Laboratorio de Bioqumica

Resumen

Se realiz el anlisis de la dependencia de la velocidad de reaccin en funcin de la cantidad

enzimtica (composicin), de la temperatura y del pH. As mismo se analiz la especificidad de la
accin enzimtica, empleando la presencia de ureasa en la harina de soya y contrastar su accin
en la tiourea y la acetamida.

Los resultados obtenidos demostraron que la velocidad enzimtica se ve influenciada por la

cantidad de enzima presente en solucin. La grfica que se produce como consecuencia de la
aparicin de eritrodextrinas del almidn genera una recta de pendiente positiva, lo cual permite
pensar que a medida que la concentracin de la enzima es mayor el tiempo que se necesita para
transformar el sustrato en producto es mucho menor (al graficar 1/t vs concentracin).

Estos ltimos resultados son consistentes por el hecho que las enzimas son catalizadores
biolgicos de una reaccin.

As mismo se demostr que la temperatura tiene un efecto importante en la velocidad enzimtica.

Si la temperatura aumenta considerablemente la reaccin puede no producirse debido a la
desnaturalizacin de la enzima. Si la temperatura es alta y propicia se obtienen los productos de la
accin enzimtica sobre el sustrato. Siendo 38C la temperatura optima para la accin enzimtica
de la ptialina.

De igual forma se pudo observar que la reaccin enzimtica tambin se ve influenciada por el
cambio del pH del medio hasta alcanzar un pH ptimo, el cual para la ptialina est alrededor de
6.7-6.8 cerca del pH neutro. Estos resultados son consistentes pues en el ser humano la enzima
ptialina as como muchas enzimas ubicadas en los tejidos sensitivos por lo general actan en pH
neutro. Este resultado puede ser ubicado en la punta de la campana.

Finalmente se pudo comprobar la especificidad enzimtica de la ureasa sobre la urea, en la

descomposicin de la urea en amoniaco y dixido de carbono.

1
Practica N 8 Cintica enzimtica
Laboratorio de Bioqumica

Introduccin

Los enzimas son macromolculas, especficamente protenas, que tienen la propiedad de catalizar
las reacciones bioqumicas. Pero las condiciones en las cuales se realice dicha catlisis afectarn la
eficiencia de la reaccin por lo tanto estas se deben de controlar en todo momento.

Por ejemplo son muy importantes los factores como la concentracin del enzima, la temperatura
y el pH. Por ejemplo si la temperatura es muy elevada, el enzima se desnaturaliza y queda inactiva;
si la temperatura es muy baja, el enzima no se desnaturaliza, pero igual queda inactiva. Mientras
que valores de pH extremos pueden desnaturalizar a los enzimas.

Los enzimas, tambin se caracterizan por tener un alto grados de especificidad, es decir slo
actan para un solo tipo de sustrato. Esto puede deberse a la relacin estereoqumica entre el
sustrato y el enzima, as como tambin al tipo de grupos funcionales que del sustrato. Por ejemplo
la ureasa contenida en la harina de soya slo acta sobre la urea descomponindola en amoniaco
y dixido de carbono. Pero este enzima no acta sobre la tiourea o acetamida a pesar de tener
una estructura muy parecida.

H2N
O + H2O ureasa NH3 + CO 2
H2N

2
Practica N 8 Cintica enzimtica
Laboratorio de Bioqumica

Marco terico

Cintica enzimtica

La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones qumicas que son catalizadas por las
enzimas. El estudio de la cintica de una enzima permite explicar los detalles de su mecanismo
cataltico, su papel en el metabolismo, cmo es controlada su actividad en la clula y cmo puede
ser inhibida su actividad por frmacos o venenos o potenciada por otro tipo de molculas.

