TINCIN DE GRAM Y OBSERVACIN

MICROSCPICA

Buritica Ahumada Brayan Alexander1., Castaeda Torres Miguel Angel2., Medina Daz Hassay
Lizeth3., Vargas Corredor Yuri Alexandra4.

Fundacin Universitaria De San Gil-Unisangil, Facultad De Ciencias e Ingenieras.

Ingeniera Ambiental
Yopal, Colombia
nayarb_01@hotmail.com
migel-ac77@hotmail.com
hassay2610@hotmail.com
Yuricitar4@hotmail.com

Resumen En el siguiente artculo se presenta la

descripcin de un procedimiento en el cual se llev a
cabo la tincin de Gram con el fin de contrastar las
bacterias presentes en una UFC (unidad formadora de
colonia) de una muestra de suelo, para identificar la
presencia de bacterias segn su grupo taxonmico:
Gram positivas y Gram negativas. En este
procedimiento, en un porta objetos limpio y seco, se
agreg una gota de agua destilada y posteriormente se
coloc una UFC (unidad formadora de colonia) encima
de esta gota con un asa de siembra previamente
esterilizada; seguidamente se calent suavemente en la
llama de un mechero para fijar la muestra.
Posteriormente se tio con cristal violeta de Hucker,
luego se lav con agua destilada, nuevamente se tio
con lugol y seguidamente se lav con alcohol para
retirar el exceso de colorante, despus se aplic fucsina
bsica para contrastar y por ltimo se lav con agua
corriente y se dej secar la muestra. Finalmente se
procedi a la identificacin la presencia de bacterias
segn su grupo taxonmico: Gram positivas o Gram
negativas presentes en la UFC a travs del microscopio
con el objetivo de 100x obteniendo Staphylococcus sp
Gram positivos y bateras Gram negativas con forma
de bacilo.
Palabras claves: Gram, negativas, positivas, tincin,
fucsina, colonias, suelo, Staphylococcus sp
Abstract- The following article presents the description
of a procedure which was performed Gram staining in
order to contrast the bacteria present in a UFC ( colony
forming unit ) of a soil sample to identify the bacteria
by taxonomic group : Gram positive and Gram
negative. In this procedure, a clean and dry objects
carrier was added a drop of distilled water and
subsequently placed a UFC ( colony forming unit )
above this drop a previously sterile inoculation loop ,
then warmed gently in the flame of a lighter to set the
sample. Subsequently stained with Hucker crystal violet
, then washed with distilled water, stained with Lugol
again and then washed with alcohol to remove excess
dye , basic fuchsin was then applied to contrast and
finally washed with water and the sample was allowed
to dry . Finally proceeded to identify the presence of
bacteria by taxonomic group : Gram positive or Gram
negative bacteria present in the UFC through
microscope with 100x objective Staphylococcus sp
obtaining batteries Gram positive and Gram negative
rod-shaped bacteria .
Keywords: Gram negative, positive, staining, fuchsin,
colonies, soil, Staphylococcus sp

1.
Estudiante de ingeniera ambiental
2.
Estudiante de ingeniera ambiental
3.
Estudiante de ingeniera ambiental
4.
Estudiante de ingeniera ambiental

