Bacillus anthracis

Ligera Referencia Histrica:

Fue el primer microorganismo que se relacion con enfermedad al ser aislado de la

sangre de ovejas con ntrax en 1850 y luego aislado en cultivo puro por R. Koch en
1877. En 1881, Pasteur realiz el primer ensayo de inmunizacin empleando bacilos
atenuados por crecimiento a 42 C en cabras y ovejas, que luego fueron inoculadas con
cepas virulentas, demostrando la proteccin conferida.

Caractersticas Macroscpicas y Microscpicas:

Se comporta como anaerobio facultativo, pero es esporognico en aerobiosis. Se le

considera no exigente, por lo que crece bien en agar con 5% sangre cordero a 35-37C
por 24 h, con o sin CO2. Las colonias son grandes, de 2-5 mm, blancas o grises con
apariencia seca como "vidrio molido" (Figura 1). Posee bordes irregulares lo que se
conoce como morfologa "cabeza de medusa". Se unen fuertemente al agar y no son
hemolticas, lo que las diferencia de Bacillus cereus. Al microscopio se observan como
bacilos rectos grampositivos de gran tamao (1 x 3 a 8 ), dispuestos de manera
independiente o en cadenas largas. En la tincin de Gram o en frotis con tincin verde
de malaquita de cultivos en CO2, pueden observarse esporas redondas en posicin
central o subterminal sin deformar el cuerpo bacteriano. La cpsula puede ser
evidenciada principalmente en condiciones in vivo y con uso de tincin de contraste
como la tinta china.
Las clulas tpicas miden 1 3-4 m, tienen terminaciones cuadradas y se disponen
en largas cadenas. Poseen esporas centrales que no se observan en microorganismos
aislados de animales vivos y son inmviles. En frotis de tejidos infectados aparecen
como organismos aislados o en cadenas cortas. Debido a su elevado potencial
infectivo, sus esporas pueden utilizarse como arma biolgica en forma de aerosol, y
estn incluidos en la lista de agentes potenciales de bioterrorismo (categora A,
agentes de alta prioridad).

Distribucin:

Aunque el ntrax puede encontrarse globalmente en zonas templadas, es ms comn

en pases con programas de salud pblica menos estandarizados y menos eficaces.
reas que actualmente figuran como de alto riesgo son Amrica del Sur, America
Central, Europa Meridional y Oriental, Asia, frica, el Caribe y Oriente Medio.
En Per, en relacin a los aspectos de ntrax o carbunco, cabe sealar que en nuestro
pas en la dcada de los 80 se reportaba 400 casos al ao bsicamente en reas
rurales (agrcolas) de Ayacucho, Cajamarca, Huancavelica, Arequipa, Ica y Lima.

Viabilidad, Propagacin y Transmisin:

Reservorio:
Bovinos, ovinos, caprinos, equinos, porcinos, suelo, agua.

Hospedadores:
Humanos, bovinos, ovinos, caprinos, equinos, porcinos, aves.

Dosis Infectiva Mnima (DIM):

 8.000 a 50.000 esporas por inhalacin.

Supervivencia Ambiental:
Cuando las formas vegetativas de la bacteria se exponen al oxgeno del
aire, se forman endosporas centrales (esporas) que pueden sobrevivir
durante 2 aos en el agua, 10 aos en la leche y durante dcadas en el
suelo y en productos animales como lana, hebras de seda o cuero seco o
procesado.

Formas de Resistencia:
Las esporas son muy resistentes al calor, a la desecacin, a la radiacin
solar y a muchos desinfectantes.

Mecanismo de Propagacin y Transmisin:

La transmisin se produce principalmente por cortes, pinchazos, o por
contacto directo de la piel lesionada con suelo contaminado con las
esporas, o con tejidos, pelo, lana, pieles y productos procedentes de
animales infectados (principalmente herb- voros), tales como cuero o
harina de hueso. Tambin puede producirse por la picadura de insectos
que se alimentan de la sangre de animales infectados o de sus
cadveres. Otros mecanismos de transmisin son la inhalacin de
esporas procedentes de productos de animales infectados y la ingesta
de carne cruda o poco cocinada contaminada con las esporas. La
transmisin de persona a persona es extremadamente rara.

