.

Universidad Aut
onoma de San Luis Potos
Facultad de Ciencias

Posgrado en Ingeniera Electronica

Dise
no y Construccion de un Sistema
Port
atil de Espectroscopia Raman para
Diagn ostico M
edico No-Invasivo.

Tesis que presenta:

L.I.E. Fernando Sebasti

an Chiwo Gonz
alez

Para obtener el grado de:

Maestro en Ingeniera Electr

onica con Orientaci
on en
Bioelectr
onica

Bajo la direccion de:

Dr. Francisco Javier Gonz

alez Contreras

San Luis Potos, S.L.P. - 26 de octubre de 2015

Dedicatoria.

Me gustara dedicar este trabajo a mis papas, Fernando Chiwo y Marilu Gonzalez, por
otorgarme todas la oportunidades para crecer como persona y superarme profesional-
mente, para ustedes, con mucho cari
no, amor, respeto y admiracion. A mi hermano
Daniel por estar siempre ah y brindarme su apoyo y grandes consejos, te admiro.
Muchas gracias, ustedes son aquellos a quienes mas quiero y amo.

Este trabajo, al igual que todos los trabajos y logros de mi vida, tanto profesionales
como personales, estan dedicados a la memoria de mis abuelos, Fernando Chiwo y
Carmela Ni
no. Les agradezco todas las ense
nanzas que me dieron y todos los valores
que me inculcaron mientras estuvieron conmigo. En donde quiera que se encuentren,
los amo abuelos.

Quisiera dedicar de manera muy especial este trabajo a mi novia Karla Lopez. Muchas
gracias por todo el amor, paciencia, comprension y apoyo incondicional que me has
brindado durante este difcil periodo. Ha sido maravilloso crecer junto a ti en esta
etapa de nuestras vidas, estoy muy orgulloso de lo que estamos construyendo juntos.
Eres la mejor y significas todo para mi, te amo de verdad.

Finalmente a todos mis amigos, por todo el apoyo que me han brindado, ustedes saben
quienes son. Y porque no... a Ryan Adams, Gary Moore y John Lennon por inspirarme
cuando mas lo necesito.

Muchas gracias a todos...Que la fuerza los acompa

ne siempre...
Agradecimientos.

Quisiera agradecer de manera especial a mi asesor, Dr. Francisco Javier Gonzalez Con-
treras por el incontable apoyo que me proporciono durante la elaboracion de este tra-
bajo, por el espacio que me brindo en el Centro de Ciencia y Tecnologa en Terahertz
(C2T2) y por todos los proyectos en donde me ha incluido. Sobre todo quisiera agrade-
cerle, por los grandes consejos profesionales y personales que me ha brindado. Muchas
gracias por todo Dr. Javier.

Agradezco de igual manera a todos mis compa

neros y amigos del Centro de Ciencia
y Tecnologa en Terahertz por sus apreciables consejos y gran ayuda durante la ela-
boracion y redaccion de este trabajo, Doctores: Samuel Kolosovas, Manuel Gutierrez,
Gustavo Vera y Ramon Daz de Leon, Maestros: Javier Mendez, Rodrigo Cabrera y

Carlos Lorenzo. A mi comite tutorial, Doctores: Angel Rodrguez, Enrique Stevens y
Alfonso Alba. Al personal academico y administrativo del Laboratorio Nacional de la
Coordinacion para la Innovacion y Aplicacion de la Ciencia y Tecnologa (CIACyT).
A la coordinacion del Posgrado en Ingeniera Electronica de la Universidad Autonoma
de San Luis Potos y a todos mis maestros, amigos y compa
neros de la Facultad de
Ciencias. Muchas gracias a todos.

Finalmente agradezco al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACYT) por la

beca otorgada para estudios de posgrado (CVU/Becario): 559382/296767 comprendida
durante el periodo del 1 de Septiembre del 2013 al 31 de Agosto del 2015.
Indice general

Indice de figuras I

1 Introducci
on. 1

1.1 Introduccion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.2 Ventajas del Diagnostico Medico No-Invasivo. . . . . . . . . . . . . . . 2

1.3 Antecedentes de el Diagnostico Medico No-Invasivo. . . . . . . . . . . . 5

1.4 Generalidades de la Espectroscopia Raman. . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.5 Motivacion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

1.6 Objetivo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

1.6.1 Objetivo Especfico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

1.7 Dermatitis Atopica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

1.7.1 Diagnostico de la Dermatitis Atopica. . . . . . . . . . . . . . . . 15

1.7.2 Diagnostico No-Invasivo de la Dermatitis Atopica. . . . . . . . . 19

1.8 Metodologa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

1.8.1 Analisis Teorico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

1.8.2 Analisis Experimental. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

i
 1.8.3 Organizacion de la Tesis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

2 Espectroscopia Raman. 23

2.1 Unidades y Transferencia de Energa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

2.2 Desarrollo Teorico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

2.3 Diagrama de Niveles de Energa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

2.4 Espectro Raman. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

2.5 Instrumentacion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

2.6 Desventajas de la Espectroscopia Raman. . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

2.7 Filtrado del Esparcimiento Raman. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

2.8 Aplicaciones de la Espectroscopia Raman como Diagnostico Medico No-

Invasivo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

3 Dise
no de un Sistema Raman Port
atil. 39

3.1 Fuente de Iluminacion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

3.1.1 Diodo Laser. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

3.1.2 Driver de Corriente Constante. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

3.1.3
Medicion de la Potencia Optica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

3.2 Gua de Conduccion para la Fuente de Iluminacion y Esparcimientos

Raman. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

3.2.1 Sonda Bifurcada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

3.3 Sonda Raman. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

3.3.1 Colimacion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

ii
 3.3.2
Acoplamiento a la Fibra Optica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

3.3.3 Filtrado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

3.4 Deteccion y Procesado de la Se

nal Raman. . . . . . . . . . . . . . . . . 62

3.4.1 Apertura de Entrada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

3.4.2 Rejilla de Difraccion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

3.4.3
Resolucion Optica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

3.4.4 Charge Coupled Device. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

3.4.5 Rango Espectral. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

3.5 Diagrama Esquematico del Sistema Raman Portatil Implementado. . . 78

4 Pruebas y Validaci
on del Sistema Raman Port
atil Implementado. 79

4.1 Espectro Raman del Silicio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

4.2 Espectro Raman de la Piel. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

5 Conclusiones. 97

5.1 Conclusiones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97

5.2 Trabajo a Futuro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100

Bibliografa I

iii
Indice de figuras

1.1 Tecnicas de Diagnostico Medico Convencionales o Invasivas . . . . . . . 3

1.2 Termografa Infrarroja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

1.3 Medicion Raman . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

1.4 Sir Chandrasekhara Venkata Raman . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

1.5 Alcohol Isopropil . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

1.6 Sistema de Espectroscopia Raman Horiba . . . . . . . . . . . . . . . . 11

1.7 Sistema de Espectroscopia Raman Ocean Optics . . . . . . . . . . . . . 11

1.8 Sistema de Espectroscopia Raman BW Tek . . . . . . . . . . . . . . . . 11

1.9 Camara de Termografa Infrarroja Flir . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

1.10 Sistema Raman para Aplicaciones Biologicas. . . . . . . . . . . . . . . 13

1.11 Dermatitis Atopica en un Paciente Pediatrico. . . . . . . . . . . . . . . 14

2.1 Espectro Electromagnetico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

2.2 Absorcion y Emision de Energa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

2.3 Proceso de Esparcimiento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

2.4 Esparcimientos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

i
2.5 Diagrama de Niveles de Energa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

2.6 Visualizacion de un Espectro Raman. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

2.7 Ejemplo de Espectro Raman. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

2.8 Filtrado de un Espectro Raman. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

2.9 Algoritmos para la Supresion de la Fluorescencia. . . . . . . . . . . . . 36

3.1 Diodo Laser. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

3.2 Longitud de Onda del Diodo Laser. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

3.4 Conexiones del Diodo Laser. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

3.3 Relacion Potencia/Corriente del Diodo Laser. . . . . . . . . . . . . . . 42

3.5 Driver de Corriente Constante. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

3.6 Conexiones del Driver de Corriente Constante. . . . . . . . . . . . . . . 44

3.7 Ajuste del Potenciometro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

3.8
Potenciometro Optico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

3.9 Test Points. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

3.10 Voltaje de Salida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

3.11 Medicion de la Potencia Optica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

3.12 Potencia Optica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

3.13 Relacion Voltaje/Potencia Optica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

3.14 Sonda Raman. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

3.15 Interior de una Fibra Optica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

3.16 Reflexion Total Interna. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

ii
3.17 Sonda Bifurcada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

3.18 Adaptador de Fibra Optica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

3.19 Filtros Opticos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

3.20 Configuraciones Opticas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

3.21 Micro Posicionador Thorlabs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

3.22 Conexion Diodo Laser-Fibra Optica-Colimador. . . . . . . . . . . . . . 57

3.23 Voltaje Necesario para la Colimacion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

3.24 Deteccion de la Colimacion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

3.25 Potencia Colimada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

3.26 Deteccion Sin Acoplador. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

3.27 Referencia de Acoplamiento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

3.28 Arreglo Optico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

3.29 Potencia Optica Final. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

3.30 Microposicionadores y Filtro Notch. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

3.31 Arreglo Optica Final. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

3.32 Espectrometro Ocean Optics USB4000-VIS-NIR. . . . . . . . . . . . . . 63

3.33 Partes de un Espectrometro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

3.34 Rango de Deteccion de Longitudes de Onda. . . . . . . . . . . . . . . . 66

3.35 Diagrama de un Slit. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

3.36 Incidencia y Difraccion en un Grating. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

3.37 Angulo Blaze. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

iii
3.38 Eficiencias de Gratings. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

3.39 Rango Espectral. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

3.40 Diagrama Esquematico de un CCD. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

3.41 CCD Toshiba TCP1304AP. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

3.42 Conexion Final del Arreglo Optico al Espectrometro. . . . . . . . . . . 77

3.43 Diagrama Esquematico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

4.1 Espectro Raman del Silicio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

4.2 Ocean Optics IDRaman Mini . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

4.3 Espectro Raman del Silicio obtenido con el IDRaman Mini . . . . . . . 81

4.4 Medicion del Silicio con el Sistema Raman Implementado. . . . . . . . 83

4.5 Software Spectra Suite. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

4.6 Software Spectra Suite. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

4.7 Espectro Crudo del Silicio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

4.8 Espectro del Silicio Procesado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

4.9 Espectro Final a 100mW . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

4.10 Mayor Tiempo de Integracion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

4.11 Esparcimiento en el Silicio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

4.12 Espectro con Filtro Notch. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

4.13 Espectro Final. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

4.14 Raman Systems R3000. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

4.15 Espectro Raman de la Piel. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

iv
4.16 Medicion Raman de la Piel Humana en la Yema del Dedo. . . . . . . . 92

4.17 Medicion Raman de la Piel Humana en el Antebrazo. . . . . . . . . . . 93

4.18 Espectro Raman de la Piel Crudo obtenido con el Sistema Implementado 93

4.19 Espectro Raman de la Piel Procesado obtenido con el Sistema Imple-

mentado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

4.20 Imagen 1 del Sistema Raman Implementado. . . . . . . . . . . . . . . . 95

4.21 Imagen 2 del Sistema Raman Implementado. . . . . . . . . . . . . . . . 95

4.22 Imagen 3 del Sistema Raman Implementado. . . . . . . . . . . . . . . . 96

4.23 Imagen 4 del Sistema Raman Implementado. . . . . . . . . . . . . . . . 96

v
Captulo 1

Introducci
on.

1.1. Introducci
on.

En los u
ltimos a
nos se han logrado importantes avances en el desarrollo de dispositivos
electronicos as como de sus aplicaciones, a la par se han llevado a cabo importantes

investigaciones en diversas areas como la Medicina, la Biologa, la Optica, la Fsica, la
Qumica, la Electronica, etc. En conjunto ambos enfoques, tanto el cientfico como el
tecnologico, han convergido en el desarrollo de nuevas tecnicas para diagnostico medico
que permiten obtener resultados mas confiables y precisos que los obtenidos con tecnicas
convencionales (invasivas) utilizadas por el personal medico. A estas nuevas tecnicas
de diagnostico medico, que estan basadas en el aprovechamiento de las propiedades de
la luz, as como en la interaccion de la misma con tejidos biologicos, se les conoce como

Biopsia Optica
[1] o bien, Metodos Opticos para el Diagnostico Medico No-Invasivo [2].

El termino Biopsia Optica se refiere a la deteccion temprana de estados cancergenos
utilizando metodos opticos [3], que a menudo son tecnicas de espectroscopa, que reali-
zan de forma no-invasiva (o bien, mnimamente invasiva) un diagnostico en el tejido In
Situ (en el sitio), In Vivo (en el ser vivo) y en tiempo real[4] . Muchas tecnicas opticas
se han aplicado recientemente para la obtencion cuantitativa y cualitativa de nuevos
datos. Debido a su alta sensibilidad, las tecnicas de espectroscopa optica son amplia-
mente utilizadas para la deteccion temprana de cambios en los tejidos biologicos. En

1
general, se puede decir que la biopsia optica o metodos opticos para diagnostico medico
no-invasivo es un termino general que describe varias tecnicas de espectroscopa optica
aplicada para el diagnostico de tejidos patologicos in vivo [5].

1.2. Ventajas del Diagn

ostico M
edico No-Invasivo.

El objetivo de los metodos de diagnostico medico convencionales, consiste en remover

un peque
no pedazo de tejido (incision) para hacer un analisis en laboratorio o intro-
ducir un dispositivo en alguna cavidad interna del cuerpo u organo, por lo tanto son
metodos completamente invasivos, ya que de cierta forma invaden el tejido humano,
produciendo una sensacion de dolor o malestar en el paciente. El termino Metodo de
Diagnostico Invasivo se define como cualquier tipo de prueba medica que requiere que
el uso de cierto tipo de instrumentacion para entrar en contacto fsico con el cuerpo
humano. La principal desventaja de estos metodos es que son dolorosos para el pa-
ciente y en los casos mas delicados requieren el uso de anestesicos. Otra desventaja de
estos metodos es que el tiempo en obtener un resultado es considerablemente largo, de
acuerdo a la Asociacion Americana de Cancer (ACS, por sus siglas en ingles Ameri-
can Cancer Asosiation)[6], el analisis tiene una duracion alrededor aproximada de uno
a dos das despues de que se tomo la muestra. Este largo periodo de tiempo puede
ocasionar incertidumbre en los pacientes, que a la larga puede provocar sntomas ne-
gativos como estres y ansiedad. Otra desventaja que presentan estas tecnicas invasivas
es que debido al retraso significativo en el diagnostico se pueden presentar errores en
el muestreo. Ademas la interpretacion de los resultados depende fuertemente de la ex-
periencia del patologo que realiza el estudio [7]. Entre estos metodos de diagnostico se
pueden mencionar la biopsia, la citologa, pruebas de sangre, endoscopia, angiografa,
etc. En la Figura 1.1 se muestran distintos tipos de tecnicas de diagnostico medico
convencionales.

2
Figura 1.1: Tecnicas de Diagnostico Medico Convencionales o Invasivas[6]. De izquierda
a derecha: Biopsia, Citologa Vaginal (Papanicolaou) y Endoscopia.

Lo anterior sugiere que el personal medico requiere otra herramienta para obtener un
mejor diagnostico, mas rapido, confiable y sencillo. Como se menciono anteriormente,
el principal problema del patologo es que debe de ser capaz de reconocer las regio-
nes cancergenas, identificar sus orgenes y definir sus lmites. Pero debido a que los
estados iniciales de las enfermedades por lo general no presentan caractersticas his-
tologicas identificables, el analisis se hace cada vez mas complicado. Tampoco es raro
que dos patologos que examinan el mismo tejido obtengan diferentes resultados, en-
tonces se debe tener en cuenta que las consecuencias para falsos positivos y negativos
son bastante considerables. Un falso negativo significa que se tiene una enfermedad,
pero por razones erroneas en el diagnostico se concluye que no debe ser atendida, por
otro lado, un falso positivo significa que erroneamente se diagnostica una enfermedad,
ambos criterios pueden ocasionar consecuencias negativas como alguna desfiguracion
fsica (ciruga innecesaria), un diagnostico verdadero pero en etapas de enfermedad
avanzadas o un fuerte trauma emocional para el paciente. Estos dos conceptos (falso
positivo y negativo) son frecuentemente utilizados en otras areas independientes a el
diagnostico medico. Cualquier tecnica que pueda mejorar los resultados de los meto-
dos de diagnostico convencionales se considerara como una herramienta valiosa para el
personal medico [8].

