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2. Southern Blot
Inventado Edwin Southern
O mtodo de blotting consiste em utilizar a propriedade permevel do gel de agarose
(electroforese) de forma a transferir o DNA para uma membrana
Etapas:
1. Tratamento do DNA genmico com enzimas de restrio (endonucleases do tipo II)
2. Separao dos fragmentos de DNA por electroforese em gel de agarose
3. Tratamento do gel e transferncia dos fragmentos de DNA do gel para um filtro de
membrana de nitrocelulose atravs de difuso capilar (regio de maior potencial hdrico
para uma regio de menor potencial hdrico)- blotting
a. Depurinao tratamento cido reduz o tamanho dos fragmentos do gel
para mais facilmente serem transferidos para a membrana
b. Desnaturao tratamento alcalino para desnaturao do DNA obteno
de ssDNA para posterior hibridao
c. Neutralizao O DNA no retido no filtro de nitrocelulose a pH=9.0
Estabilizao da Molcula
d. O gel, no final, deve ser pulverizado com brometo de etdeo de forma a
confirmar que a maioria do DNA foi transferido para o filtro.
e. Depois do filtro secar ao ar, coloca-se entre duas folhas de papel de 3mm e
aquece-se a 80C, num forno de vcuo, durante 2h ou expem-se a radiao UV
para a imobilizao do DNA no filtro
4. Hibridao entre os fragmentos de DNA e a sonda de DNA marcada com istopos
radioactivos
a. Lavagens com SSC para a remoo de sonda mal hibridada
5. Revelao do sinal que observado por uma radiografia e comparao com a fotografia
tirada ao gel de electroforese
Aplicaes:
Identificao de Polimorfismos alterao do padro de restrio do genoma
DNA fingerprinting baseados em regies repetitivas do genoma
Mapeamento gnico
Diagnsticos Pr natais: Identificao de mutaes genmicas especficas para doenas
hereditrias
Sntese de oligonucletidos:
Recorre-se a uma degradao de
Edman
Adquire-se uma sonda degenerada
a partir da sequncia peptdica
Depois de sintetizadas as sondas, estas deviam ser caracterizadas (por exemplo, atravs
da sequenciao, no entanto no fcil sequenciar este tamanho de sequncias)
Random Priming
Desnaturao da cadeia dupla de DNA.
So adicionados primers de oligonucletidos aleatrios.
Por fim, o fragmento Klenow pertencente DNA pol I adiciona novos nucletidos
marcados
Mtodo
1. PCR (para criar fragmentos com tamanho e quantidade adequado para analise SSCP)
2. Produtos double stranded de PCR so desnaturados por calor a 94C + agente
desnaturante (soluo alcalina)
3. Arrefecimento rpido em gelo (as molculas single strand no tm tempo para
annealing com outras mas formam uma estrutura secundaria estvel por reassociao ao
nvel de zonas com sequencias complementares previne a formao de dsDNA e
permite higher-order structures para formar fragmentos em cadeia simples)
4. Fragmentos separados por electroforese em gel de poliacrilamida no desnaturante.
Vantagens / desvantagens:
- Rpido, simples, cost-effective mtodo para deteco de mutaes
- Diferenas subtis podem ser difceis de detectar
- No revela o tipo ou posio da alterao da sequncia (Implica a utilizao de mtodos
complementares, tais como a sequenciao directa) para definir a sequncia que
responsvel pelo padro de mobilidade electrofortica alterado
Aplicaes:
Screening de mutaes pontuais e polimorfismos
Diagnstico de doenas hereditrias
Deteco de alteraes genmicas em clulas cancergenas
Filogenia (anlise de genes conservados)
Estudo da variao das sequncias de DNA mitocondrial numa determinada populao
5. dHPLC
6. Footprinting
Tcnica proposta por Galas e Schmitz em 1978.
Permite identificar as zonas onde uma protena reconhece e se liga a uma determinada
regio do DNA
o Utiliza-se este mtodo para analisar as funes de uma determinada protena (por
exemplo, factor de transcrio), ao se identificar as sequncias especficas a que
esta se liga.
o A ligao da protena ao fragmento de DNA protege essa zona da sequncia contra
a clivagem, impedindo a produo de fragmentos correspondentes.