I. INTRODUCCIN
El principal impedimento en la observacin de
bacterias en microscopio ptico es la falta de
contraste entre la clula en observacin y el medio
que la rodea, la manera ms simple de facilitar el
contraste es la utilizacin de colorantes, revelando
la presencia de determinados constituyentes
celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas,
paredes celulares, centros de actividad
respiratoria, etc. Para bacterias, el proceso de
fijacin por calor es lo ms habitual, aunque
tambin puede fijarse con sustancias qumicas
como formaldehido, cidos y alcoholes. Despus
de esto se aade el colorante. La fijacin produce
habitualmente el encogimiento de las clulas; la
tincin, por el contrario, hace que las clulas
parezcan mayores de lo que son realmente. La
mayora de los colorantes son compuestos
orgnicos que tienen alguna afinidad por los
materiales celulares. [1]
Algunos colorantes teirn mejor slo despus
de que la clula haya sido tratada con otra
sustancia qumica, que no es un colorante por s
mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un
mordiente habitual es el cido tnico. El
mordiente se combina con un constituyente
celular y lo altera de tal modo que ahora s podr
atacar el colorante.
Una tcnica de coloracin y la ms conocida
es la tincin de Gram, denominada as por el
bacterilogo dans Christian Gram, quien
desarrollo esta tcnica en 1844. Sobre la base de
la tincin de gran, las bacterias se clasifican en
dos grupos: gran positivos y gran negativos.
En cuanto a la tincin de gran la secuencia es
la siguiente: el frotis bacteriano se fija con calor se
tie con cristal violeta por min, se lava con agua,
se la aplica un mordiente por 1 min y se lava
nuevamente con agua, despus se decolora con
una mezcla alcohol etlico/acetona. Escurrir y
cubrir con safranina (color de contraste) durante 1
min lavar y secar.
Las bacterias Gram positiva y Gram negativas
tien de forma distinta debido a las diferencias
constitutivas en la estructura de sus paredes
celulares. La pared de la clula bacteriana sirve
para definir su tamao y su forma al organismo as
como para prevenir la lisis osmtica. La pared de
la clulas Gram positivas es gruesa y consiste en
varias capas interconectadas de peptidoglicano
(cadenas lineales de un polisacrido formado por
residuos alternativos de N-acetilglucosamina y N-
acetilmurmico unidos mediante un enlace) [3] y
un poco de cido teicoico (forman parte de la
gruesa capa de peptidoglicano que rodea a la
membrana plasmtica y estn directamente unidos
a l mediante un enlace fosfodister. De este modo
pueden conectar varias capas de peptidoglicano)
[3]
, mientras que las bacterias gram negativas se
componen de una capa delgada de peptidoglicano
y est rodeada por una capa exterior de
lipopolisacridos (forma parte de la pared de la
pared celular de las bacterias Gram-negativas.
Tienen carcter anfiptico, presentan carga
negativa, y repelen molculas hidrofbicas. Son
txicos para el hombre, y tambin se llaman
endotoxinas) [3] por lo cual estas dos tipos de
bacterias se tien de diferente color y es posible
identificarlas como Gram positiva o Gram
negativa. [2]
II. MATERIALES Y MTODOS
A. Procedimiento I: TINCIN DE GRAM
Teniendo en cuenta el procedimiento de la
gua llamada TINCION DE GRAM Y
OBSERVACIN MICROSCPICA de la
fundacin universitaria de San Gil Unisangil,
este se divide en dos secciones:
Seccin A. Extensin: primeramente se
limpi un portaobjetos con alcohol y
posteriormente se flame, luego se coloc una
gota de agua destilada en el centro del porta y con
el asa de siembra, esterilizada a la llama, se coloc
una pequea cantidad de suspensin de bacterias,
de una colonia sobre la gota de agua destilada,