Los Metodos de Diagnostico Medico No-Invasivo tienen el mismo objetivo que los meto-
dos de diagnostico invasivo; son herramientas para evaluar el cuerpo humano y definir

3
cuando una condicion medica existe o no. Estos metodos aprovechan ampliamente los
avances tecnologicos y cientficos, especialmente en las areas de la optica, la espectros-
copia y la electronica, para generar imagenes de los tejidos evitando as el contacto
fsico con el cuerpo humano, lo que permite al personal medico hacer un diagnostico
instantaneo [1]. De esta forma se evita la extraccion de tejidos en los pacientes, lo
que los hace mas confiables y menos dolorosos. Estos metodos se realizan in vivo, es
decir directamente sobre el tejido vivo, lo que proporciona informacion acerca de la
estructura qumica y de la estructura morfologica del tejido en (casi) tiempo real [9].

Entre los ejemplos de estos metodos opticos para diagnostico medico no-invasivo se
encuentran la absorcion, dispersion, reflectancia, esparcimiento Raman, luminiscencia
en el cercano infrarrojo de los tejidos biologicos, termografa infrarroja, reflectancia
difusa, auto fluorescencia inducida por la luz, tomografa de coherencia optica [3] as
como otros metodos no-invasivos que no involucran el uso de la luz, entre los que se
pueden mencionar el ultrasonido, la resonancia magnetica y la tomografa por emision
de positrones [10]. En las Figuras 1.2 y 1.3 se observan algunos metodos opticos para
el diagnostico medico no-invasivo.

Figura 1.2: De izquierda a derecha: a) Imagen clnica de cancer de melanoma en la

planta del pie. b) Imagen por Termografa Infrarroja [11].

4
 Figura 1.3: Medicion in vivo de espectros Raman de la piel[12].

Los metodos opticos para el diagnostico medico no-invasivo pueden servir como ayuda
en varios procedimientos quir
urgicos, como por ejemplo, detectar las fases tempranas
de un tumor maligno o bien para realizar un monitoreo la glucosa en la sangre. En
resumen, los metodos opticos para el diagnostico medico no-invasivo ofrecen un gran
potencial para mejorar el tratamiento de las enfermedades con riesgos mnimos para el
paciente, y tambien para hacer un temprano diagnostico y una ciruga inmediata [4].

1.3. Antecedentes de el Diagn

ostico M
edico No-
Invasivo.

Por lo general, la gran mayora de los metodos opticos para diagnostico medico no-
invasivo estan basados en Tecnicas de Espectroscopia [3], los tejidos son tratados como
una coleccion de componentes biologicos que interact
uan con la luz de cierta manera,
produciendo una radiacion electromagnetica. En aplicaciones medicas, el analisis de las
dependencias espaciales y temporales de las radiaciones obtenidas permite revelar las
caractersticas del tejido que seran imposibles de alcanzar mediante otro metodo [8].

5
La Espectroscopia es basicamente una materia experimental interesada en la dispersion,
absorcion o reflexion de radiacion electromagnetica producida por atomos o moleculas.
Aunque se han investigado un gran n
umero de tecnicas espectroscopicas, todas tienen
un principio basico en com
un. El espectro optico especfico de una muestra de tejido
contiene informacion acerca de la composicion bioqumica (obtenida mediante medicio-
nes de la absorcion, fluorescencia o esparcimiento Raman) y/o la estructura del tejido
(obtenida mediante la medicion de los esparcimientos elasticos e inelasticos del tejido).
De esta forma se pueden obtener herramientas para el diagnostico de cancer, medicio-
nes de saturacion de oxgeno en la sangre, deteccion intraluminal de ateroesclerosis o
simplemente para la identificacion de tejidos durante procedimientos quir
urgicos [9].
Mas adelante se da una definicion mas formal de espectroscopia.

En el primer caso reportado de un diagnostico medico no-invasivo basado en tecnicas

opticas se realizo un analisis espectral en tejidos normales y cancergenos (ri
non, vejiga
y prostata) en ratones [13]. En este trabajo se utilizo la tecnica de luminiscencia visible,
que consiste en la emision de radiacion optica (ultravioleta, visible o infrarroja) como
resultado de la excitacion electronica de un material, excluyendo cualquier radiacion
resultante de la temperatura del material (incandescencia) [14] , por lo tanto es un
efecto puramente electroluminiscente. En los resultados obtenidos se observo que las
caractersticas espectrales obtenidas de los tejidos normales y cancergenos presenta-
ban diferencias considerables ademas de marcar secciones bien definidas en la region
espectral para ambos casos, por lo que se llego a la conclusion de que se podra utilizar
como una herramienta para poder realizar un diagnostico de cancer in vivo.

Para la primer aplicacion de metodos opticos para diagnostico medico no-invasivo que
se realizo en tejido humano [15] se utilizaron las tecnicas de Espectroscopia Raman y
de Fluorescencia para analizar tejidos de seno y de pulmon. En este trabajo se encon-
traron diferencias en las caractersticas espectrales emitidas por los tejidos normales y
cancergenos, ya que cada uno presento sus respectivos maximos prominentes as como
otras marcas espectrales, proporcionando as una Huella Dactilar caracterstica del te-
jido que pudiera ser utilizada como una herramienta de diagnostico medico viable para
investigaciones sobre el cancer.

6
1.4. Generalidades de la Espectroscopia Raman.

La Espectroscopia se define como el estudio experimental relacionado con la Absorcion,

Emision o Esparcimiento de la radiacion electromagnetica por atomos o moleculas [16],
mas generalmente, es el estudio de las interacciones entre la luz y la materia. En los
tejidos el efecto mas pronunciado es el esparcimiento, debido a que el tejido humano
es un medio turbio o no-transparente [3].

El Esparcimiento se define como el proceso en donde un haz de luz incide sobre una
muestra, de esta manera los fotones del haz de luz interactuan con las moleculas de
la muestra, produciendo haces de luz con corrimientos en frecuencia. El esparcimiento
puede ser de dos tipos:

Esparcimiento Elastico. Proceso donde los fotones incidentes y esparcidos tie-

nen la misma frecuencia.

Esparcimiento Inelastico. Proceso donde los fotones incidentes y esparcidos

tienen diferente frecuencia.

Sir Chandrasekhara Venkata Raman (1888-1970) comenzo a trabajar en el esparci-

miento de la luz alrededor de 1921 cuando p
ublico el articulo The Color of the Sea
[17], donde explico que el color del oceano se debe a el esparcimiento de la luz, poste-
riormente descubrio el efecto que lleva su nombre en 1928 y por el cual gano el premio
Nobel en 1930 [18]. En esa epoca no existan los avances tecnologicos de hoy en da,
por lo tanto Sir Raman utilizo la luz del Sol como fuente de iluminacion, un telescopio
como colector y sus propios ojos como detectores.

7
 Figura 1.4: Sir Chandrasekhara Venkata Raman (1888-1970).

La Espectroscopia Raman es una tecnica en la cual un haz de luz incide sobre una
muestra, originando colisiones inelasticas entre los fotones del haz incidente con las
moleculas de la muestra. De esta manera se producen esparcimientos de luz con in-
tensidades distintas que pueden tener la misma frecuencia que el haz incidente o con
una frecuencia distinta debido a la ganancia o perdida en energa ocasionadas por las
colisiones inelasticas [19]. A estos corrimientos en frecuencia se les conoce como Co-
rrimientos Raman y proporcionan informacion detallada u
nica para cada molecula.
Dicha informacion es representada en una grafica conocida como Espectro Raman, el
cual muestra la intensidad de esparcimiento en funcion de la diferencia en frecuencia
entre el haz de luz incidente y los esparcimientos de luz[19]. Un espectro Raman tpico
se muestra en la Figura 1.5.

Figura 1.5: Espectro Raman del alcohol Isopropil[19].

8
Actualmente la espectroscopia Raman es ampliamente utilizada con fines medicos ya
que en comparacion con otras tecnicas de espectroscopia, esta presenta considerables
ventajas:

Es una tecnica relativamente rapida considerando que una biopsia puede tomar
horas o das, mientras que Raman puede dar una respuesta en segundos.

No requiere de una preparacion previa de la muestra.

Es no destructiva (siempre y cuando se utilicen los parametros adecuados como

la potencia del laser y el tiempo de exposicion).

El agua es transparente al efecto Raman, por lo tanto puede ser utilizada para
analizar soluciones acuosas.

Es robusta a cambios de temperatura.

Las mediciones se pueden realizar en zonas de difcil acceso con la ayuda de

sondas de fibra optica.

Proporciona informacion a nivel bioqumico que puede utilizarse para detectar

las primeras etapas de enfermedad.

Para obtener un buen resultado clnico con espectroscopia Raman, se deben de tomar
en cuenta tres factores en el sistema [20]:

Sensibilidad.

Especificdad.

Costo.

En el Captulo 2 se hace una revision a detalle de la espectroscopia Raman y de la

instrumentacion necesaria.

Ademas de las aplicaciones clnicas, existen otras disciplinas donde la espectroscopia

Raman es de gran utilidad. Por ejemplo se ha utilizado para analizar los pigmentos
en pinturas antiguas[21], muros de edificios antiguos[22], identificacion de drogas y
narcoticos[23], industria alimenticia[24], etc.

9
1.5. Motivaci
on.

Actualmente los sistemas para diagnostico medico no-invasivo basados en tecnicas de

espectroscopia no han sido aceptados en su totalidad por el personal medico. Uno de
sus principales impedimentos son las grandes dimensiones de los dispositivos, ya que
dichos sistemas pueden abarcar habitaciones o laboratorios completos, ademas el acceso
a los resultados obtenidos es complicado de visualizar debido a las configuraciones de
fabrica de los equipos como por ejemplo el filtrado de la se
nal, el ancho del espectro,
etc.

Otro impedimento de dichos sistemas de diagnostico no-invasivo son los elevados costos
que alcanzan en el mercado: el costo de un sistema de resonancia magnetica esta en
un rango de los $150, 000.00 USD a mas de $400, 000.00 USD, un sistema de tomo-
grafa de coherencia optica tiene un precio en el rango de los $27, 000.00 USD a los
$70, 000.00 USD, mientras que un sistema de ultrasonido tiene un precio en el rango de
los $15, 000.00 USD a los $30, 000.00 USD aproximadamente. Mientras que los sistemas
opticos, como un sistema Raman para laboratorio tiene un costo de aproximadamente
$500, 000.00 USD.

Aunque en la actualidad existen sistemas de espectroscopia portatiles, el precio sigue

siendo demasiado alto y por lo general son utilizados para fines no medicos, mas ade-
lante, en el Captulo 5 se realiza un analisis mas detallado acerca de los costos de los
sistemas de diagnostico medico no-invasivo.

En las Figuras 1.6, 1.7, 1.8 y 1.9 se muestran ejemplos de sistemas de espectroscopia
Raman comerciales y portatiles, as como sistemas de Termografa Infrarroja.

10
Figura 1.6: Sistema de Espectroscopia Raman Horiba Xplora One para uso en labora-
torio, precio aproximado: mas de $150, 000.00 USD.

Figura 1.7: Sistema de Espectroscopia Raman Ocean Optics IDRaman Mini, precio
aproximado: $24, 000.00 USD.

Figura 1.8: Sistema de Espectroscopia Raman BW Tek, precio aproximado: $100, 000.00
USD.

11
Figura 1.9: Camara de Termografa Infrarroja Flir T600, precio aproximado $5, 000.00
USD.

Es importante tomar en cuenta que desde hace muchos a

nos y hasta la fecha las he-
rramientas de diagnostico medico invasivo, como la biopsia o la citologa, han sido
adoptadas como estandares de oro en el area de diagnostico medico. De ser utilizados,
los metodos para el diagnostico medico no-invasivo prometen resultados mas confiables,
rapidos y precisos, ademas si se cuenta con un sistema portatil y de bajo costo, su uti-
lidad incrementara considerablemente, ya que no estara destinado para uso exclusivo
en ambientes hospitalarios.

1.6. Objetivo.

Objetivo General.

Dise
nar y construir un sistema de espectroscopia Raman portatil y de bajo costo para
analisis in vivo, empleando componentes electronicos y opticos comerciales siguiendo
el diagrama esquematico propuesto[19].

1.6.1. Objetivo Especfico.

Un sistema de espectroscopia Raman para aplicaciones biologicas consiste de cinco

componentes principales:

12
 Fuente de Iluminacion.

Gua de Conduccion para la se

nal proveniente de la Fuente de Iluminacion.

Sonda Raman.

Gua de Conduccion para la se

nal Raman.

Detector (Espectrometro) y PC para el Procesado de la se

nal Raman.

En la Figura 1.10 se observa el diagrama esquematico propuesto del sistema de espec-

troscopia Raman con todos sus componentes.

Figura 1.10: Diagrama esquematico de un sistema Raman para aplicaciones

biologicas[19]: a) Fuente de Iluminacion, b) Gua de Conduccion para la Se
nal de Ex-
citacion, c) Sonda Raman que incide directamente en el Tejido Biologico, d) Gua de
Conduccion que colecta y transmite la se
nal Raman obtenida y e) Espectrometro que
sirve como detector de la se
nal Raman para posteriormente procesarla en una PC.

13
La aplicacion principal del sistema Raman sera para realizar mediciones in vivo de
la piel para detectar los espectros de sus componentes, en particular de la Filagrina
(FLG), que es una protena clave requerida para la formacion de la barrera del Estrato
Corneo. Las mutaciones en la FLG se han reportado como un factor predisponente
para el desarrollo de Dermatitis Atopica (Figura 1.11), ahora considerada como una
enfermedad basada en un defecto genetico primario en la barrera epitelial[25].

Figura 1.11: Dermatitis Atopica (AD) en un Paciente Pediatrico. Imagen obtenida de

la Academia Americana de Dermatologa (AAD, por sus siglas en ingles, American
Academy of Dermatology).

1.7. Dermatitis At
opica.

La Dermatitis Atopica (AD por sus siglas en ingles Athopic Dermatitis o Eczema) es
una de las enfermedades cronicas inflamatorias de la piel mas frecuentes, afectando
a mas del 25 % de los ni
nos y del 1 3 % de los adultos alrededor del mundo. La
patofisiologa de la AD es compleja y es regulada por m
ultiples factores geneticos y
ambientales[26]. Aproximadamente el 70 % de los casos de AD comienza a desarrollarse
en ni
nos menores de 5 a
nos, aunque se ha observado en ambientes hospitalarios que un
10 % de los casos observados comienza en los adultos[27].

14
La AD es una enfermedad cronica (de larga duracion) que afecta a la piel. La palabra
dermatitis significa inflamacion en la piel. La palabra atopica se refiere a un grupo
de enfermedades que son hereditarias (esto quiere decir que ocurren en las familias)
y que a menudo ocurren juntas incluyendo el asma, alergias (con sntomas como una
fiebre alta, etc.) y la dermatitis atopica. En la AD la piel se vuelve extremadamente
picante e inflamada causando enrojecimiento, hinchazon, formacion de grietas, costras,
y descamacion en la piel[28].

La patogenesis de la AD a
un no es comprendida en su totalidad, sin embargo, la
enfermedad aparenta ser el resultado de una interaccion compleja entre defectos en la
barrera de la piel, anormalidades inmunologicas y agentes ambientales e infecciosos.
Las anormalidades en la barrera de la piel al parecer estan asociadas con mutaciones
en el gen de la FLG que codifica una protena estructural esencial para la formacion
de la barrera de la piel. La piel de los individuos con AD tambien ha mostrado tener
deficiencias en las ceramidas (moleculas de lpidos) as como peptidos antimicrobianos
como catelicidinas que representan la primera lnea de defensa contra muchos agentes
infecciosos. Estas anormalidades en la barrera de a piel conducen a la perdida de
agua transepidermica (pasaje del agua desde el interior del cuerpo a traves de la capa
epidermica de la piel a la atmosfera circundante) y a un incremento en la penetracion
de alergenos y microbios en la piel[27].

1.7.1. Diagn
ostico de la Dermatitis At
opica.

El diagnostico de la AD esta basado en la presencia de una combinacion de caractersti-

cas clnicas esenciales, importantes y asociadas entre si, y que representan desafos
debido al amplio rango de diagnosticos distintos[29] [30] [31] [32]:

1. Caractersticas Esenciales.

a) Pruritus.

b) Dermatitis Eczematosa.

c) Morfologa tpica y patrones especficos de la edad.

15
 d) Historial cronico o recidivante.

2. Caractersticas importantes (son observadas en la mayora de los casos y sirven

como apoyo al diagnostico).

a) Inicio de la AD a edad temprana.

b) Atopia.

1) Historial familiar o personal.

2) Reactividad IgE (Inmunoglobulina E).

c) Xerosis.