Vas de Entrada:
Parenteral o Cutneo: Representa el 95% de los casos registrados.
Respiratoria: Adquirido por inhalacin de esporas y representa el 4%.
Digestiva: Es rara y su contagio deriva de la ingesta de carne animal
contaminada; representa el 1% de casos registrados.

Actividades Laborales Riesgosas:

Agricultura, silvicultura (cuidado de cultivos y explotacin de bosques), y
jardinera. Actividades en contacto con animales o con sus productos.
Procesado, conservacin de carne y elaboracin de productos crnicos
(despojos, triperas, sebos, grasas). Fabricacin de productos para la
alimentacin animal. Actividades sanitarias y laboratorios.

Identificacin y Diagnostico:

La identificacin clnica de B. anthracis encapsulado se realiza mediante frotis

de sangre o de tejidos de cadveres frescos infectados de carbunco, y el
crecimiento del organismo se observa en placas de medio slido con sangre, no
resulta muy complicado y est al alcance de la mayora de los laboratorios de
bacteriologa. Puede haber cierta dificultad en el caso de cerdos y carnvoros
en los cuales la bacteriemia terminal no es muy marcada, o en animales que
recibieron antibiticos antes de morir.

a) Muestras Frescas
 Visualizacin de la Cpsula

Como se ha descrito anteriormente, ha de buscarse el B. anthracis

encapsulado y virulento presente en tejidos, sangre y otros fluidos del
cuerpo de los animales muertos por carbunco en los frotis de estas
muestras que se han secado, fijado en alcohol absoluto durante 3
minutos y teido con azul de metileno policrmico (reaccin de
M'Fadyean) o tincin de Giemsa. La cpsula se colorea de rosa,
mientras que las clulas del bacilo se tien de azul oscuro. Las
clulas se encuentran en pares o en cadenas cortas y a menudo
terminan como cortadas a bisel (las cadenas a veces parecen un
conjunto de coches del tren -la llamada apariencia en "furgn de
ferrocarril"). La tincin de Gram no revela la cpsula. Es importante
recalcar que la cpsula no se presenta en B. anthracis cuando crece
aerbicamente sobre agar nutritivo o en caldo nutritivo, pero puede
observarse cuando la bacteria virulenta se cultiva durante unas
pocas horas en unos mililitros de sangre (la sangre desfibrinada del
caballo parece ser la que mejor funciona). Alternativamente, la
cpsula se induce cuando B. anthracis virulento se cultiva en medio
de agar nutritivo que contenga 0,7% de bicarbonato sdico y se
incuba en presencia de CO2 (20% es ptimo, pero tambin sirve una
jarra de anaerobios). La solucin se vierte despus en placas Petri. B.
anthracis encapsulado formar colonias mucosas y la cpsula se
puede visualizar haciendo frotis finos sobre portas de microscopio,
fijando y tiendo como antes con azul de metileno policromtico.

Azul de Metileno Policromtico (tincin de M'Fadyean)

Se ha encontrado que las tinciones que dan reaccin positiva con

cultivos de B. anthracis cultivado artificialmente en sangre de caballo
no dan a veces resultados positivos en el campo. La preparacin
comercial de tincin de azul de metileno policrmico (M'Fadyean) es
cada vez ms difcil de obtener (debido al tiempo de maduracin, es
un ao con exposicin ambiental ocacional).
Para hacer frotis para tinciones, solo se necesitan gotitas de sangre o
fluido del tejido, y es mejor un frotis pequeo. Despus de fijarla en
etanol y secarla, una gota de colorante se coloca sobre el frotis y se
extiende sobre l con un asa de cultivo. Despus de 1 minuto, el
colorante se lava con agua, se empapa el exceso, se seca al aire y se
observa inicialmente usando una lente con un objetivo de 10x bajo el
cual las cadenas cortas aparecen como cabellos pequeos; una vez
encontradas, se pueden observar con aceite de inmersin (1.000x)
para buscar la presencia de la cpsula rosa rodeando los bacilos
teidos de azul/negro.

