PROGRAMA PRELIMINAR

3 al 5 de Noviembre de 2010
CIEMAT - AVDA. COMPLUTENSE, 22 MADRID

DIRECCIN DEL CURSO

Dr. Jos Luis Motelln y Dr. Juan Bueren

Entidades colaboradoras

Con el auspicio de:

Este Curso es posible gracias a una aportacin educacional de

Acreditacin de la Comisin de Formacin Continuada

del Ministerio de Sanidad y Consumo (en tramitacin).
 PROGRAMA PRELIMINAR

3 al 5 de Noviembre de 2010
CIEMAT - AVDA. COMPLUTENSE, 22 MADRID

DIRECCIN DEL CURSO

Dr. Jos Luis Motelln y Dr. Juan Bueren
 2011 Faltan!!!!!

Edita: Edikamed, S.L.

Josep Tarradellas, 52 - 08029 Barcelona
www.edikamed.com

ISBN: 978-84-7877-658-0

Impreso por:

Depsito legal:

Quedan rigurosamente prohibidas, sin la autorizacin escrita de los titulares

del Copyright, la reproduccin parcial o total de esta obra. Cualquier forma de
reproduccin, distribucin, comunicacin pblica o transformacin slo puede
ser realizada con la autorizacin de sus titulares, salvo excepcin prevista por
la ley. Dirjase a EdikaMed S.L., o a CEDRO (Centro Espaol de Derechos
Reprogrficos, www.cedro.org) si necesita fotocopiar, escanear o hacer copias
digitales de algn fragmento de esta obra.
 ndice

Gene therapy for inmunodeficiency . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

Adrian J Trasher
Centre for Immunodeficiency, Molecular Immunology Unit, Londres COMPROBAR!!!!

1. Inmunoterapia humoral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
Manuel Hidalgo
The Johns Hopkins University. Baltimore (MD). Estados Unidos
Centro Integral Oncolgico Clara Campal. Hospital de Madrid Norte Sanchinarro. Madrid

2. Genmica, protemica y medicina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

Fernando Vivanco
Fundacin Jimnez Daz
Universidad Complutense. Madrid

3. Impact of pharmacogenetics on drug use in individually optimised

pharmacotherapy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
Arnold G. Vulto PharmD PhD and Monique J. Bijl PharmD PhD
Department of Hospital Pharmacy
Erasmus University Medical Centre, P.O. Box 2030, 3000 CA Rotterdam, The Netherlands

4. Biologa de las clulas madre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

Antonio Bernard
Departamento de Cardiologa Regenerativa
Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC)

5. Clinical applications of cell therapy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

Jos Lpez-Barneo
Instituto de Biomedicina de Sevilla-Ibis
Hospital Universitario Virgen del Roco/CSIC/Universidad de Sevilla. Sevilla

6. Avances de la terapia gnica en el tratamiento de enfermedades monognicas . . 84

Juan A. Bueren
Divisin de Hematopoyesis y Terapia Gnica
CIEMAT y CIBER de Enfermedades Raras

ndice III
 7. Nanomedicina: apliacin de la nanotecnologa en la salud . . . . . . . . . . . 98
Laura M. Lechuga
Grupo de Nanobiosensores y Aplicaciones Bioanalticas
Centro de Investigacin en Nanociencia y Nanotecnologa (CIN2)
Consejo Superior de Investigaciones Cientficas

8. Farmacocintica de los medicamentos obtenidos por biotecnologa . . . . . . 113

Alfonso Domnguez-Gil Hurl
Servicio de Farmacia
Hospital Universitario de Salamanca

9. Aplicaciones de la biotecnologa recombinante vegetal a la teraputica humana 122

Fernando Ponz
Centro de Biotecnologa y Genmica de Plantas (UPM-INIA)
Campus de Montegancedo. Pozuelo de Alarcn. Madrid

10. Evaluacin de medicamentos biotecnolgicos en la Agencia Europea

de Medicamentos (EMA), BWP (Grupo de Biolgicos) y CHMP
(Comit de Medicamentos de Uso Humano) . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
Sol Ruiz
Agencia Espaola de Medicamentos y Productos Sanitarios (AEMPS)

11. Las empresas biotecnolgicas y su importancia en la terapia humana . . . . . 136

Jos Luis Motelln
AMGEN

IV 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana

 Gene therapy
for inmunodeficiency
Adrian J Trasher
Centre for Immunodeficiency, Molecular Immunology Unit, Londres
COMPROBAR!!!
At the start of the 1990s, the first clinical trials
of gene therapy were attempted for an inheri-
ted severe combined immunodeficiency (SCID)
caused by deficiency of the intracellular enzyme
adenosine deaminase. In the absence of defini-
tive treatment, SCID of any molecular type is
usually fatal within the first year of life, although
patients with ADA deficiency can be supported
by administration of exogenous bovine enzyme.
Even so, this is often only partially effective, and
is extremely expensive. The rationale for the
development of gene therapy for SCID the-
refore derives from the severity of the illness,
the inadequacy of conventional therapy, and the
considerable morbidity and mortality associated
with stem-cell transplantation, particularly from
a mismatched donor. Efficacy in these early stu-
dies was limited, but a decade further on, gene
transfer technology and cell handling proto-
cols had been refined sufficiently to produce
real clinical benefit. Four recent studies have
demonstrated highly effective gene therapy
for the X-linked form of SCID (SCID-X1) and
ADA deficiency, using retroviruses to deliver the
therapeutic genes into haemopoietic stem cells
ex vivo,. Bearing in mind the outcome and ad-
verse effects of conventional therapy, these are
remarkable results and the first clear indication
that gene therapy can offer a cure for some hu-
man diseases. In a few patients the treatment
has failed, indicating that there is more to learn
about the effective dose of corrected cells and
the potential for host factors to influence im-
mune cell development.
Many different types of vector have been tested
in laboratory experiments to deliver therapeutic
genes, and their effectiveness is largely determi-
ned by the host and tissue type. For stable gene
transfer to dividing cells, such as haemopoietic
cells, the new genetic material has to be retained
through cell division and passed on to daughter
cells. Although retroviruses are highly effective for
this, their dependence on chromosomal integra-
tion brings with it the risk of inadvertent gene
activation or inactivation. Having initially achieved
successful immunological reconstitution, five pa-
tients with SCID-X1 (out of a total of 19 SCID-
X1 and seven ADA-deficient patients treated
to date) developed T cell lymphoproliferative
disease up to after the gene therapy procedure.
In four of these patients, the enhancer sequences
in the retroviral vector, which are responsible for
effective transgene expression, had activated the
LMO-2 proto-oncogene. There are likely to be
other factors that contributed to cell transfor-
mation, but they have not yet been defined. It
is therefore unclear whether all patients are at
significant risk, or whether this is restricted to a
few with SCID-X1.
Fortunately, it is likely that much can be done
to improve efficiency and safety of current pro-
tocols, and these developments are expected
to enter clinical trial quite soon. The design of
vectors used for gene delivery is clearly impor-
Gene therapy for inmunodeficiency 1
tant, and modifications are possible that limit
the risks of mutagenesis, such as incorporation
of DNA and RNA insulator sequences in inte- c, IL7Ra, JAK3, ZAP-70
HSC-multi
grating vectors; use of self-inactivating vectors RAG1/2, artemis, ligase IV,
Cernunnos
in which the powerful viral enhancer sequences
ADA, PNP
are deleted; or targeting of safe regions in the MHC I/II, CD3//, CD45,
genome. Ultimately, the development of homo- ORAI1, STIM1, Coronin 1a
logous recombination or gene repair to accu-
rately correct genetic mutations, or the cons-
truction of mitotically stable extrachromosomal
vectors, would obviate many of these problems,
but current technologies are inefficient. SCID/CID

Q Y
9.000 MoLV R U5 IL2RG MoLV R U5
SD SA

7.000
*
T Lymphocytes

5.000 *
* *
3.000 *
1.000

10 20 30 40 50 60 70 80
months after gene therapy

Lymphocyte recovery CD3 (UK/France, 19 patients).

Forward Strand
33,65 Mb 33,85 Mb 34,05 Mb
100
C11orf41 CD59 FBXO3 LMO2 CAPRIN1 NAT10 ABTB2
Fold difference

10 Virus
integration

Relative to:
0,1 Leukaemia panel
LTR
LTR-
DP1 T cells LTR- 1 2 3 4 5 6
DP2 T cells LTR

Chromosome 11p13

2 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana

 Relative to:

Fold difference in expression

100 Leukaemia panel
DP1
DP2
10

Pre-treatment d0 d539 d717 Control

0,1
IL2RG LMO2 CDKN2A NOTCH1 HES1 MYC RBPJ/CSL G to C
CGC to CCC
Amino acid change
R1599P in the HD-N domain T CA G C C C CG T G C T G

TCRb to STIL-TAL-1 translocation

Leukemia
AB

AA/BB
HMM
Constitutive DNA
AB

AA/BB
HMM

0 50 9 Mb 100
CDKN2A
CDKN2A (p16INK4A/p21ARF1)

Accumulation of genetic lesions...

5 LTR PCMV

KpnI (523)

Indication
No MSD/MUD AP
Failure of PEG-ADA
EcoRI (1.522)
Protocol
D-60 BM harvest (save) Ncol (1.533)

D-30 Stop PEG-ADA

Banhll (159)
D-4 BM harvest
D-2 MElphalan 140 mg/m2 ORI
SalI (2.633)
D0 Infuse cells
HincII (2.635)
KpnI (3.838)
WPRE
SalI (3.273)
HincII (3.275)
3 LTR SFFV

Phase 1/2 Study: CD34+ cell gene therapy for ADA-deficient SCID incorporating melphalan conditio-
ning (D-2).

Gene therapy for inmunodeficiency 3

 2.500
Max on
PEG-ADA
2.000
ALC
Lymphocytes per ul

ALC
1.500

CD3

1.000

CD4

500 CD8
CD19
CD3
CD16/56
0
-20 0 20 40 60 80 100 120
Weeks
GRANs 13%, MONOs 6%, B 34%, T 48%, NK 34%
RBC ada 52 (40-100 nmol/mgHb/h)
dATP low

Lymphocyte recovery...

Centre N.o patients F/U Off enzyme Survival DFS

Milan 10+ 1,8-8,0 8/10 100% 80%

London 6 0,5-5,5 3/6 100% 50%

CHLA 5 0,75-4 3/5 100% 60%

Total 21 0,5-8,0 14/21 100% 67%

Summary of patients Milan/London/CHLA/NIH...

Haematopoietic gene therapy represents a highly effective treatment for SCID-X1 and ADA-deficient SCID, and is
promising for other haematological, immunological and metabolic disorders (CGD,WAS, ALD)
Insertional mutagenesis is a finite risk but relatively simple modifications to design may have significant impact on
safety
Are vectors as good as we think at expressing transgene ?

Thoughts...

4 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana

 Days 4 & 5 p = 0,01
p = 0,03
Day 1 0,1
2 days 2 weeks

replating frequency/copy number

Expansion Expansion 0,01
Lin. neg.
BM cells 0,001

DNA 0,0001

RNA Expansion 0,00001

Phenotype neg.
Limiting dilution
assay

RRLPPT.WASP.WAS.pre

RRL.PPT-eGFP

RRL.PPT.VAV.cGREEN

RRL.PPT.SF.eGFP
MOCK

RRL.PPT.SF.eGFP.pre

SRS.SF.eGFP.pre

SF91.eGFP.pre
Step 1 Step 2

R U5 EF1s IL2RG PRE $ R U5

SD

Reduced mutagenesis with SIN configuration and non-LTR promoters...

Es1 Es2

Es1

pA GFP LTR

D 4,8 kb D
B 3,1 kb
pA GFP LTR
Es1

SD
U5 R $ PRE IL2RG EF1s U5 R

Retroviral vector insertion site

No HLA identical donor

GTAC 146
EUDRACT Number: 2007-004308-11
MHRA approved 2009

R U5 EF1s IL2RG PRE $ R U5

SD

Phase I/II clinical trial of haematopoietic stem celll gene therapy for SCID-X1.

Gene therapy for inmunodeficiency 5

 RRE
RSV R U5 EFs. IL2RG PRE $ R U5
SD SA

GC prom

IL2RG genomic

RSV R U5 UCOE IL2RG PRE $ R U5

SD SA
pA Te

RSV R U5 VAV IL2RG PRE $ R U5

SD SA
?Te

Lentiviral IL2RG SIN vectors...

RSV R U5 UCOE eGFP PRE $ R U5

SD SA

CBX3 HNRPA2B1 NFE2L3

10 kb

CpG island

CBX3 HNRPA2B1
1 kb

B T

2.2 A2UCOE

Ubiquitous chromatin opening element (A2UCOE)...

6 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana

Restricted enhancer activity

R U5 UCOE IL2RG PRE $ R U5

SD

RSV R U5 UCOE IL2RG PRE $ R U5

SD SA
Ins pA Te

RSV R U5 UCOE IL2RG PRE $ R U5

SD SA
?Te

Next generation vectors...

Respiratory
Glycosylation
burst Vacuole
Active 2O2 2O2-
p21phox NADPH
Inactive Citoplasm
NAPDH oxidase
oxidase gp91phox

Flavocytochrome b Deactivated
p47phox 2e P NADPH oxidase
p67phox NADPH
p40phox P
SH3 P
domains GTP NADPH+ + H+
GDP-GTP
exchange GTP
hidrolysis
p21 and
rac

GDI dissociate
GDP
p21rac and GDP
GDI reassociate
GDI

GDP

Gene therapy for inmunodeficiency 7

Restricted expression or endogenous promoter/enhacer activity in myeloid cells

R U5 UCOE IL2RG PRE $ R U5

SD

R U5 UCOE IL2RG PRE $ R U5

SD SA

R U5 UCOE IL2RG PRE $ R U5

SD SA
Ins pA Te Ins

MSP
MiRNA targets
Chim

Next generation vectors...?

A Zinc-finger domains
Nuclease domains

Mutant sequence
B

Double-stranted
C break
Homologus recombinatio

Wild-type template

Corrected sequence

Urnov et al, 2005.

Lombardo et al., 2007.
Redondo et al., 2008.
Grizot et al., 2009

Enhanced homologous recombination...

8 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana

 1 Inmunoterapia humoral
Manuel Hidalgo
The Johns Hopkins University. Baltimore (MD). Estados Unidos
Centro Integral Oncolgico Clara Campal.
Hospital de Madrid Norte Sanchinarro. Madrid
Resumen
El uso de anticuerpos monoclonales es ac-
tualmente una modalidad teraputica de enor-
me importancia en el tratamiento de pacientes
con enfermedades neoplsicas. Los anticuerpos
se han utilizado como agentes nicos o conju-
gados con agentes radioactivos o como vehcu-
los de frmacos y toxinas. Actualmente existen
anticuerpos frente a receptores de factores de
crecimiento, factores de crecimiento per se y
otras dianas celulares, como antgenos de mem-
brana. Estos frmacos han demostrado actividad
clnica en pacientes con tumores de mama, co-
lon, pulmn, linfomas y leucemias. Las reas de
investigacin y desarrollo incluyen la generacin
de agentes con mejores propiedades farmaco-
lgicas y menos txicos.
Introduccin
El desarrollo de anticuerpos con fines te-
raputicos ha crecido de forma importante
en la ltima dcada. Inicialmente se utilizaron
anticuerpos de origen murino, aunque estas
molculas tienen el inconveniente de que ge-
neran una respuesta inmunitaria a ellos. Los
anticuerpos murinos se pueden transformar
en molculas humanizadas, de forma que no
son reconocidos por el sistema inmunitario. Los
anticuerpos humanos (o humanizados) se
caracterizan tambin por una vida media ms
prolongada. Recientemente se han desarrolla-
do estructuras con capacidad para reconocer
mltiples antgenos, con distintos tamaos y
propiedades. Junto a la creciente identificacin
de dianas teraputicas, el empleo de anticuer-
pos, tanto desnudos como conjugados con
toxinas, frmacos y compuestos radioactivos, ha
aumentado notablemente. Los anticuerpos uti-
lizados con mayor frecuencia en el tratamiento
contra el cncer son las inmunoglobulinas G
(IgG). Los avances en gentica humana y mo-
lecular han permitido la sntesis de fragmentos
de IgG. Estos anticuerpos modificados se ca-
racterizan por tener distinta afinidad antignica,
un nmero variable de sitios de unin al an-
tgeno y distintas propiedades farmacolgicas.
Las ms utilizadas son los fragmentos variables
de cadena nica (scFV), que estn compuestos
por cadenas variables pesadas y ligeras unidas
por un pptido. Estas molculas tienen un peso
molecular de 25 kDa y son eficaces como
vehculos de radionucletidos. Tambin se han
desa-rrollado estructuras de mayor enverga-
dura, como los llamados diabodis y minibodis;
el menor peso molecular de estas estructuras
facilita su eliminacin renal y su especificidad
en la localizacin tumoral, a la vez que mues-
tran menor toxicidad que la asociada a las IgG
completas.
Inmunoterapia humoral 9
Mecanismos de accin
de los anticuerpos
monoclonales
como agentes teraputicos
Los anticuerpos monoclonales ejercen sus
actividades de forma muy diversa y variada en
funcin de las dianas afectadas. Los anticuerpos
dirigidos contra receptores de factores de cre-
cimiento, como el del factor de crecimiento epi-
drmico (EGFR), impiden la unin de ligandos
con sus receptores y, en consecuencia, impiden
sus funciones, dando como resultado inhibicin
de la proliferacin celular y apoptosis. Los anti-
cuerpos tambin generan actividad antitumoral
por medio de mecanismos inmunolgicos, in-
duciendo anticuerpos antiidiotipo, citotoxicidad
dependiente de clulas (ADCC) y citotoxicidad
mediada por complemento. Como ya se ha
mencionado, los anticuerpos tambin se utilizan
como vehculos de otros agentes teraputicos
como frmacos, toxinas y sustancias radioacti-
vas. En estos casos, los mecanismos de accin
estn en funcin de las molculas asociadas.
Limitaciones del empleo
de anticuerpos
teraputicos
Inicialmente, los anticuerpos teraputicos ad-
ministrados en oncologa eran anticuerpos mu-
rinos. Una de las limitaciones ms importantes
de estos frmacos es la generacin de HAMA
(human antimouse antibodies), problema que re-
duce el nmero de tratamientos que pueden
recibir los pacientes. Tcnicas ms modernas
han permitido la generacin de anticuerpos qui-
mricos, que comparten estructuras humanas
y murinas y que presentan menor inmunoge-
nicidad. Actualmente es posible la produccin
10 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
de anticuerpos totalmente humanizados que
no generan HAMA. Un segundo problema es
la unin del anticuerpo a antgenos circulantes,
con la consiguiente reduccin en la disponibili-
dad del anticuerpo para llegar al tumor. Otras
limitaciones a la distribucin de los anticuerpos
en el tejido tumoral son las alteraciones en la
vasculatura de los tejidos, la elevada presin
hidrosttica y la distribucin heterognea de
los antgenos dentro de los tumores. Adems,
la inmunoterapia humoral est limitada por las
dificultades de acceso de las clulas efectoras a
los tejidos tumorales. Finalmente, es bien cono-
cido que los tumores secretan sustancias que
disminuyen la respuesta inmunitaria.
Anticuerpos teraputicos
Neoplasia hematolgica
CAMPATH-1
Es un anticuerpo monoclonal especfico fren-
te al antgeno CD52, un glucopptido que se
expresa en linfocitos B y T. Se ha empleado en
enfermos con leucemia mieloide crnica (LMC),
leucemia promielocitica y linfomas no Hodgkin
(LNH), as como para deplecionar la mdula de
clulas T en trasplantes alognicos. El frmaco
tiene aproximadamente un 50% de respuesta
en pacientes con LMC resistente a fludarabina.
Tambin ha demostrado actividad en pacientes
con enfermedad no tratada, si bien es menor
en los que presentan afectacin esplnica y de
los ganglios linfticos. En pacientes con LNH se
ha estudiado una versin humanizada del an-
ticuerpo: el 20% respondi, aunque de forma
transitoria. Los principales efectos secundarios
observados fueron anemia, trombocitopenia e
infecciones oportunistas.
Rituximab
El rituximab es un anticuerpo monoclonal hu-
manizado frente al antgeno CD20. En estudios
fase II, el frmaco mostr un 40-50% de res-
puestas positivas en pacientes con recidivas de
LNH de bajo grado, con muy buena tolerancia.
En algunas ocasiones, el tratamiento con rituxi-
mab comport reacciones a la perfusin carac-
terizadas por fiebre, escalofros, lisis tumoral, pla-
quetopenia, broncoespasmo e hipoxemia. Estos
sntomas se suelen resolver con tratamiento de
soporte y los pacientes pueden continuar el tra-
tamiento sin secuelas. En raras ocasiones se han
descrito reacciones cutneas de gran intensidad,
algunas incluso fatales. En pacientes con linfo-
mas de grado alto e intermedio, las respuestas
positivas fueron del 30%, independientemente
de la dosis empleada. En combinacin con qui-
mioterapia CHOP (ciclofosfamida, doxorubicina,
vincristina, prednisona), el ndice de respuestas
fue superior al 90%, con un 55% de respuestas
completas de larga duracin; es importante re-
saltar que pacientes con translocacin del gen
blc2 negativizaron dicho marcador en sangre
medido por PCR. En ancianos, el tratamiento
combinado de quimioterapia con rituximab ha
demostrado superioridad frente al tratamien-
to con quimioterapia sola. En linfomas de bajo
grado, el tratamiento combinado de rituximab y
fludarabina dio como resultado un 93% de res-
puestas globales, con una duracin de ms de 14
meses. En el desarrollo clnico del rituximab, una
observacin importante es que la presencia de
clulas CD20 positivas circulantes puede afectar
a la actividad del frmaco, actuando como un
santuario en el que se deposita el anticuerpo,
por lo que puede necesitar dosis ms altas de
ste. De hecho, en otros estudios se ha obser-
vado una relacin entre valores sricos del anti-
cuerpo y actividad clnica, de forma que pacien-
tes con enfermedad avanzada pueden precisar
dosis de anticuerpo ms altas. Ocasionalmente,
los pacientes desarrollan resistencia a rituximab
debido a la proliferacin de poblaciones linfoci-
tarias sin expresin del antgeno. En estas situa-
ciones puede considerarse la combinacin de
este agente con otros frmacos dirigidos contra
las poblaciones linfocitarias emergentes.
Tumores slidos
Trastuzumab
El Her2/Neu, tambin llamado ErbB2, es uno
de los miembros de la familia del EGFR. Este
receptor de membrana se encuentra sobreex-
presado, debido a una amplificacin gentica, en
aproximadamente el 30% de pacientes con cn-
cer de mama. El trastuzumab (Herceptin) es
una versin humanizada del anticuerpo murino
4D5. El anticuerpo va dirigido frente a eptopos
en el dominio extracelular del Her2. En estu-
dios de fase II en pacientes con carcinoma de
mama avanzado, el tratamiento con este frma-
co mostr un 10-15% de respuestas objetivas
y, aproximadamente, 9 y 13 meses de tiempo a
la progresin y supervivencia, respectivamente.
El frmaco es activo en los tumores que sobre-
expresan el Her2, determinado mediante inmu-
histoqumica o mediante amplificacin gentica
por FISH. En combinacin con quimioterapia,
el tratamiento con trastuzumab ha mostrado
superioridad frente al tratamiento con quimio-
terapia exclusivamente en pacientes con cn-
cer de mama avanzado. En un estudio fase III,
el tratamiento combinado de trastuzumab con
paclitaxel o ciclofosfamida-adriamicina tambin
se demostr superior en respuestas objeti-
vas, as como en supervivencia. El tratamiento
combinado con antraciclinas produjo casos de
disfuncin miocrdica, y no se recomienda su
utilizacin. Recientemente se han publicado es-
tudios con trastuzumab en combinacin con
quimioterapia en pacientes con carcinoma de
mama operado, demostrando una mejor su-
pervivencia libre de enfermedad en pacientes
tratadas con este frmaco, por lo que ha me-
recido su aprobacin para uso clnico. La mejor
supervivencia de las pacientes tratadas indica
que posiblemente se logre un mayor nmero
de curaciones de la enfermedad.
Cetuximab
El EGFR, o sus ligandos, est sobreexpresa-
do en la gran mayora de tumores slidos epi-
Inmunoterapia humoral 11
teliales y es una diana muy interesante para el
desarrollo de frmacos antitumorales. Farma-
colgicamente, se han desarrollado dos estra-
tegias contra esta diana, basadas en el empleo
de anticuerpos monoclonales contra el domi-
nio extracelular del receptor o de molculas
pequeas dirigidas frente al dominio intracelu-
lar de ste. Ambas estrategias han demostrado
ser efectivas y actualmente estn aprobados
frmacos inhibidores de este receptor en las
dos categoras. Los anticuerpos monoclonales
bloquean la interaccin del ligando receptor e
inhiben su funcin. Adems, los anticuerpos mo-
noclonales inducen la degradacin del receptor,
y ste es otro mecanismo de atenuacin de la
seal. En las clulas, estos episodios provocan
una inhibicin de la proliferacin celular. Estu-
dios preclnicos han demostrado adems que
estos frmacos reducen la expresin del factor
de crecimiento del endotelio vascular, con lo
que se produce una disminucin del potencial
angiognico. En estudios preclnicos se ha vis-
to tambin que los anticuerpos monoclonales
ejercen efectos sinrgicos con quimioterapia y
radioterapia frente al EGFR.
Existen varios anticuerpos de esta clase en
desarrollo y entre los ms avanzados estn el
cetuximab (Erbitux) y el panitumumab. El pri-
mero ha sido aprobado para el tratamiento de
pacientes con carcinoma de colon refractario a
irinotecn en combinacin con este agente o
con radioterapia en pacientes con carcinoma
epidermoide de cabeza y cuello con enferme-
dad localmente avanzada; tambin, como agente
nico, en pacientes con enfermedad avanzada.
En diferentes estudios clnicos se ha observado
que este anticuerpo tiene actividad, como agen-
te nico y tambin en combinacin con irinote-
cn, en pacientes con cncer de colon avanzado.
En un reciente estudio fase III, la combinacin de
cetuximab con irinotecn result ser superior
a cetuximab solo en pacientes con cncer de
colon avanzado que haban progresado al trata-
miento con irinotecn. El frmaco tiene tambin
actividad en otros tumores, tanto como agente
nico como en combinacin con quimioterapia
12 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
y radioterapia. En particular, varios estudios re-
cientes han demostrado que este frmaco tiene
actividad como agente nico en pacientes con
tumores de cabeza y cuello. Asimismo, la adicin
de cetuximab al tratamiento con quimioterapia
basada en platino, en pacientes con carcinoma
de cabeza y cuello, mostr un aumento de las
respuestas positivas. Finalmente, en un estudio
fase III, la combinacin de cetuximab con radio-
terapia result superior a la radioterapia sola en
pacientes con carcinoma de cabeza y cuello lo-
calmente avanzado. La toxicidad principal obser-
vada con este frmaco es cutnea y se manifiesta
como acn. Curiosamente, en estudios clnicos se
ha observado que los pacientes que desarrollan
toxicidad cutnea tienden a evolucionar mejor.
Los datos ms recientes demuestran aumento
de supervivencia en pacientes con carcinoma de
pulmn tratados con cetuximab en combinacin
con quimioterapia. As mismo, se ha demostrado
que los pacientes con carcinoma de colon que
se benefician del tratamiento con estos agentes
presentan gen Kras normal.
El otro anticuerpo monoclonal aprobado para
uso clnico es panitumumab. Este anticuerpo, a
diferencia de cetuximab, es totalmente humano,
lo cual disminuye la incidencia de reacciones de
hipersensiblidad. En un reciente estudio fase III
en pacientes con carcinoma de colon resisten-
te a tratamiento con quimioterapia, el panitu-
mumab mostr un aumento significativo en el
tiempo a la progresin frente a placebo. Estos
resultados han llevado a la aprobacin clnica
para pacientes con carcinoma de colon refrac-
tario a quimioterapia.
Edrecolomab
El anticuerpo 17-1A (Panorex) reconoce
el antgeno Ep-CAM. El anticuerpo desarrolla-
do clnicamente es un anticuerpo humanizado
que tiene una larga vida media, induce ADCC
y no produce HAMA. Debido a observaciones
preclnicas que indican una mayor actividad del
anticuerpo cuando se combina con citoquinas
como interfern, interleucinas y factores de
crecimiento hemopoyticos, este anticuerpo se
ha desarrollado en combinacin con los otros
agentes. Los estudios clnicos realizados con
esta molcula han dado resultados conflictivos.
La combinacin con citoquinas ha mostrado
mejores respuestas inmunitarias, pero no me-
jores respuestas clnicas. Los estudios iniciales
en pacientes con estadio III de cncer de colon
demostraron aumento en la supervivencia del
grupo tratado con anticuerpo frente al control.
Estudios posteriores en pacientes en estadio II
de cncer de colon y en combinacin con qui-
mioterapia en pacientes con estadio III no han
confirmado dicha actividad.
Bevacizumab
El VEGF es uno de los mediadores ms im-
portantes de la angiognesis. Bevacizumab es
un anticuerpo monoclonal dirigido contra este
factor de crecimiento que ha sido reciente-
mente aprobado para el tratamiento de pa-
cientes afectados de carcinoma de colon en
combinacin con quimioterapia. El frmaco ha
demostrado, en estudios fase III en pacientes
con carcinoma de colon avanzado, mama y pul-
mn, un mayor ndice de respuestas objetivas
y de supervivencia. El frmaco tambin tiene
actividad en pacientes con carcinoma de pul-
mn y se est estudiando con intensidad en
estas otras enfermedades. Los principales efec-
tos secundarios son hipertensin, hemorragias
(tumorales, epistaxis, hemoptisis) y cuadros de
perforacin intestinal.
Otros anticuerpos en tumores slidos
Actualmente se est desarrollando un gran
nmero de anticuerpos monoclonales frente a
otros mltiples antgenos, entre los que desta-
can IGF1R, VEGFR, HGF y mesotelina.
Radioinmunoterapia
Radioinmunoconjugados
En esta modalidad teraputica, los anticuer-
pos se utilizan como vehculos de sustancias
radioactivas. Los anticuerpos utilizados pueden
ser sin actividad teraputica per se o con ella,
como por ejemplo rituximab. La gran disponibi-
lidad actual de anticuerpos y radioistopos, con
propiedades fsicas y biolgicas muy diversas,
permite mucha flexibilidad en su combinacin,
de manera que es posible generar reactivos de
muy diversa ndole. Hasta hace poco, el nico
radioistopo disponible era el 131I. Recientemen-
te, est disponible tambin el 90Y, cuyo uso est
aumentando de forma progresiva. Estos agentes
de clasifican en dos grandes categoras depen-
diendo del tipo de energa que emiten, alfa o
beta. Estas sustancias se han utilizado mayor-
mente en el tratamiento de neoplasias hemato-
lgicas.Tositumomab (Bexxar) est compuesto
por 131I-anti CD20. Dosis mieloablativas de este
agente han sido eficaces en el tratamiento de
pacientes con linfoma refractario al tratamiento
convencional y tambin ha demostrado activi-
dad a dosis ms bajas en pacientes con linfomas
refractarios. Ibritumomab (Zevalin) combina
un anticuerpo frente al CD20 con 90Y. El ms
relevante estudio con este frmaco es de asig-
nacin aleatoria, fase III, en pacientes con linfo-
ma de bajo grado. Se distribuyeron de modo
aleatorio 143 enfermos para recibir tratamien-
to con ibritumomab o rituximab, resultando en
un mayor ndice de respuestas positivas (tanto
completas como parciales) en el grupo tratado
con ibritumomab. Otros frmacos RAIT inclu-
yen Lym-1 y M195. Esta modalidad teraputica
se ha ensayado tambin en tumores slidos, con
menor xito hasta el momento.
Conclusiones
Los anticuerpos monoclonales se han esta-
blecido como una importante modalidad tera-
putica y actualmente existen varios aprobados
para el tratamiento de pacientes con diversos
tipos de tumores. Los anticuerpos ofrecen una
gran versatilidad en cuanto a su posible utiliza-
cin como agentes nicos o combinados con
radioinmunoconjugados, frmacos y toxinas.
Inmunoterapia humoral 13
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 2 Genmica, protemica
y medicina
Fernando Vivanco
Fundacin Jimnez Daz
Universidad Complutense. Madrid
Resumen
La secuenciacin del genoma humano, junto
con el desarrollo y la implementacin de las
nuevas tecnologas micas de alto rendimien-
to (genmica, protemica, metabolmica), estn
incrementando de manera esencial el conoci-
miento de la enfermedad humana y establecien-
do unas bases slidas para el desarrollo de la
medicina personalizada (MP). El paradigma de
la MP, y que plantea unos objetivos ms ambi-
ciosos, es la denominada medicina 4P: pre-
ventiva, predictiva, personalizada y participativa.
Aplicando la biologa de sistemas (que utiliza los
datos y las tcnicas genmicas, protemicas y
metabolmicas), la emergencia de nuevas tec-
nologas (nanochips, microfludica, tcnicas de
visualizacin) y las nuevas herramientas compu-
tacionales, pretenden establecer nuevos estn-
dares en salud humana. Uno de sus objetivos
es incorporar el genoma de cada individuo a su
historial clnico. En septiembre de 2010 se ha
anunciado el lanzamiento del Proyecto del Pro-
teoma Humano que, de forma similar al del Ge-
noma Humano, pretende identificar y caracteri-
zar todas las protenas humanas. Su consecucin
es una pieza esencial en el establecimiento de
la MP para facilitar la obtencin de los perfiles
proteicos (de tejidos, clulas y lquidos fisiolgi-
cos) que definan cada enfermedad.
De la medicina
personalizada
a la medicina 4P
La MP es una forma o modalidad de la me-
dicina que utiliza la informacin de los genes,
protenas y metabolitos de cada paciente para
prevenir, diagnosticar y tratar la enfermedad.
Emplea la informacin del genoma de un indi-
viduo (y los datos que se derivan, expresin de
protenas, presencia de metabolitos) en pruebas
de diagnstico tiles y tratamientos especficos
para cada enfermedad y para cada paciente. La
medicina genmica hace uso de la informacin
genmica y las tecnologas complementarias
(bioinformticas) para determinar el riesgo y
la predisposicin a la enfermedad, diagnstico
y pronstico y la seleccin y priorizacin de las
opciones teraputicas. Mientras que la farma-
cogentica se centra en el estudio de cmo un
gen (o un pequeo nmero de genes) afecta al
metabolismo de un frmaco, la farmacogenmi-
ca lo hace en el estudio de cmo la variacin
gentica del genoma afecta al metabolismo y
respuesta frente a los frmacos. La MP utiliza los
test moleculares farmacogenticos y farmacoge-
nmicos para estratificar a los pacientes segn
su respuesta predicha a un tratamiento parti-
cular y mejora la eficacia del tratamiento selec-
Genmica, protemica y medicina 15
cionando los individuos que responden bien o
excluyendo a los que van a tener un efecto ad-
verso (fig. 1). En los ltimos aos los genetistas
han conseguido identificar los genes responsa-
bles de enfermedades que dependen de 1 solo
gen (unos 2.000), como la enfermedad de Hun-
tington, la fibrosis qustica o la anemia falcifor-
me. Sin embargo, otras enfermedades mucho
ms comunes, como la diabetes, la enfermedad
coronaria o diversos tipos de cnceres, tienen
una base gentica compleja (estn implicados
muchos genes) y su estudio no puede realizarse
por las tcnicas genticas habituales. No obs-
tante, las nuevas tcnicas de secuenciacin de
ADN y los microarrays de ADN han permitido
la identificacin de un gran nmero de genes de
Patients can respond differently
to the same medicine
Anti-depressants
(SSRIS)
38%
Asthma drugs 40%
Diabetes drugs 43%
Arthritis drugs 50%
Alzheimers
70%
drugs
Cancer drugs 75%
Percentage of the patient population for witch particular drug
in a class is ineffective, on average
Figura 1A. Eficacia de distintos frmacos sobre
la poblacin general.
16 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
susceptibilidad para estas enfermedades com-
plejas, abriendo la posibilidad de una deteccin
temprana y una posible prevencin en algunos
casos. Los microarrays permiten evaluar miles
de fragmentos de ADN o ARN y medir el ni-
vel de expresin de cada gen, obtenindose las
firmas de expresin gnica o perfiles de expre-
sin; son, por tanto, una herramienta muy pode-
rosa para investigar el papel de uno o mltiples
genes y los polimorfismos (SNP, variaciones de
secuencias en el ADN) en los procesos patol-
gicos de individuos o de poblaciones. Asimismo,
los estudios de asociacin genmica (Genomic-
Wide Association Study, GWAS) han permitido,
a partir de 2006, la identificacin de cientos de
genes de susceptibilidad para las enfermedades
prevalentes (muy recientemente para el asma).
Con esta aproximacin se comparan los geno-
mas de un nmero de pacientes que tienen una
enfermedad con un grupo control que no la
tiene, para identificar las diferencias entre am-
bas poblaciones. Si se encuentra alguna variante
gentica de algn gen que aparece con mayor
frecuencia en la poblacin de pacientes que en
el grupo control, esas variantes se consideran
que estn asociadas con la enfermedad.
En cierto sentido los mdicos siempre han
practicado la MP, ajustando las dosis de los me-
dicamentos a cada paciente, cambiando el tipo
de frmaco, etc., pero para probar en funcin
del resultado, lo que con frecuencia dilataba el
tiempo para aplicar el tratamiento ptimo y se
padecan los efectos adversos o la ineficacia de
los frmacos. Actualmente, la MP incorpora la
informacin derivada de los anlisis moleculares,
con nuevos perfiles proteicos en sangre que in-
dican un riesgo elevado de enfermedad cardio-
vascular o la presencia de cncer de pncreas
o de prstata o de inflamacin, que orientan
al clnico de forma decisiva en la toma de de-
cisiones. Cada vez ms, un mayor nmero de
enfermedades se caracteriza por su perfil mo-
lecular (genmico, protemico), cuyo mximo
exponente es el cncer hasta ahora el rgano,
tejido, localizacin y caracterizacin histolgica
eran los criterios decisivos. Hoy da, adems,
se caracterizan por los genes que expresa cada
tumor o por las protenas presentes en su su-
perficie. Los test moleculares ofrecen una gran
informacin sobre la situacin de cada paciente,
incluyendo la susceptibilidad a una enfermedad,
su progresin y la respuesta a distintos frma-
cos: el frmaco adecuado, en la dosis adecuada,
para el paciente adecuado, que es la esencia de
la MP (farmacogenmica). Adems, tienen en
gran medida naturaleza predictiva, lo que favo-
rece intervenciones preventivas (tabla 1). Los
dos enfoques son complementarios, siendo los
protagonistas del primero (clsico) las clulas,
los tejidos y los frmacos de tipo general, su-
puestamente tiles para todos los pacientes de
una misma enfermedad (talla nica para to-
dos). En el enfoque de la MP, los protagonistas
son los genes, las protenas y los metabolitos; y
las rutas, redes e interconexiones entre ellos, de

