DESCRIPCIN DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS DE BIOPELCULAS EN

REDES DE AGUA POTABLE ENRIQUECIDAS CON CLOROFORMO

DESCRIPTION OF ANAEROBIC MICROORGANISMS FROM DRINKING WATER

NETWORK BIOFILMS ENRICHED BY CHLOROFORM

Maria Fernanda Daz Torres 1

Aida Juliana Martinez Leon 1
Mildred Fernanda Lemus Prez1*
Manuel Salvador Rodrguez Susa 1

Abstract
The objective of this study was to describe the microorganisms capable of degrading anaerobically chloroform (CF)
present in biofilms of tree drinking water distribution networks, using traditional and molecular microbiology.
Positive results were found in MPN (most probable number) media for sulfate reducing and acetogenic
microorganisms. The methanogenic microorganisms could not be isolated. No significant difference was found
between the amount of organism enriched only with CF and the ones enriched with CF and acetic acid, which could
represent a cometabolism between the specific media and an environmental resistance. Using the PCR 16s, it was
determined the presence of the domain Bacteria in acetogenic and the Deltaproteobacteria class in the sulfate
reducing microorganisms. No positive results for Archaea domain were found for the microorganisms grown in the
methanogenic media. According to the biochemical reactions and the bibliographic information it was proposed that
the presence of Desulfobater sp., Desulfobacterium sp., and Acetobacterium sp., were present in the samples of
biofilms analyzed. The biodegradation of trichloromethane by the isolated microorganisms was found in each one of
the media used, due that they have an important quantity of metals and vitamins like B12 that catalyze the synthesis
of the compound. In previous research it has been found that the ideal form to degrade the compound is with mixed
cultures, what will be expecting to occur in the distribution networks, where the amount of metals like nickel, iron
and cobalt will favor the activity of enzymes required for its use as a carbon source.

Keywords: Chloroform, biofilm, methanogenic, sulfate reducers and acetogenic microorganisms

1
Centro de Investigaciones en Ingeniera Ambiental. Departamento de Ingeniera Civil y Ambiental. Universidad de los Andes.
* Centro de Investigaciones en Ingeniera Ambiental. Departamento de Ingeniera Civil y Ambiental. Universidad de los Andes.
Carrera 1 No 18 A 10, Bogot. Colombia. mf.lemus39@uniandes.edu.co

1
Resumen
Los trihalometanos (THM) son subproductos de desinfeccin (SPD) prevalentes en el agua potable desinfectada con
cloro, potencialmente cancergenos, de los cuales el cloroformo (CF) es el que ms se produce. Este compuesto
podra ser biodegradado por las biopelculas formadas en las redes de distribucin, debido a que estos agregados
microbianos facilitan el acceso a los nutrientes y en algunos casos la generacin de condiciones tanto aerobias como
anaerobias. El objetivo del presente estudio fue describir con herramientas de microbiologa clsica y molecular los
microorganismos presentes en las biopelculas de tres redes de distribucin de agua potable que fueron capaces de
degradar el cloroformo en condiciones anaerobias. Se encontraron resultados positivos en medios NMP para sulfato
reductoras y acetognicas. Los organismos metangenicos no lograron aislarse debido a las estrictas condiciones
anxicas. No se encontr gran diferencia entre la cantidad de organismos enriquecidos con solo CF y los
enriquecidos con CF y cido actico, lo que puede representar cometabolismo en los medios especficos y/o
resistencia ambiental. Por medio de PCR 16s se determin la presencia del dominio Bacteria en acetognicas y de la
clase Deltaproteobacteria en sulfato reductoras. Sin embargo, los organismos que se presentaron en los medios para
metanognicas no estaban dentro del dominio Archaea. De acuerdo a lo analizado a partir de las pruebas bioqumicas
y el reporte bibliogrfico, se propuso que en las biopelculas muestreadas hubo presencia de Desulfobacter sp.,
Desulfobacterium sp. y Acetobacterium sp. La biodegradacin del triclorometano por parte de los microorganismos
aislados se present en cada uno de los medios, pues tenan un contenido importante de metales y vitaminas como la
B12 que catalizan la sntesis del compuesto. En investigaciones previas se ha evidenciado que la forma ideal para
degradarlo es con cultivos mixtos, lo cual se espera ocurra en las redes de agua potable donde el contenido de
metales como nquel, hierro y cobalto favorecera la actividad enzimtica requerida para su uso como fuente de
carbono.
Palabras clave: Cloroformo, biopelculas, microorganismos metanognicos, sulfato reductores, acetognicos.

