Atenuacin de la expresin de fosfolipasa C

especfica para fosfatidilinositol de la soya

(Glycine max) empleando dCas9, para la
reduccin del contenido de cido ftico en
semillas.

Aracely Maribel Daz Ingeniera Metablica

Edgar Ricardo Ortiz M. en C. Diego Eloyr Navarro
Ismael Gereca
Omar Prez
Pablo Tovar
cido ftico

Carga negativa al pH en el que se encuentran

los alimentos.
Forma complejos con cationes divalentes y
trivalentes, formando fitatos (Ca, Mg, Fe, Zn,
Cu, Mg), o con protenas, formando sales,
denominadas fitato.
Forma de almacenamiento de fsforo en
semillas de cereales y leguminosas (50-85%).

(Martnez Domnguez, B., Go mez, I., Victoria, M., & Rinco n Leo n, F. (2002)).
 Fsforo en forma de fitato no es
disponible para humanos ni animales
monogstricos.
Para ganado porcino se selecciona una
alternativa de las siguientes: suplemento
de fitasas o suplemento de monofosfato
clcico.
Costo extra; liberacin de fsforo al
ambiente.

(Rebello, S., Jose, L., Sindhu, R., & Aneesh, E. M. 2017)

Propuesta
Variedad de soya (Glycine max) con menor
contenido de cido ftico.

Atenuamiento de fosfolipasa C (EC 3.1.4.11) en

la va del inositol fosfato.

Uso de dCas9 sin actividad nucleasa y acta

bloqueando transcripcin.
(Kegg, 2017)
Metodologa
Constructo
Diseo del gRNA, cuyo blanco ser
la enzima, con el programa E-CRISP,
con la secuencia:

5-GAA TTT TGT TGG TAT CTT TGT GG-3.

Vector binario de expresin

pHSN6I01.

El vector cuenta con secuencia

dCas9-KRAB, resistencia a
higromicina, kanamicina y
espectinomicina; cuenta con
promotor CaMV 35S. (Addgene, 2017)
Cepa bacteriana y cultivo
Agrobacterium rhizogenes cepa K599 para inducir hairy roots.

Introduccin del vector binario por electroporacin.

Seleccin clonal por crecimiento en agar LB con 150 g/mL de kanamicina.

(Cho, H.J., et. al., 1999)

Inoculacin
Las semillas de soya (G. max) se desinfectarn con una solucin 20% (v/v) de cloro comercial
(5.25%) y Tween 20 (0.1%) por 20 minutos.

Germinacin de semillas en medio de sucrosa y agar (0.5% y 1.2%). Fotoperiodo de 16h/8h a

25 C.

Transformacin Provocar heridas uniformes en cara abaxial con un bistur previamente

sumergido con A. rhizogenes.

Seleccin cotiledones transformados Placas con medio MS y 15 mg/L higromicina.

(Cho, H.J., et. al., 1999)

Anlisis de expresin
Extraccin de RNA de races de la planta.

PCR tiempo real utilizando IQ SYBR Green Supermix; Actina como gen constitutivo.

Fragmento de fosfolipasa C de 97 pb
Primer Secuencia

Fw 5-3 5-ATG CTG GGA AGC CTA AAG GT-3

Rv 5-3 5-GCC TTT TCA AGC TGT TGC TC-3

Fw Rv
GC: 50 % GC: 50%
Tm: 60.10 C Tm: 60.14 C (Bio-Rad, 2017)
 Diseo de primers para el gen constitutivo actina de 157 pb

Primers Secuencia

Fw 5-3 5- TGG CAT GGG CCA AAA AGA TG -3

Rv 5-3 5-GAG CGA CAC GGA GTT CAT TG -3

Fw Rv
GC: 50% GC: 55%
Tm: 59.39 C Tm: 59.29 C
Anlisis de expresin Extraccin de protenas congelando el
tejido a -80 C con nitrgeno lquido y
romper el tejido por molienda.

Buffer LDS e inhibidores de proteasas.

Sonicador al 30% de su capacidad tres
veces para romper la pared celular y
centrifugar.

Parte del sobrenadante se corre en

electroforesis con SDS-PAGE.

Blot con anticuerpos anti-PI-PLC.

(Donaher, 2012; Almeida, 2012)

(Abcam, 2012)
Discusin y resultados
Se busca disminuir el contenido total de cido ftico en la planta atenuando una
enzima encargada de la sntesis de sus precursores. Solo una reduccin, no un
knock out.

Buena viabilidad en plantas transfectadas con bajos niveles de cido ftico e

intermediarios de la ruta.

(Nature, 2016)
CaMV 35S Promotor constitutivo en
plantas transgnicas; dbil en la raz
de la soya, activo en puntas de races
y mucho menor en haz vascular
central.

Induccin de hairy roots usando A.

rhizogenes presenta alta eficiencia de
transformacin con GFP como
reportero; solo 56% presentan
resistencia a kanamicina.
(Cho et. al., 2000)
Conclusiones
Atenuacin de fosfolipasa C especfica para fosfatidilinositol
Alternativa para reducir niveles de contaminacin por agentes
orgnicos (fsforo) en suelo y agua, derivados del fitato en la
industria ganadera.

Empleando CRISPR-Cas9 sin nucleasa permite disminuir la

expresin, resultando en una produccin menor de cido ftico
mas no nula, sin afectar significativamente al crecimiento y
desarrollo de las semillas.
Referencias
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