Medicina personalizada

Beneficio y toxicidad

No beneficio y toxicidad

No beneficio y no toxicidad

Pacientes
con el mismo diagnstico Beneficio y no toxicidad

Tratamiento
ptimo
para cada paciente

Pacientes Genotipado
con el mismo diagnstico

Figura 1B. Comparacin de la estrategia utilizada en la MP, utilizando test genticos (panel inferir), frente a
la medicina clsica, que utiliza el mismo frmaco para todos los pacientes de una misma enfermedad.

Genmica, protemica y medicina 17

 Tabla 1. Selected Personalized Medicine Drugs, Treatments, and Diagnostics as of March 2009*

Therapy Biomarker/test Indication

Herceptin (trastuzumab) HER-2/neu receptor Breast cancer: for the treatment of patients with metastatic
Tykerb (lapatinib) breast cancer whose tumors overexpress the HER2 protein and
who have received one or more chemotherapy regimens for their
metastatic disease

Pharmaceutical and sur- BRCA 1,2 Breast cancer: Guides surveillance and preventive treatment based
gical prevention options on susceptibility risk for breast and ovarian cancer
and surveillance

Tamoxifen Aviara Breast Cancer Breast cancer: Calculates a combined risk analysis for recurrence
IndexSM (HOXB13, after tamoxifen treatment for ER-positive, node-negative breast
IL17BR) cancer

Chemotherapy Mammostrat Breast cancer: Prognostic immunohistochemistry (IHC) test used

for postmenopausal, node negative, estrogen receptor expressing
breast cancer patients who will receive hormonal therapy and are
considering adjuvant chemotherapy

Chemotherapy MammaPrint Breast cancer: Assesses risk of distant metastasis in a 70 gene ex-
pression profile

Coumadin (warfarin) CYP2C9 Cardiovascular disease: an increased bleeding risk for patients ca-
rrying either the CYP2C9*2 or CYP2C9*3 alleles

Coumadin (warfarin) VKORC1 Cardiovascular disease: Certain single nucleotide polymorphisms

in the VKORC1 gene (especially the -1639G > A allele) have been
associated with lower dose requirements for warfarin

Coumadin (warfarin) PGx PredictTM: Cardiovascular disease: Determines CYP2C9 and VKORC1 genoty-
Warfarin pes to predict likelihood of adverse events with warfarin therapy.

Coumadin (warfarin) Protein C deficiencies Cardiovascular disease: Hereditary or acquired deficiencies of pro-
tein C or its cofactor, protein S, has been associated with tissue
necrosis following warfarin administration

Pharmaceutical and lifes- Familion 5-gene Cardiovascular disease: Guides prevention and drug selection for
tyle prevention options profile patients with inherited cardiac channelopathies such as Long
QT Syndrome (LQTS ), which can lead to cardiac rhythm ab-
normalities

Statins PhyzioType SINM Cardiovascular disease: Predicts risk of statin-induced neuro-myopa-

thy, based on a patients combinatorial genotype for 50 genes

Atorvastatin LDLR Cardiovascular disease: Doses should be individualized ac-

cording to the recommended goal of therapy. Homozygous
Familial Hypercholestremia (10-80mg/day)and heterozygous
(10-20mg/day)

Camptosar (irinotecan) UGTIA1 Colon cancer: Variations in the UGT1A1 gene can influence a
patients ability to break down irinotecan, which can lead to increa-
sed blood levels of the drug and a higher risk of side effects

18 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana

 Therapy Biomarker/test Indication

Erbitux (cetuximab) EGFR expression Colon cancer: Patients enrolled in the clinical studies were re-
Gefitinib quired to haveevidence of positive EGFR expression using the
Vectibix (panitumab) DakoCytomation EGFR pharmDx test kit. EGFR positive indi-
viduals are more likely to respond to the drug than those with
reduced EGFR expression.

Erbitux (cetuximab) KRAS Colon cancer: Certain KRAS mutations lead to unresponsiveness
Gefitinib to the drug
Vectibix (panitumab)

Erbitux (cetuximab) and Target GI Colon cancer: Provides information of the expression of key mole-
Vectibix (panitumab) cular targetsKRAS, TS, and TOPO1to guide therapy
Fluorouracil
Camptosar (irinotecan)

Tagretol HLA-B*1502 Epilepsy and bipolar disorder: Serious dermatologic reactions are
(carbamazepine) associated with the HLAB*1502 allele in patients treated with
carbamazepine. Prior to initiating Tegretol therapy, testing for
HLA-B*1502 should be performed in patients with ancestry in
populations in which HLAB*1502 may be present

Immunosuppressive AlloMap gene Heart transplantation: Monitors patients immune response to

drugs profile heart transplant to guide immunosuppressive therapy.

Ziagen (abacavir) HLA-B*5701 HIV: Patients who carry the HLA-B*5701 allele are at high risk for expe-
riencing a hypersensitivity reaction to abacavir. Prior to initiating therapy
with abacavir, screening for the HLA-B*5701 allele is recommended

Selzentry CCR5 receptor (1) HIV: Selzentry, in combination with other antiretroviral agents, is
(maraviroc) indicated for treatment experienced adult patients infected with
only CCR5-tropic HIV-1 detectable...

Budesonide IBD Serology 7 Inflammatory bowel disease: Identifies subset of patients who will
benefit from budesonide.

Gleevec BCR-ABL Leukemia: Gleevec (imatinib mesylate) is indicated for the

(imatinib mesylate) treatment of newly diagnosed adult and pediatric patients with Phi-
ladelphia chromosome positive [indicated by presence of BCRABL]
chronic myeloid leukemia (CML) in chronic phase

Dasatinib Philadelphia Leukemia: Dasatinib is indicated for the treatment of adults with
Chromosome Philadelphia chromosomepositive acute lymphoblastic leukemia
(Ph+ AL) with resistance or intolerance to prior therapy

Busulfan Philadelphia Leukemia: Busulfan is clearly less effective in patients with chronic mye-
Chromosome logenous leukemia who lack the Philadelphia (Ph1) chromosome

Purinethol TPMT Leukemia: Guides adjustment of dose in treatment of acute lym-

(mercaptopurine) phoblastic leukemia: Patients with inherited little or no thiopurine
Thiaguanine S-methyltransferase (TPMT) activity are at increased risk for severe
Azathioprine Purinethol toxicity from conventional doses

Genmica, protemica y medicina 19

 Therapy Biomarker/test Indication

Tarceva (erlotinib) EGFR expression Lung cancer: The test determines patients most likely to respond.

Capecitabine DPD Multiple cancers: Rarely, unexpected severe toxicity (e.g., sto-
matitis, diarrhea, neutropenia and neurotoxicity) associated with
5-fluorouracil has been attributed to a deficiency of dihydropyri-
midine dehydrogenase (DPD) activity

Pharmaceutical and sur- MLH1, MSH2, MSH6 Multiple cancers: Guides surveillance and preventive treatment ba-
gical treatment options sed on susceptibility risk for colon and other cancers.
and surveillance

Chemotherapy CupPrintTM Multiple cancers: Determines cancer classification for tumors of

unknown primary origin.

Chemotherapy Aviara Cancer TYPE Multiple cancers: Classifies 39 tumor types from tumors of unk-
ID nown primary origin, using a gene expression profile.

Elitek (rasburicase) G6PD deficiency Multiple cancers: Rasburicase administered to patients with glucose-
phosphate dehydrogenase (G6PD) deficiency can cause severe he-
molysis. It is recommended that patients at higher risk for G6PD
deficiency be screened prior to starting ELITEK therapy

Drugs metabolized by Amplichip Multiple diseases: FDA classification 21 CFR 862.3360: This device
CYP P450 CYP2D6/CYP2C19 is used as an aid in determining treatment choice and individualizing
treatment dose for therapeutics that are metabolized primarily by
2C19: Celecoxib, Codeine, Dia-
zepam, Esomeprazole, Nelfinavir,
the specific enzyme about which the system provides genotypic
Omeprazole, Pantoprazole, Ra- information
beprazole, Voriconazole
2D6: Acetaminophen, Aripiprazo-
le, Atomoxetine, Carvedilol, Ce-
vimeline hydrochloride, Clozapi-
ne, Fluoxetine HCl, Fluoxetine
HCL and Olanzapine, Metopro-
lol, Propranolol, Propafenone,
Protriptyline HCl, Risperidone,
Tamoxifen, Terbinafine, Thiorida-
zine,Timolol maleate,Tiotropium
bromide inhalation, Tolterodine,
Tramadol, Venlafaxine

Rifampin NAT Multiple diseases: N-acetyltransferase slow and fast acetylators and
Isoniazid toxicity- slow acetylation may lead to higher blood levels of the
Pyrazinamide drug, and thus, an increase in toxic reactions

Rituximab PGx PredictTM: Non-Hodgkins lymphoma: Detects CD-20 variant (polymorphism

Rituximab in the IgG Fc receptor gene FcgRIIIa) to predict response to cancer
drug rituximab.

Celebrex (celecoxib) CYP2C9 Pain: Patients who are known or suspected to be P450 2C9 poor
metabolizers based on a previous history should be administered
celecoxib with caution as they may have abnormally high plasma
levels due to reduced metabolic clearance

Risperdal (resperidone) PhyzioType PIMS Psychiatric disorders: Predicts risk of psychotropic-induced metabolic
Zyprexa (olanzapine) syndrome, based on a patients combinatorial genotype for 50 genes.

20 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana

 Therapy Biomarker/test Indication

Gleevec c-KIT Stomach cancer: Gleevec is also indicated for the treatment of
(imatinib mesylate) patients with Kit (CD117) positive unresectable and/or metastatic
malignant gastrointestinal stromal tumors (GIST)
*This list is not intended to be comprehensive but reflects commonly used or available products as of March 2009. Some products, for which the
FDA recommends or requires pharmacogenomic testing or which have pharmacogenomic information in their label, are listed at the FDAs Web
site (http://www.fda.gov/cder/genomics/genomic_biomarkers_table.htm). Other listed products that are novel, and/or that address large popula-
tions, have been identified via websites and public announcements.
Indications in quotes are taken from the therapeutic product label.
BCR-ABL = breakpoint cluster region Abelson DPD = dihydropyrimidine dehydrogenase TOPO1 = topoisomerase 1
BRCA 1,2 = breast cancer susceptibility gene 1 or 2 G6PD = glucose 6 phosphate dehydrogenase TPMT = thiopurine S-methyltransferase
c-KIT = tyrosine kinase receptor HER2 = human epidermal growth factor receptor 2 TS = thymidylate synthase
CYP = cytochrome P450 enzyme NAT = N-acetyltransferase UGT1A1 = UDP-glucuronosyltransferase 1A1

Therapeutic product label contains pharmacogenomic information as: Information only Recommended Required

forma que los frmacos (a veces en forma de
cctel) interfieren con las redes o con los nudos
(intersecciones) que bloquean toda la red. Algu-
nos test para el cncer de mama, que evalan
70 genes, orientan no slo sobre el frmaco a
administrar sino que predicen la probabilidad
de desarrollar metstasis e incluso el grado de
malignidad. La MP, por tanto, se basa en anlisis
moleculares, con frecuencia altamente comple-
jos (perfiles genmicos de miles de genes, perfi-
les protemicos de cientos de protenas) y que
requiere un amplio apoyo de todo el sistema
de salud de los pases que quieran implantar-
lo: nuevas regulaciones, revisin profunda de la
educacin en biomedicina, sistemas integrados
de informacin sobre la salud, nueva legislacin
que proteja frente a la discriminacin (por ra-
zones genticas), cobertura de los test por los
seguros pblicos y privados, etc.
A pesar de los numerosos obstculos, lenta-
mente, pero con paso firme, la MP se va incor-
porando a los sistemas de salud de los pases
desarrollados. La tecnologa y las nuevas estra-
tegias cientficas han sido siempre los motores
de las revoluciones cientficas y todo indica que
lo mismo va a ocurrir con la medicina. Pases
como Estados Unidos o el Reino Unido han
aprobado recientemente en sus parlamentos
las directrices para el establecimiento de la MP
como el camino ptimo para la salud de la po-
blacin y, a la vez, el de menor costo a largo
plazo. El paradigma de la MP, y que plantea unos
objetivos ms ambiciosos, es la denominada me-
dicina 4P: preventiva, predictiva, personalizada y
participativa. Sus promotores (cuyo mximo re-
presentante es L. Hood, presidente del Institute
for Systems Biology, Seattle, Estados Unidos)
consideran que la aplicacin de la biologa de
sistemas (que hace uso de los datos y tcnicas
genmicas, protemicas y metabolmicas) (fig.
2), la emergencia de nuevas tecnologas (nano-
chips, microfludica, tcnicas de visualizacin), y
las nuevas herramientas computacionales, van a
modificar significativamente la medicina y el tra-
tamiento de la enfermedad. El carcter predicti-
vo proviene de la estimacin de la probabilidad
de padecer o no una cierta enfermedad en
funcin del genoma individual. Es personalizada
porque las variaciones genticas nicas de cada
individuo orientan y/o dirigen los tratamientos:
cada paciente se convierte en su propio con-
trol; a partir del genoma individual se poseen
billones de datos de cada individuo y cientos
de millones de individuos con esa cantidad de
informacin. Es preventiva porque pueden di-
searse frmacos teraputicos/preventivos a
partir de la informacin generada mediante la
biologa de sistemas. Y, finalmente, es participa-

Genmica, protemica y medicina 21

 Parallel analyses of proteins, metabolites and mRNA from complex samples
Determination of molecular function and elucidation of disease mechanisms
Informatics tools to link gene response, protein activity and metabolite dynamics
BioSystematics to translate covariant sets of genes, proteins, metabolites into biochemical
interaction and target information

Genes metabolite index

BioSystematicsTM
protein index
Proteins

Metabolites

Clinical data

ex
ind
ne
Target and

ge
System information

Figura 2. Representacin esquemtica de los elementos que constituyen la biologa de sistemas y su

aplicacin en medicina.

tiva porque los pacientes entienden y partici-
pan en las opciones que toman los mdicos, los
cuales deben actuar como integradores de la
informacin total.
Utilizando los anlisis moleculares de la bio-
loga de sistemas para el tratamiento de la en-
fermedad o su predisposicin, la medicina 4P
promete introducir nuevos estndares en la
salud humana. El resultado es que en los prxi-
mos 5-20 aos la medicina puede cambiar de
ser prioritariamente reactiva (responde cuando
aparecen los sntomas de la enfermedad) a ser
proactiva, caracterizada por las 4P. Si se adop-
tan los test moleculares en la prctica clnica
se puede realmente transformar la salud de la
poblacin. Gracias a la secuenciacin ultrarrpi-
da se puede obtener el perfil genmico de un
individuo (o de un tumor) en cuestin de das
e incluso horas, lo cual introduce unos niveles
de complejidad difcilmente controlables en la
actualidad. Sin embargo, el nmero de causas
o modificaciones (mutaciones) que hacen que
una clula sana se convierta en tumoral no pa-
rece ser muy elevado y son comunes a muchos
tumores, lo que facilita el diagnstico y sobre
todo el tratamiento. Ya no es arriesgado decir
que en un futuro inmediato la determinacin
del genoma completo de cada individuo es algo
no slo factible, sino de un precio asequible
(unos 1.000 dlares, 800 euros): el primer geno-
ma cost 3 billones de dlares, el segundo 100
millones y el tercero, el de James Watson, 1,5
millones (fig. 3). En el futuro cada recin nacido
tendr determinado su genoma completo antes
de abandonar el hospital, lo que ya es un obje-
tivo en Estados Unidos, donde el nmero de
nacimientos anuales ronda los 4 millones. Los
genomas individuales sern un estndar dentro
de las historias clnicas en los prximos aos.
Sin embargo, algunas de las tecnologas de
hoy da necesitan ser mejoradas de forma im-
portante si se quieren conseguir los objetivos
de la medicina 4P. Por ejemplo, los mtodos na-
notecnolgicos para la medicin de protenas
como medir 2.500 protenas a partir de una
gota de sangre no son posibles actualmente.

22 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana

 3,0 $3B
20
15
$ Millons
2,5
10
2,0
$ Billons
1,5
1,0
0,5
0
1990 1992 1994 1996
Figura 3. Descenso progresivo en el costo (en $) estimado para la determinacin del genoma completo
de un individuo.
Existen pequeos dispositivos que son capaces
de cuantificar 40-60 protenas en lquidos fisio-
lgicos (se han testado en saliva) que pueden
ser prototipos de desarrollos posteriores (fig.
4). La propuesta de que deben desarrollarse
test que evalen 50-100 protenas especficas
de los distintos rganos, como forma de pre-
guntarnos acerca del estado de salud en vez
del estado de la enfermedad, est sin embar-
go mucho ms cerca. Las tcnicas protemicas
ms recientes, como el mtodo MRM, ya son
capaces de cuantificar 50-100 protenas/ensayo
en un breve tiempo y con gran sensibilidad y
exactitud. Igualmente, la capacidad de obtener
anlisis detallados a partir de una nica clula
o un pequeo grupo de ellas (actualmente se
est haciendo con 1.000 clulas) podr ser real
en un futuro prximo. El desarrollo de herra-
mientas computacionales y matemticas con
capacidad de gestionar la dimensionalidad de
los datos es una tecnologa con un alto poder
transformador. En los prximos 10 aos vamos
a disponer de millones de datos procedentes
del genoma y proteomas de cada paciente.
Cmo reducir esa enorme cantidad de datos
a hiptesis simples de salud y enfermedad? El
$20M
5 $2M
$5K
$1K
0
2006 2006 2006 2006 2006
1998 2000 2002 2004 2006 2008
modo de correlacionar los datos genmicos y
protemicos con el fenotipo normal y asociado
a cada enfermedad es un gran reto. Dnde y
cmo se van a manejar informticamente todos
esos datos es actualmente un desafo y un tema
para la reflexin. Hood considera que esta im-
plementacin abocar en una digitalizacin de la
medicina, de forma similar a lo que ha ocurrido
recientemente en el paso de la informacin ana-
lgica a la digital. Es posible que la medicina se
convierta as en una ciencia de la informacin.
Protemica y medicina:
el proyecto proteoma
humano
En septiembre de 2010, dos centros indepen-
dientes (The Institute for Systems Biology, en
Seattle, Washington y el Swiss Federal Institute
of Technology, ETH, en Zrich) han anunciado
oficialmente que han completado la primera
fase para la generacin de un mapa comple-
to del proteoma humano, utilizando la espec-
trometra de masas (MS) para la identificacin
Genmica, protemica y medicina 23
A

Determinacin de perfiles proteicos

rgano-especficos (cerebro, hgado) en el plasma

Distincin salud/enfermedad

Eliminar clulas
300 nl de plasma
Cuantificacin
de protenas

Nanochips (microfludica) para el anlisis del plasma sanguneo (protenas)

Figura 4. A) La presencia de protenas rgano-especficas en el plasma permite la obtencin de perfiles

proteicos asociados a la enfermedad. B) Representacin esquemtica de un nanochip para el anlisis
de protenas plasmticas.

de las protenas estos datos estn libremen-
te accesibles a toda la comunidad cientfica en
(www.srmatlas.org; www.peptideatlas.org. Los
investigadores han generado espectros de ma-
sas (anlisis que permite identificar cada prote-
na) de referencia para cada una de las protenas
correspondientes a los 20.300 genes humanos
presentes en el genoma. Este mapa de refe-
rencia permitir a los investigadores de todo el
mundo detectar y cuantificar cualquier protena
humana de cualquier muestra biolgica (tejidos,
clulas, lquidos fisiolgicos). Se utilizan para ello
tcnicas especficas de MS, fundamentalmente
SRM (Selected Reaction Monitoring), que per-
miten detectar y cuantificar cada protena indi-
vidual a partir de alguno de sus pptidos. Mo-
ritz, Hood y Aebersold han generado ms de
150.000 SRM que incluyen al menos 5 pptidos
proteotpicos (especficos de cada protena)
para la identificacin de las protenas. Adems,
han dsarrollado ensayos de SRM especficos
para todas las protenas de membrana y todas
las glucoprotenas con sitios de N-glucosilacin.
Este ingente trabajo supone un avance compa-
rable al primer borrador del genoma humano,
de forma que ahora las bases de datos con las
protenas son de libre acceso; el costo estimado
ha sido de 5 millones de euros. El mapeo del
genoma humano requiri 10 aos y un costo
de casi 3 billones de dlares; fue el origen de lo

24 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana

que ahora comienza como Proyecto del Pro-
teoma Humano (HPP), que se estima pueda es-
tar completado en el ao 2020. Con los datos,
ahora pblicos, se da un paso de gigante para
reforzar el desarrollo de la MP porque facilita
hacer el tipo de anlisis de alto rendimiento (mi-
les de protenas de un individuo) que se requie-
re en la MP o 4P. Pero el objetivo final del HPP
no es tener un mero listado de protenas, sino
todas las posibles variantes de cada protena
(isoformas), su funcin, abundancia, localizacin
subcelular y sus interacciones (redes y rutas de
sealizacin). Casi un tercio de los 21.000 ge-
nes del genoma humano no tiene una protena
conocida asociada y de los otros dos tercios no
hay una informacin detallada. El HPP se propo-
ne obtener esta informacin detallada y tener
al menos una protena correspondiente a cada
gen humano. Es un objetivo complicado, por-
que el proteoma es dinmico, est cambiando
constantemente y las protenas son modificadas
de mltiples formas (fosforilacin, glucosilacin,
acetilacin, etc.) y en distintos tiempos. Adems,
se pretende tener una coleccin de anticuerpos
especficos para cada una de las protenas.
De cara al futuro inmediato, uno de los ma-
yores desafos es almacenar, manejar y controlar
todos los datos que genera el HPP, especial-
mente de forma integrada entre s y con los
datos genmicos. Es fundamental que presente
utilidad prctica y, en especial, que proporcio-
ne informacin til para la medicina que pueda
trasladarse rpidamente a la prctica clnica. No
debe olvidarse que en ltimo trmino son las
protenas (y no slo los genes) las molculas
clave para el entendimiento de las enfermeda-
des (y de la salud). Las protenas son los con-
tribuyentes fundamentales del fenotipo, y las
enfermedades se refieren fundamentalmente al
fenotipo y no al genotipo. Cualquier mejora e
implementacin en la medicina y en la MP de-
pende de un mayor conocimiento de las prote-
nas y del proteoma humano que ahora empieza
a desvelarse. Es importante recordar, adems,
que ms del 90% de las dianas teraputicas son
protenas, sobre las que actan los frmacos.
Protemica clnica
La protemica ofrece una informacin al-
tamente complementaria de la genmica;
como la mayora de las funciones biolgicas
las realizan las protenas, la protemica ofrece
una nueva visin de la enfermedad. A pesar
de su complejidad, el rpido y notable desa-
rrollo en los ltimos aos ha conducido a su
aplicacin a los procesos patolgicos o pro-
temica clnica, la cual se ocupa de la identifi-
cacin sistemtica y exhaustiva, a gran escala,
de patrones proteicos de enfermedad y de la
aplicacin de esos datos a los pacientes (estu-
dio de la enfermedad, susceptibilidad, preven-
cin, seleccin de terapias, seguimiento de los
tratamientos, etc.). Entender, por ejemplo, las
alteraciones tempranas en diversas enferme-
dades (tpicamente en cncer o en el sndro-
me coronario agudo), producira una notable
mejora en la prevencin e identificacin de
pacientes con riesgo y/o en estado preclnico.
La protemica clnica pretende definir patro-
nes de protenas que puedan generar infor-
macin de valor clnico acerca de la suscep-
tibilidad, diagnstico, pronstico y terapia de
la enfermedad; para que impacte de manera
real en la mejora de la salud debe identificar
y seleccionar patrones proteicos, validarlos en
estudios poblacionales muy amplios y trasla-
darlo a la prctica clnica. Entre sus objetivos,
se encuentran los que siguen.
Identificacin de biomarcado-
res individuales
La bsqueda e identificacin de biomarca-
dores individuales se lleva a cabo siguiendo
la metodologa protemica clsica de separa-
cin de protenas (2-DE, DIGE, cromatografa
multidimensional y electroforesis capilar) y
su identificacin por espectrometra de ma-
sas (MS, MALDI-TOF, ESI-Q-TOF o ESI-Trap,
MALDI-TOF/TOF). Su estrategia fundamental
es el anlisis de la expresin diferencial de
protenas entre controles y muestras pato-
Genmica, protemica y medicina 25
lgicas (fig. 5), de proteomas completos (li-
sados celulares) o subproteomas especficos
(mitocondrias, membranas, etc.). Un aspecto
fundamental es la determinacin de las mo-
dificaciones postraduccionales y su potencial
implicacin en patologa. En muchos casos los
biomarcadores se convierten simultneamen-
te en nuevas dianas teraputicas.
Obtencin de perfiles proteicos
Consiste en el estudio sistemtico, a gran esca-
la, de las protenas de una muestra para la identi-
ficacin de patrones o perfiles proteicos (huellas
dactilares proteicas), con carcter diagnstico
(discriminatorio) y/o pronstico. Los escasos
biomarcadores identificados y aprobados por la
FDA en los ltimos aos son un reflejo de la es-
trategia habitual de testar una protena individual,
o llevar a cabo anlisis en pequea escala, etc.
Aunque existen excepciones (paraprotenas de
los mielomas, dficit de -1-antitripsina) es muy
posible que no existan marcadores nicos de las
enfermedades complejas, por lo que la estrategia
protemica de estudiar paneles proteicos, supo-
ne un paso cualitativo de gran trascendencia. Este
estudio se puede realizar mediante, al menos, las
tres estrategias que siguen.
Perfiles proteicos de plasma o suero
Se analiza el suero/plasma de los pacientes
con la patologa objeto de estudio (cardiovas-
cular, neurodegenerativa, infecciosas, cncer, etc.)
y alternativamente en otros lquidos fisiolgicos
(lavado broncoalveolar, lquido cefalorraqudeo,
orina). Se utiliza la tcnica denominada SELDI-

Normal

RCC

Normal

RCC

Figura 5. Ejemplo de anlisis protemico de expresin diferencial mediante electroforesis bidimensional.

