Microbiologa

de Alimentos

CLASE 2: Crecimiento bacteriano y

deteccin
22 de Marzo de 2017
 Crecimiento microbiano
Crecimiento: Reproduccin
activa de los
microorganismos, que lleva a
su proliferacin
Sobrevivencia: Retencin de
la habilidad de crecer, sin
crecer.

Varios tratamientos previenen el

crecimiento de organismos en
alimentos, pero no los matan.
Crecimiento microbiano
Crecimiento bacteriano es un
aumento en el nmero de clulas

No es un incremento en el tamao
de una clula individual

El crecimiento bacteriano es
binario, una clula madre da
origen a dos clulas hijas

Dos eventos principales:

Replicacin del DNA
Divisin celular
Fases del crecimiento bacteriano
1. Lag: Las clulas se adaptan a
las nuevas condiciones de
crecimiento (nutrientes, T)
2. Exponencial: Las clulas se
duplican durante intervalos
especficos
3. Estacionaria: El nmero de
clulas que se dividen es
igual a las que mueren, tasa
de crecimiento es 0.
4. Muerte: Prdida en
viabilidad, acompaado de
lisis celular.
 Crecimiento exponencial

Una poblacin bacteriana se duplica a intervalos de

tiempo regulares en mltiplos de 2
1 clula, 2 clulas, 4 clulas, 8 clulas, etc
20, 21, 22, 23 2n (n = Nmero de generaciones)

http://cellsalive.com/ecoli.htm
 Cintica de crecimiento exponencial
El crecimiento exponencial en bacterias sigue
una cintica de primer orden

Repasando cintica de reaccin qumica.

 Cintica de reaccin

A B

d[A] n
=k1 [ A ]
dt

Relacin general de la conversin de A (reactante) para dar lugar a B (producto)

n: Orden molecular de la reaccin, determinado empricamente
 Reacciones de orden cero

A B
d[A]
- = kt[A]0
[A]
dt
A t t
d[A] = k dt [A] = [A]0 - kt
A0 0
 Reacciones de primer orden

A B

d[A]
=k1[A]
dt



d[A] [A]

=k1dt

[A]
t
 Reacciones de primer orden

t t
1
0 [A] d[A] = -0 ktdt ln
[A]t
= kt
[A]0

ln[A]t ln[A]0 = -kt [A]t = [A]0 e-kt

Alimentos: degradacin vitaminas en alimentos,

 Crecimiento exponencial
Cintica de primer orden
N = No 2n
N: Nmero de clulas en la generacin n
No: Nmero inicial de clulas
n: Nmero de generaciones durante el
periodo de crecimiento exponencial
 Crecimiento exponencial
Donde:
N: nmero de clulas
= t: tiempo

k: tasa de crecimiento, [h-1 ]

( (( / )
= (( ) , ( ) =
) 2.303

2 Donde:
= g: Tiempo generacional

 Escala logartmica Escala aritmtica

5000 4.00
3.50

log Nmero de clulas

4000
nmero de clulas

3.00
3000 2.50
2.00
2000 1.50
1.00
1000
0.50
0 0.00
0 1 2 3 4 5 6 7
Tiempo (h)

Nmero total de clulas log N

Ejercicio 1:

Un cultivo en fase exponencial contiene 1000 clulas a las 2 pm, y

1x108 6 horas despus.
Cul es la tasa de crecimiento del cultivo?
Cul es el tiempo generacional del cultivo en minutos?

Ejercicio 2:

Salmonella tiene una baja dosis infectiva. En hojas de lechuga,

usted detecta 0,001 clula por gramo de vegetal en un campo X.
Por regulacin no puede superar las 100 clulas por gramo. Si en
este ambiente la bacteria tiene un tiempo generacional de 4 horas,
a qu tiempo se alcanzar el umbral? Qu podra sugerir para
alargar este tiempo?
Crecimiento microbiano en alimentos
El crecimiento exponencial es slo una fase en
el ciclo de crecimiento microbiano

Estas frmulas son vlidas slo en la fase

exponencial

En los alimentos, las bacterias alternan entre

periodos de crecimiento y latencia
 Cmo cuantificar el crecimiento
microbiano?
1. Microscopa: Recuento directo
2. Plaqueo en agar nutritivo
3. Espectrofotometra: Densidad ptica a 600
nm
4. Medir cantidad indirecta de un componente
celular: DNA o antgenos
5. Peso seco de las clulas
 1. Microscopa
Mtodo para hacer conteo total de clulas:
Microscopio

Se realiza en muestras secas o lquidas

Cmaras de conteo especializadas: Neubauer

Cmara Neubauer
Aplicar 20 ul
Para calcular el nmero
de clulas por mililitro:
15 clulas x 25
cuadrados grandes x 50
x 10^3
Normalmente se
cuentan varios
cuadrados grandes y se
promedian los valores
 Ventajas/Desventajas
Ventajas Desventajas
Rpido Clulas vivas vs. clulas
Sencillo muertas
Clulas pequeas
Precisin
Muestras de baja
densidad (< 10^6
clulas/mL)
Clulas mviles
Desechos celulares
 2. Conteo de clulas viables
Clula viable: Capaz de dividirse y formar colonias

Clulas que son de nuestro inters (porqu?)