Las enzimas son protenas (macromolculas) con la capacidad de manipular otras molculas,
denominadas sustratos. Un sustrato es capaz de unirse al centro cataltico de la enzima que lo
reconozca y transformarse en un producto a lo largo de una serie de pasos denominados
mecanismo enzimtico. Algunas enzimas pueden unir varios sustratos diferentes y/o liberar
diversos productos, como es el caso de las proteasas al romper una protena en dos polipptidos.
En otros casos, se produce la unin simultnea de dos sustratos, como en el caso de la ADN
polimerasa, que es capaz de incorporar un nucletido (sustrato 1) a una hebra de ADN (sustrato
2). Aunque todos estos mecanismos suelen seguir una compleja serie de pasos, tambin suelen
presentar una etapa limitante que determina la velocidad final de toda la reaccin. Esta etapa
limitante puede consistir en una reaccin qumica o en un cambio conformacional de la enzima o
del sustrato.

Fundamentos

La reaccin catalizada por una enzima utiliza la misma cantidad de sustrato y genera la misma
cantidad de producto que una reaccin no catalizada. Al igual que ocurre en otros tipos de
catlisis, las enzimas no alteran en absoluto el equilibrio de la reaccin entre sustrato y producto.
Sin embargo, al contrario que las reacciones qumicas, las enzimas se saturan. Esto significa que a
mayor cantidad de sustrato, mayor nmero de centros catalticos estarn ocupados, lo que
incrementar la eficiencia de la reaccin, hasta el momento en que todos los sitios posibles estn
ocupados. En ese momento se habr alcanzado el punto de saturacin de la enzima y, aunque se
aada ms sustrato, no aumentar ms la eficiencia.

3
Practica N 8 Cintica enzimtica
Laboratorio de Bioqumica

Las dos propiedades cinticas ms importantes de una enzima son: el tiempo que tarda en
saturarse con un sustrato en particular y la mxima velocidad de reaccin que pueda alcanzar. El
conocimiento de estas propiedades hace posible hipotetizar acerca del comportamiento de una
enzima en el ambiente celular y predecir cmo responder frente a un cambio de esas
condiciones.

La velocidad de la reaccin va aumentando a medida que aumenta la concentracin de

sustrato hasta que la enzima se satura. (Imagen. Standard RF, MedicalRF.com/Corbis. 1999)

Ensayos enzimticos

Un ensayo enzimtico es un procedimiento, llevado a cabo en un laboratorio, mediante el cual se

puede medir la velocidad de una reaccin enzimtica. Como las enzimas no se consumen en la
reaccin que catalizan, los ensayos enzimticos suelen medir los cambios experimentados bien en
la concentracin de sustrato (que va decreciendo), bien en la concentracin de producto (que va
aumentando). Existen diversos mtodos para realizar estas medidas. La espectrofotometra
permite detectar cambios en la absorbancia de luz por parte del sustrato o del producto (segn la
concentracin de estos) y la radiometra implica incorporacin o liberacin de radiactividad para
medir la cantidad de producto obtenido por tiempo. Los ensayos espectrofotomtricos son los
ms utilizados, ya que permiten medir la velocidad de la reaccin de forma continua. Por el
contrario, los ensayos radiomtricos requieren retirar las muestras para medirlas, por lo que son
ensayos discontinuos. Sin embargo, estos ensayos son extremadamente sensibles y permiten
detectar niveles muy bajos de actividad enzimtica. Tambin se puede utilizar la espectrometra
de masas para detectar la incorporacin o liberacin de istopos estables cuando el sustrato es
convertido en producto.

4
Practica N 8 Cintica enzimtica
Laboratorio de Bioqumica

Los ensayos enzimticos ms sensibles utilizan lseres dirigidos a travs de un microscopio para
observar los cambios producidos en enzimas individuales cuando catalizan una reaccin. Estas
medidas pueden utilizar cambios producidos en la fluorescencia de cofactores que intervienen en
el mecanismo de catlisis o bien unir molculas fluorescentes en lugares especficos de la enzima,
que permitan detectar movimientos ocurridos durante la catlisis. Estos estudios estn dando una
nueva visin de la cintica y la dinmica de las molculas individuales, en oposicin a los estudios
de cintica enzimtica tradicionales, en los que se observa y se mide el comportamiento de una
poblacin de millones de molculas de enzima.

