Informe N2

Identificacin de cepas bacterianas, gentica

molecular bacteriana y estudio de levaduras y
hongos filamentosos

Nombre: Chrstian Ignacio Muoz Valverde

Profesor: Dra. Breatriz Dez
Instructor: Mara Estrella Alcamn
Ayudante: Miguel Len
Seccin: 02
Mesn: 03
Fecha de entrega: 16 de Noviembre del 2016
 Introduccin y objetivos

Como continuacin del informe anterior, el presente informe recopil a partir de los
resultados obtenidos por la batera bioqumica convencional y del API 10S que tiene un
enfoque ms amplio, pero permite una identificacin ms rpida [1], provenientes del
prctico n3, que se utilizaron para revelar la identidad de las muestras problema, tambin
provenientes del prctico anterior.

El siguiente trabajo prctico se centr en gentica molecular bacteriana, primeramente con

el objetivo de reconocer como acta un bacterifago ltico, que al infectar a la clula
termina por destruirla al final del ciclo de multiplicacin. Posteriormente se observ la
capacidad metablica de bacterias infectadas, por lo que se recurri a observar el
comportamiento al ser sembradas en agar Evans azul [3], agar comnmente utilizado para
identificar la cantidad de patgenos presentes en las colonias.

Los siguientes pasos de los que constituy el prctico n4 fueron centrados haca la
movilizacin de informacin gentica. Primero mediante la mediacin de un fago que fue el
encargado de movilizar el material gentico, este proceso es conocido como transduccin
[2]
. En segundo lugar se analiz el como una clula procariota transfiere material gentico a
otra clula procariota para ello debe existir las expresin de pilis en las clula, fenmeno
denominado conjugacin. Finalmente se trat la variacin mediante mutagnesis, en donde
se trat de forzar la mutacin de una bacteria al ponerla junto a un fago temperado en un
medio a la espera de que se forme [3]

El siguiente y ltimo trabajo prctico consisti en un estudio de levaduras y hongos

filamentosos [4]. Para ello se analizaron muestras de hongos unicelulares y pluricelulares de
forma macroscpica, mediante el estudio de las colonias, tanto como de forma
microscpica, mediante el estudio en el microscopio de varios tipos de tincin. Para as
familiarizarse con las caractersticas que poseen este tipo de eucariontes. Los hongos
utilizados fueron Cryptococcus, Rhodotorula, Mucor, Penicillium notatum y Aspergillus
niger. Cryptococcus es una levadura, pudiendo formar blastoconidias [5]. Mucor, es un
hongo dimrfico que en ausencia de oxgeno se comporta como levadura [7].
Materiales y mtodos

A continuacin se detallarn los materiales que no estuvieron explcitamente listados en la

gua del prctico. Tambin, en el caso de existir, sern sealados los cambios en la
metodologa

Practico 4: Gentica molecular bacteriana

Materiales y reactivos:

- Mechero Bunsen
- Asas de hierro
- Pipetas Pasteur
- Tubo de ensayo con caldo corriente
- Tubo de ensayo con agar corriente liquido
- Tubos Epprendorf
- Micropipetas

Mtodos:

Se realizaron los procedimientos descritos en la gua de trabajos de microbiologa

Prctico N5: Levaduras y hongos filamentosos

Materiales y reactivos:
- Mecharo Bunsen
- Asas de hierro
- Microscopio
- Portaobjeto
- Cubreobjeto
- Aceite de inmersin
- Set de tincin Gram
- Azul de lactofenol
- Tinta china

Muestras de trabajo:

- Candida albicans
- Rhodotorula sp.
- Cryptococcus neoformans
- Aspergillus niger
- Mucor sp
- Penicillium notatum

Mtodos:

Se realizaron los procedimientos descritos en la gua de trabajos de microbiologa.

 Resultados:

Los resultados provenientes del prctico n3 que consisti en revelar los resultados de las
bateras bioqumicas (Tabla I)

Tabla I. Resultados obtenidos en la batera bioqumica para la muestra 19.