La comparacin entre las protenas (manchas en la figura) del tejido sano (Normal) y patolgico (RCC),
permite detectar alteraciones en los niveles de expresin de varias protenas (flechas en los paneles
de la derecha)

26 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana

TOF (Surface Enhanced Laser Desorption/
Ionization-Time of Flight) para la generacin de
los perfiles proteicos, que combina la retencin
de las protenas del suero en biochips con la de-
terminacin de sus masas moleculares mediante
MS, permitiendo generar grficos donde se re-
presenta la abundancia frente a la masa molecu-
lar de las protenas, a modo de cdigo de barras
proteicos constituidos por miles de lneas que
caracterizan el suero de cada individuo (fig. 6). Su
poder discriminatorio es muy superior al de mar-
cadores nicos con los que se han comparado (p.
ej., PSA en cncer de prstata, protena C reac-
tiva en infeccin e inflamacin). Como el anlisis
mediante SELDI-TOF utiliza muy poca muestra
(1 l) y, adems, es muy rpido (se pueden anali-
zar cientos de muestras al da) y automatizado, su
potencial en clnica analtica es enorme y puede ir
sustituyendo muchas de las tcnicas habituales de
los laboratorios de bioqumica clnica (enzimo-
inmunoanlisis), que son ms lentos, ms caros
(utilizan anticuerpos marcados con sondas fluo-
rescentes), precisan mayor cantidad de muestra y
slo informan de un nico marcador, frente a los
miles que proporciona el SELDI-TOF.
Perfiles proteicos de tejidos: MS-Imaging
En tejidos, pueden obtenerse perfiles o imge-
nes (mapas) bidimensionales de protenas (MS-
Imaging) aplicando directamente la MS sobre
cortes histolgicos del tejido (cortes habituales
sobre portaobjetos para microscopia ptica, de
5-20 m de grosor), utilizando el MALDI-TOF
o el MALDI-TOF/TOF. El mapa bidimensional se
consigue haciendo incidir el lser (que barre
la superficie de la muestra) del espectrme-
tro sobre los cortes histolgicos y analizando
las protenas que son vaporizadas. Tpicamente
aparecen 500-1.000 seales de protenas indivi-
duales en cada punto del tejido, con masas en-
tre 2-70 kDa. De esta forma se obtiene la masa
(m/z) de las molculas (pptidos, protenas)
presentes en cada zona del tejido. Seleccionan-
do una masa dada (m/z) en los distintos espec-
tros de las diferentes zonas, se genera un mapa
6593.8
4303.1
3325.4
5392.1
Relative intensity
4303.1 6593.8
3325.1
5392.1
3,000 4,000 5,000 6,000 7,000
Figura 6. Representacin de perfiles proteicos
obtenidos por SELDI-TOF.
bidimensional de la distribucin de esa protena
(esa m/z) a lo largo del corte de tejido (a modo
de cartografa proteica). Se pueden conseguir
dos tipos de datos: perfiles proteicos (mediante
una adquisicin puntual) e imgenes (barriendo
todo el tejido con el lser) (fig. 7).
Las imgenes son generadas mediante un
software especfico que clasifica y agrupa las
protenas y compara diversas muestras, permi-
tiendo obtener imgenes tridimensionales de
la distribucin de las protenas del tejido. Esta
tecnologa implica un tipo de informacin to-
talmente nuevo para la descripcin, clasificacin
y caracterizacin de muestras histolgicas que
est permitiendo la identificacin de biomarca-
dores, la localizacin de protenas especficas y,
en el campo de la oncologa, la reclasificacin de
tumores, por ejemplo.
Una tcnica muy similar (SIMS-TOF, Secon-
dary Ion Mass Spectrometry) permite el anlisis
(identificacin y caracterizacin) de molculas
de bajo peso molecular presentes en la super-
ficie de una muestra (determinacin del meta-
boloma) hasta los 1.500 Da. Esta limitacin en
el reducido rango de masas analizado es com-
pensada en parte por la alta resolucin obte-
nida (subcelular; hasta 200 nm/pixel) y por no
necesitar la utilizacin de ningn tipo de matriz
(evitando interferencia y deslocalizacin de las
muestras: se usa el tejido directamente), lo que
Genmica, protemica y medicina 27

Las
er
Tandem MS
MS/MS spectrum
Peptide fragments
Database search 0%
Protein identification
Figura 7. Flujo de trabajo en el anlisis de tejidos mediante MS-Imaging.
la convierte en una herramienta muy valiosa en
patologa. Adems, como sta tcnica se aplica
para localizar y mapear en el tejido molculas
pequeas, particularmente frmacos (y su co-
localizacin con protenas), es de gran inters
para la industria farmacutica.
Chips (arrays) de protenas
La obtencin de perfiles proteicos, tanto de
suero (u otros lquidos fisiolgicos) como de c-
lulas o tejidos, tambin puede obtenerse a partir
de la utilizacin de chips (o micromatrices) de
protenas. stos pueden clasificarse segn mu-
28 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
Tissue slide
Matrix application
Laser ablation
MS
Mass spectra for each xy coordinate
Single m/z values Biocomputational analysis
100% Class A Class B
Protein images Classification images
chos parmetros (modo de fabricacin, qumi-
ca de la superficie, especificidad, densidad, etc.),
aunque es mejor sistematizarlos en dos grandes
grupos, segn lo que capturan o analizan.
Chips analticos
Se utilizan para determinar las protenas pre-
sentes en una muestra (perfil de expresin) y
su cuantificacin. La disolucin de la mezcla de
protenas a analizar se aplica sobre el chip, que
contiene agentes de captura que actan como
sondas. Los agentes de captura ms conocidos
son los anticuerpos (Ab) en sus distintas moda-
lidades: monoclonales completos, Fab, scFv, afi-
bodies (Ab sintticos), dominios de Ab, etc. La
utilizacin de Ab no est exenta de problemas:
inespecificidad, reacciones cruzadas, orientacin,
afinidad, etc. Otra alternativa son los chips de
antgeno para analizar el perfil srico de Ab (y
autoAb en enfermedades autoinmunes), como
los chips de alrgenos para la deteccin de IgEs
en respuestas alrgicas.
Recientemente se est generando una pltora
de agentes de captura distintos a los Ab, como
pptidos, molculas orgnicas, polmeros sin-
tticos, oligonucletidos, aptmeros, ribozimas,
trinectinas (derivados de la fibronectina), MIP
(molecular imprinted polymers: compuestos que
se polimerizan sobre las protenas creando mol-
des para su uso posterior), etc. A pesar de sta
diversidad, la captura de las protenas (y los m-
todos de deteccin) constituye el gran problema
de los chips proteicos: no existen todava agentes
de captura de alta calidad que puedan inmovili-
zarse en la superficie de un chip y que permitan
unir, detectar y cuantificar una mezcla compleja
de protenas. Este problema est retrasando no
slo el desarrollo de los chips proteicos sino de
la industria protemica en general.
Los chips de fase reversa son de especial re-
levancia en medicina porque permiten determi-
nar las protenas implicadas en las rutas de sea-
lizacin celular en las biopsias de los pacientes.
En ellos, las biopsias (tpicamente de tumores
o cardiacas) se lisan y se depositan en dilucio-
nes sucesivas como microgotas (utilizando los
mismos robots que para la fabricacin de los
chips de ADN); posteriormente, son revelados
con Ab validados (que reconocen protenas fos-
foriladas y cinasas, a fin de determinar el grado
de activacin de las diferentes rutas de seali-
zacin), obtenindose informacin cualitativa y
cuantitativa para cada paciente, lo que permite
un tratamiento personalizado; actualmente exis-
ten ms de 1.000 Ab validados. Mediante estos
arrays puede determinarse simultneamente el
estado de fosforilacin de las protenas impli-
cadas en las principales rutas de sealizacin
intracelular. La utilizacin de los arrays de fase
reversa permite as, obtener un tipo de infor-
macin molecular nico e individualizado de
cada muestra y, por tanto, de cada paciente.
Este nuevo tipo de array proporciona perfiles
de sealizacin intracelular, incluyendo las modi-
ficaciones postraduccionales, datos que no son
accesibles mediante tcnicas genmicas.
Chips funcionales
Se utilizan para determinar actividades bio-
qumicas e interacciones moleculares. Las pro-
tenas de inters se inmovilizan en el chip y se
analizan sus funciones biolgicas e interacciones
incubndolas con distintas molculas (otras
protenas, metabolitos, sustratos de enzimas,
ADN, etc.). Los dos problemas principales de
estos chips son la produccin de colecciones
extensas de protenas y su mantenimiento en
forma activa en el chip. Sin embargo, para gru-
pos de protenas con caractersticas funcionales
similares (factores de trascripcin, receptores,
cinasas) hay un gran campo por desarrollar en
clnica humana.
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ture of medical genomic healthcare. Genome Med.
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Van Eyk J, Dunn M, editores. Clinical proteomics. From
diagnosis to therapy. Wiley-VCH; 2008.
Genmica, protemica y medicina 29
 3 Impact of pharmacogenetics
on drug use in individually
optimised pharmacotherapy
Arnold G.Vulto PharmD PhD and Monique J. Bijl PharmD PhD
Department of Hospital Pharmacy
Erasmus University Medical Centre , P.O. Box 2030, 3000 CA Rotterdam,
The Netherlands
Abstract
Traditional pharmacotherapy is rather in-
efficient; on average only 40% of patients
will benefit from a particular drug as com-
pared with placebo. Interindividual variability
in drug disposition and effect can be partly
explained by genetic variants. In the science
of pharmacogenetics the influences of gene-
tic differences on patients drug response are
studied. The major causes of inefficient drug
treatment (like lack of effectiveness or the
occurrence of side effects or toxicity) are he-
terogeneity of the disease, variations in drug
disposition (pharmacokinetics) and drug res-
ponse (pharmacodynamics).
Genetic variants can be detected by ampli-
fication of DNA using the Polymerase Chain
Reaction (PCR) followed by sequence analysis.
Other techniques, like micro-arrays, enable us to
screen the whole genome.
The influence of pharmacogenetics becomes
more and more important in clinical practice
and on drug development. In this review we will
discuss the principles of pharmacogenetics and
the practical implications, illustrated with exam-
ples taken from clinical practice. Pharmacogene-
tics is a new cornerstone in medicine!
30 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
Introduction
Patients differ in their response to drugs. On
average only 40% of patients will benefit from
a particular drug as compared with placebo.
When treating risk factors (e.g. hypertension)
medically, we are grossly over treating the ge-
neral population. A good measure to evaluate
treatment effect is the Number Needed to
Treat (NNT): the total number of people that
are exposed to treatment to prevent one in-
cident. For example >1000 patients younger
than 60 years with hypertension should be
treated to prevent one death. On the other
hand about 10% of the patients will experien-
ce adverse drug reactions (ADRs). From this
perspective, traditional drug treatment is ra-
ther inefficient.
The reason for this inefficiency is that we can-
not point out beforehand which patients will
benefit from the treatment and which patients
will experience ADRs. Interindividual variability
in drug disposition and effect can be partly ex-
plained by genetic variants. Patients do not only
show a considerable variation in disease-develo-
pment but also in drug disposition (pharmaco-
kinetics) and drug effects (pharmacodynamics)
(Evans et al; 2003). In the science of pharmaco-
genetics the influences of genetic differences on
patients drug response are studied.
The mapping of the human genome is slowly
changing the scene. Based on genetic analysis
drugs can be produced tailor-made for specific
patients, based on their genetic constitution. Many
applications can be envisaged. Genetic predispo-
sition can be spelled out: which patients carry a
serious disease risk and should be treated with
priority? Which patients will benefit most from
certain types of drugs? It may become possible
to repair genetically determined risk factors, or
to repair genetic defects (gene therapy). Gene
therapy can also be employed to change the bio-
chemical repertoire of a cell in such a way that
the body is producing its own drugs. But also in
the use of traditional drugs, the scene will change.
Factors like absorption and metabolism are ge-
netically determined by the structure of so-called
P-glycoprotein pumps in the cell membrane and
polymorphism of the drug metabolising cyto-
chrome P450 (CYP) enzymes in the liver. In addi-
tion, it may become feasible to assess the sensiti-
vity of target-tissues or even become possible to
change it in a desirable fashion.
Genetic variation
The whole DNA sequence is called the hu-
man genome. The arsenal of proteins is the
proteome. 99.9% of the genome of two unrela-
ted persons is identical, but still there is genetic
variability in 0,1% of 3.3 billion base pairs (on
average one variant per 1000 bases).
The most common type of variant is a single
nucleotide polymorphism (SNP), a single-base
difference in the DNA sequence that can be
observed between individuals in the population.
A polymorphism has been defined as the minor
allele occurring in more than 1% of the popu-
lation, whereas mutations are rare. Many muta-
tions have been discovered in coding sequences
of genes causing rare inherited diseases.
The specific set of alleles observed on a sin-
gle chromosome is called a haplotype. Haplo-
Impact of pharmacogenetics on drug use in individually optimised pharmacotherapy
types are formed by recombination when the
paternal and maternal chromosomes exchange
corresponding segments of DNA. The co-inhe-
ritance of SNPs on these haplotypes leads to
associations between these alleles (linkage dise-
quilibrium). Not a single SNP but the haplotype
is associated with the disease. This advantage
leads to optimal genotyping: carefully chosen
SNPs in a specific region will provide enough
information to predict much of the information
about the remaining SNPs in that region. The-
se SNPs are called tagSNPs and are used to
screen the whole genome (Burton et al; 2005).
The human genome is diploid (one paternal
and one maternal allele). A SNP can be pre-
sent on 0, 1 or 2 alleles. If an individual has no
polymorphism on both alleles, this individual is
called homozygous wildtype. One speaks of
homozygous mutant if both alleles are affected.
An individual with one wildtype and one variant
allele is heterozygous. A SNP could lead to no
functional enzyme activity, decreased enzyme
activity or increased activity. To simplify different
combinations the term semi quantitative gene
dose (SGD) is introduced. Functional alleles have
a SGD of 1, completely dysfunctional alleles 0
(e.g. CYP2D6*4) and 0,5 for variant alleles with
decreased enzyme activity (Steimer et al; 2004).
Sources of Variation
The major causes of inefficient drug treatment
are heterogeneity in disease, variations in drug
disposition (pharmacokinetics) and drug res-
ponse (pharmacodynamics). Figure 1 shows the
relationships in relation with the drugs response
/ therapy outcome and the targets we can use
to optimise pharmacotherapy. In the following
sections we will present some illustrative exam-
ples of genetic variability with practical conse-
quences for the quality of pharmacotherapy.
Heterogeneity in disease
One of the interesting examples of diseases
showing the importance of genetic heteroge-
31
neity is Alzheimer-disease. Currently, we know
that at least 3 gene-mutations are involved. In
addition, there are polymorphisms in susceptibi-
lity genes. Such genes may not cause the disease
themselves but may make an individual more
sensitive to acquire the disease if conditions
make this permissive.
The E4 variant of APOE (apolipoprotein E) is
associated with an increased risk of Alzheimer
disease. Homozygosity of the E4 allele increases
the risk of Alzheimer by a factor 33 in Japane-
se, 15 in Caucasians and 6 in African Americans.
Although this increased risk is known for 12
years, its identification did not help to develop
effective medicines or prevention strategies.
Alzheimer is also an illustrative example to
show heterogeneity in drug response. When
the cholinesterase-inhibiting drug tacrine was
investigated in clinical trials, the overall efficacy
Individually optimised pharmacotherapy
With the aid of pharmacogenetic profiling
Heterogeneity in disease e.g.
Genetic variability in patients
Genetic diversity in infective agents
Heterogeneity in pharmacodynamics e.g.
Drug targets (e.g. receptors)
Dose-response relationship
Interactions
Side effects
Heterogeneity in pharmacokinetics e.g.
Absorption: active (PgP), passive
Distribution: active, passive, compartments
Metabolism: e.g. cytochrome P450
Elimination: renal, hepatic
Figura 1. Variability in drug response scheme.
32 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
was disappointing: only about 1/3 of the patients
benefited from the drug, in 1/3 there was no
apparent effect and the drug had to be discon-
tinued in another 1/3 due to side effects. Only
later (when the drug was already dead) it was
found that patients with a ApoE 2/3 genotype
showed a 80% response while the ApoE 4 ge-
notype predisposed for no effect / worsening
of the disease and suffering from side effects.
This example shows the potential promise of
genome technology.
Some drugs are very efficacious in some pa-
tients, but not in others. But how can we learn
this beforehand? That means that we have to
study the origins of variability in drug response
in more detail, and these may have to do with
disease state, pharmacokinetics and pharmaco-
dynamics.
On the other hand success stories are also
Diagnosis
Incl. genetic profiling
Drug selection
Dosage adjustment and monitoring
Response/Outcome
known. The monoclonal antibody trastuzumab
has a high affinity for the HER2 transmembrane
protein. HER2 (human epidermal growth factor)
is a member of the epidermal growth factor re-
ceptor (EGFR) family of tyrosine kinases and is in-
volved in regulation of cell proliferation. In patients
with overexpression of HER2 or an amplification
of the gene, breast cancer is more aggressive:
enhanced growth and proliferation, increased in-
vasive and metastatic capability and stimulation
of angiogenesis. In these patients treatment with
the selective HER2-antibody trastuzumab leads
to a response rate of 34%. In combination with
catatonic agents the response rate is further in-
creased (Hortobagyi et al; 2005).
Heterogeneity
in Pharmacokinetics
Absorption/P-glycoprotein and Multi
ATP-binding cassette, sub-family B
member 1 (ABCB1) Genes
The P-glycoprotein efflux pump, which is en-
coded for by the ABCB1 gene, plays an impor-
tant role in the export of substances from the
inside of cells and from membranes to the out-
side. P-gp (P-glycoprotein) protects cells from
toxic substances and many drugs by permitting
or inhibiting transportation through the intesti-
ne and other epithelial barriers. To date > 100
variants of the ABCB1 gene have been disco-
vered. Not all these SNPs lead to an effect on
PGP; most of them are intronic or non-coding.
Of the 15 most common variants the C3435T
mutation at exon 26 is well known. This silent
mutation leads to an alteration in the effect of
PGP.The TT genotype (homozygous variant alle-
le) is associated with a twofold lower ABCB1
expression level in the duodenum compared
with the CC genotype (wildtype) and resulted
for instance in a higher digoxine plasma concen-
tration (Kerb; 2006).
HIV-protease inhibitors are known substrates
of PGP resulting in a low bioavailability and a limi-
ted penetration in targets.The presence of one T
Impact of pharmacogenetics on drug use in individually optimised pharmacotherapy
allele at the C3435T polymorphism predicts lower
plasma concentrations of nelfinavir, efavirenz (Fe-
llay et al; 2002) and atazanavir (Rodriguez-Novoa
et al; 2007). These findings are contradictory, sin-
ce the C >T change is associated with a decrea-
sed PGP activity. A possible explanation is that
CYP3A4 activity could be increased in patients
with ABCB1 polymorphisms, leading to lower
plasma concentrations of atazanavir, which is me-
tabolized by CYP3A4 (Ma et al;2007).
The frequency of the TT genotype is very low
in Africans as compared to Caucasians (25%),
which partly explains the difference in response
between Caucasians and black Africans to these
drugs.
Metabolism/polymorphism
in drug metabolising enzymes
Many drugs are metabolised by the oxidati-
ve cytochrome P450-enzyme complex. One
member of this family, CYP2D6, is extremely
polymorphic, with more than 75 allelic variants.
CYP2D6*4 is the most common variant (21%
allele frequency in Caucasians), which leads to a
non-functional allele. Subjects homozygous for a
non-functional variant allele lack enzyme activity
and are defined as poor metabolisers (PMs).The
CYP2D6 PM phenotype results in an increased
plasma concentration of drugs predominantly
metabolised by CYP2D6 e.g. tricyclic antidepres-
sants, codeine and tramadol. In case of a narrow
therapeutic window this will lead to toxicity.
CYP2D6 gene duplication/multiplication oc-
curs relatively infrequent among Northern
Europeans (1-2% of the Swedish population),
but increases in Southern direction: 7-10% of
Spaniards and Southern Italians, and as high as
29% of Ethiopians. Such subjects can have an
inadequate response to standard doses of drugs
metabolised by CYP2D6 and are called ultra ra-
pid metabolisers (UMs) (Dahl et al; 2002).
These polymorphisms are illustrated in figure 2.
The following case is a nice example showing
the influence of CYP2D6 polymorphisms in
daily practice (Gasch et al; 2004).
33
 A 62-year-old man with a history of chronic
lymphocytic leukaemia had complaints of fever,
fatigue, dyspnoea and a cough. Therapy with ce-
ftriaxone, clarithromycine and voriconazol was
initiated for pneumonia infected by yeast. The
patient received a modest dose of codeine (25
mg 3 times daily) to relieve the cough. After 4
days, the patients level of consciousness dete-
riorated. His neurological status (a score of 6
on the Glasgow Coma Scale) was poor. After
the administration of naloxone, the patient re-
covered rapidly. Extremely high plasma levels
of codeine and morphine were found despite
of the modest dose of codeine. After analysis
of the patients CYP2D6 genotype, the patient
seemed to be an ultrarapid metaboliser. Along
with the CYP2D6 gene duplication, a drug inte-
raction may have contributed to the observed
toxic effects. Voriconazole and clarithromycine
both inhibit CYP3A4, thereby decreasing the
amount of the metabolite norcodeine (and in-
90
80
70
N.o of individuals
60
50
40
30
UM
20
10
0
0,01
UM
( )13
Figura 2. Schematic presentation of the relationship between the debrisoquine metabolic ratio and
CYP2D6 genotype in Caucasians (Dahl et al; 2002).
34 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
creasing codeine concentration). At last due to
renal failure the excretion of the morphine me-
tabolites was reduced, leading to the observed
respiratory problems.
A similar example demonstrating the impact
of the CYP2D6 genotype on codeine toxicity
was published in the Lancet (Koren et al; 2006).
A full term baby boy died due to an increased
morphine concentration (70 mg/ml in stead
of 0-2,2 ng/ml). The mother, who was breast-
feeding her child, was prescribed codeine in a
standard dose. After genotyping for CYP2D6,
the mother seemed to be an ultrarapid meta-
boliser (gene duplication). This genotype leads
to increased formation of morphine from co-
deine, which she passed on to her boy.
Tamoxifen is one of the most widely used
drugs for treatment of post-menopausal wo-
men with oestrogen receptor-positive breast
cancer. CYP2D6 plays an important role in the
formation of endoxifen, the most active meta-
EM homozygous
EM heterozygous
x
x
MR = 12,6
PM
x
x
0,1 1 10 100 1000
bolite of tamoxifen. Goetz et al. were the first to
describe that tamoxifen users with decreased
CYP2D6 enzyme activity, due to homozygous
carriership of CYP2D6 variant alleles or the in-
take of potent CYP2D6 inhibitors, had a higher
risk of breast cancer recurrence and disease
free survival (Goetz et al; 2007.).
In the Rotterdam study we found similar re-
sults. Breast cancer mortality was significantly
higher in tamoxifen users with the CYP2D6*4/*4
genotype (HR=4.1, CI 95% 1.1-15.9, p = 0.041)
compared to extensive metabolizers. A trend
test revealed a significant increased breast can-
cer mortality risk with a hazard ratio of 2.0 per
additional CYP2D6*4 variant allele (p = 0.015)
(M. Bijl, PhD-Thesis Erasmus University Rotter-
dam, 2009). Genotyping before the start of en-
docrine treatment in breast cancer could iden-
tify PMs who will better respond to aromatase
inhibitors than to tamoxifen therapy. CYP2D6
EMs could be prescribed tamoxifen, since aro-
matase inhibitors are more expensive.
Polymorphisms in another member of the
cytochrome P450 family, CYP2C9, are asso-
ciated with overanticoagulation. Anticoagu-
lants like acenocoumarol, phenprocoumon and
warfarin are metabolized by CYP2C9. Com-
pared to CYP2C9 wild type patients, carriers
of CYP2C9*2 or *3 have an increased risk of
overanticoagulation with coumarins (Visser et
al; 2004, Schalekamp et al; 2007). Together with
polymorphisms in the VKORC1 gene (vitamin K
reductase complex subunit 1) a large part (up
to 40%) in the interindividual variability can be
explained.
Notwithstanding proven evidence that geno-
typing contributes to better drug response, ge-
notyping is hardly performed in clinical practice
to predict drug response. It is mostly carried out
retrospectively to explain clinical symptoms as
seen in the cases mentioned above.
Thiopurine S-methyltransferase (TPMT) geno-
typing is a notable exception: it is clinically used
to prevent life-threatening myelosuppression
in patients with acute lymphoblastic leukaemia,
Impact of pharmacogenetics on drug use in individually optimised pharmacotherapy
treated with mercaptopurine (Puri-Nethol) or
azathioprine (Imuran).
The immunosuppressant thiopurine drugs
mercaptopurine and azathioprine are metabo-
lised by thiopurine S-methyltransferase (TMPT)
and xanthine oxidase (XO). Variation in TPMT
is of much greater impact than XO. Three im-
portant SNPs are found in the TPMT gene:
TPMT*3A, *3B and *3C. The presence of one
of these mutations leads to reduced enzyme
activity. Subjects homozygous for the variant
allele TPMT*3A (0,3% of the Caucasians) are
of increased risk of myelosuppression, a known
side effect of thiopurine drugs. *3C is the most
common variant allele in Asian subjects, while
*3B is very rare (Wang et al; 2006).
Phenotypic assays for TPMT, performed on
red blood cells, have also been developed.
However, the phenotypic assay is labour-intensi-
ve, requires qualified knowledge and expensive
instruments.
Some authors have doubts about the benefit
of genotyping, since TPMT polymorphism fails to
explain all cases of myelosuppression. However,
certainty is rare in clinical medicine. TPMT geno-
typing predicts myelosuppression and is proven
to be cost-effective (van den Akker et al; 2006).
Heterogeneity
in Pharmacodynamics
Pharmacodynamics of a drug is regulated by
the whole genome. We know for example that
drug response depends on the presence of
sufficient numbers and sensitivity of receptors.
Receptors are proteins that are encoded for by
genes. This means that the gene expression level
determines the amount of receptors and is thus
closely associated with drug response. Gene ex-
pression itself however, is determined by several
transcriptional, translational and post-translational
regulatory effects of other genes. In this way the
whole genome is involved in drug response.
Small genetic variations, such as variability
in receptors, can have a large impact on the
35
pharmacodynamics of a drug. It is no surprise
that the list of drugs that are subject to such an
effect is increasing almost daily.
In some cases a SNP or a point mutation
can modify drug response. Genetic variability
in receptors is either inherited or acquired. Re-
sistence to the tyrosine-kinase inhibitor imati-
nib is for example associated with mutations in
the kinase domain of BCR-ABL that interfere
with drug binding. The acquired mutation in a
threonine residue of the ABL kinase is the cause
of resistance to imatinib in about 67% of the
cases (Gorre et al;2001). Increased expression
of BCR-ABL from genomic amplification could
also be a mechanism for resistance.
One of the first well documented examples
of genetically determined pharmacodynamics
relates to the efficacy of cholesterol synthesis-
inhibitors of the statin-type. Carriers of so called
B1-alleles on the receptor benefit more from
statin-therapy than individuals that have just one
allele (Kuivenhoven et al;1998).
Another example relates to the tachyphylaxis
of beta-2-agonists, a well known effect from drugs
like salbutamol. The 2-receptor has three main
polymorphisms and two of them (Arg16Gly and
Gln27Glu) are found in the general population.
The two SNPs are in strong linkage disequilibrium
and can be considered together in haplotypes.
It is demonstrated that homozygous carriers of
Gly16/Gly16 desensitise faster than Arg16/Arg16
carriers. Arg16Gly and Gln27Glu are associated
with a decreased effect of 2-agonists.
Patients with variant alleles of the promo-
ter gene of ALOX5 (5-lipoxygenase) have a
diminished gene transcription, and therefore a
decreased receptor activity, which leads to a
decreased response to treatment with leuko-
triene antagonists (like montelukast) (Drazen et
al;1999).
Another interesting example relates to the
efficacy of antibodies towards the Epidermal
Growth Factor Receptor (EGFR) in the treatment
of colon-cancer. On average such drugs show
only low response rates, and this appears to be
36 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
related to the genotype of a downstream sig-
nal peptide K-RAS, which acts like a switch. The
wild type protein activity can be reduced with
VEGF antibodies like cetuximab or panitumumab.
However, if the K-RAS gene is mutated [which
is the case in ca. 40 of patients], the switch is
no longer functional, which renders the antibo-
dy ineffective and treatment with this expensive
drug useless. In many countries in Europe colon-
cancer patients are tested for K-RAS genotype
status before start of treatment with an VEGF-
antibody, and reimbursement of the drug is made
dependent on the test outcome.
Detecting genetic variation
One of the most frequently used techniques
in identifying genetic variability is the Polymerase
Chain Reaction (PCR). PCR is a simple method
by which a part of DNA or a transcript (RT-PCR)
is amplified. Subsequent sequence analysis on the
PCR product will reveal the presence of muta-
tions or polymorphism. PCR is not only used to
detect sequential variability but also variability in
gene expression. By applying real-time PCR, we
are able to measure gene expression precisely. In
this way single nucleotide polymorphism can be
detected in genes encoding drug metabolising
enzymes, transporters and receptors.
Micro-arrays have been developed to detect
many SNPs in a short time period. The Ampli-
chip CYP450 GeneChip is an oligonucleotide
microarray hybridization method for genotyping
CYP2D6 and CYP2C19. This test distinguishes
29 polymorphisms in the CYP2D6 gene inclu-
ding gene deletion (*5) and gene duplication.
In this way the phenotype of a patient (PM, IM,
EM or UM) can be predicted. For CYP2C19
the test discriminates between PM and EM
by determining 2 common polymorphisms in
CYP2C19 (*2 and *3). The main disadvantage
of the test is its price ( 500 euro per patient).
It is expected that these costs will decrease due
to a higher demand and mass production.
 For detecting disease related genes whole ge-
nome screening can be used. Commercially avai-
lable kits based on hybridisation technology (Illu-
mina, Affymetrix) contain more than 550 000
tagSNPs evenly distributed across the genome
(1 tagSNP every 5.5 Kb). None of these arrays
covers all variation in the human genome, but
come close by using haplotype tagging SNPs.
Influence on drug discovery
Pharmacogenomics can enhance drug disco-
very in two ways:
Identification of new drug targets
Subpopulation-specific drug development
Pharmaceutical companies are interested in ca-
rrying out smaller, less expensive trials using phar-
macogenetics. Identification of a genetic variant
associated with drug response can lead to smaller
phase III studies involving only those individuals who
are more likely to respond that lead to improved
efficacy, decreased toxicity and less side effects.
Although pharmacogenomics could lead to smaller
treatment groups, the increased effectiveness of the
targeted drug could provide the pharmaceutical
industry more sales. The uncertainty about adver-
se drug reactions is reduced, encouraging many
more physicians to prescribe and patients to use
the drug.
Many genetic variants vary in frequency
among ethnic populations. If a marker for drug
response has a low prevalence in a certain po-
pulation, that population might be excluded
from research or treatment.
An example is the drug BiDil, a combination
of isosorbide dinitrate and hydralazine.This drug
was not sufficiently effective in treating heart fa-
ilure in two large ethnically mixed clinical trials.
But in a subpopulation of African Americans
BiDil decreased the risk of death by 43%. The
FDA approved this drug for a single racial group
(Service; 2005).
Impact of pharmacogenetics on drug use in individually optimised pharmacotherapy
Conclusion
Pharmacogenetics constitutes a rapidly evol-
ving research field. Thousands of studies are pu-
blished annually with great promise. However,
incorporation of these discoveries in medical
practice has been slower than expected.
The implementation of these promising pros-
pects are complicated by several factors. Diagnos-
tics have to be changed in such a way that genoty-
ping of relevant PK/PD systems is included. Who
will translate this kind of sophisticated information
to a prescribing physician? By now, proper dosing
and avoiding drug interactions is already a for-
midable task. The number of disease-targets will
become almost incomprehensible for the average
physician. That means that an incredible informa-
tion dissemination barrier has to be solved. As a
result, we foresee that a new specialty will deve-
lop: genetic information specialist. Not aimed at
diagnosing inherited diseases but at inherited risk
factors and drug-treatment success-factors. And
last but not least: the costs of these developments
both for diagnosis and for more individualised
drug preparations will be impressive. There will
be no way to deny patients the results of the-
se new developments because they may prove
highly efficacious and possibly also cost-effective
(although very costly on an individual basis).
Hospital pharmacists and other healthcare
professionals should be aware of the upcoming
developments and should prepare both for a
proper information structure and sufficient ex-
pertise to advise doctors in the rapidly appro-
aching era of genetically based medicine (phar-
macogenetics). And of course of the formidable
resources needed to pay for this.
Pharmacogenetics is a new cornerstone in
medicine!
Acknowledgement
We wish to thank M.L. Becker PhD and phar-
macist, for critically reading the manuscript.
37
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 4 Biologa de las clulas madre
Antonio Bernard
Departamento de Cardiologa Regenerativa
Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC)