En la figura de la derecha se puede

observar la tpica evolucin de una
curva obtenida en un ensayo
enzimtico. Inicialmente, la enzima
transforma el sustrato en producto
siguiendo un comportamiento
lineal.

A medida que avanza la reaccin,

se va agotando la cantidad de
sustrato y va disminuyendo la
cantidad de producto que se
Curva de saturacin de una reaccin enzimtica. La
genera por unidad de tiempo
pendiente representa, en el perodo inicial, la velocidad
(disminuye la velocidad de la de la reaccin. La ecuacin de Michaelis-Menten
reaccin), lo que se manifiesta en describe cmo va variando la pendiente con la
concentracin de sustrato o de enzima. (Standard RF,
forma de curva asinttica en la
MedicalRF.com/Corbis. 1999)
grfica. Dependiendo de las
condiciones del ensayo y del tipo
de enzima, el perodo inicial puede durar desde milisegundos hasta horas. Los ensayos enzimticos
suelen estar estandarizados para que el perodo inicial dure en torno a un minuto, para llevar a
cabo las medidas ms fcilmente. Sin embargo, los modernos equipos de mezcla rpida de lquidos
permiten llevar a cabo medidas cinticas de perodos iniciales cuya duracin puede llegar a ser
inferior a un segundo.

5
Practica N 8 Cintica enzimtica
Laboratorio de Bioqumica

La mayora de los estudios de cintica enzimtica se centran en el perodo inicial, es decir, en la

zona lineal de la reaccin enzimtica. Sin embargo, tambin es posible medir toda la curva de la
reaccin y ajustar estos datos a una ecuacin no lineal. Esta forma de medir las reacciones
enzimticas es denominada anlisis de la curva de progreso. Esta aproximacin es muy til como
alternativa a las cinticas rpidas, cuando el perodo inicial es demasiado rpido para ser medido
con precisin.

Factores fsico-qumicos que pueden modificar la actividad enzimtica

Temperatura: las enzimas son sensibles a la temperatura pudiendo verse modificada su actividad
por este factor. Los rangos de temperaturas ptimos pueden llegar a variar sustancialmente de
unas enzimas a otras. Normalmente, a medida que aumente la temperatura, una enzima ver
incrementada su actividad hasta el momento en que comience la desnaturalizacin de la misma,
que dar lugar a una reduccin progresiva de dicha actividad.

pH: el rango de pH ptimo tambin es muy variable entre diferentes enzimas. Si el pH del medio
se aleja del ptimo de la enzima, esta ver modificada su carga elctrica al aceptar o donar
protones, lo que modificar la estructura de los aminocidos y por tanto la actividad enzimtica.

Concentracin salina: al igual que en los casos anteriormente mencionados, la concentracin de

sales del medio es crucial para una ptima actividad enzimtica. Una elevada concentracin o una
ausencia de sales en el medio pueden impedir la actividad enzimtica, ya que las enzimas precisan
de una adecuada concentracin de iones para mantener su carga y su estructura.

-Amilasa (Nombre alternativos: 1,4--D-glucano-glucanohidrolasa; glucogenasa)

Las -amylasas son metaloenzimas de calcio, completamente afuncionales en ausencia de calcio.

Actan a lo largo de cualquier punto de la cadena de los carbohidratos, descomponindolos en
maltotriosa y maltosa desde la amilosa o maltosa, glucosa y dextrina desde la amilopectina. Dado
que puede actuar en cualquier punto de la cadena es ms rpida que la -amylasa. En los animales
es una enzima digestiva mayor y su pH ptimo est entre 6.7 y 7.0.

En fisiologa humana tanto la procedente de la saliva como la pancretica son -Amylasas. Puede
encontrarse en algunas plantas, hongos y bacterias.