3. Caractersticas asociadas (Sugieren un diagnostico de AD, pero son demasiado

inespecficas para ser utilizadas como criterio de definicion/deteccion para la in-
vestigacion y estudios epidemiologicos).

a) Respuestas vasculares atpicas (Palidez facial, dermografismo blanco, retraso

en la respuesta Branch).

b) Keratosis pilaris/hyperkeratosis(Queratosis Pilaris/Hiperqueratosis) ichth-

yosis (Ictiosis).

c) Cambios oculares/periorbitales.

d) Otros marcadores regionales (Cambios periorales/lesiones perioauriculares).

e) Acentuacion perifolicular, liquenificacion, lesiones prurigo.

4. Condiciones que deben ser excluidas.

a) Dermatitis de contacto (Alergica e irritante).

b) Dermatitis seborreica.

c) Sarna.

d) Psoriasis.

e) Erupciones ocasionadas por drogas.

f ) Dermatitis perioral.

g) Ictiosis y trastornos de queratinizacion.

h) Linfomas cutaneos.

16
 i) Sndromes de deficiencia inmunologica.

j) Deficiencia de zinc (Acrodermatitis enteropatica).

5. Posibles variantes / caractersticas asociadas con la AD.

a) Ictiosis vulgar.

b) Keratosis pilar.

c) Eczema nummular.

d) Pitiriasis alba.

Una vez que el diagnostico ha sido establecido, se recomienda realizar frecuentes re

evaluaciones durante el tratamiento para asegurar la precision del diagnostico, para
anticipar las morbilidades como s
uper infecciones, para reforzar los puntos en com
un
con los familiares y pacientes (identificar marcadores geneticos) y para evaluar y ajus-
tar el tratamiento de acuerdo a la respuesta clnica. Estas mediciones son de gran
importancia en pacientes pediatricos[33].

Aunque varios criterios de diagnostico de AD propuestos han sido probados y validados,

la aplicacion de muchos de estos criterios requiere de mucho tiempo y de pruebas
invasivas[32]. Williams et al. propusieron un criterio de diagnostico simplificado que es
facil de utilizar, no requiere de pruebas invasivas y que presenta alta sensibilidad en el
diagnostico de la AD[34] [35] [36] [37]:

1. Criterio principal: Los pacientes deben de presentar:

a) Una condicion de picazon en la piel (o en el caso de los ni

nos, un reporte de
los padres).

2. Criterios secundarios: Se deben presentar tres o mas de los siguientes criterios:

a) Ni
nos mayores/Adultos:

1) Historial de picazon en los pliegues de la piel (por ejemplo, los pliegues

de los codos, detras de las rodillas, delante de los tobillos, alrededor del
cuello).

17
 2) Antecedentes de asma o rinitis alergica.

3) Antecedentes de resequedad en la piel durante el u

ltimo a
no.

4) Dermatitis flexural visible (por ejemplo en las curvas o pliegues de la

piel en los codos, las rodillas, las mu
necas, etc.).

b) Ni
nos menores de cuatro a
nos:

1) Picazon de las mejillas.

2) Historial de enfermedad atopica en un pariente directo.

3) Eczema en las mejillas, la frente y las extremidades exteriores.

Otra caracterstica importante de la AD es que las manifestaciones varan con la edad,

por lo tanto se deben de tomar en cuenta los siguientes marcadores:

1. Infantes (0 a 2 a
nos):

a) Superficies de extension de las extremidades.

b) Cara (frente, mejillas, barbilla).

c) Cuello.

d) Cuero cabelludo.

e) Tronco.

2. Ni
nos (2 a
nos hasta la pubertad):

a) Superficies flexurales de las extremidades.

b) Cuello.

c) Mu
necas.

d) Tobillos.

3. Adolescentes/Adultos:

a) Superficies flexurales de las extremidades.

b) Manos.

c) Pies.

18
Sin importar la edad, la comezon asociada a la AD generalmente contin
ua todo el da
y empeora por la noche, lo que lleva a factores negativos como perdida de sue
no e
impedimentos sustanciales en la calidad de vida de la persona que la padece[38].

1.7.2. Diagn
ostico No-Invasivo de la Dermatitis At
opica.

Aunque se tengan distintos diagnosticos sigue siendo complicado diferenciar la AD de

otras condiciones en la piel (dermatitis seborreica, dermatitis de contacto, psoriasis,
etc.), por lo que se requiere de un historial familiar con AD. Ademas tambien se tienen
que considerar deficiencias nutricionales y metabolicas, tumores malignos y sndromes
de inmunodeficiencia asociados con las manifestaciones cutaneas[39], por lo tanto un
diagnostico correcto sigue siendo complicado en la mayora de los casos.

Recientemente se han estudiado mutaciones en la FLG debido a que pueden presentar

un importante marcador para el desarrollo de la AD [26] proporcionando as informa-
cion relevante acerca del paciente sin necesidad de un historial familiar. Gonzalez et.
al. realizaron mediciones in vivo no-invasivas para las mutaciones de la FLG utilizan-
do la tecnica de espectroscopia Raman [25], con los resultados obtenidos se llego a
la conclusion de que se pueden emplear tecnicas opticas para realizar un diagnostico
individualizado, temprano y un monitoreo de deficiencias de la FLG y enfermedades
relacionadas, como la AD [19].

En el presente trabajo de tesis se ha planteado como hipotesis que es posible obtener

un diagnostico medico no-invasivo confiable para fases tempranas de AD utilizando un
sistema Raman portatil y de bajo costo, realizando pruebas in vivo para una posterior
validacion de los resultados obtenidos.

1.8. Metodologa.

El trabajo de esta tesis se divide en dos partes necesarias para cumplir el objetivo
planteado: un Analisis Teorico y un Analisis Experimental.

19
1.8.1. An
alisis Te
orico.

Esta parte del trabajo se centra en los estudios de las interacciones de la luz con la
materia biologica (Biofotonica) a escalas nanometricas (Nanofotonica) reportados en la
literatura, haciendo enfasis en la espectroscopia Raman, sus aplicaciones en la medicina

(Optica Biomedica) y su base teorica.

1.8.2. An
alisis Experimental.

En esta actividad se llevan a cabo las pruebas con la instrumentacion optica y electroni-
ca necesarias para el proyecto. En la parte de la instrumentacion optica se trabaja con
elementos como diodos laser, filtros opticos, enfocadores (colimadores) y fibras opticas.
Por la parte de la instrumentacion electronica se trabaja con fuentes de corriente cons-
tante, espectrometros, CCD (Charged Coupled Device) as como el software necesario
y el filtrado de la se
nal. Finalmente se realizan comparaciones entre el sistema Raman
que se propone y diferentes sistemas comerciales portatiles y no-portatiles. Para la
parte del analisis y procesado de los espectros Raman obtenidos se utiliza un espectro
de referencia obtenido de un sistema comercial.

1.8.3. Organizaci
on de la Tesis.

El trabajo de esta de tesis se encuentra organizado de la siguiente manera: En el

Captulo 1 se hace una explicacion sobre el concepto, el origen, las ventajas y los an-
tecedentes del diagnostico medico no-invasivo ademas de presentar las generalidades
de la espectroscopa Raman y sus aplicaciones en la medicina como herramienta de
diagnostico medico no-invasivo para enfermedades de la piel, como la dermatitis atopi-
ca. Se definen la motivacion y el objetivo, tanto general como especfico, del proyecto.
Al final del captulo se define la metodologa seguida y la organizacion de la tesis. En el
Captulo 2 se hace una revision a la teora y aplicaciones de la espectroscopia Raman,
as como de la instrumentacion optica-electronica requerida para la construccion de un
sistema portatil. En el Captulo 3 se revisa el procedimiento seguido para el dise
no

20
y la construccion del sistema Raman [19]. El Captulo 4 esta dedicado a la revision
de los resultados obtenidos en las pruebas y validaciones del sistema Raman portatil
implementado. Finalmente, en el Captulo 5 se presentan las conclusiones del trabajo
realizado y se presentan posibles trabajos a futuro para el desarrollo de sistemas Raman
portatiles a bajo costo.

21
22
Captulo 2

Espectroscopia Raman.

2.1. Unidades y Transferencia de Energa.

Como se menciono en el Captulo 1, la Espectroscopia se define como una materia expe-

rimental relacionada con la emision, absorcion o esparcimiento de la radiacion electro-
magnetica ocasionada por los atomos o moleculas[16]. Los parametros caractersticos
de la radiacion electromagnetica son los siguientes[40]:

Longitud de Onda (): Se define como la distancia entre dos puntos de la misma
fase en ondas sucesivas, sus unidades son los nanometros (nm), micrometros (m)
o centmetros (cm).

Frecuencia (): Se define como el n

umero de ondas que la luz recorre en un
segundo, sus unidades son los Hertz (Hz).

umero de Onda (
N ): Se define como el n
umero de ondas que existen en una
distancia especfica, sus unidades son cm1 .

La relacion entre estos parametros es la siguiente[18]:

c
= (2.1)

23
Usualmente tiene sus unidades en nm, para obtener la Eq. 2.2 de manera directa se
deben realizar las conversiones necesarias de nm a cm.

1
= = (2.2)
c

Donde c = 3x1010 cm/s es la Velocidad de la Luz. Si se combinan las Eq. 2.1 y 2.2 se
obtiene:

c
= = c
(2.3)

Si una molecula interact

ua con un campo electromagnetico, una transferencia de energa
del campo electromagnetico a la molecula ocurre solo cuando la condicion de Bohr para
la frecuencia es satisfecha:

c
E = h = h = hc
(2.4)

Donde E es la diferencia en energa entre dos estados cuantizados, h = 6.62x1027 erg

s y es la constante de Planck. Por lo tanto es directamente proporcional a la energa
de transicion[18]. En la Figura 2.1 se observan las unidades de energa para las distintas
secciones del espectro electromagnetico.

Figura 2.1: Unidades de energa a lo largo del espectro electromagnetico [18].

24
Si se asume que:

E = E2 E1 (2.5)

Donde E1 y E2 son las energas del estado base y del estado excitado respectivamente.
Cuando se produce un cambio de energa del estado base E1 al estado excitado E2 ,
entonces se dice que la molecula absorbe la diferencia en energa E, por el contrario,
cuando hay un cambio de E2 a E1 la molecula emite la diferencia de energa (Figura
2.2).

Figura 2.2: Procesos de absorcion y emision de la diferencia de energa (E) en los

estados base (E1 ) y excitado (E2 ).

2.2. Desarrollo Te
orico.

Cuando la luz interact

ua con la materia, los fotones que la conforman pueden ser absor-
bidos, esparcidos, reflejados, refractados o incluso puede no existir ninguna interaccion
con la materia. Se define Esparcimiento de Luz o Scattering al proceso donde un haz de
luz incide sobre una muestra, produciendo haces de luz con iguales o distintas frecuen-
cias (Figura 2.3) a la del haz de luz incidente. Ademas de ser el modo de interaccion
mas com
un tambien es el mas complejo, ya que involucra varios mecanismos[41].

25
Figura 2.3: Proceso de esparcimiento: Un haz de luz incide sobre una muestra origi-
nando haces de luz con frecuencias iguales o distintas a la frecuencia del haz de luz
incidente[3].

Como se menciono en la seccion 1.4, en la espectroscopia Raman cuando una muestra

es irradiada por un haz de luz, el esparcimiento se produce con frecuencias distintas o
iguales a la del haz de luz incidente. El esparcimiento de luz puede ser de dos tipos:

Esparcimiento Elastico (Rayleigh, Mie): Posee la misma longitud de onda que el

haz de luz incidente.

Esparcimiento Inelastico (Raman, Brillouin): Aproximadamente 1 de cada 107

fotones del haz de luz incidente es esparcido a una longitud de onda distinta, esto
es debido a ganancias o perdidas en energa originadas por las colisiones de los
fotones con las moleculas[19]. Dichos corrimientos en frecuencia se representan
de la forma V0 Vm donde V0 es la frecuencia del rayo de luz incidente y Vm es la
frecuencia vibracional de la molecula que esta siendo analizada. Las expresiones
V0 Vm y V0 + Vm son llamadas esparcimiento Raman Stokes y esparcimiento
Raman Anti-Stokes respectivamente[42].

En la Figura 2.4 se observan los dos tipos de esparcimientos que se producen al incidir

26
un haz de luz sobre una muestra:

Figura 2.4: Esparcimiento elastico (Rayleigh) e inelastico (Raman).

De acuerdo a la teora clasica, el esparcimiento Raman puede explicarse de la siguiente

manera [18]: La componente electrica de una onda electromagnetica que fluct
ua en el
tiempo esta dada por:

E = E0 cos(20 t) (2.6)

Donde E0 es la amplitud vibracional y 0 es la frecuencia del haz de luz incidente. Si

una molecula diatomica es irradiada por este haz de luz, un Momento Dipolar electrico
es inducido. Un Momento Dipolar se define como la medida de la separacion entre
cargas positivas y negativas en un sistema de cargas electricas, es decir, una medida
de la polarizabilidad global del sistema de cargas. Se expresa como:

p = qd (2.7)

27
Donde d es un vector de desplazamiento y q es la carga. Por lo tanto, al inducirse este
momento dipolar, se obtiene:

P = E = E0 cos(20 t) (2.8)

Donde es una constante llamada polarizabilidad, que es un valor que distorsiona

la nube de electrones al interactuar un haz de luz polarizado con las moleculas de la
muestra. La polarizabilidad depende de la habilidad de los electrones para polarizarse.

Si la molecula esta vibrando a una frecuencia m , el desplazamiento nuclear queda

expresado como:

q = q0 cos(2m t) (2.9)

Donde q0 es la amplitud vibracional y m es la frecuencia vibracional. Para una peque

na
amplitud de vibracion, es una funcion lineal de q:

= 0 + ( )0 q + ... (2.10)
q

Donde 0 es la Polarizabilidad en la posicion de equilibrio y (/q)0 es la razon

de cambio de con respecto al cambio en la carga (q), evaluada en la posicion de
equilibrio.

Si se realiza una combinacion de las Eqs. (2.8), (2.9) y (2.10) se llega a:

P = E0 cos(20 t)

= 0 E0 cos(20 t) + ( )0 qE0 cos(20 t)
q

= 0 E0 cos(20 t) + ( )0 q0 E0 cos(20 t)cos(2m t) (2.11)
q

28
Utilizando el teorema de la suma de angulos:

cos(x + y) + cos(x y)
cos(x)cos(y) = (2.12)
2

Y sutituyendolo en la Eq.2.11 se obtiene:

1
P = 0 E0 cos(20 t) + ( )0 E0 [cos{2(0 + m )t} + cos{2(0 m )t}] (2.13)
2 q

De acuerdo a lo establecido anteriormente, el primer termino de la Eq.2.13 corresponde

al dipolo oscilante que rada un haz de luz con frecuencia 0 , mientras que el segundo
termino corresponde al esparcimiento Raman Anti-Stokes con frecuencia 0 + m y
Raman Stokes con frecuencia 0 m . Si (/q)0 es igual a 0, entonces la vibracion
no es activa en Raman, debido a que no hay cambios en la polarizabilidad.

Los corrimientos Raman se calculan mediante la siguiente ecuacion:

1 1 107 nm
(cm1 ) = ( )( ) (2.14)
0 s 1cm

Donde 0 es la longitud de onda del haz de luz incidente y s es la longitud de onda

esparcida.

2.3. Diagrama de Niveles de Energa.

En la espectroscopia Raman se considera que la mayor parte de las moleculas estan en

un estado con baja energa vibracional (estado Base o Basal), al momento de presen-
tarse la polarizacion en la nube de electrones, se origina un estado de corta duracion
llamado Estado Virtual. En la Figura 2.5 se observa el diagrama de niveles de energa
de los distintos tipos de esparcimientos de luz[40].

29
Figura 2.5: Diagrama de Niveles de Energa de los esparcimientos Elasticos (Rayleigh)
e Inelasticos (Raman Stokes y Anti-Stokes) [40].

De acuerdo a la seccion 2.1, se produce una absorcion de energa cuando hay un cambio
de un estado base m a un estado excitado n pasando por un estado virtual de corta
duracion, produciendo as una perdida de energa en los fotones resultantes, que son
esparcidos con una frecuencia diferente a la de los fotones incidentes, originando as el
esparcimiento Raman Stokes. Por otro lado, si la molecula se encuentra en un estado
excitado n, debido a energas termicas, se producira una emision de energa adicional
a la de los fotones resultantes que tambien son esparcidos en una direccion diferente a
la de los fotones incidentes, originando as el esparcimiento Raman Anti-Stokes.