despus con el asa se extendi la gota y las
bacterias sobre el porta y se fij la muestra por el
calor, luego se calent suavemente a la llama del
mechero hasta que se sec.
Seccin B. Coloracin: Se aplic a la muestra
fijada anteriormente una cantidad del colorante
cristal violeta de Hucker suficiente para cubrir la
superficie del extendido durante un minuto y se
lav con agua destilada la muestra fijada,
seguidamente se aplic lugol (mordiente) sobre
toda la superficie del extendido durante un
minuto, luego se agreg alcohol de 95 para retirar
el exceso de colorante (decolorante) y se lav con
agua destilada, despus se aplic fucsina bsica
(colorante de contraste) durante un minuto y
nuevamente se la se lav la muestra pero esta vez
con agua corriente, luego se dej secar la
muestra, colocndola invertida sobre papel, una
vez que la preparacin estuvo totalmente seca, se
puso una gota muy pequea de aceite de cedro y
se observ al microscopio con el objetivo de
inmersin. (Este procedimiento se repito una vez
ms, para observar otro tipo de bacterias)
Nota: el cultivo del cual se extrajo las colonias
que se utilizaron para realizar la tincin de Gram
proviene de una muestra de suelo.
III. RESULTADOS Y DISCUSIN
Figura 1. Staphylococcus ssp en Tincin de Gram. Microscopa
ptica en objetivo 100 x. Bacterias de color violeta (Gram
positivas).
En la figura 1 se puede apreciar
Staphylococcus ssp Gram positivos que se
encuentran en racimos, pares y e cadenas cortas
con forma redonda (coco). Esta bacteria se
observa de color violeta ya que en el proceso de
tincin donde se le agrego los diferentes
colorantes como cristal violeta y fucsina bsica,
quedaron teidas; aun cuando se les retir el
exceso de colorante con agua destilada y alcohol
de 95, tomando este color caracterstico que se le
denomina a las bacterias que lo presentan Gram
positivas. Estas bacterias presentan este color ya
que la envoltura celular de las bacterias Gram-
positivas cubren la membrana citoplasmtica y
una pared celular compuesta por una gruesa capa
de peptidoglicano, que rodea a la anterior. La
pared celular se une a la membrana citoplasmtica
mediante molculas de cido lipoteicoico[4]. La
capa de peptidoglicano le proporciona una gran
resistencia a estas bacterias y es la responsable de
retener el tinte durante la tincin de Gram al
poseer una gran proporcin de este polmero
complejo (murena) la cual no la hace susceptibles
a la accin del solvente orgnico, sino que este
acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que
impide que pueda escaparse el complejo cristal
violeta/yodo, y manteniendo la coloracin azul-
violcea [5]. A diferencia de las Gram-negativas,
estas bacterias no presentan una segunda
membrana lipdica externa.
Figura 2. Bacillu spp en tincin de Gram. Microscopia ptica
en objetivo 100x. Bacterias de color rosado (Gram negativas).
En la figura 2 es posible observar bacterias con
forma de bacilo (forma de barra o vara) y de color
rosadas, lo que indica que son bateras Gram
negativas. Esta coloracin se debe a las
caractersticas que poseen las bacterias Gram
negativas en su pared celular. Debido a que las
bacterias Gram negativas poseen en su pared
celular una capa delgada de peptidoglicano
(murena) unida a una membrana externa formada
por protenas, fosfolpidos y polisacridos, la
cantidad de colorante cristal violeta y del
mordiente lugol que retiene es mnima, en
comparacin a las bacterias Gram positivas, que
tiene varias capas de peptidoglucano unido a la
membrana plasmtica, donde se encuentra el cido
lipoteicoico, y ms en la superficie, el cido
teicoico [5], por lo cual el complejo de las
molculas de cristal violeta, lugol y cido teicoico
que se forma en la pared celular de las Gram