Resumen programada en un minsculo embrin (zigoto).

Dos caractersticas son definitorias de una
clulas madre (CM), permitiendo adems di-
ferenciarlas de la gran mayora de las clulas
constitutivas de un organismo adulto: a) poseer
una capacidad muy importante de proliferacin,
pero manteniendo su estadio indiferenciado (au-
tomantenimiento), y b) ser capaces de generar
progenie, perteneciente a varios linajes celulares
del organismo (pluripotencia). El control de su
capacidad de proliferacin versus diferenciacin
se produce en localizaciones especializadas, de-
nominadas nichos, y alteraciones de este meca-
nismo bsico pueden estar implicadas en muchas
patologas humanas. El potencial teraputico
que encierra el concepto de clula madre en
su conjunto es enorme, pero debemos de ser
capaces de explotarlo adecuadamente.
Introduccin
Qu es una clula madre? Dnde podemos
encontrar las clulas madre? Para qu sirven las
clulas madre en el individuo adulto? Cuantas
tenemos? Qu podemos esperar de la revolu-
cin tecnolgico-teraputica que se nos aveci-
na? Buenas preguntas que tienen una respuesta
cambiante cada semana que transcurre.
El misterio de la vida se concreta, desde una
perspectiva meramente biolgica, en cmo la
complejidad de un organismo se encuentra pre-
Cuanto ms ampliamos nuestro conocimiento
molecular y celular, ms lejos nos parece estar
del maravilloso modelo de regulacin (a cor-
to, medio y largo plazo) que se encierra en esa
clula.
El zigoto, tras su implantacin, y con la ayu-
da del ambiente propicio aportado por las es-
tructuras maternas, desarrolla todo su potencial
biolgico, generando una constelacin estruc-
turada de tipos celulares cuyo resultado final es
un nuevo organismo.
Durante los estadios tempranos del desarro-
llo embrionario se pueden identificar y aislar
clulas con capacidad totipotencial, trmino
que se emplea para indicar que a partir de ellas
se pueden generar todos los tipos celulares del
organismo adulto. Estas clulas totipotencia-
les embrionarias se denominan clulas madre
(tambin conocidas como clulas stem del
ingls, o clulas troncales). En ratn, hace ms
de 20 aos (Martn, 1981; Evans et al., 1981;
Bradley et al., 1984) aislaron y caracterizaron
lneas celulares (fig. 1) con estas caractersticas
(embryonic stem cells, ES), obtenidas de la masa
interna de embriones en estadios tempranos
de desarrollo, denominado blastocisto (Bongso
et al., 1994).
La caracterizacin inicial de estas clulas ma-
dre permiti el establecimiento indefinido in vi-
tro de lneas celulares capaces de dar origen a un
ratn indistinguible de sus congneres, siendo
adems capaces de trasmitir su informacin en

Biologa de las clulas madre 39

la lnea germinal. Posteriormente se demostr
la posibilidad de su manipulacin gnica convir-
tindose en clulas clave para la generacin de
modelos animales capaces de desarrollar enfer-
medades anlogas a las presentes en humanos
para el estudio de enfermedades humanas y en
una herramienta insustituible para desvelar la
funcin de los genes in vivo. La trascendencia de
este cuerpo de trabajo para el desarrollo de la
biomedicina moderna ha sido reconocida me-
diante la concesin del premio Nobel de Fisio-
loga o Medicina (2007) a los doctores Mario R.
Capecchi, sir Martin J. Evans y Oliver Smithies.
Sin embargo, el concepto de CM se origina
mucho antes (Ferrebee et al., 1958), y deriva
de los trabajos pioneros que permitieron de-
sarrollar el trasplante de mdula sea y salvar
muchas vidas. La mdula sea es el rgano don-

Ovocito fertilizado (129Svj)

Lnea de ratn manipulada

genticamente:
Transmisin
Estudios bsicos a lnea
Modelos de enfermedad germinal?

Hembra seudopreada
receptora CD Iblanco
Blastocistos

Implantacin

ES (129Svj) Blastocistos (CD I)

Microinyeccin
o agregacin
Masa interna
del blastocisto
Manipulacin
gentica/
caracterizacin
Lnea de clulas ES (129Svj)
pardo

Figura 1. Esquema de la obtencin de animales manipulados genticamente mediante la utilizacin de

clulas stem embrionarias (mES).

40 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana

de se producen las clulas sanguneas a partir
de distintos progenitores mediante una orga-
nizacin piramidal (fig. 2) que, tras ejecutar un
complejo programa de desarrollo, originan los
cientos de millones de clulas funcionales que
necesita el organismo diariamente en su sangre
y rganos linfoides secundarios (donde madura
la respuesta inmunitaria).
El truco es que el funcionamiento de por
vida de este dinmico sistema (linfohemato-
poytico) est garantizado si se consigue man-
tener un pequeo nmero de clulas madre
(0,01-0,1% de la celularidad de la mdula sea)
alojadas en lo ms ntimo de los huesos del in-
dividuo. Si conseguimos extraer y trasplantar
un nmero suficiente de estas clulas madre
hematopoyticas, conseguiremos que el orga-
nismo receptor pueda reconstituir y mantener
su sistema linfohematopoytico totalmente fun-
cional durante el resto de la vida. Estos trabajos
pioneros merecieron la concesin del premio
Nobel de Fisiologa o Medicina (1990) a E. Don-
nall Thomas.
Figura 2. Esquema de la organizacin piramidal del sistema linfohematopoytico.
En este sentido amplio, y desde la dcada de
1960, el estudio del sistema linfohematopoy-
tico y el transplante de medula sea ha sido la
escuela donde se han creado y desarrollado la
gran mayora de los conceptos que hoy da se
manejan sobre la biologa y fisiologa de las c-
lulas madre. En trminos generales, el trasplante
de mdula sea, la reparacin de cartlago ar-
ticular y el trasplante de piel artificial a grandes
quemados (fig. 3) se pueden considerar los ver-
daderos antecedentes de la actual revolucin
en medicina megenerativa.
Definicin
de clula madre
Las caractersticas ms impor tantes que
permiten definir a las CM y diferenciarlas de
la gran mayora de las clulas constitutivas
de un organismo adulto son dos. La primera
es que en condiciones de cultivo adecuadas,
Biologa de las clulas madre 41
tienen una capacidad ilimitada de dividirse;
as una CM es capaz de generar un nmero
inmenso de clulas, manteniendo sus mis-
mas caractersticas por el contrario, todas
las dems clulas de las que todos estamos
constituidos, las denominadas clulas som-
ticas, poseen un nmero limitado de divi-
siones (se calcula que slo pueden dividirse
alrededor de cincuenta veces, al cabo de las
cuales mueren). La segunda es que las CM
son capaces de generar varios de los linajes
celulares de los que est constituido un indi-
viduo: clulas de corazn, de hgado, de rin,
neuronas, msculo, etc.
Hasta el momento se han identificado c-
lulas con caractersticas de CM de 4 orgenes
distintos: de origen embrionario, clulas madre
germinales, clulas madre procedentes de car-
cinomas embrionarios (terato-carcinomas) y
clulas madre procedentes de tejidos som-
Medicina regenerativa: de la realidad clnica actual a un futuro prometedor
Transplante de mdula sea
Reparacin cartlago
Piel. Quemados
Sistema linfohematopoytico
Figura 3. Antecedentes de la medicina regenerativa.
42 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
ticos, y aisladas de individuos adultos, las que
denominaremos CMA (clulas madre adultas).
En la actualidad, aunque todava se encuentran
en fase de estudio y evaluacin, estas fronteras
estrictas han desaparecido debido al desarrollo
de la tecnologa de reprogramacin gentica.
Esto permite obtener clulas con propiedades
muy similares a las embrionarias (iPS; induced
Pluripotent Stem Cells) a partir de numerosos
tipos celulares adultos (p. ej., Park et al; 2008)
que incluyen fibroblastos, queratinocitos, MSC,
etc. Aunque las posibilidades abiertas son
enormes, quedan por resolver varios temas
tcnicos y garantizar su bioseguridad. Pero aun
ms interesante es el hecho de que con esta
misma tcnica de reprogramacin gentica
se han conseguido obtener de forma directa
cardiomiocitos a partir de fibroblastos (Ieda et
al., 2010) Claramente, el sinfn de posibilidades
que se abren est an por desarrollarse.
 Hasta hace una dcada, las nicas CMA de
mamferos cuya existencia haba sido demostra-
da de forma concluyente eran las clulas ma-
dre hematopoyticas (CMH, o HSC, del ingls
Hematopoietic Stem Cells), responsables de la
produccin de todos los linajes sanguneos. Se
postulaba la existencia de CMA en otros tejidos
altamente proliferativos, como la piel y el hga-
do, pero el concepto genrico de clula madre
adulta como tipo celular existente en todos los
tejidos es un paradigma bastante reciente. En la
actualidad, sabemos que la diversidad de CMA
equivale prcticamente a la variedad de tejidos
del organismo adulto. De hecho, probablemente
es mayor, pues algunos tejidos, cmo la mdula
sea, contienen ms de un tipo de CMA.
En la divisin celular tpica, las dos clulas hijas
generadas son equivalente entre s y a la clula
progenitora de la que derivan (divisin simtri-
ca). Posteriormente, las clulas descendientes
(progenie) pueden evolucionar por distintas vas,
bien siguiendo unos programas determinados
de diferenciacin o bien pueden mantener su
potencial inicial. El mantenimiento de una rela-
cin adecuada entre la tasa de proliferacin y di-
ferenciacin permite en la mayora de los tejidos
establecer un control homeosttico de su forma
d d p d
GI/S
Divisin simtrica
Figura 4. Esquema comparativo de la divisin simtrica en comparacin con la divisin asimtrica.
y tamao, evitando un crecimiento descontrola-
do que se asocia, p. ej., con los procesos tumo-
rales. Por el contrario, las CM parece que estn
reguladas por un mecanismo de divisin conser-
vador (asimtrico), de forma que en su divisin
se genera una clula equivalente a la original y
otra que da cuenta del resto del programa de
diferenciacin. Este mecanismo de automante-
nimiento (en ingls, self-renewal) permite con-
trolar de forma estricta el nmero de CM que
existe en un determinado rgano (fig. 4).
Se ha asumido que las CM presentes en el
organismo adulto (CMA) deben de poseer, en
trminos generales, un menor potencial que las
presentes durante el desarrollo embrionario y
fetal. Sin embargo, aunque en lgica es fcil asu-
mir este principio, demostrarlo es mucho ms
complicado. Adems, al menos en el organismo
adulto, no todas las clulas madre de un rgano
participan activamente en el proceso de rege-
neracin y mantenimiento de la funcionalidad.
Slo unas pocas estn contribuyendo de forma
simultnea a la creacin de un tejido, en un mo-
mento dado. La mayora se encuentra en un es-
tado de reposo (conocido como quiescencia),
lo que las protege tanto de agresiones externas,
fsicas o qumicas, como del proceso de enve-
p d
G0
Divisin asimtrica
Biologa de las clulas madre 43
jecimiento celular. Cuando las CMA responsa-
bles en un momento dado de la regeneracin
tisular agotan sus posibilidades, son sustituidas
paulatinamente por la progenie de otras nuevas.
Las nuevas clulas as generadas representan di-
ferentes clones y el fenmeno responsable del
proceso se denomina sucesin clonal.
En definitiva, una CM se define, funcional-
mente, como una clula capaz de automan-
tenerse (mediante el mecanismo de divisin
asimtrica) y con potencial de generar (median-
te diferenciacin de sus clulas descendientes)
varios linajes celulares (pluripotencia) o todo un
organismo (totipotencia). Por lo tanto, no todas
las CM son equivalentes y aunque la mayora
de las veces se definen por su origen (embrio-
narias, adultas, etc.) no siempre estos trminos
equivalen necesariamente a un mayor potencial
de desarrollo o, incluso, de potenciales aplica-
ciones biomdicas. Los mecanismos por medio
de los cuales ocurre esta diferenciacin, los ge-
nes implicados y la posibilidad de incrementar la
eficiencia en su aislamiento y/o caracterizacin
constituyen una de las reas ms relevantes en
la actualidad de la biologa y de la biomedicina.
Clulas madre adultas.
Tipos y origen
El origen embrionario de todos los tipos de
CMA es, en ltima instancia, el mismo que el de
los restantes tipos de clulas somticas presen-
tes en el organismo adulto, es decir, las clulas
pluripotentes de la masa interna del blastocisto.
Sin embargo, es muy poco lo que se conoce
de los precursores especficos de cada tipo de
CMA, ms all de la hoja embrionaria a la que
pertenecen (ectodermo, mesodermo o endo-
dermo).
En el organismo adulto la inmensa mayora
de sus clulas se encuentran en un estado, que
denominamos postmittico, en el que rara-
mente se dividen y multiplican. Estn ejerciendo
las funciones para las que han sido programa-
44 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
das y slo en casos excepcionales (daos de
diversa ndole) salen de su letargo y, en la me-
dida que les permita su entorno y su propio
potencial, repararn el dao producido. A esta
regla general slo escapan cuatro rganos que
se encuentran en una situacin de alta actividad
fisiolgica: a) la mdula sea, por la exigente de-
manda de clulas sanguneas y mediadoras de la
respuesta inmune; b) las gnadas, que generan
constantemente clulas germinales; c) el hgado,
que tiene una gran capacidad de regeneracin,
y d) los epitelios, sobre todos el intestinal y el
epidrmico, que estn en una continua renova-
cin. En los cuatro rganos existen poblaciones
con caractersticas de CM, especficas de tejido,
que dan justificacin a dicho potencial. En los
ltimos aos el panorama respecto al cerebro
ha cambiado dramticamente. Se crea que el
nmero de neuronas y la estructura cerebral
quedaba determinado en los primeros aos de
vida, y que posteriormente slo se producan
re-estructuraciones y perdida de conexiones
(plasticidad neuronal). Sin embargo, actualmente
sabemos que el cerebro es tambin un rgano
muy activo que puede generar nuevas neuro-
nas (se ha estimado que puede llegar a producir
105 al da). Estas clulas tienen que producirse a
partir a clulas madre alojadas en el cerebro.
De manera transitoria, en el momento del par-
to una gran proporcin de clulas hematopoy-
ticas se encuentran en la sangre contenida en el
cordn umbilical y en la placenta. Si se recoge
entonces adecuadamente la sangre placentaria
se puede obtener una poblacin muy sustancial
de clulas madre hematopoyticas, con la que
se han establecido los denominados Bancos de
Sangre de Cordn. Esta fuente es ideal para el
trasplante en nios o adultos de bajo peso con
enfermedades hematolgicas severas.
Clulas madre linfohematopo-
yticas (CMH)
Como ocurre con muchos otros aspectos de
su biologa, el origen embrionario de las CMH
es el mejor estudiado de todos los tipos de
CMA. Desde principios del siglo XX se cree
que las CMH derivan de un precursor ms pri-
mitivo, comn con el linaje endotelial, al que se
denomina hemangioblasto, cuya existencia ha
sido confirmada por diversos estudios expe-
rimentales en distintos estadios de desarrollo
(Pelosi et al., 2002). La hematopoyesis se inicia
en el embrin de mamfero en el saco vitelino
(semana 5 de gestacin en humanos; d7-7,5 en
ratn). Sin embargo, los precursores hematopo-
yticos del saco vitelino slo son los responsa-
bles de la hematopoyesis embrionaria, y no dan
origen posteriormente a las CMH presentes en
el adulto. De hecho, la capacidad de los progeni-
tores primitivos (CD34+/CD117+) aislados del
saco vitelino para contribuir a la hematopoyesis
en adultos es limitada. Las CMH responsables
de la hematopoyesis definitiva en adultos se ori-
ginan en la regin del mesodermo denominada
aorta-gnada-mesonefros (AGM), derivada de
la esplacnopleura para-artica. Tras el saco vi-
telino, la hematopoyesis tiene lugar en el bazo,
hgado y ndulos linfticos, hasta el momento
en que se desarrolla la mdula sea, que even-
tualmente asume la tarea de producir clulas
sanguneas para todo el organismo adulto.
Las CMH de la mdula sea se hallan en
una concentracin aproximada de 1 por cada
10.000 clulas mononucleares; tambin pueden
obtenerse de la sangre perifrica, ya que son
capaces de abandonar la mdula sea y pasar
a la circulacin sangunea, en un proceso de-
nominado movilizacin. Las CMH se caracteri-
zan por su pequeo tamao, una gran relacin
ncleo:citoplasma, la ausencia de marcadores
de linaje (Lin-), un bajo marcaje con tintes vi-
tales como Hoechst 33342 y la presencia de
varios marcadores de superficie, entre los que
se encuentran (humano): CD34, CD90, CD117
(c-kit) y CD133. Una poblacin celular altamen-
te enriquecida con CMH puede obtenerse me-
diante seleccin por citometra de flujo de clu-
las que expresan alguno de dichos marcadores
(tradicionalmente CD34). Sin embargo, ninguno
de ellos por s solo, ni en combinaciones simples,
permite identificar especficamente una CMH.
CMA no-linfohematopoyticas
El mayor problema actual al que se enfrenta
el biotecnlogo, el ingeniero gentico o celular,
o el clnico, que pretenden utilizar CM con fines
teraputicos, es que, en la mayora de los ca-
sos (hay notables excepciones), estas CM una
vez extradas de su entorno natural tienen una
gran tendencia a diferenciar perdiendo, total
o parcialmente, su toti- o pluripotencia. Este
problema parece estar relacionado con el bajo
nivel de conocimiento de su regulacin. En el
momento que obtengamos la informacin ade-
cuada, se podrn mantener ex vivo en mejores
condiciones que permitan preservar su poten-
cial, aspirando incluso a expandir su nmero
para llegar a situaciones ptimas para su aplica-
cin clnica. Esto debera de ser posible para to-
dos los tipos de CMA que se conocen (fig. 5).
Clulas madre mesenquimales (CMM)
Adems de CMH, la mdula sea contiene
al menos otro tipo de CMA, denominadas c-
lulas madre mesenquimales (CMM, o MSC, del
ingls Mesenchymal Stem Cells), las cuales son
clulas fibroblastoides precursoras de todos
los tipos de tejidos conectivos no hematopo-
yticos (hueso, grasa, cartlago, etc.) (Pittenger
et al., 1999). Las CMM no se encuentran slo
en la mdula sea, sino tambin en el estroma
de virtualmente todos los rganos, por ejem-
plo en el tejido adiposo subcutneo (Zuk et al.,
2002) o el cartlago articular (De la Fuente et
al., 2004). Las CMM se obtienen generalmente
mediante seleccin por adherencia a plstico de
cultivo celular, pues son capaces de adherirse y
crecer en condiciones en las que otros tipos ce-
lulares habitualmente no proliferan. No poseen
ningn marcador especfico, pero presentan un
perfil homogneo y reproducible de antge-
nos de superficie, que habitualmente se define
como: CD9+/CD13+/CD29+/CD14/CD34/
CD44+/CD45/CD90+/CD105+.
Debido a su relativamente sencilla obten-
cin, su elevada capacidad de proliferacin ex
vivo (a diferencia de las CMH) y a su amplio
Biologa de las clulas madre 45
potencial de diferenciacin, las CMM son uno Clulas madre epidrmicas (CME)
de los tipos de CMA ms empleados en te-
rapia celular. Adems, en determinadas condi- Fuera de la mdula sea, uno de los teji-
ciones experimentales, las CMM han mostrado dos donde se supona desde haca dcadas la
la capacidad de diferenciarse en linajes celula- existencia de CM, dado su carcter altamente
res no conectivos, tales como el endotelial y proliferante, era la epidermis. En la actualidad
el neuronal. Por ltimo, una propiedad espe- sabemos que existen clulas madre epidrmicas
cialmente interesante de las CMM, es que son (CME o EpSC, del ingls Epidermal Stem Cells)
capaces, tanto in vitro como in vivo, de inhibir la al menos en dos localizaciones distintas. En pri-
respuesta inmunitaria (Rasmusson et al., 2006). mer lugar, en la membrana basal interfolicular se
Esta capacidad de inmunorregulacin incluye la estima que entre el 1 y el 2% de las clulas son
inhibicin de la activacin de clulas T, B, NK CME, con fenotipo p63+, las cuales son capaces
y de la maduracin de clulas dendrticas, as de generar queratinocitos que, al migrar hacia la
como la proteccin frente a patologas infla- superficie, dan lugar a la formacin de la epider-
matorias y/o autoinmunes, incluido el rechazo mis (Pellegrini et al., 2001). En segundo lugar, en
a trasplantes. el interior de los folculos pilosos, en concreto
Tejidos extraembrionarios

CM CM
Lquido amnitico Sangre de cordn umbilical

CM CM
Membrana amnitica Cordn umbilical

CM linfohematopoyticas
Tejidos embrionarios o adultos

CM mesequimales
CM epiteliales
CM neuroepiteliales
CM germinales
CM intestinales
CM neurales
CM CM CM CM de msculo esqueltico
(satlite)
embrionarias fetales adultas
CM hepticas (ovales)
CM endoteliales
CM cardiacas
CM pancreticas
CM renales
CM de neumocitos
Nacimiento
MAPC?
?

CM tumorales

Figura 5. Clulas madre. Origen, ontogenia y tipos.

