Conceptos Bsicos de Electroforesis Capilar

La Electroforesis es una tcnica de separacin e identificacin de sustancias qumicas

que se basa en el movimiento o migracin de las macromolculas disueltas en un
determinado medio (solucin tampn), como resultado de la accin de un campo
elctrico. Al igual que otras tcnicas de separacin como la Cromatografa y
Espectrometra de Masas, es ampliamente utilizada en la actualidad en la industria
biotecnolgica, biolgica y bioqumica. Se utiliza en dos modalidades distintas:
Electroforesis Convencional en gel y Electroforesis Capilar (EC). En la primera, las
separaciones se llevan a cabo sobre una capa delgada y plana (placa) de un gel
semislido y poroso que contiene un tampn acuoso en el interior de sus poros, dando
origen a una imagen donde se visualizan las sustancias en forma de zonas teidas Error:
Reference source not found. La Electroforesis Capilar es una versin de la tcnica de
Electroforesis en la que la separacin se lleva a cabo dentro de un capilar muy delgado y
presenta mejoras sustanciales respecto a la electroforesis convencional en gel,
principalmente en cuanto a los pequeos volmenes de sustancia necesaria para el
estudio y la rapidez con que se obtienen los resultados del anlisis. La EC ha sido un
mtodo muy til para la separacin de protenas (enzimas, hormonas) y cidos nucleicos
(DNA y RNA) con gran resolucin y se usa frecuentemente en complemento con otras
tcnicas de separacin tales como Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC) y
espectrometra de masas.
Una de las ventajas de la EC sobre otras tcnicas de separacin es que requiere de una
instrumentacin relativamente simple: una fuente de alto voltaje, un capilar cuyos
extremos se encuentran sumergidos, junto con dos electrodos, en dos viales que
contienen una solucin amortiguadora, un detector y un sistema de adquisicin de datos,
tal como se ilustra en la Figura 1.
 Sistema de adquisicin y
procesamiento de datos

Detector
Sentido de Migracin

Capilar

Fuente de
Tensin Electroferograma
+
Figura 1. Esquema de un sistema de Electroforesis Capilar.

La fuente de voltaje normalmente es capaz de proporcionar de 10-30 kV. El capilar