Introduccin

En el proceso de desinfeccin con cloro del agua potable se generan subproductos de desinfeccin (SPD) por la
reaccin con la materia orgnica natural (MON) en el agua, los cuales han mostrado una fuerte asociacin con
tumores en hgado, vejiga y rin en roedores (Tokmak et al., 2004; Richardson et al., 2007). Los SPD prevalentes
por la cloracin son los trihalometanos (THM) y los cidos haloacticos (AHA) (Rodrguez et al., 2004). Los THM
(cloroformo, dibromoclorometano, diclorometano y bromoformo) se forman generalmente en mayor proporcin que
los AHA, dependiendo del pH del agua, y han mostrado una estabilidad diferente en las redes de distribucin,
incrementando su concentracin en los puntos ms alejados de la red (Rodrguez et al., 2004). Por su posible
incidencia en salud, estos son regulados por la EPA, la Comunidad Europea, Canad entre otros, limitando su
concentracin en el agua potable. En Colombia solo los THM son controlados (DWI, 2008). Para el caso especfico
de los THM, Tokmak et al., (2004) encontraron que pueden ingresar al cuerpo por va oral (ingestin de agua con
THM), va dermal y/o por inhalacin (volatilizacin de THM en las duchas con baja ventilacin). El cloroformo por
va oral es el de mayor preocupacin debido a que es el ms abundante (95% del total de los THM) y el que mayor
riesgo de cncer reporta (Tokmak et al., 2004). Este riesgo se incrementara en los puntos de mayor concentracin de
THM, donde el tiempo de residencia del agua es ms alto. Estas zonas se caracterizan por bajas concentraciones de
desinfectante, y mayor diversidad de microorganismos en las biopelculas de las redes de distribucin, lo que
tambin incidira en la calidad del agua suministrada (Rueda, 2009). Las biopelculas son ubicuas dentro de los
sistemas de agua potable debido a su capacidad de adaptacin a estos ambientes con bajas concentraciones de
nutrientes y presencia de desinfectante. La relacin entre estas agrupaciones microbianas y los SPD no es clara, por
lo que se ha pensado que podran servir de fuente de carbono orgnico para su supervivencia. Los microorganismos
que comnmente se encuentran asociados a la degradacin de compuestos como el cloroformo son los
metanognicos, acetognicos y sulfato-reductores, algunas bacterias nitrificantes y reductoras de hierro. Algunas
investigaciones se han realizado para determinar la degradacin biolgica de THM. Bouwer et al., (1981)
determinaron que los THM no presentan degradacin en condiciones aerobias debido a que la oxidacin del
compuesto requiere de mucha energa, caso contrario a las condiciones anaerobias. Consecuentemente, Bagley y
Gossett (1995) encontraron que el cloroformo (CF) puede ser degradado anaerobicamente a CO2 y a diclorometano
por cultivos metanognicos enriquecidos y cultivos puros metanognicos, en este caso por la especie
Methanosarcina barkery 227.