Ocorrem duas reaces em paralelo: uma amostra de DNA sem protena ligada (controlo)
e uma amostra de DNA com uma protena ligada
Existem outros agentes de clivagem que podem ser usados alm da DNase:
Radicais hidroxilo :
Reagente qumico que
quebra a cadeia de DNA sem
estar dependente da
sequncia de base, isto ,
cliva todas as ligaes
fosfodister.
VANTAGENS: Uma vez que
to pequeno, ao
contrrio da DNase,
possvel clivar a molcula
de DNA mais prximo da
zona onde a protena est
ligada, sendo por isso,
uma tcnica mais precisa.
DESVANTAGENS: demora
mais tempo devido ao
tempo de reaco e de digesto.
Caractersticas da tcnica:
simples e rpida
permite identificar a presena de zonas de interaco de DNA com protenas
permite determinar a afinidade da ligao da protena com a sequncia de DNA e os seus
parmetros cinticos.
no permite identificar a sequncia especifica no DNA (tem de ser usado Dnase I
footprinting)
Na maior parte dos casos quer-se a primeira cadeia de cDNA o maior possvel e que
contenha a maior proporo de complementaridade com o RNA
Amplificao do cDNA atravs da reaco de PCR
Aplicaes:
Identificao de mutaes e polimorfismos em sequncias transcritas
Caracterizao da estrutura de genes ou da sua expresso
Desenvolvimento de sondas
Expresso de protenas
Propagao de vectores do cDNA, criando biblioteca de cDNA
Toma proveito da cauda poli-A natural do mRNA como primer para amplificao de PCR
Para gerar a extremidade parcial 3dos clones de cDNA, h transcrio reversa do mRNA,
usando o primer ncora QT, Q1-Q0 (oligonucletidos) que posteriormente fica integrado
no transcrito de cDNA
Amplificao realizada usando um primer contendo parte da sequncia Q0 que se liga
ao cDNA na extremidade 3 e um primer derivado do gene de interesse (GSP1).
Um segundo ciclo de amplificao utiliza primers nested (Q1 e GSP2). Diminuem a
possibilidade de formao de produtos inespecficos.
10. Re
al -
time PCR
Tcnica baseada na reaco de PCR (amplificao enzimtica em cadeia) monitorizada em
tempo real
Permite amplificar exponencialmente sequncias especficas de um pequeno fragmento
de DNA.
Real Time PCR Capacidade de:
Monitorizar o progresso da amplificao do DNA em tempo real;
Quantificar os produtos resultantes da amplificao
Tcnicas e
Mtodos
utilizadas:
Endonucleases
de restrio
cortam a dupla cadeia de DNA pelo reconhecimento de
sequncias especficas (exemplo: enzima HpaII que
sensvel metilao do DNA mas a MspI no e cliva em
regies metiladas).
o O resultado da digesto pode ser analisado
recorrendo a electroforese, PCR ou microarrays.
o Este mtodo limitado pois est dependente das sequncias de reconhecimento
das enzimas.
Imunoprecipitao - recorre a um anticorpo anti-metilcitosina que forma um
imunocomplexo com o CpGs metilados e sequncias com este complexo vo precipitar
enquanto que as ilhas CpG no metiladas permanecem no sobrenadante.
o A amostra purificada hibridao por microarray
o Esta tcnica requer grandes quantidades de gDNA e de anticorpo.
12. Pirosequenciao
Desenvolvida por Nyrn em 1987 para colmatar as falhas existentes na sequenciao
pelo mtodo clssico de Sanger
A pirosequenciao um tipo de sequenciao single-tube, no electrofortica,
baseada nas reaces acopladas de vrias enzimas, 3 na pirosequenciao de fase slida
ou 4 na pirosequenciao de fase lquida, para monitorizar a sntese de DNA.
A pirosequenciao mede a libertao de fosfato inorgnico (PP i) atravs da reaco
acoplada da luciferase. A luciferase cataliza a reao de oxidao da luciferina a
oxiluciferina com a libertao de luz que pode ser medida.
Limitaes da tcnica:
Sequncias com vrias repeties A taxa de incorporao errada de
(seguidas) de um nucletido nucletidos deve ser pequena
As enzimas tm de ser estveis A extenso deve ser sincronizada
Diluio na fase liquida
13. Imunoprecipitao da cromatina (ChIP)
Permite identificar as protenas associadas com regies especficas do genoma.