Glu Man Sorb Cit Urea Ind VP RM Pig TSI LIA Mot H2S

Muestra AG - - - - + - + - A/A + (+) -

problema
19

Muestra AV - - V + + - + - A/A - + +
problema
22

Simbologa: AG; cido-Gas / AV; cido variable / +; Positivo / -; Negativo / (+); Generalmente positivo / V;
Variable / A/A; Fermentacin tres azucares / Glu; Caldo glucosado en campana / Man; Agar Manitol / Sorb;
Caldo sorbitol / Cit; Agar Citrato / Ind; Caldo corriente / VP; Caldo de Voges-Proskauer / RM; Reaccin rojo
de metilo / Pig; Agar corriente / TSI; Agar TSI (Triple Sugar Iron) / LIA; Agar LIA (Lysine Iron Agar) / Mot;
Agar MIO

Con los resultados de la batera bioqumica se identific a la muestra 19 como Escherichia

coli y a la muestra 22 como Proteus vulgaris.

Los resultados del API fueron Escherichia coli para la muestra 19 y para la muestra 22
result en una lectura no interpretable.

Para el prctico n4 en los pasos 1 y 2 se midi la cantidad de lisis provocada por el fago
H5 en un medio con Salmonella typhimurium (Tabla II)
Tabla II. Presencia de lisis en distintas concentraciones de fago

Concentracin 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

de H5

Lisis - - - - - -

Simbologa: -; negativo

El fago de la muestra problema tampoco mostr indicios de lisis en S. typhimurium

El paso 3 del mismo prctico determin lo siguiente con respecto al crecimiento de ambas
colonias (Tabla III)
Tabla III. Caractersticas de las colonias infectadas con Fago 22 y Fago H5

Colonia Forma Color Elevacin

P22 Puntiforme Azul-Verdoso Plana

H5 Puntiforme Azul-Verdoso Plana

El paso 4 del mismo prctico busc la presencia de luminiscencia en el cultivo, que result
en negativo para nuestro grupo.

El paso 5 del mismo prctico realiz un cultivo dividido en 3 sectores dentro de la misma
placa (Agar corriente Cm:Kn) en donde se midi el crecimiento bacteriano frente a un
medio hostil (Tabla IV)

Tabla IV. Produccin de colonias en los distintos sectores de la siembra

Bacteria Crecimiento

Salmonella enteritidis ROD21::Kn Ligero

Salmonella enteritidis ROD21::Cm Ligero

Mezcla de ambas bacterias Prominente

El paso 6 del mismo prctico buscaba el crecimiento de Salmonella typhimurium en un

medio hostil (Agar McConkey:Kn) mediante mutacin mediada por el profago MudJ,
finalmente el cultivo que no present rastro de colonias.

Para el prctico n5 se analizaron una serie de muestras que se clasificaron segn sus
caractersticas macroscpicas y caractersticas microscpicas que fueron divididos en dos
grupos, hongos unicelulares (Tabla V) y hongos pluricelulares (Tabla VI)
Tabla V. Carcteristicas macroscpicas y microscpicas de las muestras unicelulares.

Muestra Caractersticas Macroscpicas Caractersticas Microscpicas

Candida albicans Color blanco / textura cremosa / Clulas ovoides / No se aprecia

elevacin leve / bordes lisos una agrupacin definida

Rhodotorula sp. Color rosado / textura cremosa / Clulas ovaladas / No se aprecia

elevacin leve / bordes lisos una agrupacin definida

Cryptococcus neoformans Color blanco / textura cremosa / Clulas circulares / No se aprecia

elevacin leve / bordes lisos una agrupacin definida /
Presencia de capsula

Tabla VI. Caractersticas macroscpicas y microscpicas de las muestras pluricelulares.

Muestra Caractersticas Macroscpicas Caractersticas Microscpicas

Aspergillus niger Color negro / textura pulverulenta Se observa la Cabeza Aspergilar y

/ reverso amarillo-crema sus conodioforos e incluso lneas
de esporas sueltas.

Mucor sp. Color blanco / textura de algodn Se observa la presencia de

/ reverso blanco esporangios y un poco de
esporangioforo.

Penicillium notatum Color verde-azul / textura Se observan estructuras

aterciopelada / reverso amarillo y semejantes a fiales y conidios.
rugoso

Discusin:

Con respecto a los resultados obtenidos en la Tabla I especficamente en la muestra 19 los

resultados en manitol y sorbitol no concuerdan con los resultados para E. coli que debido al
metabolismo de la bacteria debera fermentar ambos productos. Con respecto a la
discordancia de resultados entre la batera y el API para la P. vulgaris lo ms probable es
que se haya debido a algn tipo de contaminacin o similar.