2.4. Espectro Raman.

El Espectro Raman es una grafica donde se observan las intensidades en el eje de las or-
denadas del esparcimiento en funcion de las diferencias en frecuencia entre la radiacion
incidente y la radiacion esparcida, de esta forma es posible observar las intensidades
del esparcimiento Raman Stokes y Raman Anti-Stokes. Por lo general, ambos espar-
cimientos presentan la misma informacion en frecuencia, contrario a sus intensidades,
que de acuerdo a la ley de distribucion de Maxwell-Boltzmann, la probabilidad de que
una molecula se encuentre en el estado base es mucho mayor a que la molecula se

30
encuentre en un estado excitado [18]. De esta forma solo se considera el esparcimiento
Raman Stokes, ya que el esparcimiento Raman Anti-Stokes presenta intensidades mu-
cho menores en sus corrimientos en frecuencia y son u
nicos para cada molecula como
se puede observar en la Figura 2.6.

Figura 2.6: Forma basica de un espectro Raman, los esparcimientos Raman Stokes y
Anti-Stokes muestran diversos corrimientos e intensidades menores al esparcimiento
Rayleigh [43].

Las intensidades de las bandas se miden con respecto a la capacidad de deteccion

del equipo de medicion y/o de acuerdo a las bandas reportadas en la literatura, sus
unidades se expresan como unidades arbitrarias (a.u., por sus siglas en ingles, arbitrary
units) y corresponden a las concentraciones de las moleculas, proporcionando as una
valiosa informacion acerca de la composicion qumica de la muestra. En la Figura 2.7
se observa un espectro Raman tpico[18], en este tipo de grafica es facil observar el
esparcimiento Rayleigh, que es el que tiene mayor intensidad y cero corrimientos en
frecuencia (centro), el esparcimiento Raman Stokes, que es el que presenta perdidas
en frecuencia e intensidades menores a las del esparcimiento Rayleigh (izquierda), y el
esparcimiento Raman Anti-Stokes, que presenta ganancias en frecuencia e intensidades
mas bajas (derecha).

31
 Figura 2.7: Espectro Raman del CCL4 [18].

2.5. Instrumentaci
on.

Los sistemas de espectroscopia Raman comerciales se componen de cinco partes prin-

cipales:

Fuente de Iluminacion.

Gua de Conduccion para la Fuente de Iluminacion.

Sonda Raman.

Gua de Conduccion para el Esparcimiento Raman.

Deteccion y Procesado para de la Se

nal Raman.

32
2.6. Desventajas de la Espectroscopia Raman.

Aunque la espectroscopia Raman presenta considerables ventajas en comparacion con

otras tecnicas espectroscopicas, tambien presenta ciertas deficiencias en cuanto a ren-
dimiento que tambien dependen fuertemente de la aplicacion y de la instrumentacion
requerida. Entre ellas se pueden mencionar:

Si se utiliza un laser como fuente de iluminacion, se puede producir un calen-

tamiento en el dispositivo, lo que puede llevar a consecuencias como da
no en el
equipo o en el peor de los casos da
nar la muestra que esta siendo analizada.

Se debe de tener cuidado con la Fluorescencia, sobre todo en aplicaciones biomedi-

cas, ya que este tipo de se
nal afecta de manera considerable a la se
nal Raman.

La instrumentacion requerida y sobre todo los sistemas comerciales de espectros-

copia Raman tienen precios bastante elevados.

Es muy complicado obtener un espectro Raman, por lo tanto el detector debe de

tener una muy buena resolucion.

En general, no es posible analizar metales. Por aproximacion, un metal es infini-

tamente polarizable, por lo tanto no se producira un cambio en la polarizabilidad
al incidir un haz de luz. Aunque recientemente y mediante tecnicas especiales se
ha podido obtener un espectro Raman en metales[44].

2.7. Filtrado del Esparcimiento Raman.

Como se menciono en la seccion 2.6 la Fluorescencia es la principal fuente de ruido en

la espectroscopia Raman, esto debido a que ciertas moleculas de la muestra tienden a
emitir energa[43] cuando son excitadas por un haz de luz, aunque tambien se puede
deber a las impurezas en la instrumentacion optica y electronica utilizada. Cuando
se produce la fluorescencia el espectro Raman se ve seriamente afectado ya que por
lo general es ordenes de magnitud menor que la fluorescencia (Figura 2.8). Existen

33
distintas formas de remover esta se
nal del espectro Raman, una es hacer modificaciones
a la instrumentacion variando la longitud de onda en la fuente de excitacion. Este tipo
de modificaciones son altamente efectivas pero debido a que se requieren componentes
mas especficos, el precio de los sistemas sera mas elevado.

Figura 2.8: Espectro Raman con (lnea roja) y sin (lnea negra) fluorescencia.

Otra forma mas sencilla de remover la fluorescencia del espectro Raman es utilizar
herramientas matematicas como la transformada de Fourier, ajuste polinomial, ajuste
derivativo, analisis Wavelet, etc. Recientemente se encontro que el ajuste polinomial
es el metodo optimo para esta tarea [45] debido a que presenta diversas ventajas en
comparacion con los demas metodos ya que incluye un modelado estadstico para tomar
en cuenta las contribuciones del la fluorescencia y determinar la verdadera contribucion
de la se
nal Raman. Este metodo de filtrado recibe el nombre de algoritmo Vancouver
y es de distribucion libre [45] http://www.flintbox.com/public/project/1956. Las
ventajas que presenta en comparacion con otros algoritmos son considerables:

34
 La transformada de Fourier hace una conversion del dominio del tiempo al domi-
nio de la frecuencia, despues hay que realizar un filtrado para eliminar las bajas
frecuencias, posteriormente se hace un regreso del dominio de la frecuencia al do-
minio del tiempo, es decir, la transformada inversa de Fourier, la se
nal resultante
se considera el espectro Raman puro. Este algoritmo presenta serias deficiencias
ya que depende de la intervencion del usuario para determinar los lmites de en
el dominio que pueden alterar la se
nal Raman, dichos errores pueden incluir va-
lores negativos en las intensidades o bandas inexistentes. Otra desventaja de este
algoritmo es que requiere de un tiempo considerable para realizar el procesado.

El ajuste derivativo requiere de dos espectros a dos longitudes de onda distintas.

Esto por cuestiones tecnicas es mas complicado de realizar ya que se sugiere tener
dos sistemas Raman integrados, lo cual incrementara las dimensiones y el costo
final del sistema. Si se cuenta con un equipo con dichas caractersticas, una vez
obtenidos los dos espectros y al realizar una diferencia entre ellos, es necesario
llevar a cabo una integracion, que se considera como el espectro Raman puro.
Ademas de los problemas de costo y portabilidad, otra desventaja que presenta
esta operacion es que al realizar las operaciones mencionadas las intensidades de
las bandas Raman se ven seriamente afectadas con respecto al espectro original.

El analisis Wavelet, requiere de las componente del espectro en el dominio de

la frecuencia para descomponer la se
nal y el llamado Metodo de Umbralizacion
(Tresholding Method) para reconstruir la se
nal. Una vez obtenidas ambas com-
ponentes (del tiempo y de la frecuencia), se deben de calcular los coeficientes de
compresion Wavelet, posteriormente estos coeficientes de compresion se dividen
en bloques y se realizan decisiones simultaneas para descartar algunos coeficientes
que estan dentro de los bloques obtenidos, de esta forma se obtiene una mayor
precision en la estimacion del ruido. Claramente se observa que el analisis Wavelet
requiere una gran capacidad de procesado y tambien requiere de la intervencion
del usuario para determinar el nivel del umbral y del intervalo de la se
nal[46].

En la Figura 2.9 se muestran los distintos tipos de filtrado que se pueden realizar
al espectro Raman. Se observa que el ajuste polinomial es el que presenta mejores
resultados. La fluorescencia puede ser modelada matematicamente como una funcion

35
polinomial, el orden de la funcion debe ser elegido apropiadamente ya este depende la
obtencion de una se
nal Raman con menos alteraciones[45].

Figura 2.9: Distintos tipos de algoritmos para el filtrado del espectro Raman. De arriba
hacia abajo: Se
nal Raman Cruda (sin filtrar), Ajuste Polinomial, Transformada de
Fourier(FFT) y Ajuste Derivativo.

2.8. Aplicaciones de la Espectroscopia Raman co-

mo Diagn
ostico M
edico No-Invasivo.

Debido a que se busca un metodo de diagnostico no-invasivo, no debe de existir da

no
en el tejido humano, por lo tanto, este se debe de comportar de manera transparente
a la luz. Para lograr esto, se debe de tomar en cuenta el rango de longitudes de onda

36
denominado Ventana Terapeutica que esta en el rango de los 700 1200nm, en este
rango es donde se produce menos absorcion en el tejido humano. De acuerdo a la Figura
2.1 este rango de frecuencias corresponde al espectro del Cercano Infrarrojo (NIR, por
sus siglas en ingles, Near Infrarred) y es en el donde se produce menor fluorescencia,
haciendolo ideal para aplicaciones donde la muestra tiene una alta fluorescencia como
por ejemplo cualquier tejido biologico[47]. La mayora de los sistemas Raman para
aplicaciones biologicas utilizan como fuente de iluminacion un Laser (por sus siglas en
ingles, Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation) en el rango del NIR.
En la Figura 1.10 se muestra un diagrama esquematico de un sistema de espectroscopia
Raman para aplicaciones biologicas, dicho sistema Raman incluye los componentes
basicos mencionados en la Seccion 2.5 tomando en cuenta la ventana terapeutica para
realizar mediciones in vivo.

37
38
Captulo 3

Dise
no de un Sistema Raman
Port
atil.

3.1. Fuente de Iluminaci

on.

En los inicios de la espectroscopia moderna como fuente de iluminacion se utilizaba

una lampara de mercurio con arreglos opticos para transmitir solamente una longitud
de onda o un rango especfico de longitudes de onda[18]. En la decada de 1960 se
descubrio la radiacion Laser proporcionando ventajas significativas ya que son haces
de luz con una sola longitud de onda (tambien llamadas fuentes Monocromaticas) y
pueden trabajar a altas potencias[48]. La longitud de onda seleccionada va a depender
exclusivamente de la aplicacion requerida. Los tipos de laser pueden ser de varios tipos:
diodos laser, laseres de gas, laseres semiconductores de oxido de aluminio e itrio con su
base dopada de neodimio (Nd:YAG, por sus siglas en ingles, Neodymium-Doped Yttrium
Aluminium Garnet), etc. Es muy importante seleccionar cuidadosamente la longitud
de onda de la fuente de excitacion ya que la generacion de la fluorescencia depende en
gran parte de este parametro.

A diferencia del efecto Raman, que se origina por el proceso de esparcimiento, la fluo-
rescencia se produce por el efecto de absorcion, y en aplicaciones biologicas es mas
intensa que el esparcimiento Raman debido a la propagacion de ondas en medios con

39
perdidas (como el tejido biologico), donde el medio absorbe la energa incidente de una
onda electromagnetica para despues emitirla a una longitud de onda y energa diferen-
te. En la actualidad, los laseres en el rango del NIR se han utilizado con magnficos
resultados en la espectroscopia Raman, debido a que los fotones incidentes no poseen
la energa suficiente para excitar la fluorescencia de una molecula. Tambien tienen la
ventaja de que la fluorescencia es menor[42] en comparacion con los laseres que estan en
el rango del visible o del ultravioleta. Otro factor de gran importancia es la intensidad
de la se
nal Raman, ya que si se aumenta la longitud de onda se obtendra una se
nal
con menor fluorescencia pero tambien mas reducida, por otro lado si se selecciona una
longitud de onda menor se obtendra una se
nal Raman mas intensa pero con mayor
fluorescencia[49]. La longitud de onda es un factor muy importante para la supresion
de la fluorescencia, por eso los sistemas Raman requieren de una fuente de excitacion
en el NIR con una longitud de onda lo mas estable posible. Existen otras formas de su-
primir la fluorescencia ya sea por medio de instrumentacion optica-electronica (filtros,
longitud de onda variable, etc.) o por medio de software.

La principal desventaja de un sistema laser es su elevado costo, esto debido a sus

grandes dimensiones y por sus complejos sistemas de enfriamiento y alimentacion. Estas
limitantes tambien los hacen impracticos para aplicaciones clnicas. Con la aparicion
de los diodos laser ha sido posible el desarrollo de sistemas Raman portatiles debido
a su reducido tama
no (< 1mm3 )[18], rapido enfriado[42] y su relativamente sencillo
principio de operacion. En cuanto a las desventajas de los diodos laser tambien existe
la posibilidad de tener un corrimiento en la longitud de onda debido a los cambios de
temperatura que se generan por prolongados periodos de operacion y/o problemas en
la fuente de iluminacion.

3.1.1. Diodo L
aser.

En la actualidad los diodos laser en el rango del cercano infrarrojo han sido adoptados
como estandares en la industria por su alta potencia de salida (cientos de miliwatts),
reducido costo, bajas dimensiones, largo periodo de vida y reduccion de la fluorescencia.
En este trabajo se utilizo un diodo laser de la marca Thorlabs LP785-SF100 (Figura

40
3.1) acoplado a una fibra optica monomodal (Pigtailed)[50]:

Figura 3.1: Diodo Laser Thorlabs LP785-SF100[50].

El diodo laser tiene una longitud de onda de 786.8nm (Figura 3.2), un voltaje de
operacion de 1.98V , una corriente de operacion de 286.6mA, una potencia de salida
regulable de 0 100mW que se puede ajustar dependiendo de la corriente que se le
suministra (Figura 3.3) y una configuracion de anodo y catodo aterrizado sin fotodiodo
(Figura 3.4).

Figura 3.2: Longitud de onda caracterstica del diodo laser[50].

41
Figura 3.4: Diagrama de conexiones del diodo laser. Al carecer de un fotodiodo de
retroalimentacion, el pin 1 del diodo se deja desconectado[50].

Figura 3.3: Relacion Potencia/Corriente del diodo laser. Por ejemplo, si se suministra
una corriente de 250mA, la potencia de salida del diodo laser sera de 80mW . Para
obtener los 100mW de potencia de salida es necesario suministrar una corriente de
286mA[50].

42
3.1.2. Driver de Corriente Constante.

Debido a que la frecuencia y la potencia de salida dependen de la temperatura del

diodo y de la corriente suministrada, la operacion estable del diodo laser requiere que
estos dos parametros esten precisamente regulados[51]. Ademas deben de operar en
modo de Onda Continua (CW por sus siglas en ingles, Continuous Wave) debido a que
deben de estar emitiendo luz de forma constante. Actualmente existen Drivers capaces
de proporcionar estas caractersticas para los diodos laser, en este trabajo se utilizo un
driver Thorlabs IP500 (Figura 3.5):

Figura 3.5: Driver Thorlabs IP500.

El IP500 es un driver universal para diodos laser que trabajan en modo de onda
continua, es capaz de operar como Control Automatico de Corriente Constante (ACC,
por sus siglas en ingles, Automatic Constant Current) o como Control Automatico de
Potencia Constante (APC, por sus siglas en ingles, Automatic Constant Power). Como
alimentacion requiere una fuente de alimentacion regulada de 5V a 500mA. En este
trabajo se utilizaron los reguladores de voltaje LM7805 para el suministro de +5V y el
LM7905 para el suministro de 5V . El dispositivo cuenta con cuatro distintos puntos
de medicion (Test Points) y un punto com
un para el ajuste de potencia y corriente
mediante distintos potenciometros. Las lecturas de los cuatro test points se realizaron

43
utilizando un multmetro digital con respecto al test point com
un. Al no contar con un
fotodiodo conectado al laser no es posible hacer una lectura de retroalimentacion, por
lo tanto solo se realizo un monitoreo a la corriente suministrada en el laser. Los test
points y sus potenciometros se muestran en la Figura 3.6:

Figura 3.6: Conexion del Driver Thorlabs IP500.

El test point etiquetado como Ild proporciona una lectura analogica de la corriente
actual en el diodo laser, se utiliza la funcion de transferencia 1V = 1A, es decir,
cada Volt ledo corresponde a un Ampere. Se ajusta utilizando el potenciometro P/I
ADJ, el cual debe de estar girado totalmente hacia la izquierda antes de encender el
driver. Conforme se gira el potenciometro hacia la derecha, aumenta la corriente que
es suministrada al diodo laser (Figura 3.7). La lectura maxima que se puede obtener
en este test point es de 0.5mV = 0.5mA, aunque dependiendo de los parametros de
operacion del diodo laser, el ajuste va a variar. Despues de realizar las mediciones, es
necesario que potenciometro sea girado otra vez totalmente hacia la izquierda.

44
 Figura 3.7: Ajuste del Potenciometro P/I ADJ.

El test point IPd permite una lectura de la corriente de retroalimentacion que esta
siendo producida por el fotodiodo. En este trabajo no se considera este test point ya
que el diodo laser utilizado no cuenta con un fotodiodo conectado para el monitoreo. El
test point PLIM se configura con el potenciometro PLIM ADJ, es el que permite ajustar
la potencia maxima con la que el fotodiodo puede trabajar, la funcion de transferencia
es 1V = 1mA con un ajuste maximo de 2.5V = 25mA. Al igual que IPd, al no tener
un fotodiodo conectado al laser, este test point no se considero en las mediciones, por
precaucion se giro este potenciometro totalmente hacia la derecha.