Estas associaes so cruciais para as vrias funes celulares vitais como a
transcrio de genes, replicao e recombinao do DNA, reparaes, segregao,
estabilidade dos cromossomas, progresso do ciclo celular e silenciamento
epigentico.
Recorre ao uso de anticorpos que se ligam s protenas que queremos estudar.
Podemos querer localizar histonas com modificaes covalentes especficas como
acetilao, fosforilao ou metilao.
Etapas do mtodo:
A tcnica envolve:
1. Construo de primers: um normal e outro mutante, ambos sense, complementares
aos alelos respectivos; e outro primer anti-sense complementar aos dois alelos.
A forma mutante refractria a PCR em DNA normal
A forma normal refractria a PCR em DNA mutante
Diagrama do extremidade 5 do
gene da globina mostrando as
quatro primers requeridos para a
reaco de ARMS. Electroforese
em gel de agarose de cinco
reaces de ARMS.[3]
Baixa eficincia
Ao longo do processo de evoluo, as clulas eucariticas tenderam a ter menores
taxas de eficincia de transfeco com o objectivo de proteger os seus
genomas de material exgeno.
As baixas frequncias de transfeco tornam necessrio o uso de marcadores, cuja
presena nas clulas ser um factor de seleco (fentipo). Na maioria das experincias
tm sido usados marcadores com funes enzimticas conhecida, tal como a timidina
cinase ou o gene da GFP. A realizao de In situ hybridization pode ser utilizada para
mostrar que as clulas transfectadas possuem o material integrado no genoma.
Resumo do procedimento:
Variantes da tcnica
Comet Assay Alcalino - facilita a deteco de quebras na cadeia simples, uma vez
que a pH alcalino o DNA desnatura
Comet Assay Neutro - facilita predominantemente a deteco de quebras na dupla
cadeia Em condies de lise alcalina e electroforese neutra, as caudas dos cometas
consistem em loops relaxados de DNA.
FISH Comet Assay O comet assay associado com o FISH extremamente
informativo para localizar cromossomas especficos ou regies dos cromossomas.
Comet assay com enzimas de reparao do DNA (mais especfico)
Marcao com BUdR (marcao de danos no DNA durante a replicao e deteco
com o anticorpo anti-BUdR marcao identificada nas caudas)
Aplicaes
Biomonitorizao ecolgica Organismos adequados podem ser utilizados em
combinao com o comet assay como biosensores para a avaliao da contaminao
do ambiente com compostos genotxicos
Testes de genotoxicidade avaliar a segurana de novos medicamentos ou outros
produtos qumicos
Nutrio avaliar o efeito de nutrientes ou micronutrientes ao nvel de dano do DNA
em humanos
Reproduo assistida determinar o grau de fragmentao do DNA em clulas
reprodutoras masculinas e prever resultados na fertilizao in vitro
Aplicaes:
Anlise quantitativa da metilao
Genotipagem de SNPs
Mutaes Somticas
Quantificao da expresso gnica
Anlise comparativa de sequncias
Construo de hbridos
Insero do segmento de DNA que codifica
a protena X e do segmento de DNA-BD
Gal4 num plasmdio.
Aquando a transcrio do plasmdio forma-
se a protena hbrida X-DBD, com o
domnio de ligao (DBD) anexado ao seu
terminal.
O mesmo procedimento usado para
construir a protena Y-AD (Activation
Domain).
Presena de genes de seleco, ex: TRP1 e LEU2.
Tem de se retirar o codogene de terminao para a sntese da protena de fuso
NOTA: Tranfeco: introduo de plasmdeos em clulas procariotas (bactrias) e
Transformao: introduo de plasmdeos em clulas eucariotas unicelulares (ex:
Saccharomyces Cerevisiae)
Aplicaes:
Testar interaces entre protenas conhecidas e/ou identificar protenas que interagem
com uma protena de interesse (in vivo).
Mapear interaces entre domnios especficos de protenas (Y-AD e X-DBD) que formam
um dado complexo.
Identificar aminocidos ou domnios intervenientes na interaco.
Determinar a funcionalidade da protena: manipulao de interaces numa tentativa de
entender a sua relevncia biolgica. Ex: Mutagnese in vitro e avaliao do efeito das
mutaes na interaco entre protenas.