46 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana

en la regin denominada bulge, se ha descrito la
existencia de una poblacin de clulas madre
ms primitivas, con fenotipo CD34+/queratina
15+/integrina 6+, capaces de dar lugar no slo
a la epidermis propiamente dicha, sino tambin
a los folculos y a las glndulas sebceas. En el
hombre, sin embargo, la identificacin de las
CME interfoliculares resulta ms difcil, y se han
propuesto varios fenotipos diferentes para las
CME del bulge, siendo uno de ellos CD200+/
CD34/CD24/CD71/CD146 (Ohyama et
al., 2006). Al igual que ocurre con otros tipos de
CMA, existen estudios que indican que las CME
muestran plasticidad en determinadas condicio-
nes experimentales (Toma et al., 2001).
Clulas madre neurales (CMN)
Al contrario que la mdula sea o la epi-
dermis, ambos tejidos con una elevada tasa de
recambio (turnover) celular, el descubrimiento
de CM en el SNC constituy sin duda una de
las mayores sorpresas de la biologa en los ini-
cios del presente siglo (Doetsch et al., 1999).
Las clulas madre neurales (CMN o NSC, del
ingls Neural Stem Cells) presentes en el cere-
bro adulto de mamferos tienen su origen en
clulas de la cresta neural, y se localizan prin-
cipalmente en la regin subventricular y en la
regin subgranular del giro dentado del hipo-
campo. El principal marcador de estas clulas
es la nestina, y su aislamiento se realiza me-
diante el cultivo celular en presencia de los fac-
tores de crecimiento EGF y bFGF, condiciones
en las que crecen en forma de agregados es-
fricos en suspensin, denominados neuroes-
feras. Los cultivos de neuroesferas permiten
obtener grandes cantidades de CMN, capaces
de diferenciarse tanto a neuronas como a gla
(astrocitos y oligodendrocitos).
Otras CMA
Las CM hematopoyticas, mesenquimales,
neurales y epidrmicas son las ms estudiadas
y mejor conocidas hasta el momento, pero no
son los nicos tipos de CM demostrados en
los tejidos somticos del adulto. Otros tipos de
CMA que han despertado un especial inters
en medicina regenerativa son los siguientes:
Clulas madre endoteliales. Se ha descrito la
existencia de precursores endoteliales (que
algunos autores consideran clulas madre)
tanto en mdula sea como circulantes (Asa-
hara et al., 1997). Estas clulas estn relacio-
nadas con las CME y han despertado un gran
inters por sus posibles usos en el tratamien-
to de la patologa isqumica.
Clulas madre de msculo esqueltico. Tra-
dicionalmente se han denominado clulas
satlite, y se definen por la expresin del
factor de transcripcin Pax3. En ratn se ha
demostrado que esta poblacin posee el fe-
notipo CD34+/CD45/Sca1 (Montarras et
al., 2005).
Clulas madre pancreticas. La evidencia ex-
perimental sugiere la existencia de uno o va-
rios tipos de clulas madre en el pncreas. Las
CM capaces de diferenciarse a clulas beta
parecen ser clulas presentes en los islotes y
en los ductos pancreticos positivas en neu-
rogenina-3 (Seaberg et al., 2005).
Clulas madre cardiacas. Diversos grupos han
comunicado en los ltimos aos el aislamien-
to a partir de miocardio de clulas capaces
de diferenciarse a cardiomiocitos, endotelio
y msculo liso, aunque an existe controver-
sia sobre su relevancia, origen y fenotipo. La
mayor parte de los trabajos identifican como
clulas madre cardiacas a las CD117+/Sca-1+
(Barile et al., 2007).
Por ltimo, diversos trabajos han descrito la
existencia de CMA pluripotentes (o, al me-
nos, con una extensa multipotencia) en diversos
tejidos de mamferos. Destacan en este campo
los trabajos de la doctora Catherine Verfaillie,
en los que se describe el aislamiento a partir
de la mdula sea y otros tejidos de diversas
especies de mamferos de clulas capaces de
diferenciarse tanto in vitro como in vivo a prcti-
camente todos los linajes celulares somticos, a
las cuales denominan MAPC (Multipotent Adult
Biologa de las clulas madre 47
Progenitor Cells), y que son similares a las CMM
pero negativas para los marcadores CD44 y
HLA-I (Jiang et al; 2002). Dichos trabajos, sin
embargo, no han podido ser adecuadamente
reproducidos por muchos grupos y, en la ac-
tualidad, las MAPC se consideran en general
ms como el resultado de algn tipo de modi-
ficacin inducida por las condiciones de cultivo
ex vivo que como un tipo celular presente en
condiciones fisiolgicas in vivo.
El concepto de nicho
y el control
de la autorrenovacin
Las CM son, junto con las clulas tumorales,
las nicas clulas de mamferos capaces de pro-
liferar y mantener su potencial de diferenciacin
indefinidamente. Esta capacidad de dividirse de
forma ilimitada para dar lugar a otras CM equi-
valentes a ellas es lo que se denomina automan-
tenimiento o autorrenovacin (self-renewal).
La autorrenovacin es un proceso biolgico
de enorme relevancia, pues encierra las claves
tanto de la regeneracin y homeostasis tisular
como del desarrollo, el envejecimiento y el cn-
cer. A pesar de ello, nuestra comprensin de di-
cho proceso es an muy limitada. La mayora de
lo que conocemos acerca de los mecanismos de
autorrenovacin se ha averiguado en el modelo
de clulas madre embrionarias (ESC, del ingls
Embryonic Stem Cells). En dicho modelo se han
identificado una serie de seales extracelulares
(LIF, BMP, FGF, etc.) que contribuyen a mantener
la expresin de varios factores de transcripcin
(Oct4, Nanog, Sox2 y otros), los cuales a su vez
actan como genes maestros que mantienen el
estado pluripotente de las clulas (Rao et al.,
2004). No se comprende muy bien el posible
papel de los mencionados genes de pluripo-
tencia en la autorrenovacin de las CMA, pero
todas las evidencias indican que son bastante
especficos de ESC y que la autorrenovacin en
CMA es regulada principalmente por otros fac-
48 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
tores. Sin embargo, algo que tienen en comn
los mecanismos de autorrenovacin de todas
las CM, es que todos ellos dependen de un con-
junto especfico de seales extracelulares, que
es distinto para cada tipo de CM y que incluye:
seales solubles, tanto paracrinas como autocri-
nas, interacciones con la matriz extracelular, e
interacciones clula-clula. Segn su efecto so-
bre las clulas, dichas seales mantenedoras de
la autorrenovacin pueden clasificarse en:
Seales de proliferacin: inducen la divisin
celular.
Seales de quiescencia: inducen la ralentiza-
cin del ciclo celular en G0, estado en el cual
la clula puede mantenerse durante periodos
prolongados sin diferenciarse ni sufrir daos
genticos.
Seales inhibidoras de la diferenciacin: contri-
buyen a mantener la expresin de genes que
inhiben los procesos de diferenciacin celular.
Seales de supervivencia: proporcionan una
seal sin la cual la CM entrara en senescen-
cia/apoptosis, o bien protegen de la accin de
otras seales capaces de inducir dicha apop-
tosis.
El conjunto de todas estas seales que cons-
tituyen el microambiente especializado de una
determinada CM es lo que se denomina nicho.
El concepto de nicho, derivado de nuevo del
estudio del sistema hematopoytico (fig. 6) es
fundamental para la comprensin de la biologa
de las CM.
En el nicho adecuado, las CM son capaces de
autorrenovarse; fuera de l, las CM se diferen-
cian o mueren. Por tanto, las caractersticas del
nicho fisiolgico son dominantes y controlan
el equilibrio proliferacin/quiescencia/diferen-
ciacin, as como determinantes de la expre-
sin de potencial que se le permite a esa CM
en dicha localizacin anatmica. Cada tipo de
CMA reside por tanto slo en localizaciones
anatmicas muy precisas dentro del organismo,
donde se dan las seales que constituyen su co-
rrespondiente nicho. Este estricto control de la
autorrenovacin es una de las diferencias esen-
ciales entre una CM y una clula tumoral, la cual
no parecen presentar dichas restricciones.
Los nichos de algunos tipos de CMA han sido
localizados de forma precisa, y ya han sido men-
cionados anteriormente, como por ejemplo los
de las CME (capa basal de la epidermis y bulge
de los folculos), las CMN (regin subventricular
y giro dentado) y las CM intestinales (fondo de
las criptas). En otros tipos de CMA, sin embargo,
la localizacin del nicho es an poco precisa. En
el caso de las CMH, se ha descrito que se lo-
calizan mayoritariamente cerca de la superficie
sea, pero tambin asociadas con el endotelio
sinusoidal (Wilson et al., 2006). An no se com-
prende bien la relacin entre ambos tipos de
nicho, ni su probable funcin diferencial en la
biologa de las CMH.
Autorrenovacin frente a diferenciacin (el nicho)
TGF-
pEEDCK
M Self-renewal
IL-I
TNF
etc.
IL-I
TNF
IL-6 +
+ CSFs
SCF
IL-3 sGF
IL-6
IL-II mb-GF
etc. IL-6
Stromal cell
Figura 6. Definicin y estructura funcional del nicho hematopoytico.
Las principales rutas de sealizacin regulado-
ras de la autorrenovacin conocidas en CMA
son Wnt, Notch y Hedgehog (Blank et al., 2008).
Una caracterstica comn de todas estas seales
es que pueden regular la autorrenovacin en dis-
tintos sentidos (inducindola o inhibindola) de-
pendiendo del contexto, y probablemente como
resultado de equilibrios cuantitativos. As, por
ejemplo, la activacin de Notch es esencial para la
autorrenovacin de las CMH, pero en CMN pue-
de promover tanto la autorrenovacin en algunos
casos como la diferenciacin a gla en otros.
La sealizacin por Wnt a travs de la ruta
cannica (-catenina) promueve la autorreno-
vacin en CMH, CMM, CMN, CME y en las CM
intestinales. Sin embargo, en las CMH la dele-
cin de -catenina no afecta a la capacidad de
autorrenovacin, por lo que, o bien la sealiza-
Commitment differentiation
+
ECM-b GF
LIF
TGF-
etc.
CAM
MSC
Biologa de las clulas madre 49
cin por Wnt no es necesaria, o bien sealiza
por medio de la va no cannica en estas clulas.
De forma contraria, la acumulacin de Wnt-3a
en el suero plasmtico del ratn se ha asociado
recientemente al fenmeno de envejecimiento
fisiolgico, al menos de las clulas satlite mus-
culares (Brack et al., 2008)
Por su parte, Sonic Hedgehog tambin pro-
mueve el mantenimiento de las CMH, CMN y
CME. Al menos en las CMH, dicha actividad tie-
ne lugar a travs de un mecanismo dependiente
de BMP-4. La ruta de sealizacin de TGF-/
BMP (mediada por Smads) se ha estudiado
extensamente en CMH, y se sabe que TGF-
es uno de los ms potentes inhibidores de la
autorrenovacin de CMH. Debido al alto nivel
de redundancia de las protenas Smad, su papel
en el automantenimiento de las CMA an no se
comprende de forma completa.
Los programas genticos especficos responsa-
bles del control de la autorrenovacin de CMA
son considerablemente menos conocidos que
las seales extracelulares que los regulan. Hasta
Clula satlite
Msculo
Figura 7. Plasticidad de clulas madre hematopoyticas (CMH).
50 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
el momento, los genes de autorrenovacin mejor
estudiados en CMA pertenecen a la familia de
las protenas Polycomb. Las protenas del grupo
Polycomb (PcG) se asocian en grandes comple-
jos que reprimen la trascripcin de otros genes
mediante modificaciones de la estructura de la
cromatina. Entre los genes PcG se han identifi-
cado varios que participan en la regulacin de la
autorrenovacin de CMA. Entre ellos, el mejor
conocido es Bmi1 (Park et al., 2003), cuya expre-
sin es necesaria para el mantenimiento de las
CME y CMN. Bmi1 promueve la proliferacin de
las CMA principalmente reprimiendo la ruta de
senescencia celular inducida por p16Ink4a y p19Arf.
Plasticidad de las CMA
En los ltimos 7-8 aos ha existido una amplia
polmica, que todava persiste en algunos extre-
mos, sobre el novedoso concepto de la plasti-
cidad celular, principalmente establecido sobre
experimentacin realizada con CMH (fig. 7). Por
SNC
Sistema nervioso PEC (mdula sea)
Tumor in situ
Clula oval
Hgado
SCE
Folculo Criptas Queratinocitos-epidermis
piloso intestinales
plasticidad celular entendemos el fenmeno por
el cual una CMA, extrada de su nicho natural,
manipulada o no ex vivo, y trasplantada en otro
entorno fisiolgico, es capaz de dar lugar a otros
linajes celulares no previstos segn su programa
de desarrollo estndar.
En este proceso se han implicado diferentes
mecanismos, no totalmente clarificados, y que
incluyen dediferenciacin, transdiferenciacin
y reprogramacin. Hoy en da algunos de los
postulados iniciales no se han confirmado, pero
otros s (Rov y Gratwohl, 2008). En la actua-
lidad se est investigando la terapia celular con
CMH como posible procedimiento teraputico
para el tratamiento de muy diversas patologas
no relacionadas con el sistema linfohematopo-
ytico. Las principales aplicaciones en este senti-
do son la reparacin/regeneracin heptica y el
tratamiento de la isquemia.
La capacidad de las CMH para generar nue-
vas clulas hepticas se ha demostrado en va-
rios modelos animales de insuficiencia heptica
(Lagasse et al., 2000), y su posible aplicacin en
clnica ofrece una importante promesa terapu-
tica en este tipo de patologas. Sin embargo, la
formacin de nuevos hepatocitos no se debe a
la diferenciacin de las CMH, sino a un proceso
de fusin de dichas clulas (u otros tipos deri-
vadas de ellas, como los macrfagos) con los
hepatocitos preexistentes (Wang et al., 2003).
Este descubrimiento, no obstante, no invalida la
posibilidad de tratar eficazmente enfermedades
metablicas o infecciosas hepticas mediante
el trasplante de CMH, y se estn investigando
activamente las propiedades biolgicas de las
clulas resultantes de la fusin.
La isquemia cardiaca es otra de las patologas
que se est abordando mediante el trasplan-
te de CMH. Los trabajos iniciales en roedores
(Orlic et al., 2001) promovieron el desarrollo
de numerosos estudios preclnicos y clnicos de
terapia celular motivados por la hiptesis de
que las CMH poseen una plasticidad suficien-
temente elevada cmo para transdiferenciarse
a clulas del linaje cardiomioctico. Sin embargo,
estudios posteriores parecen descartar que di-
cha transdiferenciacin tenga lugar en una pro-
porcin significativa en las condiciones experi-
mentales habituales (Murry et al; 2004) aunque
la transdiferenciacin in vivo se ha sustanciado
en diferentes estudios realizados sobre varones
que recibieron un trasplante de corazn cuyo
donante era una mujer, sin la aparente media-
cin de mecanismos de fusin (Angelini et al.,
2007). Por tanto, sigue la polmica. Por otra
parte, la posible capacidad proangiognica est
siendo investigada en el tratamiento de la isque-
mia perifrica (Pearce et al., 2008).
De forma anloga, el potencial de las CMH
para la transdiferenciacin in vivo en clulas del
sistema nervioso central tambin se ha sustan-
ciado en diferentes estudios realizados sobre
mujeres que recibieron un trasplante de m-
dula sea cuyo donante era un varn (Cogle
et al., 2007).
En definitiva, la plasticidad celular de diferen-
tes CMA es una nueva opcin teraputica que
necesitar mucho ms tiempo para ser evaluada
con solidez, lo cual no la descarta cmo plausi-
ble aunque complicada en trminos de efica-
cia en algunas indicaciones.
Clulas madre
embrionarias humanas
Recientemente (Thomson et al., 1998; Reubi-
noff et al., 2000) se han conseguido las primeras
lneas de clulas madre embrionarias humanas
(hES), aunque por el momento las condiciones
de cultivo y expansin in vitro no estn defi-
nidas al nivel de sus homlogas de ratn. No
obstante, dada la amplia experiencia que se ha
adquirido con las clulas ES de ratn (mES), el
mero hecho de su existencia ha abierto un gran
debate social y cientfico-tico sobre lo que
puede y/o debe ser investigado al amparo de
la financiacin pblica, y sobre reformas en las
leyes correspondientes que regulen la actividad
general y econmica en torno a este nuevo po-
tencial teraputico.
Biologa de las clulas madre 51
 Como hemos comentado anteriormente,
la gran ventaja terica de partir de hES es que
stas clulas deben de poseer el potencial (por
definicin) de generar cualquier tipo celular hu-
mano. Esta premisa, sin embargo, es difcil de con-
firmar experimentalmente. De hecho, no existe
una prueba formal de que las clulas hES que se
manejan sean totalmente equivalentes a las mES;
en este sentido, ambas clulas tienen diferentes
requerimientos de crecimiento y parecen ser
bastante ms inestables genticamente (Baker et
al., 2007). Sin duda es necesario acumular mu-
cha ms experiencia sobre el comportamiento
de stas clulas en cultivo, antes de plantearse su
empleo en procedimientos clnicos.
En todo caso, la utilizacin de hES obliga a con-
trolar, de forma reproducible, su capacidad de di-
ferenciacin a clulas o progenitores del linaje ce-
lular de inters. As, se han realizado avances muy
significativos (p. ej., Narazaki et al., 2008), aunque
tambin se ha evidenciado que la identificacin y
caracterizacin de las clulas derivadas ha de ser
exhaustiva, ya que los marcadores simples que
sirven en clulas primarias somticas, pueden no
ser equivalentes sobre estas clulas obtenidas ar-
tificialmente (Martin et al., 2008).
Finalmente, la utilizacin generalizada de tcni-
cas basadas en hES obligara a disponer bien de
un panel amplio de lneas celulares que pudiesen
cubrir los haplotipos ms comunes en una deter-
minada poblacin humana, o bien a desarrollar
una tecnologa eficaz para conseguir el clonado
teraputico. Ninguna de las dos situaciones son
posibles en la actualidad, aunque pueden conver-
tirse en una realidad (Cibelli et al., 2007). En todo
caso, el traslado de esta tecnologa a ensayos cl-
nicos requerir muy probablemente el disponer
las lneas equivalentes en algn modelo animal
grande, cmo recientemente se ha conseguido
en el perro (Schneider et al., 2008).
La tercera va
Se han identificado recientemente, tanto en
ratn como en el hombre, varias combinacio-
52 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
nes de genes cuya expresin exgena en una
clula diferenciada puede, por s sola, promover
su reprogramacin y desdiferenciacin a clula
pluripotente (Takahashi et al., 2007). Este resul-
tado ha sido ya validado por numerosos grupos
y abre definitivamente una nueva va (la tercera
va) para obtener clulas pluripotenciales huma-
nas. Evidentemente, este nuevo tipo celular, iPS,
debe poseer muchas de las propiedades/cuali-
dades de las hES, pero con la ventaja de poder
obtener fcilmente una lnea autloga de un
ser humano concreto. Los resultados relaciona-
dos con la induccin selectiva de diferentes lina-
jes todava es muy reducida, pero prometedora
(p. ej., Park et al., 2008), y habr que acumular
ms experiencia sobre estas clulas para evaluar
su inters final como dianas de procedimientos
de ingeniera tisular. En todo caso, la mayora de
las reflexiones realizadas en el apartado ante-
rior (hES) se aplicaran tambin a sta nueva
opcin teraputica.
Una realidad incipiente.
Una nueva visin de algunas
patologas humanas
Hay que seguir alimentando el entusiasmo y
el soporte social que las nuevas posibilidades
teraputicas basadas en la utilizacin de CM han
resucitado, pero manteniendo paralelamente un
gran rigor y una extremada cautela. Es necesa-
rio transmitir a la poblacin la informacin de
forma equilibrada, y explicando que cualquier
avance significativo en el laboratorio tardar
ms de 10 aos en convertirse en una realidad
clnica establecida.
Las expectativas que gener en su da la
posibilidad de introducir en el organismo vivo
nuevas versiones correctas de los genes que
contenan mutaciones asociadas a enfermeda-
des genticas humanas (terapia gnica) fueron
extraordinarias. La realidad sin embargo se
mostr mucho ms exigente que la voluntad, y
han sido necesarios ms de 25 aos para que
los primeros beneficios clnicos (y no exentos
de problemas) hayan sido una realidad. Las con-
secuencias las hemos sufrido todos, incluyendo
investigadores, clnicos y pacientes. Sinceramen-
te, esperamos que no ocurra lo mismo con las
infinitas posibilidades que la combinacin de
terapia celular/gnica pueden abrir al arsenal
teraputico de la humanidad.
Debemos reconocer que aunque los avances
en el conocimiento de la biologa de las CM
han sido enormes en la ltima dcada, todava
estamos lejos de controlar completamente los
sistemas. Sin ir ms lejos, en los ltimos aos
han surgido del genoma humano nuevos ju-
gadores que eran completamente desconoci-
dos en mamferos hace unos aos; nos estamos
refiriendo a los RNA de corto tamao y no
codificantes (microRNA; miRNA) que parecen
jugar un papel importante en el control fino de
las transcripcin/traduccin (Garzon y Croce,
2008). Su papel en cncer humano es induda-
ble, pero su potencial papel sobre la biologa de
CMA es todava muy mal conocido. Por tanto,
debemos de ser humildes, y avanzar al ritmo
que el conocimiento bsico nos permita, sabien-
do aprovechar, al mximo, las opciones realistas
que existan en cada momento.
Por ltimo, no todo son bondades en el nue-
vo universo de la clula madre, y su estudio nos
ha abierto los ojos a nuevos conceptos que
hace unos aos eran pura especulacin. Se ha
demostrado que ciertas poblaciones celulares,
originarias de la mdula sea, pero que pueden
pasar a la circulacin en determinadas circuns-
tancias, tienen un papel importante en el desa-
rrollo de lesiones arteriosclerticas, as como en
el establecimiento de la vasculatura tumoral en
varios modelos. Los mecanismos moleculares
que activan esta movilizacin patolgica de c-
lulas madre no se conocen en detalle, pero esta
realidad fisiolgica se est intentando explotar
para generar nuevas posibilidades teraputicas;
precursores angioblsticos, aislados de sangre
perifrica o de mdula sea, se intentan utilizar
como vehculos celulares para conseguir pro-
ducir biomolculas de inters teraputico en
zonas localizadas del cuerpo (tumores secunda-
rios, pre-lesiones malignas o arterioesclerticas,
etc.). Estas estrategias de terapias combinadas
(celular-gnica) estn dando sus primeros frutos
en un nivel bsico.
Ms an, una vieja teora se va convirtiendo
en una realidad clnica da a da. Los tumores
slidos son aglomeraciones de clulas muy he-
terogneas gentica y funcionalmente. En varios
modelos de tumores slidos humanos se ha po-
dido constatar que dentro de los tumores existe
una poblacin muy minoritaria de clulas que es
la responsable de garantizar la propiedades del
tumor y su agresividad (su trasplante en mode-
los animales es capaz de reestablecer el tumor).
Esto ha reabierto la discusin sobre la existen-
cia de las clulas madre tumorales (CMT o
CSC, del ingls Cancer Stem Cells), inicialmente
propuesto desde la hematoncologa, y las impli-
caciones que esto tiene sobre la efectividad de
las terapias (Glinsky, 2008). La realidad es que
las clulas tumorales y ciertas poblaciones de
clulas madre poseen ciertas propiedades muy
asimilables y pueden estar relacionadas (fig. 8);
los prximos aos nos depararn con seguridad
nuevas sorpresas y, probablemente, una nueva
visin de muchas de las patologas humanas.
Homeostasis
de los tejidos
y los rganos
Fisiologa normal
Positivos Negativos
Nuevas Clulas madre adultas Nuevas
posibilidades implicaciones
teraputicas fisiopatolgicas
Cncer (stem cells)
Figura 8. Equilibrios funcionales en clulas ma-
dre adultas.
Biologa de las clulas madre 53

Reimplantacin
autloga
Diferenciacin controlada
ex vivo?
Figura 9. Estructura de un ensayo de terapia celular tpico.
Un futuro prometedor
El potencial teraputico de las clulas madre
es enorme. Basta pensar en la cantidad de per-
sonas que todava mueren a la espera de un
trasplante de rgano vital, a sabiendas que de
conseguir un donante adecuado, esto les ofre-
cera unos cuantos aos con calidad de vida.
En otros casos, algunos rganos del paciente
sufren daos debidos a procesos traumticos,
patolgicos o causados por hbitos insanos,
que solamente pueden ser aliviados mediante
complejos procedimientos clnico-quirrgicos.
La tecnologa asociada a la manipulacin de
clulas madre empieza a ofrecer un futuro en
todos estos campos. Poniendo por delante
que estamos hablando casi siempre de resulta-
dos obtenidos en modelos animales de expe-
rimentacin (rata, ratn y, en el mejor de los
casos, cerdo) y que su traslado al ser huma-
no es abismal, el futuro es muy prometedor.
Prcticamente a diario se hacen pblicos en las
revistas cientficas ms prestigiosas resultados
espectaculares. Como ejemplo citemos sola-
mente los primeros resultados de seguridad/
factibilidad (fase I) de empleo de clulas de
medula sea (movilizadas a sangre perifrica)
en el tratamiento del fallo heptico crnico
(Levicar et al., 2008).
54 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
Aislamiento celular/caracterizacin Cultivo
ex vivo
Implantacin
alognica
Expansin
ex vivo
Biomateriales? Modificacin gentica?
Sin embargo, cualquier revolucin tcnica, y
no digamos mdica, requiere su tiempo de acu-
mulacin de experiencia, reflexin y evaluacin
en una muestra significativa de la poblacin. En
todas las diferentes etapas implicadas en el de-
sarrollo de cualquier aplicacin clnica de CM
(fig. 9) se esperan avances significativos y, muy
probablemente, el formato de la produccin
celular asociada a los ensayos clnicos en los
prximos aos se parecer poco a los actuales.
Dmosle tiempo al tiempo y dejemos que este
valor absoluto ponga a cada uno en su lugar.
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Biologa de las clulas madre 55
 5 Clinical applications of cell
therapy
Jos Lpez-Barneo
Instituto de Biomedicina de Sevilla-Ibis
Hospital Universitario Virgen del Roco/CSIC/Universidad de Sevilla. Sevilla
Cell therapy: a challenge
of translational medicine
Replacement of damaged organs, tissues, and
cells is one of the fundamental objectives of
modern medicine, and the last decades have
witnessed spectacular advances in organ/tis-
sue transplantation and related disciplines (or-
gan preservation, immunosuppression, patient
clitical care, etc). Within this field, cell therapy
still remains in its initial stages of translation to
medicine, although it is the area that should
profit more of the numerous developments in
cell biology occurred in recent years. It is over
forty years that cell therapy is applied routinely
in hematology to replace bone marrow cells
damaged by accidental irradiation, mutations,
or cancer. There have been also clinical advan-
ces in cell therapy related with other areas of
medicine such as skin or bone/cartilage repla-
cement and regeneration. However, it is in the
neurological diseases where the promises of cell
therapy have probably created the highest ex-
pectations, as the ability of regeneration of the
mammalian central nervous system is null, or
very low. In addition, neurological disorders, and
particularly neurodegenerative diseases, have
high individual, social, and economic costs, thus
representing one of the major challenges of de-
veloped societies.
56 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
Cell therapy in diseases
of the central nervous
system; introductory
remarks
Many diseases of the central nervous sys-
tem (CNS) are a consequence of the acute or
chronic loss of neurons and/or glial cells owing,
among other causes, to degenerative, toxic,
traumatic, ischemic or inflammatory aggressions.
Therefore, the replacement of damaged cells by
new ones has been considered as a potential
therapeutic strategy in these CNS disorders.
Neurologic cell-based therapy implies not only
the transplantation of exogenous tissues to re-
pair or restore function (cell replacement), but
also the use of cells for the delivery of trophic
factors with a protective action on the neurons
affected by the ongoing pathological processes
(neuroprotection) (1-3). Routes of cell or tis-
sue administration include direct intracerebral
grafting by open surgery or through stereotaxic
needles, as well as intrathecal or intraventricu-
lar delivery. Systemic intravascular (arterial or
venous) injections are used in some cases and
migration of the putative therapeutic cells to
the site of lesion has been reported. Another
plausible form of cell therapy is the activation
of pre-existing neuronal precursors located in
neurogenic centers (i.e. the subventricular zone
of the lateral ventricles or the dentate gyrus of
the hippocampus) that could migrate and di-
fferentiate to replace destroyed cells in some
parts of the brain. This possibility is speculative
at present and based solely on preliminary ex-
perimental observations (4, 5).
In theory, the ultimate goal of neurologic cell
therapy is the histological and functional integra-
tion of grafts within the neighboring brain pa-
renchyma. In this regard, synaptic connections
between grafted neurons and the host tissue
have been described in experimental studies.
However, it has become evident that physiolo-
gical restoration of the intricate synaptic circuits
of the brain cannot be achieved through the cell
replacement protocols currently used to treat
CNS disorders. In contrast, the beneficial effects
of transplants are, in most cases, a consequence
of gross anatomical or neurochemical modifi-
cations in the recipient organ. For instance, the
amelioration of parkinsonism after intrastriatal
grafting of dopaminergic tissue is due to the tonic
release of dopamine and/or trophic factors from
grafted cells which, respectively, activate dopami-
ne receptors in neighboring neurons and induce
sprouting of the dopaminergic nigrostriatal fi-
bers in the host brain.Therefore, the best results
of cell therapy are obtained in CNS disorders,
such as Parkinsons disease (PD), with relatively
focalized lesions and affecting diffuse synaptic
circuits in which pre-post synaptic specification
is not an absolute requisite for the restoration
of function. At present, it is difficult to envisage
how therapies based on cell replacement or the
activation of preexisting neurons could restore
the delicate cortical and hippocampal synaptic
circuits underlying memory storage and retrie-
val extensively damaged in Alzheimers disease
patients. Other limitations of cell therapy derive
from the scarcity of cells/tissues that are appro-
priate for transplantation. Although autogra-
fts can be performed in some cases, the most
frequently used clinical protocols are based on
allo- or even xenografts, thus requiring immuno-
suppression treatment. Allotransplants are also
rendered difficult because the use of tissue from
human donors (i.e. human fetuses or embryos)
raises numerous legal and ethical issues.
Despite the limitations described above, cell
therapies have been successfully applied to the
treatment of neurological diseases for over two
decades. The pioneer studies, designed to treat
advanced PD patients with excellent results in
some cases, stimulated the development of the
field and were followed by a great deal of ex-
perimental and clinical work. These studies have
boosted the development of animal models of
numerous CNS diseases and the appearance
of well-defined clinical protocols to evaluate
disease progression. Nevertheless, the initial
enthusiasm derived from the results of open
trials has been tempered by the less spectacular
clinical outcomes of double-blind and placebo-
controlled studies performed with large patient
cohorts. Recently there has been, however, re-
newed interest in the cell therapy field due to
the appearance of new cell sources, particularly
stem cells, with potential clinical applicability. Cu-
rrently, there are numerous ongoing experimen-
tal and clinical transplantation studies designed
to test the therapeutic efficacy of several cell
types in a variety of neurological diseases, such
as PD, Huntingtons disease (HD), amyotrophic
lateral sclerosis (ALS), stroke, and spinal cord in-
jury (SCI), among others.
This chapter aims to provide a general over-
view of the current status of cell therapies
applied to CNS disorders. After a concise up-
date of the preclinical knowledge available, the
studies and techniques that have already resul-
ted in clinical application are discussed in more
detail. In this respect, the chapters main focus is
PD, a prototypical neurodegenerative disease in
which the most solid and promising conceptual
and technological advances in neurologic cell
therapy have been tested. In addition, recent
developments related with cell therapy applied
to other CNS disorders (i.e. HD, ALS, stroke,
or SCI) are briefly addressed. The chapter ends
with a concluding summary and look at future
perspectives in the field.
Clinical applications of cell therapy 57
Cell therapy in Parkinsons
disease
Pathophysiology and novel
therapeutic strategies in
Parkinsons disease
Parkinsons disease (PD) is a progressive neu-
rodegenerative disorder of unknown etiology.
Although several genetic forms have been des-
cribed (6) the majority of cases are sporadic and
unrelated to familial traits. PD is a major health
problem in developed countries, as it affects to
100-300 subjects per 100,000 inhabitants and up
to 3% of people older than 65 (7, 8). The motor
symptoms of PD (tremor, bradykinesia/hypokine-
sia, rigidity, and alterations of gait and posture)
are due to the progressive loss of dopaminergic
neurons in the substantia nigra (SN) and their
projections to the striatum (Figure 1). The dege-
nerative process also affects other areas of the
CNS and the peripheral autonomic nervous
system, thus causing several non-motor symp-
toms, such as depression, cognitive impairment,
and autonomic dysregulation (9). Although the
progressive neuronal loss is a common feature
of all neurodegenerative diseases, a typical pa-
thological hallmark of PD is the appearance of
cytoplasmic inclusions, called Lewy bodies, con-
taining synuclein and ubiquitin among other pro-
teins. The mechanism of neuronal death in PD is
likely multi-factorial, involving a cascade of events
among which cellular oxidative damage appears
to have a prominent role (Figure 1). Selective de-
crease of reduced glutathatione, mitochondrial
complex I activity, and reactive oxygen species
(ROS)-destroying enzymes, or elevated con-
centrations of iron, which can act as a catalyst
for detrimental oxidative reactions, have been
reported within the parkinsonian SN. Similarly,
there is evidence of oxidative damage to lipids,
proteins and DNA in the brains and leukocytes
of PD patients. Inflammatory-related events, such
as nitric oxide-derived reactive species produced
by glial inducible nitric oxide synthase, appear also
to participate in SN dopaminergic degeneration
(10). Besides mitochondrial dysfunction and the
oxidative or inflammatory stresses, alteration of
protein-degrading mechanisms at the proteaso-
me is an additional factor that participates in
PD initiation and/or progression. For example,
mutations in -synuclein (a presynaptic protein
of unknown function that is deposited in Lewy
bodies) or in parkin (a ubiquitin ligase necessary
for protein identification by the proteasome) are
responsible for some forms of genetic PD (6).

A Nigrostriatal pathway in mouse B Striatal dopaminergic terminal

MAO DOPAC + H2O2

DA

DAT
St
SN
DA

Figura 1. Dopaminergic nigrostriatal pathway. A) Mouse dopaminergic nigrostriatal neurons and fibers
stained using antibodies anti tyroxine hydroxylase. SN, substantia nigra; St, Striatum. B) Schematic repre-
sentation of a dopaminergic presynaptic terminal. Uptake of dopamine (DA) and its metabolization to
dihydroxyphenyl acetic acid (DOPAC) and hydrogen peroxide (H2O2) are illustrated. DAT, dopamine
transporter; MAO, monoamine oxidase.