6
Practica N 8 Cintica enzimtica
Laboratorio de Bioqumica

Cintica de Michaelis-Menten

Como las reacciones catalizadas por enzimas son saturables, la velocidad de catlisis no muestra
un comportamiento lineal en una grfica al aumentar la concentracin de sustrato. Si la velocidad
inicial de la reaccin se mide a una determinada concentracin de sustrato (representado como
[S]), la velocidad de la reaccin (representado como V) aumenta linealmente con el aumento de la
[S], como se puede ver en la figura. Sin embargo, cuando aumentamos la [S], la enzima se satura
de sustrato y alcanza su velocidad mxima (Vmax), que no sobrepasar en ningn caso,
independientemente de la [S].

Mecanismo de unin de nico sustrato para una reaccin enzimtica.

k1, k-1 y k2 son las constantes cinticas para cada una de las etapas de
la reaccin. (Standard RF, MedicalRF.com/Corbis. 1999)

El modelo de cintica micheliana para una reaccin de nico sustrato se puede ver en la figura de
la izquierda. Primeramente, tiene lugar una reaccin qumica bimolecular entre la enzima E y el
sustrato S, formndose el complejo enzima-sustrato ES. Aunque el mecanismo enzimtico para

una reaccin unimolecular puede ser bastante complejo, existe una etapa
enzimtica limitante que permite que el mecanismo sea simplificado como una etapa cintica
nica cuya constante es k2.

(Ecuacin 1)

k2 tambin llamado kcat o nmero de recambio, hace referencia al mximo nmero de reacciones
enzimticas catalizadas por segundo.

7
Practica N 8 Cintica enzimtica
Laboratorio de Bioqumica

A bajas concentraciones de sustrato, la enzima permanece en un equilibrio constante entre la

forma libre E y el complejo enzima-sustrato ES. Aumentando la [S] tambin aumentamos la [ES] a
expensas de la [E], desplazando el equilibrio de la reaccin hacia la derecha. Puesto que la
velocidad de reaccin depende de la [ES], la velocidad es sensible a pequeos cambios en la [S].
Sin embargo, a altas [S], la enzima se satura y solo queda la forma unida al sustrato ES. Bajo estas
condiciones, la velocidad de la reaccin (v k2[E]tot = Vmax) deja de ser sensible a pequeos
cambios en la [S]. En este caso, la concentracin total de enzima ([E]tot) es aproximadamente igual
a la concentracin del complejo ES:

La ecuacin de Michaelis-Menten7
describe como la velocidad de la
reaccin depende del equilibrio
entre la [S] y la constante k2.
Leonor Michaelis y Maud Menten
demostraron que si k2 es mucho
menor que k1 (aproximacin del
equilibrio) se puede deducir la
siguiente ecuacin:

(Ecua
Representacin grfica de la curva de saturacin de
cin 2) una enzima donde se puede observar como evoluciona
la relacin entre la concentracin de sustrato y la
Esta famosa ecuacin es la base de velocidad de la reaccin. (Standard RF,
la mayora de las cinticas MedicalRF.com/Corbis. 1999)

enzimticas de sustrato nico.

Representacin de la ecuacin de Michaelis-Menten

La grfica de velocidad frente a [S] mostrada anteriormente no es lineal. Aunque a bajas

concentraciones de sustrato se mantenga lineal, se va curvando a medida que aumenta la

8
Practica N 8 Cintica enzimtica
Laboratorio de Bioqumica

concentracin de sustrato. Antes de la llegada de los ordenadores, que permiten ajustar

regresiones no lineales de forma sencilla, poda llegar a ser realmente difcil estimar los valores de
la Km y la Vmax en las grficas no lineales. Esto dio lugar a que varios investigadores concentraran
sus esfuerzos en desarrollar linearizaciones de la ecuacin de Michaelis-Menten, dando como
resultado la grfica de Lineweaver-Burke y el diagrama de Eadie-Hofstee. Con el siguiente tutorial
de la cintica de Michaelis-Menten realizado en la Universidad de Virginia , se puede simular el
comportamiento de una enzima variando las constantes cinticas.