El u
ltimo test point es el ILIM, que al igual que PLIM, permite monitorear un nivel
maximo de corriente, solo que ahora en el diodo laser en vez del fotodiodo. La funcion
de transferencia de este test point es 1V = 1A con un ajuste maximo de 0.5V =
500mA. En esta parte fue de gran importancia rotar totalmente hacia la derecha el
potenciometro ILIM ADJ y de esta forma tener 500mA como el valor maximo de
corriente soportada. El diodo laser tiene un valor maximo de 310mA, de esta forma no
existio mayor problema con el lmite de corriente suministrada. Todas las mediciones

45
de los test points se realizaron con referencia al test point com
un TP GND.

3.1.3. Medici
on de la Potencia Optica.

Para realizar las pruebas al laser se selecciono el modo de operacion en CW y el

potenciometro optico Newport 1918-C con el detector 918D-SL-OD3 (Figura 3.8) con-
figurado para detectar una longitud de onda de 786.8nm.

Figura 3.8: Potenciometro Digital Newport 1918-C y Detector 918D-SL-OD3.

Una vez que se configuro el driver y el potenciometro se midio la potencia de salida

del diodo laser entre los test points ILIM e TP GND (Figura 3.9).

Figura 3.9: Lectura de los Test Points.

46
Las lecturas del test point se observan en la Figura 3.10, como se menciono en la seccion
3.1.2, si se obtiene un voltaje de 150mV es equivalente tener una corriente de 150mA:

Figura 3.10: El voltaje ledo corresponde a la corriente suministrada al diodo laser.

De acuerdo a la Figura 3.3 al suministrar 150mA de corriente al diodo laser, se obtendra

una potencia de salida de 30mW , para verificar esta informacion se incidio el diodo
laser directamente sobre el detector 918D-SL-OD3 como se muestra en la Figura 3.11:

Figura 3.11: Medicion de la Potencia Optica del Diodo Laser.

En el potenciometro optico puede observarse el valor de la potencia de salida del diodo

laser, en este caso 30mW (Figura 3.12).

47

Figura 3.12: Potenciometro Optico.

De acuerdo a la Figura 3.3, para obtener los 100mW de potencia requeridos, se debe
suministrar una corriente de 286mA al diodo laser. Esto se obtuvo ajustando el poten-
ciometro P/I ADJ hasta obtener una lectura de 286mV en el multmetro. Finalmente,
en el potenciometro optico se observa la potencia optica obtenida (Figura 3.13).

Figura 3.13: De izquierda a derecha: Lectura de los 286mV y de los 100mW .

48
3.2. Gua de Conducci
on para la Fuente de Ilumi-
naci
on y Esparcimientos Raman.

3.2.1. Sonda Bifurcada.

La Gua de Conduccion es el medio por donde el haz de luz proveniente de la fuente

de iluminacion es transmitido hacia la muestra, y por donde los esparcimientos son
recolectados. En la espectroscopia Raman existen dos tipos de gua conduccion: arreglos
opticos (que incluyen elementos como espejos dielectricos, lentes enfocadores, etc.) y

Fibras Opticas. Para aplicaciones donde se requiera el uso de un laser, la fibra optica
presenta considerables ventajas ya que con ella es posible tener acceso a puntos de
difcil acceso en la muestra.

La ventaja de utilizar una fibra optica es que se puede utilizar tanto para para la fuente

de iluminacion y para la parte de recoleccion de la luz. La Fibra Optica Bifurcada con-
siste de una fibra central utilizada para la fuente de excitacion y otro manojo de fibras
opticas en los bordes, que son las encargadas de recolectar los esparcimientos de luz.
En la Figura 3.14 se observa la configuracion de la fibra bifurcada para espectroscopia
Raman[19]:

Figura 3.14: Configuracion de la fibra optica bifurcada para espectroscopia Raman.

49
Este tipo de fibra optica tambien se utiliza en mediciones como reflectancia o analisis
de fluorescencia [52]. Una fibra optica para aplicaciones espectroscopicas consiste de
un n
ucleo (Core), un recubrimiento dopado (Cladding) (Figura 3.15) y una cubierta
(Jacket) para la proteccion de la fibra optica.

Figura 3.15: N
ucleo (Core) y Recubrimiento (Cladding) de una Fibra Optica.

Cuando un haz de luz proveniente de un medio N1 incide sobre una interfaz a un angulo
incidente i , se produce una transmision total a un medio N2 y una reflexion mnima
en el medio N1 . Por otro lado, cuando el angulo incidente aumenta con respecto a la
normal y se vuelve paralelo a la interfaz, el angulo de refraccion t alcanzara un valor
de 90, dando como resultado una refraccion paralela de la interfaz, a este valor se le

conoce como Angulo Crtico (c ).

Cuando el haz de luz incidente alcanza un angulo mayor al angulo crtico se producira
una reflexion total en el medio N1 y una refraccion nula el medio N2 , es decir, el haz de
luz no se transmitira al medio N2 y se propagara por el medio N1 . A este principio se le
conoce como Reflexion Total Interna. En la Figura 3.16 se observa una representacion
de dicho principio.

50
Figura 3.16: Refraccion del haz de luz incidente del medio N1 al medio N2 (lneas roja
y verde).

Cuando el angulo incidente i aumenta con respecto a la normal, el angulo de refraccion

t alcanzara un valor de 90 y se refracta sobre la interfaz (lnea azul). Cuando el angulo
incidente i alcanza un valor tal que el angulo refractado t > 90 se producira una
reflexion total al medio N1 (lnea morada). Utilizando la ley de Snell es posible calcular
el angulo crtico:

N1 sini = N2 sint (3.1)

Aplicando la condicion del angulo crtico t = /2 y sustituyendo en la Eq. 3.1 se

obtiene:

N1 sinc = N2 sin(/2) = N2 (3.2)

Finalmente el angulo crtico queda expresado como:

c = sin1 (N2 /N1 ) (3.3)

51
El angulo crtico existe solo si una onda se propaga de un medio mas denso a otro menos
denso, por lo tanto la reflexion total interna solo se produce cuando N1 > N2 [53]. Para
que sea posible introducir un haz de luz en la fibra optica es necesario que dicho haz

de luz se encuentre dentro del Angulo Maximo de Aceptancia de la fibra max . Cuando
un haz de luz es dirigido a un extremo de la fibra optica, todos los rayos de luz que
esten dentro del angulo de aceptancia son propagados dentro de la fibra optica, todos
los rayos que excedan este angulo pasan a traves del cladding y son absorbidos. Las
fibras opticas pueden recibir y emitir luz dependiendo de su Apertura Numerica (N.A.
por sus siglas en ingles Numerical Aperture), que se define como la medicion del angulo
maximo necesario para que un sistema optico pueda recibir luz[54]. Volviendo a aplicar
la ley de Snell es posible calcular la apertura numerica de la fibra:

q
N sinmax = N12 N22 (3.4)

Donde N es el indice de refraccion del medio (aire, agua, tejido biologico, etc.), max es
el angulo de aceptancia y N1 y N2 son los indices de refraccion del core y del cladding
respectivamente. La parte izquierda de la ecuacion se define como la apertura numerica
de la fibra (N.A.).

En la actualidad existen diversos tipos de fibras opticas, ya sea para redes de datos,
aplicaciones biomedicas, para tecnicas de espectroscopia, etc. Tambien existen distintos
tipos de fabricantes, los cuales ofrecen modelos que van desde un cable simple de fibra
optica, hasta un arreglo de n fibras opticas compactadas. Todos los tipos distintos de
de fibras opticas tienen sus caractersticas y al igual que el diodo laser, dependiendo
de la aplicacion requerida, el tipo de fibra optica ideal para la aplicacion puede variar
dependiendo de su modo, de las caractersticas del core y del cladding, de la apertura
numerica, del diametro, del rango de longitudes de onda, del conector incluido y de la
longitud de la fibra optica. En este trabajo se utilizo una sonda bifurcada para reflexion
Ocean Optics R200-7-VIS-NIR como gua de onda para el haz de luz proveniente de la
fuente de iluminacion y como fuente de coleccion para los esparcimientos Raman[55].
Las especificaciones de la sonda proporcionadas por el fabricante son las siguientes, y
en base a ellas se realizo el dise
no de la sonda Raman:

52
 Diametro: 200m.

Apertura Numerica (N.A.): 0.22.

Angulo de Aceptancia ( max ):

1. Para N = 1 (Aire).

a) max = 12.7.

2. Para N = 1.36 (PielHumana)[56].

a) max = 9.3.

Rango de Longitudes de Onda: 400 2100nm.

Esta sonda consiste en un arreglo de seis fibras opticas de igual diametro alineadas
alrededor de una sola fibra central tambien del mismo diametro optimizadas para tras-
mitir longitudes de onda en el rango de los 400nm a los 2, 100nm (Visible/Infrarrojo).
Dicho arreglo consiste en dos extremos, uno con la fibra central que usualmente se
utiliza como gua de onda para la fuente de iluminacion y otro extremo con las fibras
que rodean a la fibra central, que se utilizan para colectar los esparcimientos (Figura
3.17).

Figura 3.17: Sonda Bifurcada, en un extremo se observa la fibra central y del otro
extremo se observan las fibras colectoras.

El extremo de la fibra central se conecto a el diodo laser utilizando un adaptador

Thorlabs ADAFCSMA1 ya que la fibra optica trenzada del diodo laser contiene un
conector FC/PC y la sonda tiene un conector SMA 905. Este adaptador fue de gran
importancia, ya que por sus especificaciones tecnicas, acomoda los n
ucleos de ambas

53
fibras y minimiza las reflexiones no deseadas haciendo contacto fsico entre ambas fibras
(Figura 3.18).

Figura 3.18: Adaptador ADAFCSMA1.

El extremo de las fibras colectoras fue conectado a un arreglo optico, de esta forma fue
posible caracterizar una sonda Raman basada en fibras opticas.

3.3. Sonda Raman.

Una Sonda Raman es esencialmente una fibra optica con un arreglo optico integrado. La
modificacion necesaria en la fibra optica es un arreglo optico para aislar el esparcimiento
Rayleigh de la luz que es colectada, para bloquear este esparcimiento existen distintos
tipos de arreglos opticos como filtros Notch, pasa banda, de interferencia, de borde
(Edge), filtros pasa-altas, etc. (Figura 3.19) El mas adecuado es el filtro Notch o de
Muesca ya que posee una longitud de onda especfica que es la que sera bloqueara.
Una vez filtrado el esparcimiento Rayleigh solo se tiene que volver a acoplar el rayo de

54
luz resultante a la fibra optica, ahora llamada fibra colectora, de esta manera solo se
tendran lecturas de los esparcimientos de luz. Dicho arreglo se divide en tres partes:

Colimacion.

Filtrado.

Acoplamiento.

Figura 3.19: Tipos de filtros que son acoplados a la fibra optica. De izquierda a derecha:
Pasa-Banda (Interferencia), Notch o de Muesca, Pasa-Altas y Pasa-Bajas.

Una Lente se define como un dispositivo refractor (una discontinuidad en el medio pre-
dominante) que reconfigura una distribucion de energa transmitida[54], esto es, cuando
un haz de luz incide sobre una lente, esta puede ser configurada de distintas formas
para remodelar el haz incidente. Estas configuraciones pueden ser fuentes convergentes
y divergentes que a la vez pueden ser utilizadas como Colimadores y Acopladores.

Una Fuente Convergente es aquella donde los rayos de un haz de luz originalmente
paralelo se propagan hacia un punto de interseccion (Punto Focal). Una Fuente Diver-
gente es aquella donde los rayos de un haz de luz originalmente paralelo se propagan en
direcciones diferentes alejandose el uno del otro, es decir, los rayos de luz se extienden.
En ambos casos los rayos de luz resultantes no son paralelos entre si. Un Punto Focal se
define como un punto donde una lente debe de ser colocada para obtener una imagen
fiel de un haz que incide sobre ella [57]. La distancia que existe entre el punto focal y
la lente recibe el nombre de Distancia Focal.

55
Utilizando el punto focal de una lente y la distancia focal es posible obtener un Coli-
mador, el cual consiste en un haz que se propaga con todos sus rayos de luz paralelos
y con un grado mnimo de convergencia o divergencia. Este tipo de configuracion es
de gran utilidad si se requiere procesar el haz de luz proveniente de una gua de onda
y tiene aplicaciones en sistemas de comunicacion de radio, radares, sistemas sonares y
de comunicaciones opticas [57]. Tambien es posible obtener un Acoplador, con el cual
es posible volver a introducir el haz de luz a la gua de onda para posteriormente ana-
lizar la se
nal optica procesada en la PC. En el presente trabajo se utilizo el dispositivo
Thorlabs PAF-SMA-5-B, que es un micro posicionador con cinco grados de libertad:
dos para ajustar linealmente la lente en los ejes X y Y y tres para para un ajuste
angular en el eje Z. La distancia focal efectiva del microposicionador es de 4.6mm y su
N.A. es igual a 0.47. Para asegurar un acoplamiento correcto es necesario que la N.A.
del dispositivo optico para colimar/acoplar un haz de luz sea por lo menos el doble que
la la N.A. de la fibra optica [58]. Ademas cuenta con un recubrimiento anti reflexion
para un rango de longitudes de onda de 600 1050nm y adaptador SMA 905 com-
patible con las fibras opticas utilizadas en este trabajo. Realizando las configuraciones
necesarias es posible utilizar el dispositivo para colimar, acoplar, converger o diverger
un haz de luz [59](Figura 3.20).

Figura 3.20: Distintas configuraciones del microposicionador PAF-SMA-5-B.

56
3.3.1. Colimaci
on.

Para realizar una colimacion optima primero es necesario obtener una caracterizacion
del diodo laser, es decir, evaluar como responde a determinados niveles de voltaje
y a que temperaturas funciona correctamente. Dichas mediciones fueron realizadas
utilizando el diodo laser a una potencia aproximada de 100mW y el dispositivo PAF-
SMA-5-B configurado como colimador (Figura 3.21). Partiendo de las mediciones se
describen en la seccion 3.1.3 lo siguiente fue hacer el ajuste necesario al dispositivo
optico.

Figura 3.21: Colimador/Acoplador Thorlabs PAF-SMA-5-B.

Realizando la conexion al colimador (Figura 3.22) y ajustando el diodo laser a una

potencia de 100mW (Figura 3.23) al momento de realizar la colimacion y midiendo la
potencia colocando el detector a una distancia de 3cm del colimador (Figura 3.24) se
obtuvo una potencia de 92mW (Figura 3.12).

Figura 3.22: Conexion del diodo laser a la fibra optica y al colimador.

57
Figura 3.23: Lectura del multmetro para la colimacion.

Figura 3.24: Deteccion de la potencia del haz colimado.

Figura 3.25: Potencia del haz colimado.

58
3.3.2.
Acoplamiento a la Fibra Optica.

Una vez que se obtuvo una colimacion efectiva el siguiente paso a desarrollar fue el
acoplamiento a la fibra optica, es decir, volver a introducir el laser dentro de la fibra
optica. En esta parte fue necesario realizar otra prueba de colimacion a una distancia
igual a la del acoplador para posteriormente a
nadir el acoplador y realizar los ajustes
necesarios para obtener la misma potencia que la del rayo colimado. Tambien fue
necesario tener el colimador en una posicion fija, esto con el fin de evitar mediciones
erroneas en la medicion de la potencia.

Para realizar la caracterizacion del acoplador se coloco el detector a una distancia de

aproximadamente 10cm (Figura 3.26) del colimador con el IP500 configurado para
obtener una potencia de salida de 100mW . Por la distancia a la que fue colocado el
detector se obtuvo una potencia de salida de 70mW , esto debido en gran parte a la
distancia focal del PAF-SMA-5-B (Figura 3.27 ).

Figura 3.26: Deteccion sin acoplador.

59
 Figura 3.27: Referencia para el acoplamiento a la fibra optica.

Posteriormente se coloco el siguiente microposicionador junto al colimador, alineandolo

de tal forma que ambos estuvieran a la misma altura y que los diametros de ambas
lentes estuvieran de frente (Figura 3.28). Siguiendo los pasos para acoplamiento[59] se
obtuvo una potencia de salida de aproximadamente 65mW (Figura 3.29). Esto se debe
a que una vez que el haz colimado incide sobre la lente del acoplador se produce una
refraccion ocasionando que se pierda el efecto de la colimacion en el haz refractado,
por lo tanto este se propaga de forma divergente dentro de la fibra optica y si no se
vuelve a realizar una colimacion existiran perdidas en la potencia.