58 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana

 PD treatment relies mainly on L-dopa, a drug
that is converted to dopamine in neuronal so-
mata and presynaptic terminals. L-dopa is nor-
mally complemented with the administration
of dopamine receptor agonists or inhibitors
of dopamine-degrading enzymes (monoamine
oxidase and catechol-o-methyl transferase).
Patients who develop disabling motor com-
plications (motor fluctuations and dyskinesias)
or drug-resistant tremor can be candidates for
surgical implantation of electrodes for electrical
stimulation, these normally being placed at the
subthalamic nuclei. This methodology, consisting
of the application of high frequency (> 100
Hz) electrical pulses to inhibit neuronal activi-
ty, can correct the alterations of basal ganglia
circuits in the parkinsonian brain. Although the
current pharmacological and surgical therapies
are symptomatically effective, their long-term
utility is limited because they do not halt the
disease progression (11). Therefore, there is a
need for neuroprotective and/or neurorestora-
tive therapies capable of arresting or reversing
the neurodegenerative process. Dopamine cell
replacement and the intracerebral administra-
tion of trophic factors are cell-based promising
therapeutic approaches currently subjected to
intense basic research and clinical evaluation.
Transplantation of dopamine-
secreting cells. Preclinical
studies
Mammalian models of Parkinsons disease
Development of research on CNS cell thera-
py depends on the existence of animal models
of the neurological diseases, where the effecti-
veness, advantages, and limitations of the various
therapeutic approaches can be tested experi-
mentally. A brief description of the mammalian
models of PD available is given below.
A commonly used PD animal model is the
hemiparkinsonian rat, generated by unilateral
stereotaxic injections of 6-hydroxydopamine
(6-OHDA) either into the SN, the neighboring
medial forebrain bundle, or the striatum. In all
cases the drug is metabolically converted to do-
pamine and generates H2O2, which subsequently
kills the dopaminergic nigrostriatal neurons due
to oxidative stress (Figure 2). Unilateral destruc-
tion of the dopaminergic nigrostriatal neurons
produces a spontaneous rotational behavior
towards the side of the lesion (greatly exacer-
bated by administration of D-amphetamine)
that is easily monitored with a rotameter. As
the number of rotations is proportional to the
degree of SN lesion (and to the extension of
striatal dopaminergic denervation) this model
permits the experimenter to test the recovery
of the syndrome after striatal transplantation of
dopamine (and/or trophic factor)-releasing cells
(Figure 2) (12). The 6-OHDA model has, howe-
ver, numerous limitations since it is generated
by acute oxidative damage to SN dopaminergic
neurons, a phenomenon quite different from
the chronic and progressive death of this neu-
ronal population characteristic of PD. Moreover,
the direct mesencephalic injection of 6-OHDA
makes it difficult to obtain animals with partial
lesions, which are required to test neuroprotec-
tive therapies based on the trophic action of
the transplanted cells on nigrostriatal neurons
spared by the lesions or still unaffected by the
ongoing neurodegenerative process. In the last
few years there have been several attempts
to generate chronic rat PD models, although
their feasibility and reproducibility are still under
scrutiny. Chronic intravenous or subcutaneous
administration of rotenone (a membrane-per-
meable inhibitor of mitochondrial complex I)
seems to produce bilateral destruction of do-
paminergic SN neurons with Lewy body-like
cytoplasmic inclusions. Similar results have also
been reported after chronic administration of
proteasome inhibitors. Unfortunately, the validi-
ty and reproducibility of this model (that initia-
lly raised great expectations) is being seriously
questioned (10, 13).
The monkey model of PD is also broadly
used owing, among other reasons, to the need
for testing in non-human primates most of the
Clinical applications of cell therapy 59
cell therapy procedures destined for clinical use.
Monkeys are chronically treated by subcuta-
neous injections of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-
tetrahydropyridine (MPTP), a drug converted
in the primate brain to 1-methyl-4-phenylpyri-
dinium ion (MPP+) which, in turn, is taken up
selectively by dopaminergic neurons via the
dopamine transporter (Figure 1). As MPP+ is
a potent mitochondrial complex I inhibitor, its
chronic application leads to progressive dopa-
minergic cell death. MPTP has similar actions in
mice (see below) but is ineffective in rats since
they do not express the enzymes required to
convert MPTP into MPP+. In primates (monkey
and human) MPTP produces a bilateral parkin-
sonian syndrome with motor features similar
to those present in sporadic PD (10, 14). The
objectives of experimental cell therapy in par-
kinsonian monkeys are similar to those descri-
bed above for the rat. Dopamine- or trophic
factor-releasing cells are normally deposited ste-
reotaxically in the striatum (normally at several
locations in the putamen) and clinical recovery
is monitored with ad hoc behavioral tests. The
MPTP monkey is particularly useful to perform
unilateral striatal transplants since the contrala-
teral striatum (injected with saline solution) can
be used as control. In these cases, the success
of the procedure results in unilateral histological
and clinical recovery, with the animals behaving
in a hemiparkinsonian manner hence showing
a typical rotational behavior towards the side
contralateral to the transplant (15).
Systemic administration of MPTP in mice
produces bilateral destruction of dopaminergic
nigrostriatal neurons (10, 16, 17). The parkin-

Nigrostriatal denervation in the hemiparkinsonian rat Striatal reinervation after CB grafting

Figura 2. Hemiparkinsonian rat model and intrastriatal grafting of dopaminergic cells. A) Coronal sec-
tions at the level of the striatum (St) and the mesencephalon (SN, substantia nigra;VTA, ventral tegmen-
tal area) showing the normal (left) and denervated (right) nigrostriatal pathway. B) Striatal dopaminergic
reinnervation after transplantation of carotid body glomus cells (g, graft).

60 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana

sonian syndrome in mice is less amenable for
behavioral analysis than the syndrome in the rat;
however mice are sometimes chosen because
MPTP administration requires no surgery and,
as in the case of primates, if unilateral transplan-
tation is performed the contralateral side can
be used as an internal control. In addition, sus-
ceptibility to MPTP-derived toxicity can be stu-
died in the numerous genetically modified mice
strains available. An acute MPTP mice model is
normally generated by subcutaneous injections
(single or distributed over 12-24 h) of the drug.
Chronic models, based on the continuous de-
livery of MPTP using subcutaneous pumps or
repeated injections, are being assayed in several
laboratories but results differ among the various
groups and animals strains.
There are several mouse genetic models in
which some of the genes altered in familial PD
(i.e. -synuclein or parkin) have been transgeni-
cally overexpressed in an attempt to reproduce
the disease. So far, none of these genetically mo-
dified animals exhibit clear histological, neuroche-
mical or behavioral signs of parkinsonism. Ano-
ther PD mouse model is the one obtained after
genetic disruption of the glial cell line-derived
neurotrophic factor (GDNF) signaling pathway.
GDNF is the most representative member of
a family of trophic factors (called dopamino-
trophic factors) that promote the in vivo and
in vitro survival of dopaminergic neurons (see
below). GDNF null animals die at early neonatal
stages due to kidney agenesia and alterations of
the enteric nervous system, although in these
animals both the SN and the striatum are nor-
mal. In adult life, the overall GDNF expression in
the central nervous system decreases drastically,
although high levels of GDNF are maintained in
some striatal neurons and glial cells, possibly as
a mechanism to aid trophic maintenance of the
nigrostriatal pathway. Heterozygous GDNF+/-
animals develop normally, although it has been
reported that they show a mild reduction of the
dopaminergic neuronal pool at advanced age.
Thus, it seems that abolition of GDNF expres-
sion (or function) in the adult mouse could ser-
ve as a good PD mouse model. Conflicting re-
sults have recently been reported regarding the
effect of c-ret (a transmembrane component of
the GDNF receptor) knock-out in adult life (18,
19). The conditional GDNF null mouse recently
generated in our laboratory has demonstrated
that striatal GDNF production is absolutely ne-
cessary for the survival of adult mesencephalic
dopaminergic neurons. These animals show an
extensive loss of cells in SN and VTA as well as
in the Locus coeruleus. They also have a clear
akinetic syndrome that ameliorates after L-dopa
administration (19b).
Preclinical transplantation studies
The first cell therapy studies in animal models
of PD were performed in the late 1970s in rats
using fetal rat dopamine-containing neurons as
donors with the aim of restoring striatal dopa-
mine levels. In these investigations, improvement
of the functional deficits in parkinsonian animals
was paralleled by the survival of intrastriatal gra-
fts and axonal outgrowth (20, 21). After this pio-
neer work, numerous studies have been perfor-
med in the last 25 years in an effort to address
the following main objectives:
I. To establish the effectiveness of different ty-
pes of donor tissue on recovery from the
parkinsonian syndrome.
II. To test the survival of the transplanted tissue
and its histological integration within the host
striatal parenchyma.
III. To evaluate electrophysiological and neuro-
chemical activity in grafts and the establish-
ment of functional connections (synapses)
between the graft and the host brain.
IV. To determine whether immunosuppression
facilitates long-lasting cross-species trans-
plantation of neural and non-neural tissues.
After the initial transplantation of mesen-
cephalic tissue from rat embryo to rats, a step
further was the transplantation of mesencepha-
Clinical applications of cell therapy 61
lic dopaminergic neurons, taken from mouse
embryos or human fetuses, to the dopaminer-
gically denervated neostriatum of recipient rats,
and the use of primates with MPTP-induced
Parkinson-like syndrome as graft receptors (22).
At the same time, adrenal chromaffin cells were
used as an alternative dopamine source in PD
animal models, from rats to primates, although
with poorer results than those obtained using
embryonic or fetal dopamine neurons (23).
In parallel with these studies there have been
several reports from groups using porcine me-
sencephalic neurons with good results (24). Si-
milarly, tissues in the peripheral nervous system,
other than the adrenal medulla, have been used.
In those studies, transplants of sympathetic neu-
rons from the superior cervical ganglion were
performed in experimental animal models as
well as in humans (25).
Among the most promising new experimen-
tal approaches developed within the last few
years are the transplantation of retinal pigment
epithelial cells and of carotid body tissue. In
the first case, stereotaxic intrastriatal implan-
tation of human retinal pigment epithelial cells
attached to gelatin microcarriers in rodent and
non-human primate models of PD produced
long-term amelioration of motor and behavio-
ral deficits, with histological and PET evidence of
cell survival without immunosuppression (26).
In the second case, the autotransplantation of
dopaminergic carotid body (CB) cell aggrega-
tes was able to effect notable histological and
functional recovery in parkinsonian rats (27, 28)
and MPTP-treated monkeys (15). The CB is a
tissue particularly attractive for antiparkinsonian
cell therapy because it combines the properties
necessary for dopamine cell replacement and
for neuroprotection. The CB contains neural
crest-derived dopaminergic glomus cells, which
function as arterial oxygen sensors and relea-
se large amounts of dopamine in response to
hypoxia. Long-term recovery of parkinsonian
animals after intrastriatal CB grafting is induced
not only by the release of dopamine, but also
62 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
through a trophic effect on nigrostriatal neu-
rons. In fact, adult rodent CB cells express much
higher GDNF levels than any other paraneural
cells studied (adrenal medulla, superior cervical
ganglion, Zuckerlands organ and PC12). Mo-
reover, GDNF expression by CB glomus cells is
maintained after intrastriatal grafting and in CBs
of aged or MPTP-treated animals (29) (Figure
3). Thus, glomus cells appear to be miniaturized
biological pumps useful for the local delivery of
GDNF and possibly other trophic factors.
Besides the transplantation of dopamine-
producing cells, other experimental strategies
have been designed to directly increase the
striatal concentration of trophic factors that
could eventually induce regeneration of the
dopaminergic nigrostriatal pathway. Among
these studies Sertoli cells from the testis, am-
niotic epithelial cells or genetically modified
cells overexpressing trophic factors have been
used. Some of these trophic factor-producing
cell types have been assayed in conjunction
with dopamine releasing cells (i.e. cotransplan-
tation of peripheral nerve plus adrenal medu-
lla, and Sertoli or CB cells plus ventral mesen-
cephalic neurons) (30).
After more than 20 years of preclinical re-
search in antiparkinsonian cell therapy, the stu-
dies performed can be retrospectively classified
into three major groups:
I. Intrastriatal transplantation of heterologous
dopaminergic neurons to compensate for
the loss of intrinsic dopaminergic fibers. For
these studies, fetal mesencephalic neurons
were normally used and the establishment
of synaptic connections between the graft
and host neurons was considered a good
indication of graft survival and integration in
the recipient brain. More recently, fetal me-
sencephalic neurons are being substituted by
stem cell-derived dopaminergic neurons (see
Section 3.2).
II. Intrastriatal transplantation of dopamine-
releasing cells (adrenal chromaffin, retinal or
 carotid body cells) with the sole objective of
increasing the average level of dopamine in
the striatal parenchyma. Functional connec-
tions between the graft and host tissues were
not expected.
III. Intrastriatal delivery of cells releasing trophic
factors (carotid body, retinal cells, Sertoli or
amniotic epithelial cells or genetically modi-
fied cells), to encourage striatal reinnervation
through sprouting of the intrinsic nigrostriatal
neurons.
Over the years, interest has shifted from pro-
cedures that could be included in categories i/ii
to those included in category iii. In the initial sta-
ges, the limiting factors in cell therapy research
were graft survival and accessibility to an abun-
dant dopaminergic neuronal source. Currently,
it is considered more important to determine
the mechanisms of action of the transplants to
help better define the type of patient that could
eventually benefit from cell therapy.
Current developments using stem cells
Embryonic stem (ES) cells are generally thought
to offer a promising source of dopaminergic neu-
rons suitable for PD cell therapy.They are charac-
terized by a high proliferation rate and the po-
tential to give rise in vitro to any cell type of the
adult organism (2). In recent years, the differentia-
tion of mouse embryonic stem cells into dopa-
minergic neurons has been repeatedly obtained
in different laboratories following two different
approaches. One involves the co-culture of ES
cells with stromal feeder cells (PA6, MS5) that fa-
cilitates the induction of the neural fate. Another
approach implies a five-stage method based on
the formation of a three-germ layer structure, the
embryoid body, from which neural cells can be
selected. In both protocols, neural progenitor cells

Intrastriatally grafted carotid body cells Carotid body cells in situ

Figura 3. Maintenance of carotid body glomus cell phenotype in situ (right) and several weeks after
intrastriatal transplantation (left). Immunocytochemical staining using anti tyroxine hydroxylase antibo-
dies (brown-yellow) and X-galactosidase (green). The X-gal signal indicates that the GDNF promoter is
active in these dopaminergic cells. See reference (29) for further details.

Clinical applications of cell therapy 63

can be expanded and induction to the midbrain
dopamine fate can be favoured by exposing the
cells to appropriate morphogenetic factors (31,
32). Neuronal differentiation is normally triggered
by mitogen withdrawal, and the dopaminergic
phenotype is normally demonstrated by identifi-
cation of the cells with markers such as tyrosine
hydroxylase and the dopamine transporter (Figu-
re 4). Embryonic stem cell-derived dopaminergic
neurons are normally obtained from established
ES cell lines, however, dopaminergic neurons have
also been derived from embryos obtained by nu-
clear transfer or from induced pluripotent stem
cells (iPSC).
Striatal transplantation of previously specified
midbrain ES cell-derived neural progenitors cells
has been reported to provide surviving dopa-
minergic neurons in the host brain and render
histological, neurochemical and behavioral re-
covery of hemiparkinsonian rats (33, 34) (Figu-
re 4). If ES cells are genetically manipulated to
overexpress the nurr-1 gene, dopaminergic neu-
ronal differentiation is markedly increased and,
subsequently, a higher yield of surviving dopa-
minergic neurons is achieved upon grafting (33).
One major drawback of ES cell-based therapy
is tumor generation, however this possibility is
greatly diminished with appropriate differentia-
tion procedures that eliminate all proliferative ES
cells from the transplanted preparation. Several
recent studies performed in non-human primate
and human ES cells have demonstrated the abili-
ty of these cells to differentiate into dopaminer-
gic neurons. However, survival of transplanted
dopaminergic neurons, an absence of prolifera-
tive cells in the grafts, and consistent behavioral
recovery are issues that seriously compromise
the clinical applicability of human ES cell-derived
neurons. Identification of key factors determi-
ning the survival of human ES cell-derived do-
paminergic neurons is an active field of research
for regenerative medicine (35).
Neural stem cells derived from fetal or adult
brain have been shown to differentiate into
dopaminergic neurons, although the yield is re-
64 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
latively poor due to their limited capacity for
proliferation and because of their preferential
glial differentiation. Different factors have been
used to increase the dopaminergic differentia-
tion of neural stem cells with relatively modest
success, although good results are beginning to
be reported by some laboratories (35b). Bone
marrow stromal cells and umbilical stem cells
are also attractive sources of multipotent stem/
progenitor cells, currently subjected to intense
research, that could eventually be used for au-
tologous transplants. However, the ability for do-
paminergic differentiation of these cells is quite
limited. Neural crest-derived progenitors have
also been recently described in the carotid body,
which permit the adaptive growth of this organ
in chronic hypoxia. In vitro, these progenitors can
differentiate to dopamine and GDNF producing
cells, hence they could be used for transplan-
tation studies in PD (35c). In summary, several
critical challenges need to be overcome befo-
re fetal, adult or autologous stem cells can be
brought into the clinical field to treat PD (35).
Transplantation of dopamine-
secreting cells. Clinical studies
General overview
Transplantation of dopamine-secreting cells in
advanced PD patients was initiated in the mid
1980s. A summary of the transplantation pro-
cedures, with indication of the donor tissue and
current status of the technique, is given in Table
1. Despite the highly variable clinical outcomes
of these studies, with excellent results reported
in selected patients but only modest effects in
most cases, the overall benefit experienced by
the patients stimulated further research and cli-
nical tests. Clinical trials resulting in a higher im-
pact have been those employing adrenal medu-
lla or mesencephalic neurons as donor tissues.
The first stereotaxic intrastriatal implantation
of autologous adrenal medulla on four patients
was performed, with modest results, by the Lund
group in 1985 (36). In 1987, a Mexican group re-
ported excellent clinical results (not confirmed
by others) after transplantation by open surgery
of adrenal tissue into a cavity made in the cauda-
te nucleus (37). These pioneer trials were soon
followed by numerous studies in several hospi-
tals all over the world. These studies differed in
the surgical approach (open versus stereotaxic)
as well as in the procedures followed for adre-
nalectomy and the treatment given to the cells
prior to transplantation. All studies performed
were open, with few patients (3 to 20) and wi-
thout blind evaluation. In most cases the clinical
efficacy of adrenal medulla autografts was very
modest with a lack of neurochemical improve-
ment based on positron emission tomography

A Embryonic stem cells Neural precursor cells Dopaminergic neurons

Oct-4 TH

Dapi

Grafting
1.000

500
Rotations

-500

-2 0 2 4 6 8 10
Weeks

Figura 4. In vitro differentiation of dopaminergic neurons from embryonic stem (ES) cells. A) Left, Colonies
of mouse ES cells. Undifferentiated state is proved by Oct-4 staining. Calibration bars: 100 m and 50 m,
in phase contrast and immunostaining, respectively. Center, Monolayer of ES cells-derived neural precur-
sors. Neural identity is proved by nestin staining on cells adopting typical rosette disposition. Calibration
bars: 100 m and 50 m, in phase contrast and immunostaining, respectively. Right, ES cells-derived dopa-
minergic neurons (tyroxine hydroxylase,TH +). Calibration bar: 100 m. 4-6-diamidino-2-phenylindole
(Dapi) shows nuclear counterstaining. B) Left. Photograph of the transplanted rat brain illustrating the
localization of the graft in the striatum. The inset shows the dopaminergic identity (TH+) of the ES cells-
derived grafted neurons. Calibration bars: 500 m and 200 m (inset). Right. Schematic representation
of the rotational behavior of hemiparkinsonian rats non-transplanted (red) and transplanted (green) with
ES cells-derived dopaminergic neurons. See further details in the text and reference (33).

Clinical applications of cell therapy 65

(PET). Postmortem analyses have demonstrated
an almost complete absence of chromaffin cells
at the transplanted sites. Several groups have
reported that the viability of adrenal medulla
grafts and their clinical efficacy increased if the
cells were treated with trophic factors or co-
transplanted with other tissues (i.e. peripheral
nerve) (38). The transplantation of adrenal tis-
sue to treat PD has, however, been abandoned
due among other factors to the relatively high
morbidity/mortality associated with the dual
(abdominal and cranial) surgery and the deve-
lopment of other therapeutic approaches. The
most compelling alternative to adrenal autogra-
fts is the transplantation of fetal mesencephalic
neurons (see below), a technology that has do-
minated the clinical trials on cell therapy applied
to PD patients for the last 15-20 years.
Transplantation of fetal mesencephalic
neurons
The first intrastriatal transplants of human
fetal mesencephalic tissue in PD patients were
carried out by the Lund group between 1989
and 1991, stimulated by the good results obtai-
ned with the same methodology in preclinical
studies . Since some patients treated with fetal
cells showed long lasting clinical improvement,
this methodology was extended to other labo-
ratories. In most cases the technique used was
the bilateral stereotaxic implantation of disper-
sed cells or tissue fragments in the caudate/
putamen. It is believed that this technique has
been applied in open trials to several hundred
patients although only about 50 have been ca-
refully evaluated in the scientific literature (see

Tabla 1. Transplantation procedures in patients with Parkinsons disease

Tissue Type of First Spread Level

transplantation1 report2 of the technique of development
& current status
Adrenal medulla Autologous (36) Worldwide Abandoned

Homologous (37) Single or few centers Abandoned

(human fetal)

Adrenal medulla & Autologous (38) Single or few centers Abandoned

peripheral nerve

Mesencephalic tissue Homologous (39) Worldwide Phase III studies3 in

(human fetal) progress

Heterologous (40) Single or few centers Phase III study3 in

(porcine embryonic) progress

Retinal pigment Homologous (post- (41) Single or few centers Phase III study3 in
epithelial cells mortem eye donors) progress

Carotid body cells Autologous (42) Single or few centers Phase II clinical and
PET study completed

Sympathetic ganglion Autologous (43) Single or few centers Open-label series

cells
1
Type of transplantation. Autologous: transplantation of tissue obtained from the same patient. Homologous: donor tissue obtained from other
individuals of the same species. Heterologous: donor tissue obtained from individuals of different species. 2 First report. Refers to the first full
publications of outcomes in patients. 3 Phase III studies refer to double-blind placebo-controlled trials.

66 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana

summary in Table 2). Although the transplanta-
tion methodology differs in the age and number
of donor fetuses, the preparation, storage and
dissociation of the tissue, and the protocol of
immunosuppression used, the clinical evaluation
of these patients has been more homogeneous
than in the case of adrenal transplants. Patient
evaluation was generally done with the Unified
Parkinsons Disease Rating Scale (UPDRS) and
most assays followed the Core Assessment Pro-
gram for Intracerebral Transplantations (CAPIT)
protocols (60). In the following sections we
summarize the clinical results and other rele-
vant features of the main open studies and of
the two double-blind, placebo-controlled, trials
completed in recent years.

Tabla 2. Methodology of the main open-label trials on human fetal mesencephalic transplants
(see clinical outcomes in the text)

Country Ref. n Donors Graft type/ Location IMS Clinic PET1 Necropsy2
(city) technique of implants al follow-
N.o per Age up
hemisphere

Sweden (39, 44) 2 3-4 7-9 w Cells C + P Unilateral 6m 18 m Yes () No

(Lund) Stereotaxic

(45-47) 2 3-4 6-7 w Cells P Unilateral 6m 3y Yes (++) No

Stereotaxic

(48) 23 3-4 6-8 w Cells C + P Bilateral 12 m 2y Yes (++) No

Stereotaxic

USA (49, 50) 7 1 7-8 w Cells or C + P Unilateral (2) 6 m (4) 4y Yes (+) (1) No
(Denver) strands of P Bilateral (5) No (3) () (6)
tissue/
Stereotaxic

USA (51) 4 1 7-11 w Tissue/ C Unilateral 6m 18 m Yes (+) (1) Yes (+/) (1)
(New Stereotaxic
Haven)

USA (52-54) 6 3-4 6-9 w Tissue/ P Bilateral (6-8 6m 2y Yes (++) Yes (+++) (2)
(Tampa/ Stereotaxic tracks/side)
New York/
Chicago)

France (55-57) 5 2-3 6-9 w Cells C + P Unilateral (4) 6m 1-3 y Yes (++) No
(Crteil) Stereotaxic P Unilateral (1)

Spain (58) 10 1 6-15 w Tissue/ C Unilateral Chronic 5y No No

(Madrid) Open
surgery

USA (59) 13 1 (6) 6-9 w Tissue/ P Bilateral 18 m 6m Yes No

(Los Angeles) 2 (7) Stereotaxic

Ref. (references): Publications where the results appeared. n: number of patients operated in the different trials. In other columns
the number of patients is given between parentheses. Location of implants: C: caudate. P: putamen. IMS: immunosuppression.
Other notations: w: weeks. m: months. y: years.
1
18F-dopa PET. Yes: at least some patients were studied. (): no significant changes; lesser (+) or greater (++) increase in 18F-
dopa uptake. 2 Necropsy. Yes: at least some patients were studied. Uncertain (+/-), minor (+), moderate (++), or major (+++)
graft survival and integration. 3 Two patients with MPTP-induced parkinsonism.

Clinical applications of cell therapy 67

Clinical outcome. Open studies
The main methodological features of the
open clinical studies performed with heterolo-
gous implantation of mesencephalic neurons in
PD patients are summarized in Table 2. In most
trials the patients (between 2 and 13) suffered
advanced PD with motor complications, and
one study included two cases of MPTP-induced
parkinsonism. The surgical procedures are varia-
ble, with uni- or bilateral caudate and /or puta-
minal implantations. The clinical follow-up of the
patients varied between 6 months and 5 years
and in most cases included neurochemical eva-
luation with [18F]-dopa PET analyses. Despite the
methodological differences, all studies reported
some degree of motor improvement in most

Tabla 3. Methodology of the two double-blind placebo-controlled studies

on human fetal mesencephalic transplants (see clinical outcomes in the text)

Double-blind placebo- Denver/New York Group (61) New York/Chicago/Tampa Group (62)
controlled trials

Patients Transplant group: 20 ( 60 yrs: 10; Transplant group: 23 (1 donor: 11; 4 donors: 12)
> 60: 10) Placebo group: 11
Placebo group: 20 ( 60 yrs.: 11; >
60: 9 )

Follow-up 1 year 2 years

Loss of follow-up 1 (transplant group) 3 (group not specified)

Primary outcome Subjective global self-rating of change Change in UPDRS III

(scale from -3 to +3)

Donors:
N.o/hemisphere 2 1 (11 patients); 4 (12 patients)
Age 7-8 weeks 6-9 weeks

Graft type Strands of tissue Fragments of tissue

(cultured up to 4 weeks) (stored in cool hibernation medium up to 2 days)

Surgical technique Stereotaxic (bilateral in one stage) Stereotaxic (bilateral in two stages)
2 twist-drill holes per side 1 burr hole per side

Location of implants Putamen bilateral (4 tracks per side; Posterior putamen bilateral (8 tracks per side;
tissue deposited continuously) 4 deposits per track)

Immunosuppression No Cyclosporine during 6 months

18
F-dopa PET One year after surgery: One and two years after surgery:
mean increase in uptake ( in 3 mean increase in uptake
patients) difference to placebo group
difference to placebo group trend to a greater increase in the 4 donors
no difference in 60 / > 60 years group
groups

Necropsy1 2 patients (> 60 years): ++ 2 patients (1 donor/side): ++

2 patients (4 donors/side): +++
III: motor sub-scale of the Unified Parkinsons Disease Rating Scale. 1 Necropsy. See footnote of Table 2.