La grfica de Lineweaver-Burk o representacin de doble recproco es la forma ms comn de

mostrar los datos cinticos. Para ello, se toman los valores inversos a ambos lados de la ecuacin
de Michaelis-Menten. Como se puede apreciar en la figura de la derecha, el resultado de este tipo
de representacin es una lnea recta cuya ecuacin es y = mx + c, siendo el punto de corte entre la
recta y el eje de ordenadas equivalente a 1/Vmax, y el punto de corte entre la recta y el eje de
abscisas equivalente a -1/Km.

Obviamente, no se pueden tomar

valores negativos para 1/[S]; el mnimo
La grfica de Lineweaver-Burke o del doble
valor posible es 1/[S] = 0, que recproco muestra el significado de los puntos de
correspondera a una concentracin corte entre la recta y los ejes de coordenadas, y el
gradiente de la velocidad. (Standard RF,
infinita de sustrato, donde 1/v = 1/Vmax.
MedicalRF.com/Corbis. 1999)
El valor del punto de corte entre la
recta y el eje x es una extrapolacin de
datos experimentales obtenidos en
laboratorio. Generalmente, las grficas de Lineweaver-Burke distorsionan las medidas realizadas a
bajas concentraciones de sustrato y esto puede dar lugar a estimaciones no muy exactas de la V max
y de la Km.9 Un modelo lineal mucho ms exacto es el diagrama de Eadie-Hofstee, pero en las
investigaciones cientficas actuales, todo este tipo de linearizaciones han quedado obsoletos y han

9
Practica N 8 Cintica enzimtica
Laboratorio de Bioqumica

sido sustituidos por mtodos ms fiables basados en anlisis de regresin no lineal. Para analizar
los datos es conveniente la normalizacin de los mismos, ya que esto puede ayudar disminuyendo
la cantidad de trabajo experimental a realizar e incrementando la fiabilidad del anlisis.

Especificidad

Las enzimas suelen ser muy especficas tanto del tipo de reaccin que catalizan como del sustrato
involucrado en la reaccin. La forma, la carga y las caractersticas hidroflicas/hidrofbicas de las
enzimas y los sustratos son los responsables de dicha especificidad. Las enzimas tambin pueden
mostrar un elevado grado de estereoespecificidad, regioselectividad y quimioselectividad.

Algunas de estas enzimas que muestran una elevada especificidad y precisin en su actividad son
aquellas involucradas en la replicacin y expresin del genoma. Estas enzimas tienen eficientes
sistemas de comprobacin y correccin de errores, como en el caso de la ADN polimerasa, que
cataliza una reaccin de replicacin en un primer paso, para comprobar posteriormente si el
producto obtenido es el correcto. Este proceso, que tiene lugar en dos pasos, da como resultado
una media de tasa de error increiblemente baja, en torno a 1 error cada 100 millones de
reacciones en determinadas polimerasas de mamferos. Este tipo de mecanismos de
comprobacin tambin han sido observados en la ARN polimerasa, en la ARNt aminoacil sintetasa
y en los ribosomas.

Aquellas enzimas que producen metabolitos secundarios son denominadas promiscuas, ya que
pueden actuar sobre una gran variedad de sustratos. Por ello, se ha sugerido que esta amplia
especificidad de sustrato podra ser clave en la evolucin y diseo de nuevas rutas biosintticas.

Ureasa

La ureasa (EC 3.5.1.5) es una enzima que cataliza la hidrlisis de urea a dixido de carbono y
amoniaco. La reaccin ocurre de la siguiente manera:

(NH2)2CO + H2O CO2 + 2NH3

En 1926, James Batcheller Sumner demostr que la ureasa es una protena. Es producida por
bacteria, hongos y varias plantas superiores.