2
Yu y Smith (1997) basados en la investigacin de Bagley y Gosset (1995) utilizaron microorganismos
metanognicos y cloroformo, determinando que el proceso de de-cloracin fue efectivo tanto para cultivos mixtos
como para la M. barkeri. Gupta et al. (1996) observaron que la degradacin de cloroformo se da mucho mejor en
contacto con organismos sulfato-reductores con cido actico como fuente de energa, que con metanognicos, con
un 96% de eficiencia de transformacin. Tuovinen y Hsu (1982) desarrollaron ensayos donde encontraron presencia
de microorganismos sulfato-reductores en tuberas de agua potable, as mismo otros investigadores determinaron la
presencia de sulfato-reductores del genero Desulfobacter (Tuovinen & Hsu, 1982; Herb et al, 1995; Wang y
Cullimore, 2010). Estos organismos posiblemente degradan el cloroformo por medio de la dehalogenacin reductiva,
utilizando corrinoides en enzimas especficas que ayudan a metabolizar el compuesto en formas ms simples.
En la mayora de investigaciones se encontr que la degradacin del cloroformo es mejor cuando no se sobrecarga el
sistema, es decir que con concentraciones menores a 1mg/L las bacterias y/o arqueobacterias metanognicas, sulfato-
reductoras y cultivos mixtos realizan la degradacin por dehalogenacin reductiva a una tasa mayor. Aunque cabe
resaltar que estos estudios fueron realizados con metanol, cido actico o piruvato como fuente primaria de energa,
lo que generalmente no se encuentra en el agua potable. Para el caso de las redes de distribucin de agua potable en
Colombia, Perz (2010) tom biopelculas de tuberas de agua potable y realiz enriquecimientos con cidos
haloacticos (AHA), cuantificando degradacin de cido dicloroactico y tricloroactico. Asi mismo Viancha (2011)
realiz una identificacin por biologa molecular de estos microorganismos. A partir de estos estudios se observ que
las biopelculas de tanques de almacenamiento son capaces de degradar los cidos di y tricloroactico bajo
condiciones aerobias y que microorganismos como Xanthobacter sp y Raoultella sp seran parte de este proceso de
biodegradacin.
Debido a la ausencia de informacin respecto al rol de las biopelculas de redes de distribucin de agua potable en el
comportamiento de los THM en el sistema de agua potable, y teniendo en cuenta estudios anteriores sobre
degradacin biolgica de estos compuestos, el objetivo de este trabajo fue realizar un aislamiento y descripcin por
medio de microbiologa clsica y biologa molecular de los microorganismos anaerobios (i.e. metanognicos,
acetognicos y sulfato-reductores) presentes en tres biopelculas de diferentes redes de distribucin de agua potable
en Colombia, capaces de crecer con CF y con CF y cido actico (como compuesto primario).

Materiales y mtodos

La investigacin se realiz en cuatro etapas: viabilidad, muestreo y seleccin e identificacin de la presencia de

microorganismos acetognicos, metanognicos y/o sulfato-reductores, a partir de cultivos enriquecidos con
cloroformo y cido actico.

Viabilidad del ensayo

Debido a que no se han encontrado ensayos de degradacin de cloroformo con biopelculas de agua potable, y que en
estos consorcios se presentan condiciones aerobias y anaerobias, fue necesario evaluar el crecimiento microbiano en
CF como nica fuente de carbono.

G F E D C G F E D C
1 0.30
OD600 ( nm)
OD 600 ( nm)

0.8
0.20
0.6
0.4 0.10
0.2
0 0.00
Da 3 Da 10 Da 18 Da 3 Da 10 Da 14 Da 18
Figura 1 Resultados de medicin indirecta (turbiedad como medida de crecimiento bacteriano) de degradacin de
cloroformo en condiciones a) anaerobias (izquierda) b) aerobia (derecha)
Para ello se tomaron cinco biopelculas: G: Tubo hierro dctil 14; F: Tubo lateral de CCP; E Sedimento tubo
70 de CCP; D: Tubo hierro dctil 4; C: Tubo Manhole de CCP. El ensayo en condiciones aerobias fue
adaptado de Perz (2010). A 100 mL de medio mineral M9 con CF a 0.1 M se adicionaron 20 mL de biomasa
extrada, exceptuando el blanco. Para el escenario anaerobio se tomaron condiciones similares, pero en una cmara
anaerobia. La medicin de crecimiento de biomasa se realiz midiendo la absorbancia a 600nm (OD600) con un

3
espectrofotmetro (Thermo, AQUAMATE UV-VIS). Adicionalmente, se realizaron siembras en cajas con medio
R2A (Sharlau) y CF (0.1M). En la figura 1 se puede observar que existi un incremento considerable en todos los
valores de OD600 bajo las condiciones anaerobias, lo cual puede asociarse a un aumento en la biomasa asociado a la
degradacin del cloroformo. En presencia de oxgeno, no se obtuvo una variacin importante en el OD 600,
relacionado, tal como lo report Bouwer et al., (1981), al no consumo del cloroformo como sustrato. Lo anterior
determin que para su degradacin por microorganismos de biopelculas de agua potable las condiciones ms
favorables seran las anaerobias.