El mtodo ms empleado determina el nmero

de clulas viables emplea agar

Recuento en placa (Plate count)

 Supuesto
Cada clula puede crecer y dividirse hasta
formar una colonia
Nmero de colonias son proporcionales al
nmero de clulas inicial
Diferentes tipos de medios de cultivo
De
Selectivos Diferenciales
enriquecimiento
Slo pocas Potencian el Varios pueden
especies pueden crecimiento de crecer, pero de
crecer (presencia una especie forma distinta
agentes Inhiben el (cambio en color,
inhibitorios, crecimiento de pigmentos)
antibiticos) otros
microorganismos
 La gran anomala de la placa
Comnmente el conteo total de clulas
(microscopio) > Conteo de clulas viables
Porqu?

1. Microscopio cuenta clulas muertas y vivas

2. Requerimientos nutricionales
 Estado VBNC
VBNC: Viable but not culturable
Bacteria no puede crecer en medio de cultivos
No es capaz de reproducirse
Puede reactivarse en cualquier momento
Induccin del estado: stress ambiental
Clulas morfolgicamente pequeas, baja tasa
metablica
Pueden permanecer en el estado por aos
 Cultivo bacteriano sometido a estrs leve (6% NaCl)
Se hace recuento en medio no selectivo (lnea slida) y medio
selectivo (lnea discontinua).
La diferencia en las curvas representa el total de clulas
daadas.
 3. Mtodo turbidimtrico
Medicin de masa celular

Principio: Durante crecimiento exponencial

todos los componentes celulares crecen en
proporcin al incremento de clulas

Podemos medir: protenas, material gentico

o masa celular
 Principio
Una cultivo celular se ve opaco a la vista
Clulas dispersan la luz que pasa por la
suspensin. Se mide la turbidez del cultivo
entre 600 y 660 nm
A mayor concentracin de clulas mayor ser
la dispersin de luz, y mayor la absorbancia
La masa celular es proporcional al nmero de
clulas
Representacin de datos
 Ventajas/Desventajas
Ventajas Desventajas
Rpido No todos los m.o. crecen
Sencillo parejo en medios lquidos

No destruye la muestra Algunos m.o. forman

La misma muestra puede agregaciones (pequeas o
evaluarse repetidas veces grandes)

Datos permiten calcular m.o. que forman pelculas

tiempo de generacin
 4. Cuantificacin molecular
Los mtodos moleculares ofrecen mayor
sensibilidad y mayor rapidez de respuesta
En algunos casos queremos detectar hasta
una clula (tolerancia cero Listeria, E. coli)
Reaccin en cadena de la polimerasa: PCR
ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
 Reaccin en Cadena de la Polimerasa
PCR
Mtodo in vitro y automatizado, que permite la
produccin de grandes cantidades de una secuencia
especfica de DNA

Alimentos: Deteccin de genes presentes en ciertos

patgenos.

Usa la Taq DNA polimerasa, una enzima que copia el

DNA, y partidores de PCR especficos para ciertos
patgenos.

La deteccin se hace en geles de agarosa o por la

emisin de fluorescencia
 1. Denaturacin
2. Apareamiento o annealing
3. Extensin

https://www.youtube.com/watch?v=2KoLnIwoZKU
 Taq polimerasa
Mg+2
DNA templado
dNTPs
Primers
95C Buffer reaccin

Polimerasa copia desde el extremo

3del final de un partidor
50-65C
Secuencia partidor idntica a la del
gen, pero copia la hebra
complementaria

Temperatura hibridacin dada por la

72C
secuencia de los partidores.
 ELISA
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

Deteccin y cuantificacin de un antgeno por un

anticuerpo
Antgeno: protena o carbohidrato especfico de un
patgeno, flagelina, LPS, protenas de cpsula
Muestras de sangre, fluidos, alimentos, ambientales,
virus, bacteria
Dos formas: ELISA indirecto y directo
 ELISA
Indirecto

Indirecto:

La muestra se una a una superficie de plstico por adsorcin

El anticuerpo primario une al antgeno presente en la muestra
En cada paso se lava y elimina lo que no se une
Se agrega un anticuerpo secundario, que se une especficamente
al anticuerpo primario.
El anticuerpo secundario est previamente marcado con
fluorescencia, o con un sustrato que da una reaccin
colorimtrica
 En resumen
Existen cuatro fases del crecimiento bacteriano, y
la fase exponencial se ajusta a una reaccin de
primer orden.
El crecimiento en alimentos es discontinuo,
adems, las bacterias se encuentran en estados
de latencia o formando biofilms
Existen varios mtodos para cuantificar el
crecimiento bacteriano, donde destaca el
recuento en placa, la medicin de absorbancia y
los mtodos moleculares.
 Referencia
Madinga et al. 2011. Brock Biology of
Microorganisms.
Chapter 6. Microbial growth.
Doyle P. M and Beuchat L.R. (eds). Food
Microbiology: Fundamentals and Fronteires.
Unit I: Factors of Special Significance to Food
Microbiology. Chapter 1. Growth, Survival, and death
of microbes in food
Franco y Contardo. 2015. Gua de Laboratorio de
Microbiologa de Alimentos. Paso prctico 4.
 Referencias
Madingan MT, Martinko JM, Dunlap PV and Clark
DP. 2009. Brock Biology of Microorganisms. 12th
Edition. Pearson International Edition.
Chapter 6. Microbial Growth
Doyle P. M and Beuchat L.R. (eds). Food
Microbiology: Fundamentals and Fronteires.
Unit I: Factors of Special Significance to Food
Microbiology. Chapter 1. Growth, Survival, and death
of microbes in food