10
Practica N 8 Cintica enzimtica
Laboratorio de Bioqumica

Caractersticas

Peso molecular: 480 kDa o 545 kDa para la ureasa de frijol.

Metal en el sitio activo: Niquel(II).
pH ptimo : 7.4
Temperatura ptima: 60C
Especificidad enzimtica: urea e hidroxiurea
Inhibidor enzimtico: metales pesados

Diagnstico

Los organismos que producen ureasa tienden a ser patgenos del tracto gastrointestinal o
urinario, siendo que la ureasa les permite neutralizar el cido presente en estos medios acdicos.

Los patgenos ureasa positivos, incluyen:

Helicobacter pylori
Bacterias entricas incluyendo Proteus, Klebsiella y Serratia
Nocardia, una bacteria filamentosa
Ureaplasma urealyticum, relacionada con mycoplasma
Cryptococcus, un hongo oportunista

11
Practica N 8 Cintica enzimtica
Laboratorio de Bioqumica

Procedimiento Experimental

Materiales de laboratorio: Rejilla, 10 tubos de ensayo, cocinilla, vasos de 100 y 500mL,

probeta, termmetro,

Reactivos: solucin de almidn al 1%, solucin de yodo en yoduro de potasio (Lugol),

buffer fosfato citrato 0,1M con pH 5,6;6,4;7,2;8,0.

Material biolgico: solucin de saliva diluida.

Dependencia de la velocidad de reaccin de la cantidad de enzima

1. Primero se diluye la saliva en 20, 40,80 y 160 veces su volumen.

2. Se toma 4 tubos de ensayo y se coloca en cada uno de ellos 1mL de cada una de las
soluciones preparadas.
3. A cada uno de los 4 tubos se agrega 1mL de solucin de almidn y se coloca en un bao de
38C y se controla el tiempo inicial de la reaccin.

12
Practica N 8 Cintica enzimtica
Laboratorio de Bioqumica

4. Despus de unos 2 minutos toman 2 gotas del lquido de cada muestra y le agregan a ellas
1 gota de solucin de Lugol. Se registra el tiempo en que la reaccin ha terminado pues
primero se presenta una coloracin azul, luego rojo-violeta y por ultimo roja.

Dependencia de la velocidad de la reaccin enzimtica de la temperatura

1. Se coloco en un tubo de ensayo 5 gotas de saliva. Luego se hirvi por 2 minutos en un

bao de agua y se paso a enfriar.
2. En otros dos tubos se coloca 5 gotas de saliva tambin pero sin hervir.
3. A todos los tubos se les agrego 10 gotas de solucin de almidn.
4. Al primer y segundo tubo se les coloco en un bao de 38C y al tercer tubo en agua con
hielo por 3 minutos.
5. Por ultimo se aadi a cada tubo 1 gota de solucin de Lugol y se comparo las
coloraciones.

13
Practica N 8 Cintica enzimtica
Laboratorio de Bioqumica

Dependencia de la velocidad de la reaccin enzimtica del pH del medio

1. En 5 tubos se miden 10 gotas de solucin buffer de fosfato-citrato con los diferentes pH

mencionados.

2. Luego a cada uno de los tubos se le agr3go 5 gotas de saliva diluida 10 veces su volumen y
10 gotas de solucin de almidn y todo se coloca en un bao de agua a 38C.

3. Luego de 2 a 3 minutos se toma 1 gota de cada tubo y se le realiza el ensayo de Lugol en

donde anotaremos el tiempo de aparicin de la coloracin roja.

14
Practica N 8 Cintica enzimtica
Laboratorio de Bioqumica

Demostracin de la especificidad absoluta de la ureasa

(Laboratorio N9)

1. En un tubo de ensayo se coloca 1mL de urea ya preparada, en un segundo tubo se coloca

tiourea y en el tercero acetamida.
2. A cada tubo se le agrego aproximadamente 100mg de harina de soya y 2 gotas de
fenolftalena, mezclamos cuidadosamente y dejamos reposar a temperatura ambiente.
3. Por ultimo se observa la aparicin de color rosado claro y detectamos la presencia de
amoniaco por el olor caracterstico.