positivas, es muy difcil de remover, lo que no
sucede con las Gram negativas, porque el cristal
violeta y el lugol no reaccionan con el cido
teicocio, debido a que las bacterias Gram
negativas en su pared celular no lo tienen. Por otra
parte, la membrana externa que poseen las
bacterias Gram negativas es soluble en
compuestos orgnicos como a la mezcla de
alcohol y acetona, por lo tanto al momento de
agregar el decolorante alcohol 95, el complejo de
cristal violeta y lugol se perdi. De igual forma,
las bacterias Gram negativas tomaron su color
rosado, debido a que se le agrego el colorante de
contraste llamado Fuscina para colocarlas en
manifiesto.
Es importante decir que las colonias a las que
se les realiz tincin de Gram, eran de una
muestra de suelo, lo cual explica la presencia de
estas bacterias, debido a que en el suelo
predominan las bacterias Gram negativas. Sin
embargo en el suelo tambin se encuentran
bacterias Gram positivas, pero en menor
proporcin que las Gram negativas, lo cual
tambin explica la presencia de estas bacterias en
el suelo.
IV. CONCLUSIONES
Tanto las bacterias Gram positivas como las
Bacterias Gram negativas se presentan
morfolgicamente como cocos o bacilos, sin
embargo al ejecutar tincin de Gram en estas para
identificar su grupo taxonmico, las Gram
positivas se tien de color violeta mientras que las
Gram negativas se tien de color rosado.
Mediante la tincin de Gram se identifican
bacterias Gram positivas y Gram negativas gracias
al color que tornan despus de ser teidas; en el
caso de las bacterias Gram positivas se tien de
violeta, esto se debe a que gracias a que contienen
una pared gruesa de peptidoglicano y gran
cantidad de cidos teicicos que permiten fijar y
retener rpidamente el colorante inicial el cual es,
el cristal violeta de Hucker, y adems son
resistentes a la decoloracin. Lo contrario ocurre
con el caso de las Gram negativas, las cuales
poseen una pared delgada con menos cantidad de
peptidoglicano y lpidos, la cual requiere de un
colorante de contratincion como la safranina o la
fucsina en este caso, ya que el colorante inicial es
fcilmente retirado en la decoloracin con alcohol,
debido a que por su delgada pared celular no lo
retienen.
La tincin de Gram permite conocer la
morfologa celular, el tamao, la forma y su
clasificacin taxonmica (Gram positivos o Gram
negativos) de acuerdo al color que tornan las
bacterias despus de la tincin, sin embargo no
permite conocer la especie o gnero de la bacteria
al cual pertenece.
Las colonias de bacterias a las que se les
realiz tincin de Gram se tomaron de una
muestra de suelo, lo cual explica la presencia de
estas bacterias, debido a que en el suelo
predominan las bacterias Gram negativas. Sin
embargo en el suelo tambin se encuentran
bacterias Gram positivas, pero en menor
proporcin que las Gram negativas, lo cual
tambin explica la presencia de estas bacterias en
el suelo. De acuerdo a esto Fue posible observar
bacterias Gram negativas con forma de bacilo
(con forma de barra o vara) y Gram positivas
como Staphylococcus sp.
REFERENCIAS
[1] Daz Camilo (2011). Definicin de tincin. [En lnea].
Disponible: http://es.scribd.com/doc/52811425/Tinciones-en-
Microbiologia-Seminario. Citado: 19/11/2013.
[2] Santambrosio Eduardo. (2009).tincin de gram. [En lnea].
Disponible:
http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio
/biotecnologia/practico4.pdf. Citado: 19/10/2013.
[3] Gonzlez Juan. Definicin de peptidoglicano, cido
teicoico y lipopolisacridos [En lnea]. Disponible:
http://www.ehu.es/biomoleculas/hc/sugar35b.htm#lp. Citado:
19/10/2013.
[4] Martinez Roberto. (2009). Bacteria gram positiva [En Temperatura suficiente. [6]