Muestreo y seleccin
Se tomaron muestras en redes de distribucin de tres municipios de Colombia (nombradas como A, B, H), de
acuerdo al protocolo utilizado por Prez (2010). Las redes en las cuales fueron muestreadas las biopelculas B
(tubera de asbesto cemento, AC) y A (tubera de hierro galvanizado) eran abastecidas por agua tratada por un
sistema completo convencional; mientras, la biopelcula H de tubera de AC distribua agua nicamente filtrada y
desinfectada. A partir del procedimiento desarrollado por Zhang et al., (2009), la biomasa fue extrada a cinco
biopelculas (se escogieron dos de las biopelculas del anlisis anterior debido a los buenos resultados presentados en
la medicin indirecta: C y D), removiendo el componente inorgnico (120 mL de medio M9 * 20 g de biopelcula; 3
minutos de sonicacin y 30 de decantacin); posteriormente se cultivaron en agar bacteriolgico al 3% con CF (100
g/L) grado analtico al 99% y cido actico (AA) grado analtico al 99% (5mgC/L-COT permitido en la red) como
compuesto primario. De acuerdo con los resultados obtenidos en esta etapa se escogieron tres muestras de
biopelculas, las cuales presentaron mejor crecimiento, para la caracterizacin microbiana.
Identificacin microbiana por microbiologa clsica
La identificacin microbiana se realiz en varias etapas:
- Identificacin por tcnica de nmero ms probable NMP a partir de las metodologas propuestas por Fernndez et
al., (2006), para microorganismos metanognicos y sulfato reductores, y la de Rieu-Lesme et al., (1996) para
acetognicos, por la tcnica NMP (AWWA, 2005). Las tres biopelculas se sometieron a una concentracin de 100
g/L de CF o a la mezcla de CF (100 g/L) y cido actico (12.5 mg/L) y fueron incubadas a 35C durante: dos
semanas para acetognicas; un mes para sulfato-reductoras y dos meses para metanognicas.
- Crecimiento en agar bacteriolgico: para el aislamiento se realizaron siembras de los tubos de NMP con
crecimiento positivo en agar al 3% suplementando con CF (100 g/L) y con CF(100 g/L) + AA(12.5 mg/L).
- Identificacin por tcnica de tincin de Gram y por pruebas bioqumicas: presencia de la enzima catalasa,
identificacin de motilidad (Sulfuro, indol y motilidad), fermentacin de azcares y produccin de sulfuro de hierro
(TSI, agar de triple azcar y hierro).
Identificacin molecular
Se realiz por medio de la tcnica de PCR. La extraccin de ADN se realiz a la biomasa de la biopelcula, a los
cultivos de las muestras de biopelculas enriquecidas con CF y AA, en los medios especficos, y a los
microorganismos obtenidos de los medios sin enriquecer. Se utiliz el ZR Soil Microbe DNA MiniPRep (Zymo
Research) siguiendo las instrucciones del fabricante. La amplificacin de ADN ribosomal 16s (bacterias), Archaea, y
gen dsrAB de sulfato reductoras se realiz a partir de los primers reportados por Dale et al., 2006, Skillman et al.,
2004, Lcker et al 2007. Se utilizaron dos controles positivos: Desulfovibrio vulgans y Metanosarcina sp donados
por la Unidad de Saneamiento y Biotecnologa Ambiental (USBA) de la Facultad de Ciencias de la Pontificia
Universidad Javeriana de Bogot (profesora Sandra Baena).

Anlisis y resultados

Muestreo y seleccin
El muestreo se realiz durante ocho meses. Los resultados de crecimiento en R2A para las cinco biopelculas
preseleccionadas con CF (100g/L), CF (100g/L) y AA (12,51mg/L) mostraron que no se present crecimiento en
las biopelculas D (hierro dctil) y H (AC) para AA+CF ni para CF, mientras que para las dems biopelculas C
(CCP), A (Galvanizado) y B (AC) si se present crecimiento de organismos heterotrficos. Por esta razn las
biopelculas A, B y C fueron las seleccionadas para la investigacin

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Identificacin microbiana por microbiologa clsica y molecular

Nmero Ms Probable (NMP): Para el caso de organismos metanognicos los resultados por NMP fueron de gran
dificultad. Por lo anterior, se realiz la identificacin de clulas por medio del microscopio Zeizz Primo Star y el
desplazamiento del tapn, para de forma indirecta detectar la presencia de organismos que produjeron biogs.
A partir de los resultados de NMP de las biopelculas sometidas a los medios selectivos sin ningn tipo de
enriquecimiento, se observ que las tres biopelculas presentaron crecimiento microbiano para los tres grupos
bacterianos (Figura 2). Cabe resaltar que las biopelculas A y B fueron las que mostraron mejores resultados, lo cual
se pudo deber al tiempo de extraccin de la muestras.