Figura 3.28: Colimador y Acoplador a la fibra optica.

60
 Figura 3.29: Potencia de Salida del acoplador.

3.3.3. Filtrado.

Despues de obtener una colimacion, un punto intermedio en la caracterizacion de la

sonda Raman fue la parte de filtrado, ya que si se presentan perdidas considerables en
la se
nal Raman es posible trabajar sin un filtrado siempre y cuando se tenga cuidado al
momento de incidir la sonda sobre la muestra. Una vez obtenida una colimacion efectiva
es recomendable realizar primero el acoplamiento a la fibra optica y despues colocar
el filtro. El filtro debe ser colocado entre ambos colimadores respetando la distancia
focal. En las Figuras 3.30 y 3.31 se muestra el montaje final del arreglo optico.

Figura 3.30: Microposicionadores y Filtro Notch.

61

Figura 3.31: Arreglo Optico Final.

3.4. Detecci
on y Procesado de la Se
nal Raman.

Anteriormente se hacia una deteccion fotografica por largos periodos de tiempo para
poder procesar el esparcimiento Raman, posteriormente haba que realizar un analisis
con un microfotometro aumentando as el tiempo para la deteccion. En la actualidad
existen diversas tecnicas para realizar esta tarea en un tiempo mas optimo: conteo de
fotones, arreglo de fotodiodos, CCDs, detectores de InGaAs, etc. La mayora de estos
dispositivos estan basados en el efecto fotoelectrico, que convierte la luz en corrien-
te electrica. En la actualidad los sistemas de espectroscopia comerciales utilizan un
Espectrometro para la parte de deteccion de la se
nal Raman.

Un Espectrometro es un dispositivo optico-electronico utilizado para medir la densidad

de potencia espectral en funcion de la longitud de onda o frecuencia optica. El dispo-
sitivo combina elementos opticos y electronicos, que son ubicados de tal forma que sea
posible una deteccion lo mas eficiente posible. Debido a que en aplicaciones biologicas
la se
nal Raman es muy debil en comparacion con la fluorescencia, es de gran importan-
cia tener un sistema de deteccion con una baja Relacion Se
nal a Ruido (SNR, por sus

siglas en ingles, Signal-to-Noise Ratio) y una alta Resolucion Optica y Espectral, las
cuales dependen fuertemente de las caractersticas del espectrometro. Existen distintas
configuraciones en los espectrometros, como pueden ser los espectrometros basados en

62
Rejillas de Difraccion y/o Prismas y los espectrometros interferometricos.

En este trabajo se utilizo un espectrometro Ocean Optics USB4000-VIS-NIR tipo

Czerny-Turner y el software compatible Spectra Suite, con el que es posible realizar
mediciones como absorbancia y reflectancia en tiempo real[60] (Figura 3.32). Con este
software es posible configurar el Tiempo de Integracion, el cual se define como el perio-
do de tiempo en el cual la luz detectada es acumulada, entre mayor sea el tiempo de
integracion, mayor sera el grado de deteccion, pero tambien es posible que el detector
se sature si el tiempo de integracion es demasiado alto. Tambien es posible configurar
el N
umero de Lecturas a Promediar, el cual determina el n
umero de adquisiciones para
posteriormente realizar un promedio, por lo tanto aumentando el n
umero de lecturas
a promediar, es posible obtener un espectro con menor contribucion de ruido. Al igual
que el tiempo de integracion, si el n
umero de lecturas a promediar es demasiado alto,
el detector se puede saturar o incluso el software se puede volver excesivamente lento.
Tambien es posible configurar el Ancho de Lectura, con el cual es posible promediar
dos bandas adyacentes, que al igual que los parametros anteriores, si se configura con
un valor alto, el espectro final puede cambiar drasticamente. Por precaucion, en este
trabajo solo se configuro el tiempo de integracion en un rango de 100ms a 10s, y el
n
umero de lecturas a promediar en un rango de 1 a 10 lecturas.

Figura 3.32: Espectrometro Ocean Optics USB4000-VIS-NIR.

63
El dise
no Czerny-Turner consta de cinco partes: una apertura de entrada (Slit), un
espejo colimador, una rejilla de difraccion (Grating), un enfocador y un detector. El
espectrometro tiene el siguiente funcionamiento: el haz de luz entra al espectrometro
por el slit para posteriormente ser direccionado hacia el espejo colimador, donde el haz
de luz es configurado para que sus rayos se propaguen paralelamente hacia el grating,
en donde el haz de luz es dispersado en sus componentes espectrales incidiendo sobre
un espejo enfocador, el cual direcciona el haz disperso hacia el detector[60].

En la Figura 3.33 se observa el diagrama esquematico general del espectrometro tipo

Czerny-Turner proporcionado por el fabricante[60], y el cual es el que se utilizo en este
trabajo. Ademas de estos componentes el espectrometro cuenta con dispositivos optico-
electronicos opcionales como lentes enfocadores, filtros y amplificadores para optimizar
la se
nal del detector.

Figura 3.33: Componentes del Espectrometro Ocean Optics USB4000-VIS-NIR: (1)

Conector SMA 905, (2) Slit, (3) Filtro (opcional), (4) Espejo Colimador, (5) Grating,
(6) Enfocador, (7) Lente Colectora, (8) Detector, (9) Filtro Pasa-Altas (opcional) y
(10) Amplificador del Detector (opcional).

Cada sistema Raman tiene sus caractersticas especficas y estas son proporcionadas
por el fabricante. En este trabajo, al utilizarse un espectrometro modular, es necesario

64
calcular dichas caractersticas de un sistema Raman a partir de las caractersticas del
espectrometro utilizado. Las caractersticas del espectrometro USB4000-VIS-NIR y
sus componentes de fabrica, por lo tanto y a partir de ellos es posible determinar la
resolucion espectral y optica del sistema Raman:

Rango de Longitudes de Onda: 345.9 1, 038.5 = 693nm.

Apertura de Entrada (Slit): 25m.

Resolucion Optica (FWHM ): 1.42nm.

Rejilla de Difraccion (Frecuencia del Grating): 600grooves/mm.

Resolucion de Pxel: 7.5 pixeles.

Elementos del Detector: 3, 648.

Blaze: 500nm.

Distancia Focal de Entrada: 42mm.

Distancia Focal de Salida: 68mm.

SNR: 300 : 1.

Antes de trabajar con el espectrometro fue de gran importancia realizar una carac-
terizacion del rango de deteccion de longitudes de onda. Para realizar esta tarea se
utilizo una lampara de luz blanca de tungsteno Ocean Optics LS-1 conectada a un
extremo de la sonda bifurcada, el otro extremo de la sonda se conecto directamente
al espectrometro. Se realizo una incidencia directa sobre una superficie blanca, de es-
ta forma se comprobo el rango de deteccion del espectrometro. Se se observo que al
utilizar los 786.8nm del diodo laser, el porcentaje de deteccion del espectrometro para
esa longitud de onda es de aproximadamente 52.99 % (Figura3.34). Por lo tanto se
concluyo que el detector del espectrometro es adecuado para la aplicacion propuesta.

65
Figura 3.34: Rango de Deteccion del Espectrometro USB4000-VIS-NIR utilizando la
lampara LS-1. Se observa el porcentaje de deteccion de la longitud de onda del diodo
laser ( 786.8nm ).

3.4.1. Apertura de Entrada.

El Slit se define como la apertura de entrada del espectrometro. En esta parte el haz
de luz incidente proveniente de la fibra optica es transmitido de forma divergente hasta
encontrarse con un colimador. A partir del diametro del slit y la Resolucion de Pxel

es posible determinar el Angulo de Difraccion del Slit utilizando la Eq. de Young :

mD
Y = (3.5)
S

Donde Y es la distancia de proyeccion de la imagen proveniente del slit, es la longitud

de onda del haz de luz incidente, D es la distancia focal entre el slit y la proyeccion de la
imagen, m la Resolucion de Pxel y S el diametro del slit(Fig.3.35). En ausencia de un
slit, el diametro de la fibra optica es utilizado como reemplazo, lo cual puede resultar
inconveniente si se considera que la fibra optica tiene un diametro mucho mayor al de
un slit.

66
 Figura 3.35: Diagrama de un Slit.

El espectrometro utilizado en este trabajo cuenta con un slit fijo con un diametro de
25m, una distancia focal de 42mm y una Resolucion de Pxel de 7.5 [60]. Realizando
las sustituciones de valores en la Eq. 3.5 y partiendo de la Fig. 3.35 se obtiene el angulo
de difraccion del slit:

(7.5) (786.8nm) (42mm)

Y = = 9.91mm (3.6)
25m

Y 9.91mm
= tan1 ( ) = tan1 ( ) = 13.27 (3.7)
D 42mm

3.4.2. Rejilla de Difracci

on.

Un Grating o rejilla de difraccion es un arreglo periodico de elementos difractivos gra-

bados sobre una superficie reflectora o transparente (es decir, puede ser una superficie
metalica o transparente) que es capaz de alterar la magnitud o fase de un haz de luz
incidente[54]. Los elementos difractivos de un grating com
unmente son lneas finamen-
te separadas entre si llamadas Grooves y se expresan como ( grooves/mm ). A este
parametro com
unmente se le denomina Frecuencia de Groove. Existen distintos tipos

67
de gratings: de transmision, de reflexion, de superficie holografica, los blazed gratings
y los gratings con la configuracion de Littrow.

La eficiencia de un grating depende de distintos parametros complejos [61]. Debido a

su extenso principio, el analisis de todos estos parametros esta fuera del alcance de esta
tesis por lo que se abordara una descripcion general acerca del principio de operacion
de un grating de reflexion:

Ecuacion de un Grating.

Ordenes de Propagacion.

Ordenes Evanescentes.

Eficiencia de Difraccion.

Dispersion de un Grating.

Rango Espectral de un Grating.

Corte de Ordenes.

Guas de Onda Incidentes.

Resolucion de un Grating.

Montado de un Grating (Mounting).

Eficiencia de un Grating (Condicion Blaze).

Flujo del Haz de Luz Incidente.

Energa del Haz de Luz Incidente.

Frecuencia de un Grating (Frecuencia de Groove).

Cuando un haz de luz incide sobre la superficie de un grating, es difractado por los
grooves, por lo tanto cada groove se convierte en una peque
na fuente de luz reflejada
o transmitida. La principal utilidad de un grating es que existe un u
nico conjunto de

68
angulos donde los esparcimientos de luz estan en la misma fase [62]. En la Figura 3.36
se observa el principio geometrico de un grating.

Figura 3.36: Incidencia y Difraccion en un Grating [61].

Si se tiene un haz de luz incidiendo a un angulo i con respecto a la normal de grating.

Tomando la diferencia de trayectoria geometrica entre el haz de luz incidente y el haz
de luz difractado por los grooves en direccion d se obtiene:

dsini + dsind (3.8)

Donde d es el periodo del groove, se expresa en m y se calcula tomando el n

umero
inverso de la frecuencia de groove, i es el angulo de incidencia y d es el angulo de
difraccion. De acuerdo al principio de interferencia de ondas, cuando la Eq 3.8 es
igual a la longitud de onda del haz de luz o a cualquier m
ultiplo entero de ella, los
componentes difractados del haz de luz estaran en la misma fase. La capacidad del
grating para difractar un haz de luz en sus componentes espectrales de manera clara se
expresa como la Ecuacion del Grating utilizada en la difraccion clasica, donde el haz
de luz incidente y el haz de luz difractado estan en el plano perpendicular a los grooves,

69
es decir, que cualquier haz de luz se encuentra en el centro del grating[62]:

m
sini + sind = (3.9)
d

Donde es la longitud de onda del haz de luz incidente y el orden de difraccion

m representa el n
umero de longitudes de onda entre la luz reflejada por los grooves,
usualmente es un m
ultiplo entero de [63]. Como se menciono anteriormente existen
distintos tipos de gratings, entre ellos el Blazed Grating. El Blaze se define como la
concentracion de una region limitada del espectro en cualquier orden distinto de cero (
m 6= 0 ), un blazed grating se dise
na para obtener una mayor eficiencia a una longitud
de onda especfica cuando se cumple la condicion:

m = 2dsinB (3.10)

Donde a B se le llama Angulo Blaze, y es el angulo formado entre la cara del groove
y el plano del grating (Figura 3.37).

Figura 3.37: Condicion del Blaze. Se muestra el angulo de incidencia (i ) y de difraccion

(d ) en relacion al angulo del blaze (B ). F N es la normal de la cara del groove y GN
es la normal del grating [62].

70
Para que la condicion del blaze sea satisfecha, es necesario que la normal de la cara
del groove bisecte con el angulo producido entre el haz incidente con el haz de luz
difractado [62]. Es importante mencionar que cuando la Eq. 3.10 no se cumple, la
eficiencia del grating disminuye de manera considerable. En este trabajo se utilizo un
grating en posicion fija con una frecuencia de groove de 600grooves/mm, un periodo
de groove de 1.66m y un blaze a 500nm. En la Figura 3.38 se observa que la eficiencia
del grating utilizado alcanza su maximo a una longitud de onda de aproximadamente
500nm [60].

Figura 3.38: Eficiencia de los gratings disponibles para el espectrometro USB4000-

VIS-NIR en el rango espectral de 350 1000nm. El grating utilizado es el n
umero 3
[60].

3.4.3. Resoluci
on Optica.

La Resolucion Optica de un espectrometro (FWHM, por sus siglas en ingles, Full Widht
at Half Maximum) se define como la capacidad del espectrometro para diferenciar una
determinada banda de otra banda cercana y depende de las caractersticas del grating
y del slit [60]

Entre mayor sea la frecuencia de groove del grating, mayor sera la resolucion,
pero el rango espectral se vera reducido.

Entre menor sea el diametro del slit mayor sera la resolucion, pero la se
nal sera

71
 mas debil.

Para determinar la resolucion optica del espectrometro el primer paso fue calcular el
grado de Dispersion del espectrometro a partir del rango de longitudes de onda y del
n
umero de detectores del espectrometro:

Rango() 693nm
Disp. = = = 0.189nm/pixel (3.11)
N o.Detectores 3648pixeles

Una vez calculada la dispersion, fue posible determinar la resolucion optica:

Res.Optica = (Disp.) (ResP ixel) = (0.189nm/pixel) (7.5pixel) = 1.42nm (3.12)

De acuerdo a las especificaciones tecnicas del espectrometro, si la longitud de onda de

inicio es de 345.9nm y el Rango Espectral es de 693nm, la resolucion optica sera de
1.42nm. Si se reduce el rango espectral la resolucion optica sera mayor (Figura 3.39):

Figura 3.39: Relacion del rango espectral en funcion de la longitud de onda de inicio
del espectrometro [60].

Con la resolucion optica es posible identificar las bandas del espectrometro que esten a
una distancia de 1.42nm, ahora el siguiente paso fue determinar la Resolucion Espectral,

72
que es la separacion entre dos bandas de un espectro en funcion de la longitud de onda
del haz de luz incidente. Tomando la longitud de onda del diodo laser (0 = 786.8nm =
12, 709.71cm1 ) y la resolucion optica del espectrometro se obtiene:

1 (nm) = 0 Res.Optica(nm) = 786.8nm 1.42nm = 785.38nm (3.13)

2 (nm) = 0 + Res.Optica(nm) = 786.8nm + 1.42nm = 788.22nm (3.14)

Realizando un cambio de unidades a las Eq. 3.13 y 3.14 de nm a cm1 se obtiene:

1 (cm1 ) = 0 Res.Optica(cm1 ) = 12, 732.68cm1 (3.15)

2 (cm1 ) = 0 + Res.Optica(cm1 ) = 12, 686.81cm1 (3.16)

Finalmente tomando la diferencia entre las Eqs. 3.15 y 3.16 con la longitud de onda
del haz incidente 0 = 12, 709.71cm1 se obtiene una resolucion espectral de 23cm1 .
Tpicamente el ancho de lnea en los espectros Raman para los solidos y lquidos es de
10cm1 y para tejido biologico es de 10 20cm1 debido a que es un medio turbio.
Los sistemas de espectroscopia Raman comerciales tienen una resolucion espectral de
aproximadamente 8cm1 [49], por lo tanto el resultado obtenido indica que el sistema
propuesto con los componentes indicados es de muy baja resolucion.

