Analisis de proteinas

VECTOR DE EXPRESION

Qu es?
Es una paso de la expresin de protenas recombinantes mediante este sistema
requiere de vectores especficos o de expresin, conocidos como plsmidos, de los
cuales existe una gran variedad con una gran diversidad gentica que facilitan la
localizacin y purificacin de la protena expresada. Estos vectores son pequeas
molculas de ADN circular que se encuentran en bacterias de forma independiente
al ADN cromosomal que no son esenciales para la sobrevivencia de las mismas
(Microbial Genetics, 2003)
Aplicacin medica
Paso para la expresin de protenas recombinantes
Tcnica
Se obtiene el plsmido de una clula procarionte a partir de la centrifugacin de
colonias de bacterias, obteniendo precipitados que son tratados por medio de una
lisis alcalina, el cual se basa en la desnaturalizacin y precipitacin selectiva del
DNA cromosmico en medios con NaOH y SDS. En estas condiciones el DNA
plasmdico permanece intacto debido principalmente a su pequeo tamao y su
naturaleza circular y superenrollada. (Luz Y. 2010)
Seguido a esto se identifica el plsmido con el que se habr de trabajas para este
proceso, ya que debe de cumplir con 3 caractersticas esenciales, sitio origen de
replicacin propio, sitios de clonacin mltiple, que permitan la apertura del DNA
con enzimas de restriccin y hace posible la clonacin de insertos de 1 DNA en la
forma y orientacin determinada y debe poseer marcadores genticos
seleccionables que permitan aislar las clulas hospedadores que contengan el
vector. (Galvn A.) a partir de esto se agregara la secuencia de ADN que se quiere
codificar para la obtencin de una protena en otra clula.
Imagen 1: se observa la insercin de una secuencia de ADN al plsmido en los sitios
especificos

EXPRESION DE UNA PROTEINA RECOMBINANTE

Qu es?
Es la tecnica por la cual se induce a una celula o bacteria (E. coli) el producir cierta
proteina que in vivo son encrontradas relativamente en baja concentracion o
inecxistentes. (Huang CJ., 2012)
Aplicacin medica
La creacin de productos farmacuticos para el beneficio del hombre como.

Vacunas
Hormonas
Enzimas
Antibiticos
Anticuerpos

La primera protena recombinante fue la insulina

Tcnica
Generalmente a partir de bacterias como E. coli, los plsmidos recombinantes
formados son introducidos en las bacterias, por un procedimiento de transformacin
como: el mtodo de sales (generalmente, CaCl2), polietilenglicol y electroporacin,
que se fundamentan en la formacin de poros en la membrana y pared celular para
permitir la entrada del material gentico hacia el interior de la clula.
Se agregan adems enzimas extras para la unin de este ADN extra a el ADN de la
bacteria o clula, como la ADN ligasa especfica para este vector
A partir de esto de agregan protenas promotoras las cuales se encargan de facilitar
la expresin de estos genes y mantener la estabilidad del proceso
 CUANTIFICACIN COLORIMTRICA DE PROTENAS
Qu es?
Es el mtodo para determinar la concentracin de protenas en una muestra
biolgica se utiliza en conjunto con un esquema de purificacin de una protena
concreta, cuando se quiere conocer la actividad especfica de una preparacin
enzimtica, existen varios mtodos pero los ms utilizados son los Mtodo de
Biuret, Mtodo de Bradford y el Mtodo de BCA (Emilio F.) por ser los ms
econmicos y especficos
Aplicacin medica
El diagnostico de enfermedades crnico degenerativas
Tcnica
Se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de
los enlaces peptdicos en medio bsico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La
intensidad de coloracin es directamente proporcional a la cantidad de protenas
(enlaces peptdicos) y la reaccin es bastante especfica, de manera que pocas
sustancias interfieren (Emilio F. ) esto refirindose a el mtodo Biuret, llamado as
por el reactivo utilizado.
Se aade este a reactivo a 5 tubos con diferentes concentraciones de agua y de la
protena previamente purificada, se observa el cambio de color y se observa en la
Absorbancia obteniendo la concentracin de protenas

REFERENCIAS:

Huang CJ, Lin H, Yang X.(2012) ,Industrial production of recombinant therapeutics in

Escherichia coli and its recent advancements., J Ind Microbiol Biotechnol. ;39(3):383-99.
doi: 10.1007/s10295-011-1082-9. Epub 2012 Jan 18.
Macrobial Genetics, 2003, Expression vectors, link of the web:
http://www.sci.sdsu.edu/~smaloy/MicrobialGenetics/topics/in-vitro-genetics/expression-
vectors.html
 Luz Y., (2010), Expresin y purificacin de las protenas recombinantes estructurales
vp5, vp6 y vp8 del rotavirus. Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina
Departamento de Ciencias Biolgicas Maestra en bioqumica Bogot d.c., Link.
http://www.bdigital.unal.edu.co/3192/1/597660.2010.pdf
Aurora G., Manuel T., Aislamiento y purificacin del DNA de un plsmido recombinante
Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales,
Edificio Severo Ochoa, 14071-Crdoba, link: https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/39%20AISLAMIENTO%20Y%20PURIFICACI%C3%93N%20DEL%20DNA
%20DE%20UN%20PL%C3%81SMIDO%20RECOMBINANTE.pdf
Emilio F., Aurora G., Mtodos para la cuantificacin de protenas, Departamento de
Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo
Ochoa, 14071-Crdoba link : https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/27%20M%C3%89TODOS%20PARA%20LA%20CUANTIFICACI%C3%93N
%20DE%20PROTE%C3%8DNAS.pdf