIBLIOGRAFA

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