68 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana

patients. In general, patients experienced an in-
crease in the on period and improvement of
symptoms, particularly rigidity and bradykinesia,
in the off period. On dyskinesias were re- tic improvement of advanced PD patients after
duced in some patients but increased in others
(see Complications below). The clinical bene-
fits of the transplants, perceived either imme-
diately or around 3-6 months after the surgery,
reached a peak at approximately 1-2 years af-
ter surgery and then progressively disappeared.
There are, however, reports of persistent clinical
improvements 5 to 10 years after transplanta-
tion. In the few open studies that included con-
trols the results reported are also quite distinct.
In the Los Angeles group study (Table 2) the
blinded evaluation of motor benefits was higher
in patients randomly assigned to receive more
tissue than a control group. However, the New
Haven group (Table 2) failed to see differences
between transplanted patients and a control
group of similar characteristics that received
only pharmacological treatment. In conclusion,
the open studies summarized in this section
represent hallmarks in the development of cell
therapy strategies to fight PD, although their
scientific value is limited because of the lack of
uniform analytical methodologies.
Clinical outcome. Double-blind studies
To progress in the evaluation of the clinical
applicability of fetal mesencephalic cell trans-
plantation in PD, two double-blind, placebo-
controlled studies have been performed in re-
cent years. These are the first controlled phase
III clinical trials ever done to test a cell therapy
strategy applied to a CNS disease. The major
methodological features of these studies are
summarized in Table 3. Patients were subjected
to stereotaxic bilateral implantation of fetal tis-
sue in the putamen. In the two trials a randomly
selected placebo group was subjected to sham
surgery consisting of craniectomy without du-
ramater perforation. Both the patients and the
clinical evaluators were unaware of the type of
treatment (either placebo or transplant) fetal mesencephalic tissue, the procedure was, in
applied to each case. All patients were evalua-
ted pre- and post-surgically with [18F]-dopa PET
scans. The major objective of the studies was
the precise evaluation of actual symptoma-
transplantation. The trial of the Denver/New
York group (61) placed special emphasis on the
effect of patient age on the clinical outcome,
whereas the New York/Chicago/Tampa group
(62) focused on the clinical effects of transplan-
tation of different amounts of tissue.
In the Denver/New York trial transplanted pa-
tients showed a statistically significant improve-
ment of 18% in the UPDRS III scale in off with
respect to the placebo group one year after sur-
gery. This improvement, affecting mainly rigidity
and bradykinesia, was due to the marked effect
of the transplants on patients below 60 years
of age (34% average improvement). The clini-
cal benefit appeared during the first 4 months
and was maintained in open evaluations for up
3 years. More recent analysis of this patient co-
hort has suggested that the best prognostic fac-
tor was responsiveness to levodopa rather than
patients age. Fetal cell transplantation did not
induce significant changes in the diary of fluc-
tuations, levodopa dose or cognitive function. In
the New York/Chicago/Tampa trial no statistica-
lly significant clinical differences in the UPDRS III
scale in off were observed between patients
of the transplanted and placebo groups two
years after surgery. There was, however, a trend
towards a clinical amelioration proportional to
the amount of tissue transplanted. Patients with
UPDRS III < 49 who received a larger amount
of tissue showed a statistically significant clinical
recovery with respect to the placebo controls.
In this last subgroup, the clinical effects were
perceived around three months after the sur-
gery and reached a peak around 6-12 months.
There were no significant changes in the diary
of fluctuations or the levodopa dose.
Complications
In most of the transplantation trials done with
general, well tolerated although some complica-
Clinical applications of cell therapy 69
tions associated with the cranial surgery were
reported. Intracerebral hemorrhages, epileptic
seizures, or postsurgical confusional syndromes
were the most frequent complications, normally
resolved after a few days of treatment. In one
case, patient death by hydrocephaly was repor-
ted due to migration of the transplanted tissue
to the fourth ventricle. In some patients trans-
planted with homologous fetal tissue, the ad-
ministration of immunosuppressants has been
associated with renal dysfunction or nosoco-
mial infections. Besides these complications, the
placebo-controlled studies have reported the
appearance in some transplanted patients of
severe and persistent dyskinesias (characterized
by stereotyped abnormal movements of the
limbs) during the off periods. In the Denver/
New York study this complication affected 15%
of the patients (younger than 65 years) that had
experienced clinical improvement. In the New
York/Chicago/Tampa trial, dyskinesias appeared
in more than 50% of the patients and were par-
ticularly severe in three cases. The off dyski-
nesias have been suggested to originate from
an excess of dopamine released from the trans-
plant. However, no correlation between the
severity of the dyskinesias and the amount of
tissue transplanted or [18F]-dopa uptake in PET
studies (see below) has been reported. It has
been suggested that the dyskinesias reflect the
anomalous innervation of striatal cells by the
transplanted neurons, however it cannot be dis-
counted that they are generated by other varia-
bles (i.e. tissue preparation) different from those
in previous open studies.
Neurochemical and histological data
The open trials testing the effect of fetal
neuronal transplants have generally included
the monitoring of striatal dopamine content
using [18F]-dopa PET scans (see Tables 2 and
3). Dopa (a dopamine precursor) is taken up
by the dopamine transporter in the nigrostria-
tal presynaptic terminals (Figure 1), as well as
in the soma and neurites of the transplanted
dopaminergic neurons. Therefore accumula-
70 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
tion of the marker (which results in a higher
amount of emitted radiation) provides an in-
dication of striatal dopaminergic innervation.
Practically all the studies performed have re-
ported an increase of [18F]-dopa uptake in the
transplanted area at one-year follow-up. In
one study synaptic release of dopamine in the
transplant was demonstrated by neuroimaging
using [11]C-raclopride, a drug that competes
with dopamine for binding to postsynaptic D2
receptors (63). In the two double blind-studies
[18F]-dopa uptake one year after the surgery
was significantly higher in the transplanted pa-
tients in comparison with the placebo group.
Thus, the neuroimaging data suggest that fetal
mesencephalic grafts survive for several years
after transplantation and remain neurochemi-
cally and functionally active.
In patients that died during the studies (gene-
rally for causes not related to the transplantation
procedure) and were subjected to necropsy, the
direct histological examination of the striatum
normally confirmed the in vivo PET data. The-
se postmortem histological analyses have also
demonstrated that the surviving dopaminergic
neurons account for less than 5% of the several
hundreds or millions initially transplanted, which
suggests a marked mortality of donor cells du-
ring the transplantation procedure.
Current status of the methodology
and future developments
After almost 20 years of intense research,
the applicability of fetal mesencephalic tissue
for treatment of advanced PD is being se-
riously questioned. Besides the limitations of
this methodology already recognized in the
open studies (scarcity of donor tissue and poor
cell viability), the double-blind studies have sug-
gested that the successful implantation of do-
paminergic cells in the striatum is not sufficient
to induce significant clinical amelioration of
symptoms. The scarcity of donor tissue (seve-
ral fetuses per patient) is heightened by ethical
and legal concerns regarding the use of human
embryonic material. Additionally, the dissection
and manipulation of fetal mesencephalic tissue
is technically difficult and results in a mixture
of different neural populations with a high in-
cidence of cell death. The numerous attempts
to minimize these limitations have included the
treatment of cells with neurotrophic factors
or antioxidants as well as the use of porcine
mesencephalic tissue. Although both appro-
aches have been tested in experimental animal
models as well as in open clinical studies with
some positive results, they have not provided
clear improvement with respect to the trials
utilizing human tissue. Porcine xenographs (40)
have been virtually abandoned because of the
danger of interspecies infections, although a
phase III clinical trial is in progress.
A major limitation of fetal mesencephalic tis-
sue transplantation is the relatively poor clinical
effect of this procedure despite the fact that the
grafted dopaminergic cells remain neurochemi-
cally active. Therefore, it seems that the de novo
formation of an ectopic SN in the striatum (the
result of intrastriatal dopaminergic neuronal
grafts) is not sufficient to ameliorate PD patient
symptoms. In contrast, it seems that an excess
of dopamine or the establishment of aberrant
synaptic connections between the transplanted
cells and striatal neurons, might lead to severe
motor complications that, in terms of patients
life quality can be even worse than the manifes-
tation of the disease.
The limitations and complications derived
from the use of fetal mesencephalic tissue have
led to the conclusion that, in its current state,
this procedure, although conceptually pionee-
ring in the field, is not an advisable therapeutic
option for PD. Moreover, the double-blind pla-
cebo-controlled studies on fetal mesencepha-
lic transplantation suggest that dopamine cell
replacement in the striatum is not the ideal
approach to compensate for the progressive
nigrostriatal neuronal loss. Given this scenario,
the clinical applicability of other transplantation
procedures based on a similar rationale (e.g.,
intrastriatal grafting of porcine mesencepha-
lic neurons or stem cell-derived dopaminer-
gic neurons) is, for the moment, uncertain. It
is generally believed that other cell types and
methodologies, capable of delivering locally
the proper cocktail of trophic factors, might be
more effective in protecting the dopaminergic
nigrostriatal neurons from whatever insults
cause PD and to arrest or even reverse the
neurodegenerative process.
Recent pilot studies with other tissues
In recent years there have been numerous
attempts to evaluate the potential applicability
of dopamine-producing cells other than fetal
mesencephalic neurons for transplantation in
PD. In the context of this chapter the studies
done with carotid body (CB) and retinal cells
are particularly relevant since they have been
transferred from animal models to PD patients.
Transplantation of carotid body tissue
As described above, the CB is an organ com-
posed of highly dopaminergic glomus cells who-
se efficacy for antiparkinsonian cell therapy has
been tested in animal models of PD (15, 27). A
priori, a major advantage of the CB with respect
to fetal mesencephalic neurons is that the for-
mer can be used for autotransplantation since
its unilateral surgical resection has no significant
side effects (42), thus circumventing most of the
limitations of fetal transplants. Intrastriatal CB
grafts can induce notable behavioral ameliora-
tion in parkinsonian rats and monkeys due not
only to increase of the intrastriatal dopamine
level but also to a trophic effect of the trans-
plant on the dopaminergic nigrostriatal neurons
(28). In fact, CB glomus cells are among those
with the highest GDNF content in adult rodents
(29). The favorable results in preclinical studies
stimulated the execution of two pilot phase I/II
open trials to test the feasibility, safety and clini-
cal efficacy of CB autotrasplantation in PD. The
experimental protocol in these studies con-
sisted of the unilateral removal of the CB and
the preparation of cell aggregates, which were
bilaterally deposited at the putamen through
a stereotaxic needle (42) (Figure 5). Typically,
Clinical applications of cell therapy 71
about 150-200 aggregates, with approximately
200 cells each, were obtained from a human CB
and, therefore the total number of cells trans-
planted was around 15,000-20,000 on each side
of the brain.
In the first CB trial, 5 of 6 PD patients showed
amelioration of the UPDRS III scale in off pe-
riods when blindly evaluated by an independent
neurologist using masked video recordings (42).
Clinical improvement was between 26-74% and
13-52% at 6 and 12 months of follow-up, res-
pectively. The patient that did not receive any
benefit from the implantation had a fibrous ca-
rotid body with major absence of dopaminergic
glomus cells. In the long term a trend towards
the presurgical clinical status was observed,
although 3 patients still maintained a measura-
ble motor improvement (15-48%) 36 months
after transplantation. A patient of this sub-study
who, for technical reasons, only received cells
in one side of the brain (although the needle
tracts were done bilaterally), showed clinical im-
provement only in the side contralateral to the
transplant. The clinical evolution of the patients
in the second sub-study performed by the same
group was essentially similar to that described
above (64). Patients of the second sub-study
were subjected to [18F]-dopa PET scans before

A C

CS

CgS

Cd
1 mm

B Th LS
Pt

SNc STS
Cd
SNc
DG

250 m

Figura 5. Intraputaminal stereotaxic transplantation of dopaminergic cells in Parkinson disease patients.

A) Carotid body resected from a parkinsonian patient after it was cleaned of surrounding connective
tissue. B) Carotid body cells aggregates transplanted through a stereotaxic needle as illustrated in C. Pt,
putamen, Cd, caudate nucleus; Th, thalamus; SNc, substantia nigra pars compacta; SNr, substantia nigra
pars reticulata. See reference (42) for further details.

72 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana

and 1 year after transplantation. This neuroche-
mical analysis showed a non-significant 5% in-
crease in mean putaminal [18F]-dopa uptake but
there was a significant inverse relationship bet-
ween clinical amelioration and annual decline in
putaminal [18F]-dopa uptake. Complications of
CB grafting are similar to those reported for
other intracerebral transplantation procedures.
However, carotid body grafted patients, unlike
those subjected to fetal transplantation, do not
seem to develop off-period dyskinesias, which
might be related to the fact that they received a
much lower number of dopaminergic cells and
that the main effect of CB transplants is to sti-
mulate intrinsic dopaminergic striatal reinnerva-
tion (42, 64).
The pilot studies performed have indicated
that CB autotransplantation is a feasible and
safe procedure with potential clinical applicabi-
lity to treat PD patients. In addition, CB grafting
has demonstrated similar symptomatic efficacy
as the placebo-controlled mesencephalic grafts.
The beneficial effect of CB grafts is higher in
young patients with a well-preserved CB and
in individuals with a less severe disease. Altoge-
ther, these studies suggest that the clinical im-
provement observed after CB transplantation,
although modest, derive from a true neuropro-
tective effect of the transplanted glomus cells on
the nigrostriatal pathway. Nevertheless, at pre-
sent, CB autotransplantation is not a methodo-
logy ready to be evaluated in large controlled
phase III trials until the characteristics of suitable
candidates and the objectives of the therapy
are clearly defined, and the origin and quanti-
ty of donor tissue are determined. Although
autotransplantation is conceptually attractive,
the amount of tissue obtained from a single CB
appears to be smaller than that needed to ob-
tain significant clinical benefit consistently. The in
vitro expansion of CB tissue using either con-
ditionally immortalized glomus cells or their di-
fferentiation from multipotent precursors (35c),
provides possible therapeutic strategies that will
surely be explored in future work.
Transplantation of retinal cells
The retinal pigment epithelium contains do-
paminergic cells whose suitability for transplan-
tation studies has recently been tested in animal
models of PD (26, 41). Good results in precli-
nical experiments led to the execution of an
open pilot study in six patients with advanced
PD. About 300,000 human pigment cells atta-
ched to gelatine microcarriers were grafted, wi-
thout immunosuppression, into the most affec-
ted putamen of each patient. All subjects were
reported to have a clear improvement in the
UPDRS III motor scale in off periods that was
initiated during the first month of the surgery
and improved subsequently. Average reduction
of the UPDRS III score with respect to the basal
value was 48% at 12 months. No major compli-
cations or dyskinesias have been reported (65).
Therefore, allografts of retinal pigment epithe-
lial cells seem to be well tolerated and clinically
effective in PD patients. The mechanism of ac-
tion of these transplants is unknown, although a
recent study has proposed that, as for CB cells,
retinal cells could also release trophic factors
to support nigrostriatal neurons (66). This me-
thodology is being evaluated in a double blind,
placebo-controlled study currently in progress
(Table 1).
Administration of trophic fac-
tors (GDNF delivery)
Neurotrophic factors are substances (gene-
rally proteins or peptides) that, among other
functions, regulate the differentiation and main-
tenance of neuronal phenotype. These factors
also protect neurons against cell death by apop-
tosis and/or exogenous pathological insults.
Numerous studies both in vivo and in vitro have
shown that mesencephalic dopaminergic neu-
rons are sensitive to a variety of trophic factors
including the glial cell line-derived neurotrophic
factor (GDNF), brain-derived neurotrophic fac-
tor, neurotrophin 4, insulin-like growth factor,
fibroblast growth factor and platelet-derived
Clinical applications of cell therapy 73
growth factor, among others. GDNF has con-
sistently shown to exert the strongest and most
selective in vitro and in vivo trophic actions on
nigrostriatal dopaminergic cells (67). In animal
models of PD, GDNF can prevent neuronal de-
generation and restore the striatal dopaminer-
gic function (19b, 68-70). Depletion of GDNF
has been found in the SN of human PD brains,
which may constitute an additional pathogenic
mechanism of the disease.
Although all the precedents summarized in
the previous paragraph suggest that GDNF ad-
ministration might be a valuable neuroprotec-
tive and neurorestorative therapy for PD, the
method of GDNF delivery into the striatum has
become a critical issue, since GDNF does not
cross the blood-brain barrier, diffuses poorly in
the extracellular environment and is easily des-
troyed by proteases. Different methods of direct
administration have been experimentally tested,
including intermittent injections, continuous
infusion, and implantation of GDNF-releasing
biodegradable microspheres (71). Intraventri-
cular or intraputaminal GDNF administration
has been reported to promote structural and
functional recovery in advanced parkinsonian
monkeys (70). However, in a controlled clinical
trial, monthly intraventricular administration of
GDNF failed to provide clinical benefit in ad-
vanced PD patients but resulted in frequent ad-
verse events (72). A post-mortem examination
in one patient suggested that GDNF did not
reach the target cells via this route. The safety
and clinical effects of a continuous intraputami-
nal GDNF infusion have been evaluated in two
open-label trials. An initial trial of a British group
on five PD patients reported encouraging clini-
cal outcomes at one year, while [18F]-dopa PET
studies showed an increase in putaminal uptake
around the tip of each catheter (73). A second
American study on 10 patients using a different
delivery protocol also reported positive results
at six months (74). However, a randomized pla-
cebo-controlled trial involving 34 PD patients
showed no significant clinical differences bet-
74 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
ween groups at six months, despite increased
[18F]-dopa uptake in the recombinant GDNF-
treated group (75). The open-label extension of
this study was halted due to safety concerns:
three patients developed neutralizing antibo-
dies, which could potentially cross-react with
endogenous GDNF, while in a parallel toxico-
logy study some monkeys developed cerebellar
damage.
In this context, research interest has focused
on other indirect methods of GDNF delivery,
such as cell therapy, i.e. the intrastriatal grafting
of GDNF-producing cells (CB or genetically
modified cells), and in vivo gene therapy using
GDNF-encoding viral vectors (71). CB cells
have already been tested in PD patients with
good results in less-affected and younger pa-
tients, this finding being compatible with the tro-
phic action of the grafted tissue. Besides GDNF,
CB glomus cells also produce BDNF and other
factors, so they could supply damaged neurons
with the appropriate cocktail of trophic factors
to encourage nigrostriatal regeneration. Despi-
te these stimulating results, the use of CB or
other cell types to deliver trophic factors in PD
patients is still under debate and experimental
evaluation.
Cell therapy in other CNS
disorders
Huntingtons disease
Huntingtons disease (HD) is a dominantly
inherited neurodegenerative disorder caused
by a polyglutamine expansion in the gene en-
coding the huntingtin protein. Its pathological
hallmark is the preferential loss of medium
size spiny GABAergic neurons in the striatum,
although degeneration progressively extends to
the cortex and other brain regions.The function
of huntingtin is unknown and the pathogenesis
of HD remains obscure. The disease is clinically
characterized by movement disorders (mainly
chorea), dementia and behavioral disturbances,
leading to progressive disability and death. The
relatively selective striatal damage at early sta-
ges of HD made this disease a potential target
for cell therapy shortly after the initial experi-
mental work on PD. Animal (normally rodents)
models of HD are obtained by striatal neural
death-induction either with excitotoxic drugs or
after metabolic poisoning. There also transgenic
mouse models of HD expressing poliglutamine
repeat expansions. Numerous preclinical stu-
dies have demonstrated that transplants of fe-
tal striatal cells survive in the host striatum and
induce reversion of the motor and behavioral
abnormalities. More recently, other donor tis-
sues, such as neural progenitor cells, pre-diffe-
rentiated GABAergic neurons obtained from a
neural stem cell line, or several types of trophic
factor-producing cells, have also been assayed in
rodent HD models (76).
Transplantation of human fetal striatal tissue
has been undertaken in a few open clinical trials
each involving each 4-7 mild to moderate HD
patients. A Core Assessment Program for In-
tracerebral Transplantation in HD (CAPIT-HD)
has been developed in order to standardize
the study protocols. Some bilaterally transplan-
ted patients had small improvements in clinical
measures at one-year, which correlated with an
increase in the striatal and cortical metabolic
activity measured by PET. One autopsy study
performed 18 months after transplantation de-
monstrated surviving grafted cells innervated by
host-derived dopaminergic fibers (77). However,
in the long-term follow-up, a progressive clinical
and PET decline has been consistently observed
(78). Porcine xenografts have also been tried in
12 HD patients, with no change in functional
capacity one year after unilateral transplantation
(79). Although improvements in transplantation
procedures and patient selection could lead to
better outcomes, striatal cell replacement alone
seems unlikely to induce a long-lasting benefit
taking into account the progressive and exten-
sive nature of neurodegeneration in HD. In this
context, other strategies aiming to exert a neu-
roprotective effect on damaged neurons should
be further developed.
Amyotrophic lateral sclerosis
Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a de-
vastating disease characterized by progressive
upper (cortical) and lower (spinal) motor neu-
ron degeneration.The absence of disease-modi-
fying therapies has prompted experimental and
clinical research on cell therapy. Although the
etiopathogeny of ALS is unknown it seems that
alteration of redox regulation both in neurons
and astrocytes is a major cause of the disease.
In a minority of cases the disease is familial due
to a mutation (G93A) in the Cu-Zn superoxide
dismutase (SOD1), and overexpression of the
mutant human SOD1 in transgenic mice results
in a syndrome that resembles human ALS. Using
this animal model, several cell-replacement and/
or neuroprotective strategies have been tested
(80). Potential benefits have been advocated
after transplantation into the spinal cord of
hNT cells (derived from a human teratocarci-
noma cell line), bone marrow cells, Sertoli cells,
neural precursor cells, astrocytes derived from
embryonic stem cells, or different genetically
modified cells to produce trophic factors. Intra-
venous administration of human umbilical cord
blood mononuclear cells has also been tried in
rodents with promising results.
Some cell therapy strategies have been assa-
yed on ALS patients in small phase I-II clinical
trials: twelve subjects were subjected to intra-
thecal implantation of encapsulated genetically
engineered baby hamster kidney cells releasing
human ciliary neurotrophic factor (81), and se-
ven patients participated in a study on intraspinal
cord implantation of autologous mesenchymal
stem cells (82). Although preliminary results of
the later study might be encouraging, the wides-
pread nature of cell death in ALS (involving the
spinal cord, brainstem and cortex) is a daunting
Clinical applications of cell therapy 75
challenge for focal cell replacement strategies.
On the other hand, diffuse trophic factor deli-
very from glial cells or combined approaches
(cell replacement plus growth factor delivery)
may show promise in modifying the course of
the disease.
Currently, numerous cell-based therapies for
ALS are being performed in institutions outsi-
de the academic environment without sufficient
scientific knowledge or medical control. The cli-
nical outcome of these operations is not well
documented and therefore there is urgent need
of phase III (double-blind and placebo-contro-
lled) studies to clarify the actual efficacy of cell
therapy in ALS.
Spinal cord injury
In recent years cell-based therapies have
been intensely studied to ascertain whether
they exert favorable effects on traumatic spinal
cord injury (SCI). Several groups have repor-
ted excellent results in animal models and some
pilot clinical studies are being performed. The
experimental strategies designed for cell thera-
py in SCI vary depending on the nature of the
lesion (complete or incomplete), and whether
the treatment is applied few hours/days (acute)
or weeks/months (chronic) after the lesion. In
the case of complete spinal cord lesions the ul-
timate goal is to induce neuronal regeneration,
a challenging but as yet unreachable scenario
that is worth pursuing since it is expected that
a significant functional recovery could be obtai-
ned even if only 1% of the severed axons are
replaced or regenerated. In incomplete spinal
cord lesions the functional failure is derived in
part from axons partially damaged by contu-
sion, edema, or ischemia. In these cases neuro-
protective measures can help to obtain axonal
re-myelinization and sprouting.
A variety of cell types tested in animal models
of SCI have shown considerable therapeutic
potential after intraspinal transplantation or fo-
llowing administration by other routes, such as
76 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
intravascular, intraventricular or intrathecal (83).
Schwann cells have been transplanted into spi-
nal cord animal models based on the regene-
rative capacity of this cell type observed in the
peripheral nervous system. Similarly, olfactory
ensheathing glia, a specialized form of glial cell
able to promote regeneration of axons in the
olfactory nerve, have been tested, with some
success, for regeneration in spinal cord injuries
(84). Neural progenitor cells have been implan-
ted in spinal cord animal models yielding beha-
vioral recovery presumably due to neurogenesis
and synaptogenesis from the transplanted cell
preparation or from donor-host humoral inte-
ractions that may support regeneration of host
axons. Most of the effects exerted by either
neural or stem cell-derived progenitors appear
to be due to their preferential differentiation
to oligodendrocytes or astrocytes. In fact oligo-
dendrocytes derived from human embryonic
stem cells have also been reported to myelinate
axon in foci of contused spinal cords. An enti-
rely different approach relies on the capacity of
endogenous mesenchymal or immune cells to
provide axonal regeneration. With this objective
appropriately activated macrophages have been
shown to provide functional recovery.
Regarding the clinical application of cell the-
rapy in SCI, several small phase I-II pilot studies
using various cells types have shown promising
but inconclusive results. Twenty patients with
acute (n = 7) or chronic (n = 13) SCI recei-
ved autologous bone marrow transplantation
by intra-arterial (via catheterization of a. ver-
tebralis) or intravenous route, with promising
results in the acute phase (up to 1 month after
injury) (85). Eight patients were subjected to
intraspinal injection of incubated autologous
macrophages within 14 days of injury, three
of whom achieved neurological improvement
(86). For the purpose of clinical applicability
a number of groups have demonstrated the
production of olfactory ensheathing glial cells
(OECs) by tissue culture of the olfactory epi-
thelium obtained from biopsy samples of the
upper nasal lining. Others have used OECs
obtained from fetuses or cadavers. An initial
published clinical trial has shown no adverse
effects one year after transplanting autologous
cultured mucosal OECs into spinal injuries
(87). Two other neurosurgical teams (one in
Beijing and another in Lisbon), have adopted
transplantation of olfactory tissue as a clinical
procedure for treating patients with SCI. The
results from these groups are uncertain, not
well documented, and criticized by part of the
scientific community (84, 88). Apart from press
commentaries, no real breakthroughs in clini-
cal achievements have been proved. Therefore,
validation of these and other procedures must
await the outcomes of independent randomi-
zed double-blind controlled trials that will su-
rely be performed in the near future.
Stroke
Among neurological disorders, stroke re-
presents a leading cause of death and disabi-
lity in developed countries and despite inten-
se research only a few options exist for the
treatment of stroke-related infarction of brain
tissue. Numerous preclinical experimental stu-
dies on cell therapy have been performed in
rodent models of stroke (endothelin-induced
transient middle cerebral artery occlusion or
collagenase-induced intracerebral hemorrha-
ge), which include direct grafting of cells in the
infarcted area or surroundings as well as intra-
ventricular, subarachnoidal, intra-arterial or in-
travenous cell administration. Among the cells
tested are adult stem cells from bone marrow,
umbilical cord and neural or adipose tissue,
as well as embryonic stem cell-derived neu-
ral (neurons and glial) cells. Some studies have
used engineered neural stem cells to produce
angiogenic factors (VEGF and others) as well
as the GDNF-secreting CB cells. In experimen-
tal stroke, cell therapy can partly reverse some
behavioral deficits. However, the underlying
mechanisms remain unknown as most studies
reveal little, if any, evidence for neuronal repla-
cement and the observed behavioral improve-
ments appeared to be related more to a graft-
derived induction of a positive response in the
remaining host tissue than to cell replacement
by the graft itself (89-91).
From a clinical standpoint the information
available pertains only to a few pilot studies
performed on a small patient cohort. The group
of Pittsburgh pioneered the clinical application
of cell therapy for stroke by performing stereo-
taxic implantation of human neuronal cell lines
with promising results. However, a controlled
randomized trial by the same group in patients
with ischemic or hemorrhagic subcortical mo-
tor strokes (treatment n = 14; control n = 4)
failed to show significant benefit in the primary
outcome measure (92). A study based on trans-
plantation of fetal porcine cells was terminated
by the USA Food and Drug Administration
after the inclusion of five patients. Autologous
mesenchymal stem cell transplantation by intra-
venous infusion, which appear to migrate to the
site of the lesion, has also been tested in some
clinical trials. One of the most representative
studies is that performed by Bang et al. (93) on
five stroke patients and 25 controls. In this trial
the treated group achieved a better functional
outcome at six months compared with controls.
As indicated above, both the mechanisms of ac-
tion of transplanted cells and their actual clinical
efficacy are still undetermined. Cell therapy in
stroke is a promising experimental approach
but for the moment not a realistic therapeutic
option.
Other diseases
Besides the preclinical and clinical studies
already discussed, cell-based neuroregenerati-
ve or protective therapies have been assayed
in several other neurological disorders. Neural
precursor cell transplantation has been shown
to attenuate the severity of experimental au-
toimmune encephalomyelitis, an animal model
Clinical applications of cell therapy 77
of multiple sclerosis. Intraventricular transplan-
ted cells migrated along white matter tracts and
seemed to down-regulate the acute inflamma-
tory process and reduce axonal injury (94). A
different procedure, autologous hematopoie-
tic stem cell transplantation, has been used to
treat patients with severe multiple sclerosis. In
a series of 178 patients, 63% were reported to
have neurological improvement or stabilization
at a median of 41.7 months after transplanta-
tion (95). However, a recent autopsy study on
five patients who received this transplant found
evidence for ongoing demyelination and neuro-
degeneration.
Hematopoietic stem cell transplantation, in-
cluding umbilical cord blood transplantation, is
being currently under consideration as a pos-
sible therapy in young patients with storage
diseases such as mucopolysaccharidosis, muco-
lipidosis, leukodystrophies, Krabbe disease, Tay-
Sachs disease or neuronal ceroid lipofuscinosis.
Intracranial transplantation of neural stem cells
has recently shown striking beneficial effects in a
mouse model of Sandhoff disease, a lethal gan-
gliosidosis (96). However, further basic research
in these areas is needed before the experimen-
tal data warrant the translation to patients of
safe procedures with reasonable and well-de-
monstrated clinical efficacy.
Conclusions
and perspectives
Although neuroregeneration and neurorepair
are concepts and goals intimately associated with
the development of modern neuroscience, it is
only in the last 25 years that experimental and
clinical studies have systematically addressed the
possibility of neural reparation by means of cell
therapy. Diseases of the brain and spinal cord
represent especially daunting challenges for cell-
based strategies of repair, given the multiplicity
of cell types within the adult central nervous
78 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
system, and the precision with which they must
interact in both space and time. Nonetheless, a
number of diseases are, in principle, especially
appropriate for cell-based therapy, in particular
those in which single phenotypes are lost, and in
which the re-establishment of vectorially speci-
fic connections is not entirely requisite for the-
rapeutic benefit. In recent years, the preclinical
and clinical studies on Parkinsons disease initia-
ted in the 1980s have been extended to other
neurological diseases, such as Huntingtons di-
sease, amyotrophic lateral sclerosis, stroke, and
spinal cord injury, among others.
Originally, the goal of cell therapy was the
restoration of function by replacement of dead
cells with healthy ones. However, in most recent
studies the primary interest has shifted from cell
replacement to neuroprotection, in the hope
that application of the proper cocktail of trophic
factors released from cells grafted at the injured
sites or administered systemically would either
prevent neuronal damage or activate intrinsic
regenerative mechanisms leading to restoration
of the destroyed neurons or synaptic connec-
tions. The discovery of neurogenic centers in
the adult brain (in the subventricular zone of the
lateral ventricles and the dentate gyrus of the
hippocampus) has stimulated research on the
potential therapeutic applicability of pre-existing
neuronal precursors, which under appropriate
conditions could migrate and differentiate to
replace destroyed cells in other parts of the
brain. This possibility is, however, speculative and
only based on preliminary experimental ob-
servations. Recently, much attention has been
focused on the relevance of hippocampal neu-
rogenesis to the pathophysiology and treatment
of mood disorders. Indeed all major pharmaco-
logical and non-pharmacological treatments for
depression enhance hippocampal neurogenesis
and suppressing hippocampal neurogenesis in
mice blocks behavioral responses in some anti-
depressant-sensitive tests.
Neurologic cell-based therapies have been
also much influenced by the development of
embryonic stem (ES) cell research, as these cells
have the potential to give rise in vitro to any cell
type of the adult organism. ES or iPS cells are
generally thought to offer a promising source of
neurons suitable for cell replacement therapy in
Parkinsons disease and other disorders. Most
investigators in the field are, however, aware
that translation of ES/iPS cells to the clinical
setting is confronted with numerous limitations
and unsolved problems. Differentiation of ES/
iPS cells to mature neurons is still not well con-
trolled and therefore the possibility of tumor
generation is high. In addition, the short lasting
viability of neurons derived from human ES(iPS
cells compromises their use in cell therapy. ES/
iPS cell-derived neuronal types may not possess
the complete set of phenotypic features of their
in vivo counterparts, which may contribute to
the limited success of these cells in repairing
injured or diseased brain and spinal cord in ani-
mal models. Hence, efficient generation of neu-
ral subtypes with correct phenotype remains a
challenge. Consequently, major hurdles still lie
ahead in applying human ES/iPS cell-derived
neural cells clinically.
Although cell therapy constitutes an actively
progressing research field, it is also the subject
of numerous criticisms and concerns. The scien-
tific and technical advances being made are qui-
te heterogeneous and erratic, as in many cases
transplantation studies are performed without a
precise knowledge of the putative therapeutic
products released by the cells, their mechanisms
of action, or even the type of cell transplanted.
Moreover, together with well-controlled pilot
clinical trials being performed in academic re-
search environments, there are institutions offe-
ring cell-based therapies to heavily deteriorated
patients without having performed the neces-
sary scientific preclinical studies and methodo-
logical (safety and feasibility) tests. In conclusion,
neurologic cell-based therapies still remain a
promise rather that a reality, and effective clinical
translation in this area will necessarily require a
period of sustained and solid basic research.
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Clinical applications of cell therapy 83
 6 Avances de la terapia gnica
en el tratamiento
de enfermedades monognicas
Juan A. Bueren
Divisin de Hematopoyesis y Terapia Gnica
CIEMAT y CIBER de Enfermedades Raras
Introduccin
Los avances en el campo de la gentica
molecular estn teniendo una importante
repercusin en nuestra capacidad para com-
prender, diagnosticar y tratar variedad de
enfermedades congnitas y adquiridas. As, la
posibilidad de introducir genes en clulas eu-
cariotas ha permitido comenzar nuevos pro-
tocolos de marcado y de terapia gnica (TG)
humana que no resultaban abordables hace
unos pocos aos.
Tal como se muestra en la figura 1, la TG pue-
de realizarse por medio de dos aproximaciones
diferentes. La primera, denominada terapia g-
nica de adicin, se basa en la insercin del gen
Terapia de adiccin
Insercin gnica
Alta eficacia de insercin
Insercin gnica homo o heterloga
Limitaciones de regulacin
Aplicable en terapia humana
Figura 1. Modalidades bsicas de terapia gnica.
84 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
teraputico bajo el control de secuencias pro-
motoras y potenciadoras de la expresin gnica;
todos los protocolos de TG que actualmente se
realizan en la clnica utilizan esta aproximacin.
La segunda, conocida cmo terapia de susti-
tucin, tiene por objeto la sustitucin del gen
afectado por la versin correcta del mismo gen.
En ella, el gen introducido se encontrara en su
entorno natural y, por tanto, bajo el control de
los sistemas fisiolgicos que regulan su expre-
sin. Debido la baja eficacia de recombinacin
homloga actualmente conseguida en clulas
eucariotas, esta aproximacin todava no se en-
cuentra en fase de aplicacin clnica.
Desde el punto de vista prctico, la TG puede
realizarse tanto in vivo (inoculando el vector de
Terapia de sustitucin
Recombinacin homloga
Baja eficacia de recombinacin
Precisa reparacin gnica
ptima regulacin de expresin
No implantado en terapia humana
transferencia en el paciente) como in vitro. En este
caso, la transferencia gnica se realiza sobre clulas
extradas del paciente, las cuales, una vez modifica-
das genticamente, son reinfundidas en l.
En general, los vectores de transferencia g-
nica presentan una eficacia de transduccin
notablemente superior cuando se utilizan in
vitro sobre las clulas diana a transducir frente
a cuando se inoculan in vivo. En una serie de
ensayos clnicos, no obstante, se utilizan proto-
colos de TG in vivo, en los cuales los vectores de
transferencia gnica se introducen por va sist-
mica o en los tejidos del paciente afectados por
la enfermedad (fig. 2).
La revista Journal of Gene Medicine (http://www.
abedia.com/wiley/index.html) ha reportado que
hasta junio de 2010 se haban puesto en marcha
un total de 1.644 ensayos clnicos de TG. Aunque
la mayor parte de estos protocolos han tenido
Terapia gnica ex vivo
Medidas modificadas genticamente
Tipos de medicamentos gnicos
Figura 2. Modalidades bsicas de terapia gnica.
Avances de la terapia gnica en el tratamiento de enfermedades monognicas
como objeto el tratamiento del cncer (64,5%),
los resultados ms significativos han estado re-
lacionados con el tratamiento de enfermedades
monognicas. Tal como puede observarse en la
figura 3, de todos los vectores utilizados, los re-
trovirales (gammarretrovirales) y los adenovirales
son los de uso ms frecuente en estos ensayos.
No obstante, ya se observa la puesta en marcha
de un total de 27 ensayos (1,7% del total) con
vectores lentivirales, propuestos como una nueva
familia de vectores de mayor seguridad y eficacia
respecto a los retrovirales.
El fundamento para la utilizacin de vecto-
res virales es el de aprovechar su gran capa-
cidad infectiva y, en algunos casos, de integrar
su genoma en la clula husped, eliminando
su potencial replicativo en la clula infectada
(transducida). El virus modificado (vector) slo
ser capaz de llevar a cabo un nico ciclo de
Terapia gnica in vivo
Vectores de transferencia gnica
85
 Indications addressed by Gene Therapy Clinical Trials Vectors used in Gene Therapy Clinical Trials