posee una longitud entre 50 cm y 1m y posee un dimetro interno muy reducido (menor
a 100 m), que facilita la disipacin del calor generado por la resistencia elctrica del
electrolito dentro del capilar. Los extremos del capilar estn colocados en dos
recipientes que contienen una solucin del electrolito, el mismo con el que se ha llenado
el capilar. Los volmenes de muestra a analizar son extraordinariamente pequeos (de
0,1 a 10 nl).
Los equipos de Electroforesis Multicapilar Error: Reference source not found poseen
la capacidad de llevar a cabo el proceso de electroforesis en varios capilares
simultneamente, permitiendo el anlisis de mayor cantidad de muestras en el tiempo y
por ende la generacin de grandes volmenes de datos.
Existen varios tipos de Electroforesis Capilar, sin embargo este trabajo se concentrar
en la Electroforesis Capilar en Zonas debido a que el equipo que origina los datos
analizados en este trabajo es de este tipo.
La Electroforesis Capilar en Zonas est basada en la separacin de los analitos segn
la relacin carga/tamao. En esta tcnica la composicin del tampn es constante
manteniendo su fuerza inica y pH en todo el capilar y durante todo el tiempo que dura
la separacin. El potencial aplicado hace que los diferentes componentes inicos de la
mezcla migren cada uno segn su propia movilidad y se separen en zonas que puedan
estar completamente resueltas o parcialmente traslapadas. Entre las zonas
completamente resueltas hay huecos ocupados por el tampn. La inyeccin de la
muestra al capilar se puede llevar a cabo por gradiente de voltaje (electrocintica) o
gradiente de presin (hidrodinmica o hidrosttica) entre los dos extremos del capilar.
La deteccin se realiza, por lo general, directamente sobre el capilar (celda de
deteccin). El tipo de detector escogido depende de los analitos a determinar, y se
escoge aquel que proporcione una sensibilidad elevada para todos los compuestos. La
deteccin directa e indirecta ultravioleta-visible (UV-Vis) es uno de los ms usados en
EC, aunque tambin es utilizado el mtodo de Fluorescencia, el cual es ms selectivo y
sensible. Este mtodo generalmente se combina con el uso de un Lser (fluorescencia
inducida por LASER) para la deteccin de sustancias trazas Error: Reference source
not found, Error: Reference source not found, Error: Reference source not found. Se
utiliza un lser de moderada intensidad, junto con la capacidad de enfocar un pequeo
punto de luz en el interior del capilar. En este procedimiento se realiza una preparacin
previa de la muestra para marcar las sustancias a medir con una sustancia fluorescente.
La principal dificultad es la alineacin de los componentes pticos de manera tal que la
excitacin emisin sean ptimas. En el sistema colineal, la misma lnea ptica es
utilizada para enfocar el haz del Lser y para colectar la fluorescencia emitida Error:
Reference source not found. Los datos analizados en esta investigacin fueron obtenidos
con un equipo que utiliza este mtodo de deteccin.
Existen dos fenmenos que intervienen en la migracin de las molculas en
Electroforesis Capilar: el flujo electroosmtico y el flujo electrofortico.
El flujo Electroosmtico se traduce en el desplazamiento, por el capilar y bajo la
influencia de un campo elctrico, de la solucin tampn en conjunto con las molculas
de soluto cargadas. Este fenmeno se debe a que la pared interna del capilar se carga
negativamente y con las cargas positivas atradas se conforma una doble capa de cargas.
La capa interna (+) se moviliza hacia el ctodo y como se encuentra solvatada con
molculas de agua, arrastra toda la solucin en ese sentido. Una caracterstica nica del
flujo electroosmtico es que presenta un perfil de distribucin plano, el cual slo se
desva unos pocos nm de la pared, de forma que proporciona la misma velocidad a todos
los solutos, sea cual sea su posicin en la columna.
El Flujo Electrofortico es el movimiento de las molculas de soluto cargadas hacia los
extremos correspondientes del capilar, los cationes (+) hacia el ctodo (-) y los aniones
(-) hacia el nodo (+). Estas fuerzas elctricas producen aceleraciones de los analitos
que son contrarestadas por la fuerza de friccin debido a la viscosidad de la solucin,
ocasionando que casi instantneamente las molculas adquieran una velocidad
constante. La velocidad de los analitos esta influenciada por la viscosidad y sta
depende completamente de la temperatura, por lo que el control de esta ltima variable
es muy importante en la obtencin de una alta reproducibilidad Error: Reference source
not found.
La separacin de los analitos se basa en las diferencias de las movilidades
electroforticas de los solutos inicos, que harn que los analitos migren a travs del
capilar y lleguen al detector a tiempos diferentes.
La movilidad electroosmtica es normalmente superior a la movilidad electrofortica de
los solutos inicos inyectados, por lo que todas las molculas (positivas, negativas y
neutras) se dirigen hacia el ctodo haciendo posible separar cationes y aniones en una
sola inyeccin de la muestra. Aunque los compuestos neutros migran hacia el ctodo no
pueden ser separados mediante Electroforesis capilar en zonas debido a que no muestran
movilidad electrofortica
Los datos obtenidos en una corrida de Electroforesis Capilar se representan en un
Electroferograma que es una grfica de intensidad (de emisin de UV, o fluorescencia)
en funcin del tiempo (en min). La duracin de una corrida suele ser entre 9 y 45
minutos y tiene el aspecto que se observa en la Figura 1. Cada pico corresponde a una
sustancia en particular. La ubicacin de una sustancia en el tiempo depende de la
relacin carga/masa, las sustancias ionizadas positivamente (izquierda) son detectadas
por el sensor inicialmente y las sustancias negativas (derecha) posteriormente. La
concentracin de una determinada sustancia se calcula utilizando la altura del pico
respectivo o el rea bajo la curva. En un experimento es comn realizar varias
mediciones obtenindose varios electroferogramas para observar y medir las variaciones
de concentracin de determinadas sustancias en diferentes condiciones, por lo que
generalmente existen patrones de picos, como el que se muestra en la Figura 2, que
pueden repetirse con cierto grado de similaridad en los electroferogramas producto de
un mismo experimento.
 Figura 2. Patrn en varios Electroferogramas.

Actualmente, en el Laboratorio de Fisiologa de la Conducta de la ULA, el

reconocimiento de patrones como los observados en la Figura 2, se realiza de manera
visual por parte del especialista. Observe, en la Figura 2, que la similaridad se ve
gravemente afectada por la poca reproducibilidad inherente a la EC y la variacin
importante de una o varias sustancias (picos) en el patrn, por lo que el reconocimiento
de patrones en este tipo de seales es un problema en actual desarrollo y tema
fundamental de este trabajo. Note que los picos no miden exactamente lo mismo en
todos los electroferogramas, es decir, no son de la misma altura o no encierran la misma
rea, no se encuentran ubicados en los mismos instantes de tiempo y no estn separados
unos de otros por la misma diferencia temporal en los electroferogramas. Estas
caractersticas hacen que el proceso de reconocimiento de patrones sea ms complicado
que en otros tipos de seales con menor variabilidad.