12000
ACETOGNICAS
NMP/100mL

8000
4000 METANOGNICAS

0
SULFATO-
A B C
REDUCTORAS
Biopelcula
Figura 2 Resultados de NMP para microorganismos metanognicos, acetognicos y sulfato-reductores
Los resultados para metanognicos no fueron concluyentes, puesto que el cultivo de microorganismos es bastante
complejo y no se pudo garantizar que los organismos cuantificados fueran tales. Las biopelculas enriquecidas
presentaron crecimiento tanto en CF como en CF y AA, para cada uno de los medios selectivos (Figuras 3), sin
embargo para los organismos acetognicos de la biopelcula C no se observ ningn tubo positivo en las diluciones
observadas, lo que lleva a pensar que no hay organismos acetognicos presentes en esta biopelcula, o que elementos
como el tiempo de extraccin podran haber debilitado a la riqueza de la biopelcula. En la biopelcula A (Figura 3)
se present un mejor crecimiento cuando la muestra estaba enriquecida con AA y CF que con solo CF, ya que el
cido actico es un sustrato importante en algunas especies de este tipo de organismos, lo que habra incrementado la
biomasa ms fcilmente que en condiciones de solo cloroformo, y posterior o paralelamente ayudado a reducir este
subproducto de desinfeccin. Por otra parte, en la biopelcula B no se vio diferencia entre ambos enriquecimientos.
Para el caso de AA y CF, esto pudo deberse a que existi cometabolismo, es decir que existieron cultivos mixtos de
organismos acetognicos donde mientras algunos tomaron como sustrato el cido actico otros usaron lo que estos
produjeron usndolo como fuente primaria, y de manera indirecta consumieron el cloroformo. Para el CF, las
bacterias acetognicas presentes en la biopelcula B no requirieron de la presencia de AA para incrementar la
biomasa y utilizar este compuesto como fuente de carbono. Estos resultados mostraron que aunque en los recuentos
iniciales las biopelculas A y B fueron similares (NMP/100 mL = 4700), bajo las condiciones de CF y CF+AA su
comportamiento estara estrechamente ligado con la diversidad y los factores que la modifican (i.e. la calidad del
agua, la concentracin de desinfectante, el material, entre otros), siendo el 32% y el 5% de la bacterias acetognicas
presentes en la biopelcula B y A respectivamente, capaces de utilizar el cloroformo como fuente de carbono.
Los microorganismos metanognicos y acetognicos no han sido reportados en biopelculas de agua potable. Sin
embargo estos organismos se han identificado en lodos y reactores de aguas residuales como degradadores de
compuestos clorados (Bouwer et al., 1981; Egli et al., 1987 y 1988; Mikessel & Boyd, 1990; Bagley & Gossett;
1995; Gupta et al., 1996b; Yu & Smith, 1997), por esta razn se busc dentro de estas biopelculas la posible
presencia de los organismos antes mencionados.
Los microorganismos presentes en los medios enriquecidos para bacterias sulfato-reductoras fueron los que mejores
valores arrojaron, reportando crecimiento en las tres biopelculas bajo las dos condiciones evaluadas. Esta situacin
puede deberse a que algunos organismos sulfato-reductores pueden ser facultativos soportando mejor las condiciones
de transporte y preservacin de las muestras (Madigan et al., 2010). Tambin se podra asociar al material de la
tubera de donde proviene la biopelcula. Herb et al., (1995) encontraron que bacterias del tipo Desulfobacter pueden
estar presentes en las biopelculas provenientes de tuberas corrodas de cemento; asimismo Tuovinen y Hsu (1982)
utilizando la tcnica NMP, determinaron que en los ndulos de las biopelculas de tuberas de hierro se almacenaba
este gnero por su alto contenido en minerales. Wang y Cullimore (2010) determinaron cmo las sulfato-reductoras,
denitrificadoras y relacionadas con hierro, deterioraban las tuberas de asbesto-cemento al ser estos organismos

5
comunes dentro de estas tuberas. Esto es comparable con lo desarrollado en esta investigacin debido a que las tres
biopelculas provienen de estos materiales.