3.4.4. Charge Coupled Device.

En la actualidad los espectrometros cuentan con un Dispositivo de Carga Acoplada o

CCD (por sus siglas en ingles, Charge Coupled Device). El principio basico de operacion
de un CCD es el siguiente; se considera un arreglo de m n elementos foto sensitivos,
donde n es el n
umero de pixeles sensibles a determinadas longitudes de onda y m es

73
el n
umero de elementos formados por los n pixeles en cada renglon. Estos elementos
al detectar fotones generan foto electrones y los almacenan como una peque
na carga
electrica independiente [18] [14] [64]. Posteriormente las cargas que son almacenadas en
los m elementos se transfieren de abajo hacia arriba mediante un pulso de reloj, hasta
llegar a un registro serial, en donde mediante otro pulso de reloj, las cargas almacenadas
en los n pixeles del elemento se transfieren a un Convertidor Analogico-Digital (ADC,
por sus siglas en ingles, Analogic to Digital Converter) y finalmente son procesadas
como se
nales digitales mediante un microcontrolador, el cual realiza una cuatizacion
de las se
nales y posteriormente una visualizacion grafica de los datos adquiridos, que
en este caso es un espectro Raman. De esta forma es posible realizar un conteo de los
fotones incidentes sobre el CCD y as determinar su intensidad de acuerdo a la longitud
de onda incidente sobre el CCD. En la Figura 3.40 se observa el diagrama esquematico
de un CCD.

Figura 3.40: Diagrama esquematico de un CCD.

74
Una caracterstica muy importante de los CCDs es su Respuesta Espectral, tambien
conocida como Eficiencia Cuantica (QE, por sus siglas en ingles, Quantum Efficiency),
que se define como la capacidad del CCD para absorber fotones con determinada
longitud de onda, por lo tanto existen distintos tipos de CCDs configurados para
tener una QE mayor a distintas longitudes de onda. Al igual que el grating, este es un
factor de gran importancia para la deteccion de una se
nal Raman ya que la longitud de
onda de la fuente de excitacion tiene que corresponder con las caractersticas del CCD.
El espectrometro utilizado en este trabajo cuenta con un CCD Toshiba TCD1304AP
de 3648 elementos acomodados verticalmente, donde cada pixel tiene una dimension de
8m200m, el arreglo de todos los elementos tiene una dimension de 29.18mm200m
y una QE de 100 % a una longitud de onda de 550nm (Figura 3.41) [60] [65] Al igual
que el grating (Figura 3.37), se observa que el CCD tiene una mayor eficiencia en
aproximadamente 500nm.

Figura 3.41: Respuesta Espectral del CCD TCP1304AP [65].

La mayor ventaja de un CCD es su alta sensibilidad en un amplio rango de longitudes

de onda, velocidad de transmision de datos, bajo ruido y relativo bajo costo. Aunque
tambien deben de considerarse aspectos como el n
umero de elementos foto sensitivos,
ya que si se incrementa, existira mayor sensibilidad en el dispositivo, pero la lectura
sera mas lenta. En cambio, si se reduce el n
umero de elementos, la sensibilidad se vera

75
reducida. Una alternativa a este problema es utilizar dos o mas CCDs con el mismo
n
umero de elementos, de esta forma se tendra mayor velocidad en la lectura de datos
y mayor sensibilidad.

3.4.5. Rango Espectral.

El Rango Espectral de un sistema Raman se define como la seccion del espectro electro-
magnetico donde se encuentran las bandas que el sistema puede identificar dependiendo
de la resolucion optica. Dicho rango se calcula a partir de la longitud de onda incidente
y usualmente se expresa en cm1 , por ejemplo un sistema Ocean Optics IDRaman Mini
tiene un rango espectral de 400 2, 300cm1 y un laser con una longitud de onda de
785nm. Realizando el analisis descrito en el Captulo 2, es posible determinar el rango
de longitudes de onda que el sistema puede detectar. Tomando la diferencia entre la
longitud de onda del laser incidente 785nm = 12, 738.85cm1 y los lmites del rango
espectral:

1 = 12, 738.85cm1 400cm1 = 12, 338.85cm1 = 810nm (3.17)

2 = 12, 738.85cm1 2, 300cm1 = 10, 438.85cm1 = 957.95nm (3.18)

Por lo tanto, el sistema sera capaz de identificar las bandas que se encuentren en
un rango de longitudes de onda de 810 957.95nm. Ahora dado que el espectrometro
USB4000 no es propiamente un sistema Raman, es necesario calcular el rango espectral,
por lo tanto se tomo el rango de longitudes de onda 345.9 1, 038.5nm y se realizo la
conversion a cm1 :

LS = 1038.5nm = 9, 629.7cm1 (3.19)

LI = 345.9nm = 28, 910cm1 (3.20)

76
Finalmente, para calcular el rango de corrimientos Raman del sistema implementado
se realizaron las siguientes diferencias:

1 = 12, 709.71cm1 9, 629.7cm1 = 3, 080.01cm1 (3.21)

2 = 12, 709.71cm1 28, 910cm1 = 16, 200.29cm1 (3.22)

Por lo tanto, utilizando un laser con una longitud de onda de 786.8nm y el espectrome-
tro USB4000-VIS-NIR con la configuracion actual (slit, grating, blaze, etc.) el rango
espectral es de 16, 200.29 3, 080.01cm1 .

El amplio rango espectral y sus valores negativos se deben en gran parte a la sensibilidad
del espectrometro por la radiacion que se encuentra en el visible (V IS) 400 750nm y
parte del ultravioleta (U V ) 10 400nm, restringiendolo para aplicaciones en el visible
y en solo una parte del infrarrojo. En las secciones posteriores se realiza el analisis
este resultado y finalmente se da una conclusion y se proponen mejoras de dise
no
como trabajo a futuro. En la Figura 3.42 se observa la conexion realizada entre el
espectrometro y el arreglo optico.

Figura 3.42: Conexion Final del Espectrometro al Arreglo Optico.

77
3.5. Diagrama Esquem
atico del Sistema Raman Port
atil
Implementado.

Una vez realizados el dise

no y la construccion del sistema Raman portatil implementado
se muestra el diagrama esquematico de todo el sistema. En el diagrama se muestran
las conexiones exactas de todos los componentes opticos y electronicos, as como los
adaptadores de fibras opticas y softwares utilizados. Para una mejor visualizacion se
respetaron los colores de las conexiones y de los dispositivos, as como etiquetas para
una rapida identificacion de los componentes descritos a lo largo del presente Captulo.

Figura 3.43: Diagrama Esquematico del Sistema Raman Implementado.

78
Captulo 4

Pruebas y Validaci
on del Sistema
Raman Port
atil Implementado.

4.1. Espectro Raman del Silicio.

La primera parte de la validacion del sistema Raman portatil implementado fue realizar
mediciones sobre muestras que tienen espectros bien definidos como el Silicio (Si) [66],
que tiene bandas Raman caractersticas aproximadamente en 300cm1 y 521cm1 y
que se encuentran reportadas en la literatura y bases de datos para espectroscopia [67]
(Figura 4.1).

Figura 4.1: Espectro Raman del Silicio (Si) reportado en la literatura [67].

79
En base a este dato fue necesario realizar una medicion de Silicio para utilizarla como
referencia. En el proceso se utilizo un sistema Ocean Optics IDRaman Mini, cuyas
caractersticas son:

Longitud de Onda: 785nm.

Rango Espectral: 400 2, 300cm1 .

Rango de Longitudes de Onda: 810 957nm.

Resolucion Espectral: 8cm1 .

SNR: 1000 : 1.

Potencia de Salida: 100mW (50mW sobre la muestra).

Como se indico en el Captulo 3, mientras el equipo tenga mayor resolucion espectral,

el rango de longitudes de onda disminuira, en el caso del IDRaman Mini, el rango de
longitudes de onda es menor en comparacion con el del sistema portatil implementado.
La medicion se realizo incidiendo perpendicularmente el laser del sistema IDRaman
Mini sobre la muestra de Silicio (Figura 4.2):

Figura 4.2: Sistema Ocean Optics IDRaman Mini.

80
En la Figura 4.3 se observa el espectro obtenido del Silicio con el IDRaman en una
region de interes de 200 800cm1 donde se observan las bandas Raman en 300cm1 y
521cm1 . Es importante mencionar que el IDRaman tiene la resolucion necesaria para
resolver espectros tanto en solidos como en lquidos, ademas ajustando el enfoque de la
lente es posible obtener un espectro Raman con baja fluorescencia, ya que de momento
no se esta analizando ning
un tejido biologico.

Figura 4.3: Espectro Raman del Silicio (Si) utilizado como referencia.

De acuerdo a lo propuesto en el Captulo 3, utilizando el diodo laser de 786.8nm es

posible obtener una potencia de salida regulablr de 0 100mW sobre la muestra y
una resolucion espectral de 23cm1 , por lo que el sistema implementado tiene consi-
derables diferencias en comparacion con el IDRaman, ya que la resolucion espectral
es el factor determinante para obtener un espectro Raman valido. Ademas tomando
en cuenta la gran diferencia que existe en la SNR entre ambos sistemas, se observo
que el espectro Raman obtenido con el sistema implementado tendra mayor ruido y
su intensidad estara mas reducida y que debido a las caractersticas del grating y del
CCD la posibilidad de obtener un espectro Raman adecuado era muy baja.

Primero se realizo un desarrollo teorico. Si se utilizo como fuente de excitacion un haz

de luz con una longitud de onda de 786.8nm y se espera obtener corrimientos Raman
de 300cm1 y 521cm1 , a partir de estos datos se busca observar la longitud de onda
esparcida y determinar si se encuentra dentro del alcance de las configuraciones del

81
grating y del CCD (Seccion 3). Utilizando la informacion descrita en el Captulo 2, se
tiene la longitud de onda del haz incidente en nm y su conversion a cm1 :

0 = 786.8nm = 1, 2709.71cm1 (4.1)

Ahora, realizando las conversiones necesarias y la diferencia entre los n

umeros de onda
se obtiene:

S=300 (cm1 ) = (12, 709.71 300)cm1 = 12, 409.71cm1 (4.2)

S=521 (cm1 ) = (12, 709.71 521)cm1 = 12, 188.71cm1 (4.3)

Convirtiendo las unidades de las diferencias entre los n

umeros de onda de (cm1 ) a
(nm) se obtiene la longitud de onda esparcida. Se observa una mayor longitud de onda
en el haz de luz esparcido con respecto al haz de luz incidente:

S=300 (nm) = 12, 409.71cm1 = 805.82nm (4.4)

S=521 (nm) = 12, 188.71cm1 = 820.43nm (4.5)

Una vez realizado el analisis de las bandas del Silicio, se procedio a realizar la medicion
con el sistema Raman implementado. Se coloco la sonda sobre una base especial, de tal
forma que el laser incidiera directamente sobre la superficie del Silicio (Figura 4.4). Es
importante mencionar que debido al alto indice de refraccion del Silicio (N = 3.44), se
realizaron m
ultiples mediciones ya que al momento de variar la distancia de la sonda
hacia la muestra toda la lectura presentaba importantes cambios, donde en el peor de los
casos el CCD se saturaba debido a la alta reflexion generada. Una vez realizados varios
experimentos, por precaucion se coloco la sonda a un distancia de aproximadamente
0.5cm.

82
 Figura 4.4: Medicion del Silicio con el Sistema Raman Implementado.

De acuerdo a las especificaciones del grating [60] y del CCD [65], el espectrometro al-
canza su mayor eficiencia alrededor de los 500nm y conforme se aumenta la longitud de
onda, la eficiencia disminuye. Por lo tanto, con el sistema implementado es muy com-
plicado obtener una deteccion de longitudes de onda mayores a 800nm. Para realizar
las mediciones fue necesario ajustar los parametros del tiempo de integracion, prome-
diado de espectros y suavizado del programa Spectra Suite. Para obtener un espectro
mas definido es necesario ajustar el tiempo de integracion en el orden de los segundos,
aunque sera mas lento de procesar y tendra mas ruido ocasionado por el CCD. Para
eliminar dicho ruido existen dos opciones: una es realizar un promediado de n espectros

83
y la otra es realizar un suavizado donde se realiza un promediado de puntos adyacentes
en un solo espectro (Figuras 4.5 y 4.6).

Figura 4.5: Opciones del Software Ocean Optics Spectra Suite.

Figura 4.6: Software Ocean Optics Spectra Suite.

En la Figura 4.7 se observa la adquisicion de un espectro Raman crudo obtenido utili-

zando la configuracion implementada. Para comprobar que los componentes estuvieran
funcionando correctamente de acuerdo a lo mencionado en el Captulo 3 primero se
realizaron las mediciones sin el filtro notch con una potencia de salida de 50mW , un
tiempo de integracion de 1s, un promedio de 4 espectros e incidiendo a una distancia de
0.2cm de la muestra de Si. Una vez que se observo que todos los componentes funciona-
ban correctamente lo siguiente fue familiarizarse con el software Spectra Suite haciendo
distintas configuraciones al tiempo de integracion y promediado de espectros hacien-
do la incidencia a diferentes distancias e inclinaciones. Para realizar estas mediciones
siempre se estuvo observando que la temperatura del diodo laser no incrementara. Se
observa el rango espectral de 16, 171 3, 109.58cm1 calculado en el Captulo 3

84
Figura 4.7: Espectro Raman Crudo del Silicio (Si) obtenido con el Sistema Implemen-
tado.

Se tomo una de region de interes de los 200 800cm1 . Debido a que el Silicio no
produce fluorescencia, no se realizo un filtrado. Aunque si se analizan muestras biologi-
cas es recomendable realizar una eliminacion de la fluorescencia utilizando el algoritmo
Vancouver [45] con un polinomio de 5to grado. El espectro obtenido fue el siguiente:

Figura 4.8: Region de interes del espectro Raman del Silicio (Si).

En la Figura 4.8 se observan ambas bandas pero con una intensidad mucho menor,
ademas es importante mencionar que la densidad de las bandas estan relacionadas

85
con la resolucion espectral del sistema, por esta razon aparecen mas gruesas que en el
espectro de referencia. Tambien aparecen bandas en aproximadamente 200 y 650cm1
originadas por el alto tiempo de integracion de la medicion y por la ausencia de un
suavizado. Tambien es posible que dichas bandas sean contribuidas por la baja SNR
del espectrometro y por la ausencia de un filtro de lnea a la entrada.

Aumentando la potencia del diodo laser hasta los 100mW , con un tiempo de integracion
de 100ms y sin suavizado se obtuvo una se
nal mas limpia, sin las bandas anteriormente
mencionadas, pero tambien menos intensa debido al bajo tiempo de integracion (Figura
4.9):

Figura 4.9: Espectro Raman del Silicio (Si) obtenido con una potencia de salida de
100mW .

Analizando ambos resultados, se observo que la potencia de salida es un factor crucial

al momento de hacer las mediciones, ya que al momento de realizar la medicion con
una potencia 50mW hubo que aumentar el tiempo de integracion hasta 1s, en cambio,
con la potencia ajustada a 100mW , el resultado fue instantaneo (100ms) y con un
resultado similar al anterior. Aumentando el tiempo de integracion a 1s se obtuvo un
espectro con menos ruido y con las bandas mejor definidas (Figura 4.10).

86
Figura 4.10: Espectro Raman Crudo del Silicio (Si) obtenido con un tiempo de inte-
gracion de 1s y una potencia de salida de 100mW .

Realizando un zoom al espectro crudo, es posible observar el efecto de esparcimiento

sobre la muestra de Si (Figura 4.11). Como se menciono anteriormente, al aumentar el
tiempo de integracion, el espectro presenta mas ruido y mas en este u
ltimo caso debido
a la alta potencia, por lo tanto en este espectro fue necesario realizar un suavizado.

Figura 4.11: Efecto de esparcimiento observado sobre una muestra de Silicio.

Una vez obtenido el espectro a 100mW se procedio a colocar el filtro notch para
bloquear las bandas producidas por el esparcimiento Rayleigh y de esta forma analizar
las bandas resultantes producidas por el esparcimiento Raman (Figura 4.12). Se observo
una menor saturacion en la deteccion y mayor contribucion de ruido en el espectro, por

87
lo tanto se tuvo que realizar un suavizado en una region de interes de 200 800cm1 .
En esta parte final del trabajo se utilizo el software Matlab para el suavizado.

Figura 4.12: Espectro Crudo del Silicio con el Filtro Notch incluido en el sistema
implementado.

En la Figura 4.13 se observa el espectro en la region de interes despues del suavizado.

Cualitativamente presenta similitudes con el espectro de referencia, pero debido a la
gran diferencia de las resoluciones de los equipos y a precauciones tecnicas que se
mencionan mas adelante, hacer un analisis cuantitativo esta fuera del alcance de este
trabajo ya que se requieren hacer modificaciones al equipo comercial. La atenuacion de
las bandas en el espectro se deben al ruido de la medicion, debido a esto fue necesario
aumentar el grado del suavizado de la se
nal:

Figura 4.13: Espectro Final del Silicio.

88
4.2. Espectro Raman de la Piel.