lnea]. Disponible: http://martinez-roberto.blogspot.com/.

Citado: 19/10/2013.

[5] Wikipedia (2013). Tincin de Gram. [En lnea].

Disponible: http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci
%C3%B3n_de_Gram. Citado: 19/11/2013
[6] Cedeo, Kenia (2011).fuentes de error en la tincin de
gram. [En lnea]. Disponible:
http://labmicrofarmaciaulat.blogspot.com/p/tincion-de-
gram_20.html. Citado: 19/10/2013.
[7] Lpez Tvez, Leonor (2006). Comportamiento de las
bacterias en la tincin de gram. [En lnea]. Disponible:
http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp6.pdf. Citado:
19/10/2013.
[8] Wikipedia (2013). Tincin de Ziehl-Neelsen. [En lnea].
Disponible: http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci
%C3%B3n_de_Ziehl_Neelsen. Citado: 19/11/2013
[9] Diagnstica re activos para uso in vitro (2007).Aceite de
inmersin. [En lnea]. Disponible:
http://www.ihrdiagnostica.com/tecnicas/pdf/AceiteDeInmersio
nv2.pdf Citado: 19/10/2013.
2. A qu se debe el distinto comportamiento de
las bacterias Gram+ o Gram- al tratamiento
con la coloracin de Gram?
La coloracin de gran es de gran importancia
en Microbiologa porque permite diferenciar dos
grandes grupos de bacterias (Gram+ y Gram-),
segn se comporten ante esta tincin. El
fundamento radica en la diferente estructura de la
pared celular de ambos grupos: las bacterias
Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano
en su pared, mientras que las bacterias Gram-
tienen una capa de peptidoglicano ms fina y una
capa lipopolisacardica externa, por este motivo a
las bacterias Gram+ se les fija el primer colorante
usado en la mezcla, mientras que las Gram-
despus del lavado se desprende el colorante y se
fija el colorante de contraste de la tincin.
3. Explique como la tincin de Gram
permite realizar identificacin bacteriana.

La tincin de Gram ofrece la coloracin de las

Anexo 1. PREGUNTAS POST LABORATORIO
N5
1. Cules son las fuentes de error ms
comunes en la Tincin de Gram?
Los peores obstculos de la Tincin, que
impiden conseguir el resultado perseguido, son los
errores del tcnico. Para evitarlos hay que elegir
bien los reactivos y ser muy cuidadosos al ejecutar
la tcnica. A continuacin se especifican algunas
de las fuentes de error:
Impurezas en los reactivos de
Tincin.
Concentracin inadecuada de los
reactivos de tincin.
pH inadecuado.
El colorante se fija a la clula
por mecanismos fsico-qumicos, que se
alteran si el PH no es el apropiado.
Los colorantes pueden ser
cidos, bsicos o neutros.
Tiempo de Tincin incorrecto.
bacterias dependiendo sus caractersticas
presentes en la pared celular, en las cuales si es
Gram positiva estas se tien del primer colorante
(cristal violeta) y al utilizar el mordiente (lugol),
se fija a la pared celular, por lo cual al aplicar el
decolorante no se pierde el color como sucede en
las Gram negativas se tien del colorante de
contraste (fucsina), por lo cual al observar en el
microscopio se logra definir la morfologa de las
bacterias, es decir el tamaa y la forma por lo cual
se logra identificar los tipos de bacterias. [7]
4. Investigue otra tcnica de Tincin
selectiva utilizada para identificacin
bacteriana, explique los fundamentos de estas
tcnicas.
Tincin de Ziehl-Neelsen: Las paredes
celulares de ciertas bacterias contienen cidos
grasos (cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90
tomos de carbono) que les confieren la propiedad
de resistir la decoloracin con alcohol-cido,
despus de la tincin con colorantes bsicos. Por
esto se denominan cido-alcohol resistentes. Las
micobacterias como Mycobacterium tuberculosis
y M. marinum se caracterizan por sus propiedades
de cido-alcohol resistencia. La coloracin clsica
de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que
el colorante atraviese la pared bacteriana que
contiene ceras. Al suspender el calentamiento y
enfriar con agua, provoca una nueva solidificacin
de los cidos grasos de modo que el colorante ya
no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el
calentamiento aumenta la energa cintica de las
molculas del colorante lo cual tambin facilita su
entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten
la decoloracin son de color rojo y las que no, se
ven de color azul ya que se utiliza azul de
metileno como tincin de contraste. [8]
Figura 3. Observacin al microscpico ptico de una tincin de
ziehl-Neelsen.
5. Para qu se utiliza el aceite de inmersin?
El aceite de inmersin para microscopio tiene
aproximadamente el mismo ndice de refraccin
que el vidrio. Mediante el aceite de inmersin se
elimina casi completamente la desviacin de los
rayos de luz y se aumenta considerablemente la
eficacia de los objetivos de los microscopios. [9]