CF AA+CF CF AA+CF
3000 12000
NMP/100mL

NMP/100mL
2000 8000
1000 4000
0 0
A B C A B C
Biopelcula Biopelcula
Figura 3 Resultados de NMP enriquecido para microorganismos acetognicos (izq) y sulfatoreductores (der)
En la figura 3 se observa que en la biopelcula B se present un mejor crecimiento en el medio enriquecido con solo
CF que con CF+AA. Esto podra indicar que los microorganismos que ac se encontraron no realizan
cometabolismo, es decir que puede que haya existido un solo tipo de organismo en el medio que no utiliz el cido
actico como sustrato, o que existieron varias especies de sulfato reductoras que no usaron el compuesto, solo
consumieron el cloroformo y de manera indirecta degradaron el cido actico lentamente. Este resultado estara en
contraposicin con lo reportado por Gupta et al., (1996a), quienes observaron que la degradacin de cloroformo se
daba mucho mejor en contacto con bacterias sulfato reductoras con cido actico como fuente de energa, con un
96% de eficiencia de transformacin. Por otra parte las biopelculas A y C mostraron que el 100% (11000 NMP/100
mL de 11000 NMP/100 mL) de las bacterias sulfato reductoras eran capaces de utilizar tanto el CF como el CF en
presencia de AA como fuente de carbono.

Identificacin por tincin de gram pruebas bioqumicas y molecular: A partir de las pruebas bioqumicas
realizadas se realiz una comparacin con el manual de Bergeys: Boone (2001), el libro Brock: Madigan et al.,
(2009) y Archaea: Molecular and celular biology: Cavicchioli (2007), para determinar los posibles gneros de sulfato
reductoras y acetognicas.

Sulfato reductoras: Para los organismos sulfato reductores (tabla 2) se limit la bsqueda en microorganismos que
han sido comprobados como dehalogenadores de tetra y triclorometanos y algunos que han demostrado presencia en
tuberas de distribucin de agua potable. Egli et al., (1987) encontraron que la bacteria Desulfobacterium
autotrophicum presentaba una buena tasa de degradacin del tetraclorometano (CCl4). En las biopelculas de las
tuberas de agua potable como se dijo, se han encontrado bacterias del tipo Desulfobacter (Herb et al., 1995),
asimismo, Rske et al., (2012) encontraron presencia de la familia Desulfobacteraceae, de donde pertenecen los
organismos nombrados anteriormente. Los organismos del gnero Desulfobacter (6 especies), hacen parte de la
familia Desulfobacterales; utilizan el acetato como donador de electrones, el cual es completamente oxidado a CO2.
Sulfato, sulfito y tiosulfato son utilizados como aceptor terminal de electrones y son reducidos a H 2S. La enzima
monxido de carbono dehidrogenasa (encargada de proceso metablico por va acetil CoA) se encuentra inactiva
(Boone, 2001; Madigan et al., 2009). Los microorganismos del gnero Desulfobacterium (3 especies) al igual que los
Desulfobacter provienen de la familia Desulfobacterales, y se caracterizan por su metabolismos respiratorio y
fermentativo; usan el formato, butirato, cidos grasos de gran tamao, cidos orgnicos, alcoholes y H2 + CO2 como
donador de electrones (estos se oxidan completamente a CO 2). El sulfato y otros compuestos oxidan el azufre a H 2S;
azufre y nitrato no son utilizados como terminal de electrones. El crecimiento en acetato y propionato es lento.
Algunas especies pueden crecer lento en ausencia de un aceptor de electrones. Poseen activa la enzima monxido de
carbono dehidrogenasa, lo que indica que la va anaerobia de esta enzima proporciona la oxidacin de acetil-CoA o
CO2 durante la fijacin en el crecimiento autotrfico (Boone 2001; Madigan et al., 2009).
Para estas aproximaciones se tuvieron en cuenta las caractersticas ms relevantes, puesto que para asegurar la
presencia del algn gnero se deben hacer ms pruebas bioqumicas, que garanticen la presencia de todas las
caractersticas de alguno de los gneros. A partir de esto, de manera muy amplia se puede decir que en las
biopelculas estudiadas estn presentes organismos sulfato-reductores, que estn documentados como degradadores
de cloroformo. La presencia de Desulfobacterium en la biopelcula B, soportara los resultados del NMP en los
cuales se dio un mejor crecimiento en condiciones de solo CF que con AA+CF, debido a su crecimiento lento en