Como se menciono en el Captulo 1, el objetivo principal del sistema es para realizar

pruebas in vivo en pacientes pediatricos con el fin de realizar diagnosticos individua-
lizados y de esta forma proporcionarle a el paciente informacion acerca de un posible
desarrollo de AD por medio de espectroscopa Raman utilizando como referencia el
espectro de la FLG. Para medir el espectro Raman de la piel, es necesario incidir la
sonda directamente sobre la piel, puede ser en la yema de los dedos o en la parte su-
perior de la axila. El espectro Raman de la piel tiene sus bandas caractersticas y a
partir de cualquier anomala en una de ellas es posible la deteccion de enfermedades
en la piel como la AD [68], Alergia al Nickel [69], Fibrosis Hepatica [7], Cancer de
Mama [42] y recientemente para la caracterizacion de Tejido Cerebral [70]. En todos
los trabajos mencionados anteriormente se utilizaron equipos como el Ocean Optics
Raman Systems R3000, que en su momento fue considerado como el estado del arte
para espectroscopa Raman a bajo costo y portatil, aunque sus dimensiones son mucho
mayores en comparacion con el Ocean Optics IDRaman Mini, ademas su precio sigue
siendo bastante elevado, por lo tanto, en la actualidad no se considera la mejor opcion
para realizar pruebas Raman In Vivo (Figura 4.14).

Figura 4.14: Sistema Ocean Optics Raman Systems R3000.

89
Las caractersticas del Raman Systems R3000 son las siguientes:

Longitud de Onda: 785nm.

Resolucion Espectral: 10cm1 .

Rango Espectral: 200 2700cm1 .

Rango de Longitudes de Onda: 797.52 996.13nm.

Potencia de Salida: 90 290mW .

Al igual que el IDRaman, el R3000 tambien posee una alta resolucion y un bajo rango
de longitudes de onda. En proyectos de aplicacion de radiacion infrarroja este punto
lejos de ser una desventaja, es el factor mas importante, ya que se busca solo trabajar
dentro del espectro del infrarrojo con el fin de evitar los efectos de la fluorescencia.
En cambio con el sistema implementado, al tener un mayor rango de longitudes de
onda, es seguro que la se
nal resultante sea en mayor parte efecto de la reflexion de
longitudes de onda en el visible y en el ultravioleta. Es importante mencionar que
por precaucion ninguna medicion realizada duro mas de 60s ya que, si es expuesto
a longitudes de onda que se encuentren dentro del rango del infrarrojo [65], el CCD
puede presentar da
nos irreparables como pueden ser: degradado en su resolucion y/o
en su foto respuesta no-uniforme (PRNU, por sus siglas en ingles, Photo Response Non-
Uniformity), descalibracion, etc. Un ejemplo de esto, es la saturacion que se produjo
al dejar pasar largos tiempos de adquisicion.

El espectro Raman de la piel in vivo utilizando un haz de luz incidente de 785nm

se muestra en la Figura 4.15, en ella se observa la ubicacion de las bandas Raman
caractersticas de la piel, cada una de ellas corresponde a un tipo de protena o enlace
[7] y han servido como referencia para innumerables trabajos de espectroscopia Raman
en tejido humano.

90
 Figura 4.15: Espectro Raman de la Piel[7].

Como se puede apreciar, el valor mnimo del espectro es de 853cm1 y realizando la con-
version de unidades se obtiene una banda en 841nm, entonces por el analisis realizado
anteriormente, con el sistema implementado sera muy complicado de resolver este tipo
de bandas por las caractersticas anteriormente mencionadas acerca del grating. Tam-
bien es importante mencionar que aunque con el detector incluido en el espectrometro
es posible obtener una deteccion hasta longitudes de onda en el rango de los 1, 000nm,
la eficiencia de deteccion no sera la optima. Las conversiones de las bandas del tejido
humano son las siguientes:

1, 749cm1 = 909.93nm.

1, 653cm1 = 902.05nm.

1, 445cm1 = 885.43nm.

1, 377cm1 = 880.13nm.

1, 303cm1 = 874.21nm.

1, 272cm1 = 872.07nm.

91
 1, 076cm1 = 857.42nm.

1, 030cm1 = 854.05nm.

1, 002cm1 = 852.01nm.

936cm1 = 847.25nm.

853cm1 = 841.33nm.

820cm1 = 839nm.

Se observa que para realizar mediciones Raman in vivo sobre la piel humana es nece-
sario contar con un detector que tenga un amplio rango de deteccion de longitudes de
onda. De acuerdo a la seccion 3.4, el CCD utilizado en este trabajo tiene la capacidad
para detectar dichas longitudes de onda, aunque la eficiencia de deteccion no sera la
optima, por lo tanto la capacidad del sistema para resolver las bandas Raman y el
rango espectral dependeran exclusivamente de las caractersticas del grating.

Para realizar las mediciones in vivo se coloco la sonda directamente sobre la piel, en
dos secciones, una en la yema del dedo (Figura 4.16) y otra sobre el antebrazo (Figura
4.17).

Figura 4.16: Medicion Raman de la Piel Humana en la Yema del Dedo.

92
 Figura 4.17: Medicion Raman de la Piel Humana en el Antebrazo.

Realizando las mediciones in vivo sobre tejido humano se obtuvieron espectros con
relativamente ninguna banda y alta contribucion de ruido (Figura 4.18). Dichos espec-
tros se obtuvieron variando el promedio de espectros entre 1 10 y con un tiempo de
integracion de 60s. Para suprimir los efectos del ruido en la medicion las pruebas se
realizaron en un ambiente con mnima iluminacion.

Figura 4.18: Espectro Raman de la Piel Crudo obtenido con el Sistema Implementado.

El siguiente paso fue procesar el espectro con el algoritmo Vancouver en un rango de

93
200 1, 800cm1 utilizando un polinomio de 5to grado y un suavizado para eliminar
las contribuciones del ruido (Figura 4.19).

Figura 4.19: Espectro Raman de la Piel Procesado obtenido con el Sistema Implemen-
tado.

Se observa de forma clara que ninguna de las bandas obtenidas corresponden a alguna
de las bandas reportadas en la literatura ni con ninguna de las obtenidas con el sis-
tema IDRaman ni el R3000, que son los equipos con los que se tuvo acceso, haciendo
practicamente imposible la capacidad de realizar un analisis cuantitativo como la co-
rrelacion entre espectros o el analisis por componentes principales (PCA, por sus siglas
en ingles, Principal Component Analysis). Por lo tanto, tomando en cuenta los resul-
tados obtenidos a lo largo del trabajo, se observo que con los componentes actuales,
el sistema implementado no es el adecuado para realizar mediciones en muestras que
tengan bandas mayores a los 500cm1 .

Como trabajo final, se dise

no un sistema resistente al agua y a golpes como estuche para
el sistema propuesto. En su interior se opto por dejar espacios libres en caso de realizar
alg
un cambio, calibracion o reparacion de los componentes opticos y electronicos. En las
Figuras 4.20, 4.21, 4.22 y 4.23 se muestra el montaje final del sistema de espectroscopia
Raman portatil implementado.

94
Figura 4.20: Vista Frontal del Sistema Raman Implementado.

Figura 4.21: Vista Lateral del Sistema Raman Implementado.

95
Figura 4.22: Vista Lateral del Sistema Raman Implementado.

Figura 4.23: Vista Frontal del Sistema Raman Implementado.

96
Captulo 5

Conclusiones.

5.1. Conclusiones.

Se dise
no y construyo un sistema de espectroscopia Raman utilizando componentes
de uso limitado como espectrometros modulares, diodos laser, fibras opticas multimo-
dales, microposicionadores y un estuche resistente al agua. El costo final del sistema
fue alrededor de $10, 000.00 USD, un precio relativamente bajo en comparacion con
otros trabajos reportados en la literatura, en donde se han utilizando sistemas Raman
portatiles comerciales que poco a poco se han vuelto obsoletos, como el Raman Systems
R3000, cuyo precio es de aproximadamente $16, 000.00 USD. Con el sistema implemen-
tado a
un es posible reducir el precio final, ya que se pretende reemplazar los diodos
laser pigtailed por modulos laser, de esta forma el precio final sera aproximadamente
de $7, 000.00 8, 000.00 USD.

Actualmente compa
nas especializadas como Ocean Optics, BW Tek, Agiltron, Sci
Apps, Rigaku o Thermo Scientific tienen en el mercado sistemas Raman Handheld, es
decir, sistemas fabricados para un uso manual sin necesidad de una PC o alg
un control
especfico. Estos sistemas poseen caractersticas formidables para realizar espectrosco-
pia Raman (en algunos casos la resolucion espectral llega a 7cm1 ), pero tambien tienen
sus contrapartes. Como se menciono anteriormente, en este trabajo se utilizo el Ocean
Optics IDRaman Mini como referencia y a lo largo de las mediciones se observaron los

97
siguientes problemas:

Complicada operacion.

Difcil acceso a los espectros Raman obtenidos.

Difcil visualizacion de resultados en la peque

na pantalla del sistema.

Si se analiza tejido biologico, usuario no puede realizar una supresion de la fluo-

rescencia ya que el sistema lo realiza automaticamente, con esto hay grandes
probabilidades de que se pierdan bandas de interes.

Es mas sencillo utilizarlo conectado va USB a una PC, restandole as el estatus

de Portatil.

El sistema electronico es muy delicado, confinandolo totalmente a mediciones de

laboratorio.

Incompatibilidad de software.

El sistema presentaba errores en sus libreras.

El sistema tiene una potencia de salida de 50mW sobre la muestra, por lo tanto
es difcil obtener un espectro de la piel in vivo.

Elevado costo: $24, 000.00 USD.

Utilizando el sistema implementado fue posible obtener un sistema de espectroscopia

Raman con restricciones en cuanto al rango espectral y a la potencia optica. Dicha
clasificacion se denomina como LRRS (por sus siglas en ingles Low Resolution Raman
Spectroscopy). Desafortunadamente el principal problema del sistema fue el dise
no de
fabrica del espectrometro, ya que esta dise
nado para ser utilizado en aplicaciones como
absorbancia y reflectancia en el visible, aun as, con los resultados del presente trabajo
se llego a la conclusion de que es posible obtener espectros Raman debido al optimo
dise
no optico y electronico del sistema. La fuente de corriente constante fue bastante
sencilla de implementar y de utilizar, aunque se requieren ciertos conocimientos basicos
de electronica, no significo gran problema en el desarrollo del trabajo. La colimacion

98
y el acoplamiento supusieron el mayor reto, sobre todo para alcanzar una potencia
optica de 100mW despues de la parte de acoplamiento, pero una vez que se tuvo la
experiencia necesaria al realizar m
ultiples experimentos durante aproximadamente dos
meses, los resultados fueron instantaneos, obteniendo perdidas mnimas. Un detalle
interesante fue el filtrado del esparcimiento Rayleigh, ya que al obtener una colimacion
y un acoplamiento correcto, puede considerarse como opcional ya que su longitud de
onda no interfiere con las mediciones, pero por precaucion es recomendable utilizarlo,
ya que al tener mayor intensidad que los esparcimientos Raman, el detector se puede
saturar. En este trabajo se utilizaron las dos configuraciones para realizar las mediciones
del Silicio obteniendo resultados muy similares. Tambien se observo que en la mayora
de las mediciones el CCD entraba en saturacion debido a las propiedades reflectoras
del material y al alto tiempo de integracion. Para las mediciones de la piel se utilizo
primero el sistema sin filtrar y despues con el filtro, pero en ning
un caso se observo un
resultado optimo.

En la parte experimental, afortunadamente en el caso del Silicio se pudo contar con

una banda Raman en 300cm1 ya que su equivalente a longitud de onda entraba dentro
del rango aceptable por el detector y del grating, no obstante la banda caracterstica de
521cm1 se obtuvo despues de realizar m
ultiples mediciones, y a
un as no presentaba
la intensidad esperada. Debido a que las bandas Raman caractersticas de la piel se
encuentran en un rango de 820 1, 749cm1 , es decir, en un rango de longitudes de
onda de 839 910nm se esperaba que el espectrometro USB4000-VIS-NIR pudiera
detectar dichas longitudes de onda ya que el fabricante indica un rango de operacion
de aproximadamente 350 1, 000nm. Realizando un analisis a sus componentes se
encontro que las se
nales mayores a 800nm se perdan ya sea debido a que se utilizo un
laser de 786.8nm y que el blaze del grating es de 500nm. Una alternativa rapida sera
reemplazar dichos elementos o en su defecto, el espectrometro por uno que tenga las
caractersticas necesarias al mismo precio (alrededor de $3, 000.00U SD) como el Ocean
Optics USB4000-Custom. Otra alternativa rapida sera reemplazar el diodo laser por
uno con una longitud de onda de aproximadamente 500nm, aunque se descartara
un uso para aplicaciones clnicas debido a que en este rango de longitudes de onda
(Visible) existe mayor contribucion de fluorescencia, por lo tanto, esta u
ltima opcion

99
no se considera, ya que el interes principal del trabajo es la aplicacion de radiacion
infrarroja.

Con todos estos aspectos en contra, el trabajo se llevo a cabo ya que el dise
no es bas-
tante prometedor. Lamentablemente debido a la baja resolucion del equipo, el objetivo
principal del proyecto que era realizar un analisis de pacientes pediatricos in vivo para
diagnostico de AD fue practicamente imposible al no obtener ninguna banda carac-
tersticas en los espectros de la piel. Se realizaron mediciones promediando alrededor
de 20 espectros por muestra y ajustando el tiempo de integracion, pero por precaucion
se opto por no seguir exponiendo el espectrometro ni el diodo laser.

5.2. Trabajo a Futuro.

Este trabajo se realizo utilizando componentes con los que se dispona en ese momento,
conforme se avanzaba en la comprension del tema se iban adquiriendo mas componen-
tes, donde algunos resultaron adecuados y otro no tanto, por lo tanto la curva de
aprendizaje fue bastante extensa. Ahora con mas conocimiento y experiencia en el
tema es posible plantear el dise
no y la construccion de un sistema de espectroscopa
Raman, no solo para diagnostico medico, tambien para caracterizacion de materiales e
identificacion de sustancias.

Como trabajo a futuro a corto plazo lo ideal seria adquirir un espectrometro que incluya
un grating con una frecuencia de groove de por lo menos 1, 200grooves/mm, con un
blaze lo mas cercano a 785nm, un slit de por lo menos 25m y un CCD optimizado
para deteccion de radiacion infrarroja. Un detalle extra sera reemplazar el diodo laser
pigtailed por un modulo laser convencional ya que el diodo laser requiere el driver
de corriente constante, que a su vez requiere de una fuente simetrica de 5V y un
modulo laser solo requiere una alimentacion de 3.3V y es el que se incluye en el sistema
IDRaman Mini. Esta u
ltima modificacion si bien no es necesaria, si es lo suficientemente
adecuada para un usuario sin experiencia en electronica, ya que para el ajuste del diodo
laser hay que configurar correctamente el driver. Tambien se hara una modificacion a

100
la sonda Raman a
nadiendo un filtro pasa-banda de la misma longitud de onda que la
del laser utilizado, este filtro extra sirve para suprimir los modos generados en la fibra
optica del diodo laser (esta prueba se realizo midiendo la intensidad del diodo laser
y no se observo contribucion alguna). Ademas sera de gran utilidad buscar muestras
que presenten bandas Raman menores a 300cm1 a una resolucion espectral menor a
20cm1 .

Como trabajo a futuro opcional o a mediano plazo, se pueden disponer de fibras opticas
mas cortas ya debido a su tama
no y poca flexibilidad se pueden da
nar. Una opcion mas
adecuada a el cable de fibra optica sencillo utilizado en este trabajo es utilizar un cable
de fibra optica alineado, el cual contiene en un extremo una fibra central y seis fibras
alrededor de ella, y en el otro extremo, contiene las siete fibras ordenadas linealmente.
De esta forma la incidencia sobre el CCD sera mas exacta, ademas de obtener una
colimacion y un acoplamiento sin perdidas. Finalmente, una vez que se hayan realizado
todas las modificaciones necesarias se deben realizar pruebas clnicas con n cantidad
de pacientes, probar con distintas potencias de salida, realizar distintas configuraciones
opticas y validar los espectros resultantes con distintas tecnicas multivariantes y/o
por correlacion contra espectros de referencia en un ambiente clnico. Por u
ltimo, a
largo plazo, lo ideal tambien sera dise
nar y construir cada uno de los elementos del
espectrometro (slit, grating, espejos, etc.) adecuandolo a nuestras necesidades, de esta
forma se tendra un sistema Raman de dise
no totalmente propio, ademas de a
nadirle
m
ultiples laseres con distinta longitud de onda y sus respectivos filtros notch y una
gua de onda seleccionable para cada longitud de onda.

101
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