Descoberta de agentes teraputicos: a identificao de um hbrido alvo e a
caracterizao das suas propriedades poder levar ao desenho de ligandos susceptveis
de interagirem com a protena de interesse.
20. siRNA
O dogma central uma pequena pea do puzzle na compreenso da expresso gnica
Ao longo dos ltimos anos foi descoberta uma lista de RNAs funcionais no-codificantes
(siRNAs e miRNAs)
A sua investigao dificultada por serem de pequeno tamanho, instveis
fisiologicamente e em muitos casos s se expressam em situaes de stress.
O dsRNA actua como agente desencadeador de silenciamento gnico. Pode ser produzido
por polimerizao do RNA a partir de um RNA molde ou por hibridao de transcritos que
se intersectam transposes).
NOTA: Nas clulas existem sensores que medeiam mecanismos de silenciamento sem
envolver um dsRNA desencadeador
siRNAs podem ser simultaneamente moldes e alvos, sendo um dos desafios das
pesquisas actuais compreender a regulao dos conjuntos de genes. Como resultado, um
nico RNA aberrante ou siRNA pode gerar vrios dsRNA que iro silenciar ainda mais
molculas alvo
Defesa eficiente contra invasores que replicam rapidamente como os vrus Na
defesa do genoma os processos de amplificao asseguram que molculas de RNA
derivadas de um transposo possam activar a via de silenciamento da cromatina
para suprimir as cpias de um elemento transponvel
Aplicaes Teraputicas:
RNAi distingue-se de outras tecnologias por usar a maquinaria celular para dirigir o
silenciamento especfico
21. Array de expresso
Arrays Tcnica de hibridao entre amostras de RNA provenientes de clulas do
organismo em estudo (target) com amostras de cidos nucleicos cuja sequncia
conhecida (probe) a fim de se proceder ao estudo do trasncriptoma.
Aplicao dos Microarrays:
1) Expresso gnica - identificao e anlise de padres associados expresso de
genes em dadas condies de doena
2) Identificao de genes - identificao e descrio de genes envolvidos em processos
fisiolgicos, patolgicos
3) Deteco de mutaes / polimorfismos
4) Comparao genmica
5) Microarrays utilizando protenas
Realizar mltiplos duplicados (para uma dada amostra nas mesmas condies)
Utilizar amostras de clulas/tecidos diferentes (da mesma espcie) para analisar a
parecena (ou no) dos resultados.
Aplicar as mesmas condies experimentais para vrias amostras diferentes.
mRNA is only an intermediate between DNA and protein. Post-transcriptional and post-
translational control play a major role in modulating protein expression.
22. Sequenciao de transcriptomas (RNA-seq)
Mtodo de alto rendimento que permite determinar directamente sequncias de cDNA a
partir de mRNA.
Baseia-se na sequenciao de DNA complementar (cDNA) ao mRNA, atravs de
tecnologias de sequenciao de DNA.
Mtodo desenvolvido para mapear e quantificar transcriptomas.
Processo:
1. Obteno da amostra de RNA (RNA
total)
2. Isolamento de RNA poliadenilado
3. Sntese de cDNA Transcrio Reversa
4. Fragmentao do cDNA (aco de
DNase)
5. Reparao das extremidades dos
fragmentos de cDNA A fragmentao
do cDNA pode produzir extremidades
coesivas que tm de ser convertidas em
extremidades abruptas
6. Ligao dos adaptadores aos
fragmentos de cDNA Os adaptadores
so oligonucletidos com sequncias especficas que vo permitir a posterior associao
dos primers de sequenciao.
7. Amplificao por PCR
8. Electroforese em gel de agarose Este passo
vai permitir a seleco das bandas
correspondentes aos fragmentos de cDNA de
tamanho desejado para posterior sequenciao.