Identificacin Mediante Cultivo en Placa

Bacillus anthracis crece fcilmente en la mayora de los tipos de

medios slidos nutritivos, aunque el medio de diagnstico que se
suele escoger es medio slido con sangre de carnero, caballo o
 conejo. Se le agrega polimixina para suprimir el desarrollo de
bacterias contaminantes. La sangre es el material clnico primario
para someter a examen. Frotis de sangre, de otros fluidos del cuerpo
o tomados de incisiones en tejidos u rganos se pueden sembrar por
extensin sobre placas de medio slido con sangre.

Caractersticas de las Colonias despus de 18 -24 hrs de incubacin:

- Colonias con un color entre blanco grisceo y gris.
- Con un dimetro entre 0,3-0,5 mm.
- No hemolticas.
- Con una superficie hmeda traslcida.
- Muy pegajosa cuando se toma con un asa de cultivo debido a la
presencia de cpsula.
- Se aprecian rastros y manojos prominentes de crecimiento hacia
la colonia de origen, todos en la misma direccin, esto es comn
mente denominado como cabeza de medusa.

Para la confirmacin de B. anthracis se puede llevar a cabo slo

demostrando la presencia en el cultivo con sangre de un bacilo
encapsulado, formador de esporas y Gram-positivo. Se puede
determinar la ausencia de movilidad como una prueba adicional.

Susceptibilidad de B. anthracis al Bacterifago Gamma

El procedimiento para la prueba es simplemente sembrar en estra

una lnea con el organismo sospechoso sobre una placa con medio
slido nutritivo o con sangre, o en una porcin de una placa (se
pueden llevar a cabo varias pruebas sobre una placa), y colocar una
gota de 10-15 l de la suspensin del fago sobre una parte del rea
sembrada y colocar un disco de penicilina de 10 unidades en el otro
lado. Se debe dejar que la gota de la suspensin del fago penetre e
incubar la placa a 37C.

Resultados: Si el cultivo es B. anthracis, el rea bajo el fago estar

desprovista de crecimiento bacteriano, debido a la lisis, y una zona
clara se podr ver alrededor del disco de penicilina despus de
incubacin durante la noche. (Nota: muy ocasionalmente se
encuentra aislados de B. anthracis resistentes al fago).

Identificacin mediante PCR

El ADN molde para PCR se puede preparar desde una colonia fresca
de B. anthracis sobre agar nutritivo por resuspensin de la masa de
crecimiento que se recoge con un asa en 25 l de agua estril
desionizada. Los cebadores adecuados son especficos para confirmar
la presencia de los plsmidos pX01 y pX02.

b) Identificacin del Agente en Muestras Antiguas o Descompuestas,

Materiales Procesados y Muestras Ambientales, Incluyendo Suelo
Estas muestras contienen con frecuencia contaminantes saprofitas que
inhiben y obscurecen el crecimiento de B. anthracis en medios slidos no
selectivos. Se sugiere un procedimiento especial:
i) La muestra se mezcla con dos volmenes de agua estril
destilada o desionizada y se coloca en un bao de agua a
62,5 0,5C durante 15 minutos.

ii) Se preparan diluciones decimales de 10-2 o 10-3. De cada

dilucin se siembran 10-100 l en medio slido con sangre y
250-300 l en medio slido PLET (polimixina, lisozima, EDTA
[cido etiln diamino tetraactico], acetato talioso) (8,14).
Todas las placas se incuban a 37C.

iii) Las placas de medio slido con sangre se examinan para la

aparicin de colonias tpicas como se ha descrito
previamente despus de la incubacin durante toda la
noche, y las placas con medio PLET se examinan despus
de 40-48 horas. La confirmacin de la identidad de colonias
sospechosas de B. anthracis se lleva a cabo como se
describi anteriormente.