Los resultados provenientes del prctico n4 presentan una serie de cambios con respecto a
lo esperado, primeramente los resultados de la Tabla II seala que no hay presencia de
lisis, a pesar de haber sido administrado el fago H5 que es de carcter ltico [7]. Esto se
puede explicar por el paso del tiempo, el cual permiti a la bacteria formar colonias
nuevamente. Por lo tanto no se logr identificar la naturaleza del fago, tambin hay que
sealar que este error con respecto a la teora se puede deber por una baja concentracin
del fago o una muerte de la bacteria cuando se mezcl con el agar blando.

Los resultados de la siguiente parte del prctico n4 correspondiente al metabolismo

bacteriano (Tabla III), se observa una cantidad predominante de colonias azul-verde
oscuro, que son signo de que hubo lisis, ya que sta acidifica el medio, provocando la
oscuridad de las colonias [8]. Adems se observa un color levemente ms claro en la colonia
con presencia de P22, esto se debe al carcter lisognico del fago, que seguramente se deba
al paso del tiempo, ya que seguramente si se analiza el cultivo con un tiempo menor la
diferencia de color debera ser ms notoria debido a la baja cantidad de lisis.

En relacin con los resultados que tienen relacin con la transduccin de plsmidos, en el
experimento que nuestro grupo realiz no result efectiva la luminiscencia, pero analizando
los resultados de un grupo vecino efectivamente s se logr expresar el fago P22/pkkGFP,
teniendo el error pudo haber ocurrido en las disoluciones de las especies involucradas.

Analizando los resultados que involucran esta vez a la seccin de movilizacin de

plsmidos por conjugacin (Tabla IV), los resultados concuerdan con lo terico debido a
que efectivamente se producen colonias en el sector de la mezcla y adems la mezcla crece
en los cultivos que se le practicaron por separado. Sin embargo, tambin se observan
colonias, aunque en menor cantidad, de los reactantes separados que se puede deber a una
contaminacin entre los sectores que tambin transfirieron la resistencia al Agar Cm:Kn o
que debido al tiempo las colonias lograron transferir sus genes por toda la placa
adquiriendo la resistencia de sus vecinos.

En la parte final de este prctico n4 se busc la generacin de mutagnesis, no s observ

presencia de colonias por lo tanto se deduce que no hubo la mutagnesis esperada que le
diera resistencia a la S. typhimurium frente al antibitico administrado en el agar.

Por ltimo, con respecto a la morfologa de hongos, todos los resultados

coincidieron con lo esperado, logrando identificar estructuras como esporangios,
conidios y las hifas en el caso de los hongos filamentosos. Y estructuras muy similares a las
presentadas en la gua del prctico en el caso de las levaduras.
Conclusin:

Recopilando los resultados mostrados a lo largo de todo este informe se puede

concluir que la identificacin de una bacteria puede ser efectiva tanto con el uso de una
batera convencional bioqumica o un test API, con resultados ms claros en el API siempre
y cuando se realice de forma adecuada el test.

Se logr observar que existen mtodos para modificar la estructura genmica de una
bacteria y de esta forma otorgarle componentes o cualidades que antes no era capaz de
expresar por si misma

Finalmente en relacin al estudio que se realiz en hongos, se identific claramente

las diferencias entre hongos filamentosos y levaduras, desde sus formas y estructuras
macroscpicas que pueden ser observadas a simple vista, hasta estructuras y organizaciones
que requieren de un microscopio para lograr ser estudiadas.
Bibliografa

1. - Microbiology Laboratory Theory and Application, Brief Edition! Laboffe,

M.J, Pierce, B.E, 2a edicin, Morton Publishing, 2012, pg 475.

2. - Biology of Microorganisms. Madigan, M.T, Martinko, J.M, Stahl, D.A y Clark, D.P,
13 edicin, Mc Graw-Hill, 2012, pg 273

3. Bacteriologia diagnstica. Rojas N., Chaves E., Garca F., Universidad de costa rica
Facultad de microbiologa, 2006, pg 23

4. - Referencia 2, pgina 286

5. - Microbiology: an introduction. Tortora G. J, Funke, B. R, Case, C. L, 11 edicin,

Pearson, 2013, pg 4

6. - Referencia 2, pgina 335

7. - Mucor dimorphism, Orlowski M, Microbiol Rev, 1991

8. - The Bacteriophages, Calendar, R, 2a edicin, Oxford University Press, 2006, pg.

457

9. - Curing bacterial cells of lysogenic viruses by using ucb indicator plates, Bochner,
B.R, Biotechniques, 1984