9. Purificao dos fragmentos de cDNA
10. Sequenciao de DNA e anlise de dados
Aplicaes:
Identificar, caracterizar e catalogar transcritos expressos numa clula/tecido
especfico;
Determinar padres de splicing e estrutura dos genes;
Quantificar os nveis de expresso gnica de cada transcrito durante o desenvolvimento
e em condies fisiolgicas/patolgicas
Fig. 2. MicroRNA processing(Source: Addl. Reference1)
Mtodos de deteco:
Before Hibridao
it can participate in regulation, the miRNA needs to have some processing per-
Hibridao in situ usando
formed. uma
After the it issonda de LNA:
exported to theLocked nucleic
cytoplasm, acid loop is spliced off. The re-
the upper
sulting double-stranded RNA is separated, and
Um anlogo bi-cclico de RNA em que o oxignio 2 est ligado one strand is then
Fig.incorporated
ao carbono
2. Micro into
RNA pro a (So
cessing
protein complex called RNA induced silencing complex, or RISC. RISC target mRNA
4 atravs de
foruma ponte de
degradation, metileno
both Before it can
by guiding cleavage of the mRNA and by promoting participate
transport to a in
Possui uma grande afinidade para RNA e DNA e confere aos dmeros formed. After the it is expo
sulting double-stranded RN
(LNA-RNA) uma elevada estabilidade trmica, permitindo altas
protein complex called RNA
for degradation, both by gui
temperaturas de melting (>70C)
Usa-se um marcador ligado cadeia de LNA (ex.: DIG), para podermos posteriormente
detectar os locais de hibridao e vermos onde se encontram os miRNAs
Apresenta vantagem sobre PCR
Deteco atravs de nanoporos com auxlio da protena viral p19
Mtodos de Anlise
Podemos quantificar miRNAs atravs de processos como os
microarrays ou qRT-PCR (quantitive real time-PCR)
No entanto em ambos os processos torna-se necessrio um passo
inicial de trancrio reversa, em que convertemos o miRNA
em DNA para procedermos aos mtodos de anlise
24. Protemica
Protemica um metodo directo que permite identificar, quantificar e estudar as
modificaes ps-traducionais das proteinas de uma celula, tecido ou mesmo
organismos.
Principios Fundamentais da protemica:
Bioquimcos
Biofiscos
Bioinformticos
Interdisciplinaridade cientfica contribui para documentar a distribuio geral de
protenas da clula, indentificar e caracterizar protenas individuais de interesse.
Proteoma:
Conjunto de protenas expressas a nvel celular, em determinadas condies
especficas;
Depende do tipo de linhagem celular, etapa de desenvolvimento, estmulo ambiental,
nutricional, metablico, entre outros;
Um gene pode originar mltiplas protenas:
Alternative splicing;
Processamento e modifio proteca ps-traduo (clivagem peptidica,
acetilao, glicolisao, etc) ;
Genoma Fixo, esttico, constante;
Proteoma Dinmico, varivel:
Maior complexidade;
20 aminacidos diferentes;
Interaces electrostticas,hidrofbicas, pontes hidrognio, disulfureto;
Estrutura primria, secundria e terciria;
Colorao de Protenas:
Azul de coomassie
Nitrato de Prata
Marcao radioactiva
4. Espectrometria de Massa
baseia no movimento de ies em campos elctricos e magnticos para classific-los
de acordo com a sua relao massa/carga, produzindo um espectro e massas
Ferramenta analtica de medio do peso molecular (MW);
Concentraes picomolar
Preciso de 0,01% do peso total da amostra num polipptido de 40 kDa, h um erro
de 4 Da pode assim detectar substituies de aminocidos e modificaes ps-
traduo;
Informaao Recolhida:
Informaes estruturais
Amostra de fragmento e analisar os produtos
til para o sequenciamento de oligonucleotidos e pptidos
Identificao de componentes individuais em misturas complexas
Protemica Diferencial
- Compara diferentes perfis de protenas em situaes de interesse. Tem como objectivo
melhorar o contedo de informaes do estudo do proteoma;
Electroforese diferencial em gel (DIGE) Rotulao fluorescente para trs
populaes complexas de protenas antes de mistur-las e resolv-las
simultaneamente no mesmo gel
Usa steres de succinil de corantes de cianina (CY2, CY3 e CY5)
Multplex Proteome (MP) - determinao dos nveis de expresso de
protenas, sensveis a glicolisaes, com capacidade de ligao a drogas, ou
metabolizao das mesmas. Melhor que a DIGE porque d uma faixa de
informao muito superior
Utiliza fluorforos
Isotope-Coded Affinity Tags ICAT - reagente formado por 3 componentes
funcionais
Constituido por: Tiis , etileno-glicol, biotina