6
acetato. Sin embargo, la similitud entre la biopelcula A y C por NMP bajo las dos condiciones, no podra ser
explicada por esta aproximacin al tipo de organismo, y debera llevarse a una identificacin por medio de
secuenciacin.
Tabla 2: Resultados de pruebas bioqumicas y posibles microorganismos sulfato reductores
SIM Tipo de organismo Gen
Muestra Morfologa TSI Catalasa SR
SR 16S
Motilidad H2S
Bacilos
A (CF) No 3 azcares1 NO Desulfobacter
Gram (-)
Bacilos
A (AA+CF) No 3 azcares SI Desulfobacter
Gram (-)
3 azcares y
Bacilos
B (CF) Si produccin NO Desulfobacterium
Gram (-)
de gas
SI positivo positivo
Bacilos 3 azucares y
B( AA+CF) Gram (-) y Si produccin NO Desulfobacterium
(+) gas
Bacilos 3 azcares
C(CF) Si NO Desulfobacterium
Gram(-)
Bacilos 3 azcares
C(AA+CF) Si NO Desulfobacterium
Gram(-)
3 azcares: indica la fermentacin de glucosa, lactosa y sacarosa
Metanognicas. Teniendo en cuenta que estos microorganismos no se pudieron cultivar adecuadamente, se sugiere
utilizar para otros estudios pruebas adecuadas tanto tradicionales como moleculares para corroborar la presencia de
metanognicas en las tuberas de agua potable. El PCR correspondiente a Archaea no amplific para las 6 muestras
aisladas bajo condiciones de metanognesis, lo cual corrobora en conjunto con los resultados de gen 16s, que los
organismos que estuvieron presentes en el medio NMP para metanognicos pertenecen al dominio Bacteria y no al
Archaea.
Acetognicos: Se realiz una comparacin con el gnero Acetobacterium, debido a que es el que han reportado como
degradador de cloroformo y compuestos similares (Egli et al., 1988). Adicionalmente, debido a que no se han
reportado organismos acetognicos en las tuberas de redes de distribucin de agua potable, se limit el anlisis solo
a este organismo. El gnero Acetobacterium se caracteriza por su morfologa de bacilos Gram positivos,
estrictamente anaerobios, y su temperatura ptima de incubacin esta cercana a los 30C y pH neutro. Utilizan
diferentes cidos grasos para la acetognesis (Madigan et al., 2009).
Tabla 3. Resultados de pruebas bioqumicas y posibles microorganismos acetognicos
Muestra Morfologa Catalasa Tipo de organismo Gen 16s
A (CF) Bacilos Gram (-)
A (AA+CF) Bacilos Gram (-) y (+) Acetobacterium
No Positivo
B (CF) Bacilos Gram (-)
B( AA+CF) Bacilos Gram (+) Acetobacterium
Dos de las muestras analizadas pueden ser del gnero Acetobacterium, pues cumplieron con las caractersticas
propias de este tipo de organismos; las muestras A (AA+CF) y B (AA+CF), fueron las que presentaron la morfologa
ms parecida (tabla 3), adems que en el medio de NMP tenan cido actico, un cido graso que las Acetobacterium
sintetizan durante la acetognesis. Sin embargo, al no contar con un control positivo de este tipo de organismo no fue
posible desarrollar la PCR. A los microorganismos de las muestras metanognicas y acetognicas no se les hizo
anlisis del indol, puesto que no se present un crecimiento importante.
Ruta metablica degradadoras de CF en la biopelcula
La forma en que se ha encontrado la degradacin de compuestos como el CF es por medio de un co-metabolismo
(Egli et al.,1988; Bagley and Gossett 1995; Gupta et al., 1996 a,b; Yu and Smith 1997). Es decir, que los