15
Practica N 8 Cintica enzimtica
Laboratorio de Bioqumica

Reacciones Qumicas

El mtodo est basado en el estudio de la velocidad de hidrlisis del almidn revelado con
Lugol, en dependencia de la cantidad aadida del alfa-amilasa de la saliva. As mismo se
cumplen las reacciones al influir la temperatura y el pH.

La amilasa del almidn forma con el yodo un complejo de color azul, el glucgeno pardo
rojizo o amarillento.

La primera reaccin que se describe a continuacin es el fraccionamiento del almidn en

maltosa y dextrina por la enzima amilasa, esto ocurre en la boca.

Demostracin de la especificidad absoluta de la ureasa

El mtodo se bas en la determinacin del amonaco que se forma por la accin de la ureasa de
la harina de soya sobre la urea:

(NH2)2CO + H2O CO2 + 2NH3

El desprendimiento de amoniaco se detect por el olor y por el cambio de color de la

fenolftalena y del papel de tornasol rojo.

16
Practica N 8 Cintica enzimtica
Laboratorio de Bioqumica

Clculos Experimentales

Dependencia de la velocidad de reaccin de la cantidad de enzima

T(s) 1/T(s) [amilasa diluida]

8 0.13 20
10 0.10 40
14 0.07 80
20 0.05 160

Dependencia de la velocidad de reaccin de la cantidad de

enzma
0.14
0.12
0.1
0.08
1/T(s)
0.06
0.04
0.02
0
0 50 100 150 200
[concentracion] de amilasa

Dependencia de la velocidad de la reaccin enzimtica de la temperatura

Enzima Sustrato Coloracin con Lugol Temperatura (C)

Amilasa Almidn Transparente 38
Amilasa Almidn Transparente 38
Amilasa Almidn Azul 8

Dependencia de la velocidad de la reaccin enzimtica del pH del medio

pH 1/T (min)
5.6 0.070
6.4 0.170
6.8 0.330
7.2 0.200
8.0 0.125

17
Practica N 8 Cintica enzimtica
Laboratorio de Bioqumica

Dependencia de la velocidad de la reaccin enzimtica del pH

del medio
0.35
0.3
0.25
0.2
1/T(min)
0.15
0.1
0.05
0
5 6 7 8 9
pH del buffer fosfato-citrato

18
Practica N 8 Cintica enzimtica
Laboratorio de Bioqumica

Discusin de resultados

Dependencia de la velocidad de reaccin de la cantidad de enzima

Los resultados obtenidos demuestran que la velocidad enzimtica se ve influenciada por la

cantidad de enzima presente en solucin.

La grfica que se produce como consecuencia de la aparicin de eritrodextrinas del almidn

genera una recta de pendiente positiva, lo cual permite pensar que a medida que la concentracin
de la enzima es mayor el tiempo que se necesita para transformar el sustrato en producto es
mucho menor (al graficar 1/t vs concentracin).

Estos ltimos resultados son consistentes por el hecho que las enzimas son catalizadores
biolgicos de una reaccin.

Por otro lado se pudo corroborar cualitativamente la presencia de eritrodextrinas del almidn,
como consecuencia de la accin enzimtica de la ptialina sobre el sustrato (almidn).

Cabe destacar por ultimo, que se pudo observar que la reaccin enzimtica sigui una cintica de
Michaelis por tener un comportamiento lineal al ser graficada la velocidad versus la concentracin.
As mismo destacar que la reaccin enzimtica de la amilasa sobre el almidn es de naturaleza
especfica.

Dependencia de la velocidad de reaccin enzimtica de la temperatura

Los resultados del experimento demuestran que la temperatura tiene un efecto importante en la
velocidad enzimtica.

Si la temperatura aumenta considerablemente la reaccin puede no producirse debido a la

desnaturalizacin de la enzima. Si la temperatura es alta y propicia se obtienen los productos de la
accin enzimtica sobre el sustrato.

Como es el caso de la ptialina actuando sobre el almidn. As mismo se produce este resultado a
38C, que es una temperatura ideal de accin de la enzima. Finalmente la accin enzimtica no se
produce a 7C debido a que no es la temperatura de accin de la ptialina.

19
Practica N 8 Cintica enzimtica
Laboratorio de Bioqumica

Estos resultados pues indican, que la accin enzimtica es especfica no solamente a la estructura
del sustrato sino tambin a una temperatura adecuada, para que se puedan generar los enlaces de
naturaleza covalente y se pueda producir el fenmeno termodinmico y por ultimo la
transformacin de los reactantes en productos.

Dependencia de la velocidad de reaccin enzimtica del pH del medio

Los resultados demuestran que la reaccin enzimtica tambin se ve influenciada por el cambio
del pH del medio hasta alcanzar un pH ptimo, el cual para la ptialina est alrededor de 6.7-6.8
cerca del pH neutro.
Estos resultados son consistentes pues en el ser humano la enzima ptialina as como muchas
enzimas ubicadas en los tejidos sensitivos por lo general actan en pH neutro. Este resultado
puede ser ubicado en la punta de la campana.
El pH funciona de esta manera como un tercer factor adems de la temperatura y la composicin
del sistema.

20
Practica N 8 Cintica enzimtica
Laboratorio de Bioqumica

Conclusiones

El estudio de la cintica de una enzima permite explicar los detalles de su mecanismo

cataltico, su papel en el metabolismo, cmo es controlada su actividad en la clula y cmo
puede ser inhibida su actividad por frmacos o venenos o potenciada por otro tipo de
molculas.

La velocidad enzimtica se ve influenciada por la cantidad de enzima presente en solucin.

La grfica que se produce como consecuencia de la aparicin de eritrodextrinas del
almidn genera una recta de pendiente positiva, lo cual permite pensar que a medida que
la concentracin de la enzima es mayor el tiempo que se necesita para transformar el
sustrato en producto es mucho menor (al graficar 1/t vs concentracin).

Los resultados son consistentes por el hecho que las enzimas son catalizadores biolgicos
de una reaccin.

La temperatura tiene un efecto importante en la velocidad enzimtica. Si la temperatura

aumenta considerablemente la reaccin puede no producirse debido a la
desnaturalizacin de la enzima. Si la temperatura es alta y propicia se obtienen los
productos de la accin enzimtica sobre el sustrato.

Como es el caso de la ptialina actuando sobre el almidn. As mismo se produce este

resultado a 38C, que es una temperatura ideal de accin de la enzima. Finalmente la
accin enzimtica no se produce a 7C debido a que no es la temperatura de accin de la
ptialina.

Los resultados demuestran que la reaccin enzimtica tambin se ve influenciada por el

cambio del pH del medio hasta alcanzar un pH ptimo, el cual para la ptialina est
alrededor de 6.7-6.8 cerca del pH neutro.

Estos resultados son consistentes pues en el ser humano la enzima ptialina as como
muchas enzimas ubicadas en los tejidos sensitivos por lo general actan en pH neutro.
Este resultado puede ser ubicado en la punta de la campana.

21
Practica N 8 Cintica enzimtica
Laboratorio de Bioqumica

Bibliografa

1.- BIOQUMICA, Legninger, Edit. Omega. Segunda edicin. 1981. Madrid.

2.- BIOQUMICA PRCTICA, Plummer. Edit. McGraw-Hill.
3.- GUA DE PRCTICAS DE BIOQUMICA, Garca Alayo, Fred, FQIQIA, UNMSM, Per, 2011.

22
Practica N 8 Cintica enzimtica