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microorganismos trabajan mejor juntos, puesto que tienen rutas metablicas, sustratos y productos diferentes que
pueden ser tomados por los otros microorganismos como sustrato (Capelleti et al., 2012). Es por esto que si los tres
tipos de microorganismos se hubieran encontrado juntos la ruta metablica del cloroformo y los resultados
probablemente hubieran sido diferentes. Sin embargo, era necesario primero determinar la presencia de estos grupos
microbianos por separado para observar si eran capaces de sobrevivir en presencia del cloroformo, lo cual se
comprob en esta investigacin (a excepcin de los metanognicos). Debido a lo anterior la degradacin del
cloroformo podra presentarse en una tubera de agua potable, ya que al ser la biopelcula una matriz de diversidad
microbiana de todo tipo de aceptores, es de esperar que alguno tome el cloroformo y lo empiece a metabolizar.
Aunque antes de afirmar esto, es necesario hacer una prueba de cintica de degradacin con estos microorganismos
para evaluar la tasa de dehalogenacin del cloroformo. Adems se debe corroborar si por difusin el cloroformo
llega a la parte ms interna de la biopelcula para que sea degradado. A partir de ello se plante una posible ruta de
degradacin por medio de un cometabolismo de los tres tipos de microoganismos sulfato reductores, acetognicos y
metanognicos, donde los organismos sulfato reductores al ser posiblemente facultativos toman parte del cloroformo
en la fase anxica/xica de la biopelcula y lo metabolizan de tal forma que llegue a clorometano el cual ser
utilizado por organismos acetognicos como fuente primaria, que toman el grupo metilo transformndolo por la ruta
acetil CoA a acetato (WohIfarth & Diekert, 1997); este a su vez, sera tomado como fuente de carbono primario por
parte de los microorganismos metanognicos que lo sintetizaran a otros compuestos que serviran como fuente de
carbono para algn grupo de los microorganismos anaerobios presentes en la matrz. En condiciones aerobias es
posible que exista degradacin del cloroformo a una tasa muy baja, (18%) como el caso encontrado por Whaman et
al., (2006), por medio de cultivos nitrificantes. A partir de esto se podra plantear que en la matriz microbiana el
cloroformo podra ser inicialmente tomado por estos organismos, que al seguir con su difusin en la biopelcula
continuara con el proceso explicado previamente. Se propone un proceso de dehalogenacin reductiva hasta llegar a
clorometano, donde luego por medio de enzimas de las bacterias acetognicas se realiza una hidrlisis tomando el
grupo metilo y sintetizndolo por la ruta acetil-CoA. Sin embargo, Capelleti et al., (2012) han encontrado que el
cloroformo tambin podra degradarse por medio de hidrlisis enzimtica, similar a lo planteado por Prez (2010) y
Viancha (2011) en la degradacin aerobia de los cidos cloro acticos, desde el inicio o por medio de
dehalorespiracin.

Conclusiones

Se comprob la presencia de organismos anaerobios que son capaces de crecer en medios especficos enriquecidos
con cloroformo y cido actico, los cuales al ser sometidos a pruebas bioqumicas y moleculares confirmaron la
presencia de bacterias acetognicas y sulfato reductoras en las tuberas de agua potable. La metodologa NMP para
microorganismos metanognicos aunque es muy utilizada no garantiza la especificidad de este tipo de organismos,
debido a la dificultad de su cultivo. Dentro de las biopelculas analizadas se encontraron bacterias en el medio
acetognico y deltaproteobacterias en el medio sulfato reductor. Sin embargo, respecto a los microorganismos
metanognicos no se puede asegurar su presencia en las biopelculas analizadas, ya que aunque en el medio NMP se
present crecimiento, en lo referente a la identificacin por biologa molecular se encontr que no eran del Dominio
Archaea. Las rutas metablicas para la degradacin de cloroformo propuestas tanto en condiciones individuales
como en condiciones mixtas, son las esperadas tanto en los medios NMP como en las tuberas de agua potable
debido a la disponibilidad de los metales esenciales para la sntesis enzimtica de los corrinoides, la F430 y las
ferrodoxinas.

Agradecimientos

Profesora Sandra Baena y Departamento de Ingenieria Civil y Ambiental de la Universidad de los Andes

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