Adenovirus 23,8% (n = 400)

Cancer diseases 64,5% (n = 1.060) Retrovirus 20,5% (n = 344)
Cardiovascular diseases 8,7% (n = 143) Naked/Plasmid DNA 17,7% (n = 304)
Monogenic diseases 8,2% (n = 134) Vaccinia virus 7,9% (n = 133)
Infectious diseases 8% (n = 131) Lipofection 6,5% (n = 109)
Neurological diseases 1,8% (n = 30) Poxvirus 5,5% (n = 93)
Ocular diseases 1,1% (n = 18) Adeno-associated virus 4,5% (n = 75)
Other diseases 2,4% (n = 40) Herpes simplex virus 3,3% (n = 56)
Gene marking 3% (n = 50) Lentivirus 1,7% (n = 29)
Healthy volunteers 2,3% (n = 38) Other categories 4,9% (n = 82)
Unknown 3,3% (n = 55)

Figura 3. Distribucin de los ensayos clnicos de Terapia Gnica por indicaciones y vectores.

infeccin, lo que le permitir actuar como ve-

hculo seguro del gen teraputico. Todos los
Criterios para definir
elementos necesarios para que el vector tera- el vector de transferencia
putico pueda empaquetarse e infectar las c-
lulas diana son aportados con las denominadas a utilizar
lneas celulares empaquetadoras. En la figura
4 se muestra un ejemplo de cmo modificar El xito teraputico de la TG depende funda-
un gammarretrovirus para producir un vector mentalmente de 3 cuestiones. En primer lugar,
gammarretroviral. resulta necesario insertar eficazmente el trans-

env (SU)
env (TM) LTR Gag Pol Env LTR
gag
(matriz)
gag
(cpsida)

RNA
pol LTR Gen teraputico LTR

Ciclo de infeccin del retrovirus MoMuLV Generacin de clulas empaquetadoras

de vectores teraputicos

Clula productora
de vectores retrovirales
Ensamblaje
Fusin Integracin
Citoplasma
de membranas Ncleo
ARN ARNm
PROT mRNA ARNm
ARNm
ARN
ARN
ADN
Integracin Ncleo
Vector retroviral
teraputico
ADNbc

Figura 4. La Manipulacin Gentica de los Retrovirus: De virus patognico a medicamento gnico..

86 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana

gn teraputico en las clulas diana deseadas;
por otra parte, tambin es necesario que el gen
se exprese en cantidad suficiente y durante el
tiempo suficiente para que se obtenga benefi-
cio clnico, y, por ltimo, como en todo medi-
camento, la eficacia teraputica de la TG viene
limitada por la relacin entre el beneficio clnico
que produce y los riesgos que conlleva.
En el caso de enfermedades asociadas a de-
fectos monognicos resulta evidente que la cura-
cin de la enfermedad slo se obtendr cuando
las clulas de los tejidos afectados tengan acceso
permanente a niveles umbrales de la protena
deficitaria. Una de las aproximaciones ms direc-
tas para lograr este objetivo se fundamenta en
la transduccin de la poblacin celular afectada,
o de sus clulas progenitoras, con vectores que
permitan la integracin estable del transgn en el
genoma celular. En los protocolos clnicos disea-
dos al efecto se han utilizado fundamentalmente
vectores gammarretrovirales, en particular los
derivados del virus de la leucemia murina de Mo-
loney (MoMLV). Como ya se ha indicado, los vec-
tores lentivirales constituyen una herramienta de
reciente aplicacin en el campo de la TG, ya que
permiten la integracin del transgn en clulas
quiescentes y ofrecen una mayor seguridad en
comparacin a los vectores gammarretrovirales.
Estudios y ensayos
clnicos representativos
sobre los beneficios y
limitaciones de la terapia
gnica actual
Hasta que los laboratorios de gentica mole-
cular ofrezcan alternativas eficaces para el trata-
miento de mutaciones dominantes, el tratamien-
to gentico de las enfermedades monognicas
se est centrando en las que estn asociadas a
mutaciones monognicas recesivas, en las cuales
la expresin de una copia funcional del corres-
Avances de la terapia gnica en el tratamiento de enfermedades monognicas
pondiente transgn pueda ser suficiente para la
curacin de la enfermedad.
En las patologas en las que no es posible o
no es del todo eficaz la administracin exge-
na de la protena deficitaria, se han planteado
alternativas de terapia celular o gnica sobre
estos pacientes. En la actualidad existen unas 30
enfermedades monognicas que habitualmente
se tratan mediante trasplante de progenitores
hematopoyticos procedentes de donantes his-
tocompatibles sanos. Puesto que en promedio
slo 1 de cada 3 pacientes posee un donan-
te familiar HLA idntico, y debido a los riesgos
asociados al trasplante alognico a partir de do-
nantes alternativos, se considera una larga serie
de enfermedades monognicas candidatas a ser
tratadas mediante TG.
A continuacin se muestra el fundamento de
algunos de los protocolos de TG de enferme-
dades monognicas que han sido ms relevan-
tes, bien por su eficacia teraputica, bien por
las dudas levantadas respecto a los riesgos que
entraa esta nueva alternativa teraputica.
Inmunodeficiencia ADA
Entre las enfermedades que primero se con-
sideraron para su tratamiento gnico destacan
las inmunodeficiencias severas combinadas
asociadas a mutaciones en los genes adenosina
deaminasa (ADA-SCID) y gamma-c, asociado a
la inmunodeficiencia X1-SCID. La ausencia de
ADA implica una acumulacin celular del sustra-
to desoxiadenosina trifosfato, lo cual resulta par-
ticularmente txico en los linfocitos T (fig. 5).
Adenosina
Iosina
Deoxidante ADA
Deoxiinosa
dATP
Figura 5. Esquema del fundamento bioqumico
de la inmunodeficiencia severa combinada ADA.
87
 sta fue una de las primeras patologas en ser
tratadas mediante TG con vectores retrovira-
les, primero en el National Institutes of Health
(NIH) de Estados Unidos [1, 2], y luego en el
Hospital S. Raffaelle de Miln [3-5]. Las alterna-
tivas que se consideraron para el tratamiento
gentico de esta enfermedad tenan por objeto
la transferencia del gen ADA en los linfocitos T
de los pacientes o en las clulas madre hemato-
poyticas (CMHs). En todos los casos se com-
prob la presencia de clulas corregidas gen-
ticamente en la sangre de los pacientes, aunque
tan slo se obtuvieron modestas evidencias
de beneficio clnico. Los mejores resultados se
han obtenido recientemente por los grupos de
Miln (A. Aiuti) y de Londres (B. Gaspar y A.
Thrasher): utilizando un protocolo en donde se
retir la administracin de la protena ADA, los
pacientes se acondicionaron con un tratamien-
to submieloablativo previo a la perfusin de las
clulas CD34+ transducidas con vectores ga-
mmarretrovirales portadores del gen ADA [5,
6]. El esquema bsico seguido en estos ensa-
yos clnicos es el que se muestra en la figura
6: se extrajeron clulas de la mdula sea de
los pacientes, se purificaron las clulas CD34+
y se transdujeron con los vectores teraputicos;
finalmente, la poblacin conteniendo las clu-
las corregidas genticamente fueron perfundi-
das en los pacientes tras su acondicionamiento
con dosis submieloablativas de busulfn (fig. 6).
La gran mayora de estos pacientes mostraron
beneficios clnicos incuestionables, sin que en
ninguno de ellos se produjeran efectos adver-
sos graves. Este protocolo constituye uno de
los ejemplos ms significativos de la eficacia y la

Recoleccin de clulas Seleccin de clulas

de mdula sea CD34+
Acondicionamiento
submieloablativo

Infusindel inculo corregido Transduccin con vectores

genticamente teraputicos

Figura 6. Esquema bsico del protocolo utilizado para la terapia gnica de la inmunodeficiencia ADA-SCID.

88 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana

 IL-7R IL-4R IL-2R

a a b

c c c a

JACK3 J3 J3 J3

py-stat

NCLEO

Activacin gnica

Figura 7. Sealizacin defectiva por receptores de citoquinas en inmunodeficiencia X1-SCID.

seguridad que la TG puede ofrecer a pacientes
con enfermedades monognicas.
Inmunodeficiencia X1-SCID
sta inmunodeficiencia representa aproxi-
madamente la mitad de todas las inmunodefi-
ciencias graves combinadas y est asociada a un
defecto en la cadena c, una protena que forma
parte de numerosos receptores de interleuci-
nas (fig. 7).
La TG de estos pacientes tambin se ha rea-
este protocolo, desarrollado en Francia por A.
Fischer y M. Cavazzana-Calvo, es el primer pro-
tocolo de TG de una enfermedad monognica
que ha demostrado eficacia teraputica incues-
tionable (fig. 8). El equipo de Adrian Thrasher,
en Londres, ha obtenido resultados similares en
cuanto a la eficacia teraputica del proceso [8]
9.000
P5
8.000
7.000
Linfocitos T/mcl

6.000
lizado mediante la transferencia del vector te- 5.000 P8 P7
raputico a clulas CD34+, en este caso sobre 4.000 P4
pacientes que no recibieron acondicionamiento 3.000 P9 P1 P2

alguno. En el 90% de los pacientes se obser- 2.000 P6

1.000
v reconstitucin del sistema inmunitario con P10
0
clulas que contenan el gen teraputico y una 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
evidente mejora clnica, que, como en el caso Meses despus de la terapia gnica
anterior, permiti que los pacientes abando-
naran las unidades de aislamiento a las pocas Figura 8. Rescate de la inmunodeficiencia por
semanas del tratamiento [7]. Se considera que terapia gnica en inmunodeficiencia SCID-X1.

Avances de la terapia gnica en el tratamiento de enfermedades monognicas 89

??, pues todos los pacientes peditricos trata-
dos han mostrado clara mejora clnica.
Como veremos ms adelante, 5 de los 15
pacientes X1-SCID tratados por TG desarrolla-
ron leucemia linfoctica como consecuencia de
esta intervencin teraputica, si bien 4 de ellos
respondieron satisfactoriamente al tratamiento
antitumoral. Las causas y consecuencias de este
proceso maligno producido como consecuen-
cia del tratamiento con vectores retrovirales se
discuten, as mismo, ms adelante.
Granulomatosis crnica
Constituye otra inmunodeficiencia que ha re-
cibido atencin particular para su tratamiento
gentico. Esta enfermedad se caracteriza por
una deficiente respuesta de las clulas fagoc-
ticas para generar anin superxido, lo que se
manifiesta mediante un sndrome recurrente de
infecciones y formacin de granulomas (fig. 9).
Estudios experimentales sugieren que la co-
rreccin gentica de, aproximadamente, un 5%
de los granulocitos circulantes, ser suficiente
para reportar un beneficio teraputico [9]. Los
estudios clnicos basados en el trasplante de
clulas CD34+ transducidas con vectores re-
trovirales y trasplantadas en pacientes no acon-
dicionados, no mostraron beneficio teraputico.
No obstante, un ensayo clnico realizado por
Manuel Grez, en Frankfurt, en pacientes que
recibieron acondicionamiento mieloablativo,
ha mostrado evidente mejora clnica en los 2
pacientes tratados [10]; sin embargo, en este
ensayo clnico tambin se han descrito efectos
adversos graves similares a los descritos en pa-
cientes X1-SCID [11].
Hemofilia
La hemofilia es una enfermedad ligada al cro-
mosoma X originada por mutaciones en el gen
que codifica el factor VIII (hemofilia A) o el fac-
tor IX (hemoflia B) de la coagulacin. A pesar
de los avances producidos en la administracin
intravenosa de estos factores, su corta vida media
90 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
y elevado coste han incentivado la investigacin
en el campo de la TG de esta enfermedad. En el
tratamiento de la hemofilia A y B se han seguido
mltiples enfoques, que incluyen la transduccin
de fibroblastos con plsmidos portadores del gen
del factor VIII truncado, perfusin intravenosa de
vectores retro o adenovirales con el gen del fac-
tor VIII, o la transduccin de msculo esqueltico
o hgado con vectores AAV portadores del gen
del factor VIII y el minigen del factor IX, respec-
tivamente. Ninguno de los protocolos puestos
en marcha hasta el momento ha conseguido
expresar a largo plazo el factor de coagulacin
correspondiente a niveles teraputicos. Trabajos
ms recientes han conseguido alcanzar niveles
del factor de coagulacin del orden del 5-25% en
perros hemoflicos o primates no humanos, me-
diante 3 aproximaciones diferentes. En un caso se
administr por va sistmica vectores retrovirales
en perros neonatales, en donde los hepatocitos
se encontraban con alta tasa proliferativa, y se
han utilizado tambin vectores AAV para trans-
ducir msculo esqueltico por va intravascular, o
el hgado por va de la arteria heptica o portal.
La administracin de vectores AAV al hgado se
contempla actualmente como uno de los proce-
dimientos ms prometedores para el tratamiento
de la hemoflia, pues ya se han alcanzado valores
de alrededor del 10-12% de los valores normales,
aunque la expresin se mantuvo durante sema-
nas, en lugar de aos, como fue el caso de perros
hemoflicos [12]. La presencia de clulas CD8+
de memoria contra antgenos de la cpsida viral
parece ser la causante de la corta duracin en la
que se expres el factor. La inmunosupresin del
paciente hasta que la cpsida viral se aclare de sus
tejidos, o la utilizacin de serotipos diferentes de
AAV (AAV-8 en lugar de AAV-2), se contemplan
como alternativas de inters para mejorar la efi-
cacia clnica del procedimiento.
Hemoglobinopatas
De entre ellas, destacan las talasemias y la
anemia de clulas falciformes. Algunos genes de
hemoglobinopatas (alpha-thal, beta-thal y HbS)
causan enfermedad (talasemia alfa, talasemia beta
y anemia drepanoctica, respectivamente), pero
otros (HbE y HbC) slo causan manifestaciones
clnicas graves cuando se combinan con alguno
de los genes del primer grupo. Los nios con ta-
lasemia suelen nacer sin manifestaciones clnicas,
pero la anemia surge entre los 6 meses y los 2
aos de vida. La sustitucin de la globina- defec-
tiva o ausente en pacientes con talasemia , pue-
de ser curativa. Resultados preclnicos recientes
del grupo de G. Ferrari muestran la correccin
de clulas humanas de pacientes con talasemia
major. La caracterizacin de clulas derivadas de
la mdula sea de estos pacientes antes despus

Figura 9. Fundamentos moleculares de la granulomatosis crnica.

Avances de la terapia gnica en el tratamiento de enfermedades monognicas 91

de la transferencia del gen teraputico mostr
una elevada eficacia de transduccin, restaura-
cin de la sntesis de la hemoglobina, rescate de
la apoptosis y la correccin de los defectos en
eritropoyesis. En general, estos resultados pro-
porcionan un fundamento slido para una futura
traduccin clnica de este protocolo de TG [13].
Anemia de Fanconi
La anemia de Fanconi (AF) es una enferme-
dad autosmica recesiva, poco frecuente entre
la poblacin pero de muy mal pronstico. Los
pacientes suelen desarrollar anomalas cong-
nitas mltiples (en el 65% de los casos), fallo
de mdula sea y predisposicin a cncer. En
promedio, la manifestacin de la aplasia se ob-
serva alrededor de los 8 aos de edad, si bien
prcticamente todos los pacientes que alcanzan
los 40 aos muestran fallo de mdula sea. Una
de las caractersticas de esta enfermedad, que la
hace particularmente apropiada para su trata-
miento por TG, radica en la ventaja selectiva de
las clulas corregidas genticamente respecto a
las clulas defectivas en los genes de Fanconi
[14]. La AF es consecuencia de mutaciones o
deleciones en cualquiera de los 13 genes de
AF relacionados con la estabilidad genmica de
estas clulas. Los resultados publicados sobre
los ensayos realizados en fase I no manifesta-
ron beneficios teraputicos evidentes (Liu et al.,
1999) [15]. Nuestro equipo de investigacin ha
publicado recientemente resultados preclnicos
que abren nuevas expectativas al tratamiento
por TG de esta enfermedad mediante nuevos
procedimientos de manipulacin celular y nue-
vos vectores lentivirales, ms eficaces y seguros
respecto a los utilizados anteriormente [16].
Fibrosis qustica
El gen de la fibrosis qustica (FQ) est locali-
zado en el cromosoma 7 y posee un tamao de
6,7 kB. En el 75% de los pacientes enfermos de
FQ, la enfermedad se produce por un defecto
en la posicin 508. Como consecuencia de las
92 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
deficiencias de este gen se produce una altera-
cin fsica y qumica de las secreciones de las
vas respiratorias y de las enzimas pancreticas.
Debido al defecto en el transporte del cloro
entre las clulas, las mucosidades se hacen muy
densas, dificultando la expulsin del moco bron-
quial y facilitando su infeccin con patgenos
difciles de eliminar. La TG prioritaria de esta en-
fermedad radica en la insercin del gen de la FQ
en las clulas respiratorias. Se han desarrollado
diversos ensayos clnicos en fase I utilizando
fundamentalmente vectores adenovirales y, ms
recientemente, vectores no virales. Los proto-
colos con vectores adenovirales han mostrado
ventajas respecto a su eficacia de transduccin
de las clulas diana; sin embargo, tambin han
puesto de manifiesto su inmunogenicidad, al ha-
berse generado anticuerpos que neutralizaron
la eficacia de los vectores. Las formulaciones no
virales facilitarn la administracin repetida de
frmaco gentico. En todo caso, estos ensayos
clnicos estn mostrando mayores complicacio-
nes de la inicialmente previstas.
La seguridad en terapia
gnica
Problemas en el tratamiento
de la deficiencia de la ornitn
transcarbamilasa
Esta es una enfermedad en la que los pacien-
tes carecen de una enzima clave del metabo-
lismo de aminocidos, la ornitn transcarbami-
lasa (OTC), lo que da lugar a una acumulacin
potencialmente fatal de amoniaco en la sangre.
Puesto que la actividad OTC est normalmen-
te presente en el hgado, se considera que ste
es el tejido diana de vectores que expresen la
versin correcta del gen OTC. En virtud de la
eficacia de los adenovirus para infectar clulas
hepticas, se propuso utilizar tales vectores para
transducir las clulas hepticas de estos pacien-
tes con el gen OTC. Estudios in vitro, y tambin
en animales de experimentacin, mostraron la
eficacia del protocolo propuesto. El tratamien-
to de 17 pacientes con dosis progresivamente
crecientes del vector no manifest efectos txi-
cos graves. No obstante, en 1 de los pacientes
tratados con la dosis ms alta se manifest un
proceso febril seguido de inflamacin hepti-
ca y aumento descontrolado de los niveles de
amonio, dando lugar a la entrada en coma del
paciente. Lamentablemente, el paciente falleci
poco despus, y est todava en investigacin la
causa primaria de su muerte. Este hecho, como
consecuencia de la inoculacin del vector viral,
dispar las alarmas de los organismos regula-
dores, principalmente en lo que se refiere a la
inoculacin in vivo de vectores de la familia de
los adenovirus. En la actualidad se han generado
nuevos vectores adenovirales desprovistos de
la mayor parte del esqueleto viral implicado en
su inmunogenicidad, por lo que se confa que su
empleo prevenga de la generacin de respues-
tas inmunognicas no previstas.
Incidencia de leucemias
en pacientes X1-SCID tratados
mediante terapia gnica
De los 20 pacientes X1-SCID que fueron
tratados en Pars y Londres mediante TG, 5 de-
sarrollaron leucemia linfoctica asociada a la in-
sercin del gen teraputico en la proximidad de
diferentes oncogenes [17]. De manera paralela a
la observacin de las primeras leucemias en los
pacientes SCID-X1, C. Baum observ por pri-
mera vez en animales de experimentacin un fe-
nmeno similar. En sus experimentos trasplant
clulas madre hematopopyticas que haban sido
transducidas con vectores gamarretrovirales a
animales receptores [18] ??. Al cabo del tiempo
observ en algunos animales la aparicin de una
leucemia clonal, que investig en su nivel molecu-
lar. En su estudio, Baum observ que el vector re-
troviral se haba insertado junto al oncogn evi1,
al cual haba activado mediante las secuencias
promotoras presentes en el vector. De manera
anloga, en los ensayos clnicos con pacientes
Avances de la terapia gnica en el tratamiento de enfermedades monognicas
X1-SCID se observ que una gran proporcin
de las inserciones del vector teraputico tuvo lu-
gar en regiones prximas a (o dentro de) genes
de las clulas diana. De hecho, se observ que
la insercin del vector teraputico ocurra con
frecuencia junto al oncogn LMO2, implicado en
leucemias linfocticas [19] (fig. 10). ??
Estudios posteriores han evidenciado que los
vectores gamarretrovirales se insertan preferen-
temente en la proximidad o dentro de genes que
se estn transcribiendo activamente en el mo-
mento de la transduccin [20]. En estudios com-
plementarios se observ que estos vectores se
insertan preferentemente en regiones prximas
al inicio de la transcripcin, facilitando con ello la
transactivacin de los genes prximos. Con obje-
to de minimizar el riesgo de transactivar oncoge-
nes por la insercin de vectores teraputicos, se
han desarrollado vectores de mayor seguridad.
As, a diferencia de lo que ocurre con los vecto-
res gamarretrovirales, los vectores lentivirales no
muestran una preferencia por integrarse junto al
inicio de la transcripcin del gen [21]. Por otra
parte, la introduccin de promotores menos po-
tentes que los promotores virales anteriormente
utilizados constituye una alternativa complemen-
taria que est mejorando significativamente la
seguridad de la TG [22].
En todo caso, los riesgos asociados a la TG
han de ser correctamente ponderados, por
una parte para minimizar en lo posible el ries-
go asociado a su utilizacin, pero tambin para
no impedir su aplicacin a pacientes que no
tienen alternativas teraputicas de beneficio
comparable.
Puesta en marcha
de nuevos ensayos clnicos
con vectores teraputicos
de nueva generacin
Como consecuencia de los estudios de se-
guridad realizados desde que se pusieron de
93
manifiesto los primeros efectos adversos aso-
ciados a la terapia con vectores retrovirales,
comenz el desarrollo de vectores lentivirales
para su aplicacin clnica. El primer ensayo de
tratamiento de una enfermedad monognica
con vectores lentivirales se realiz reciente-
mente en Pars en pacientes con X-adreno-
leucodistrofia (ALD) [23]. Esta enfermedad
cursa con una desmielinizacin severa en
cerebro, por deficiencia en la protena ALD.
La progresin de la enfermedad puede ser
detenida mediante trasplante alognico de
progenitores hematopoyticos. En el ensayo
clnico realizado por N. Cartier et al., se trans-
dujeron clulas CD34+ de la mdula sea de
los pacientes con vectores lentivirales porta-
dores del gen de la ALD y se reinfundieron
tras un acondicionamiento mieloablativo de
los pacientes (fig. 11). Los resultados reporta-
dos en este trabajo demuestran por primera
vez la detencin del proceso de desmieliniza-
cin en pacientes tratados por TG, abriendo
una nueva expectativa para la terapia de esta
grave patologa.
La reprogramacin celular,
una nueva estrategia
para la terapia gnica
de enfermedades
monognicas
Ante el limitado nmero de clulas madre he-
matopoyticas presentes en la mdula sea de
los pacientes con aplasias congnitas, como la
anemia de Fanconi (AF), por ejemplo, surgi la
necesidad de investigar la posibilidad de generar
progenitores hematopoyticos a partir de fuen-
tes alternativas a la mdula sea. Para ello resul-
t esencial el descubrimiento del investigador
japons Yamanaka en el ao 2006, que demos-
traba por primera vez que la transferencia de
tan slo 4 genes poda reprogramar fibroblastos
de piel [24] y as generar clulas pluripotentes
inducidas (iPS) similares a las clulas madre em-
brionarias. Nuestro equipo, en colaboracin
con el de Raya e Izpisa-Belmonte, en el Centro

41.253 44.218 46.229 54.614

P4
6 13 17 24 31 34 -C 37 M MFG c 1 MFG c 2
P5
Hacein-Bey et al., Science 302, 416;2003.

3LTR 8
7
198 pbs
6
% de inmigracin

5
4
3
IS
10 ngWT 2
1
50 c. IS
10 ngWT 0
-10 a -9
-9 a -8
-8 a -7
-7 a -6
-6 a -6
-5 a -1
-4 a -3
-3 a -2
-2 a -1
-1 a 0
0a1
1a2
2a3
3a4
4a6
6a6
6a7
7a8
8a9
9 a 10

500 c. IS
CD3 T PBL PBL
Distancia al origen de transcripcin TSS (kb)
600 integraciones independientes: 63% a < 10 kb de genes

Figura 10. Oncognesis insercional en dos pacientes X1-SCID tratados por terapia gnica.

94 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana

de Medicina Regenerativa de Barcelona, y el de el defecto gentico de fibroblastos de piel de
Surralls, de la Universidad Autnoma de Bar- pacientes AF y, tambin, de reprogramar estas
celona/Ciber de Enfermedades Raras, demos- clulas para generar progenitores hematopo-
tramos recientemente la posibilidad de corregir yticos con fenotipo sano [25] (fig. 12). Desde

20 months

ALD patient Lipid storage

(lipid storage disorder) relief

Gene-corrected HSCs

HIV-based vector with

therapeutic ABCD1 gene Progeny
of gene-corrected
HSCs distribute
throughout
the body

HSCs

Figura 11. Terapia gnica con vectores lentivirales en pacientes con X-adrenoleucodistrofia (tomado de L
Naldini. Science 326, 805-6, 2009).

Avances de la terapia gnica en el tratamiento de enfermedades monognicas 95

 + Oct 3/4
Clulas de la piel + FANCA
+ Sox2
+ c-Myc
+ Klf4

Clula iPS

CMH CMH

Figura 12. Esquema seguido para la generacin de progenitores hematopoyticos a partir de fibroblastos de
piel de pacientes con anemia de Fanconi (Raya et al. Nature 460: 53-9, 2009).

esta primera demostracin, la reprogramacin
celular se contempla como un nuevo campo de
gran expectacin en el cual la TG de adicin y
tambin por recombinacin homloga tendr
una oportunidad de traslacin clnica.
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96 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana

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97
 7 Nanomedicina:
apliacin de la nanotecnologa
en la salud
Laura M. Lechuga
Grupo de Nanobiosensores y Aplicaciones Bioanalticas
Centro de Investigacin en Nanociencia y Nanotecnologa (CIN2)
Consejo Superior de Investigaciones Cientficas

Resumen ciencia y tecnologa que nos est conduciendo

La nanomedicina, aplicacin de la nanotecno-
loga en las ciencias de la salud, es la rama de la
nanotecnologa que se perfila como la de mayor
proyeccin en un futuro prximo debido a sus
importantes aplicaciones, especialmente diag-
nsticas y teraputicas. La deteccin temprana
de enfermedades, su tratamiento precoz per-
sonalizado y un preciso seguimiento posterior
de su evolucin sern posibles en los prximos
aos gracias a la aplicacin de las herramientas
nanotecnolgicas que se estn desarrollando
actualmente. Los importantes avances en este
campo podran dar lugar a sistemas de diagnosis
y tratamientos teraputicos de mayor eficacia
que los existentes, lo que redundara en una
mayor calidad de vida para el hombre. Una au-
tntica revolucin se vislumbra en el horizonte
del cuidado de la salud y la tecnologa mdica.
Introduccin:
qu es la nanomedicina?
Desde hace unos aos la nanotecnologa se
est perfilando como un rea emergente en
a una nueva revolucin industrial. La nanotecno-
loga se define como el desarrollo de ciencia y
tecnologa a niveles atmicos y moleculares, en la
escala de aproximadamente 1-100 nm, para obte-
ner una comprensin fundamental de fenmenos
y materiales en dicha escala nanomtrica y para
crear y usar estructuras, dispositivos y sistemas que
tengan nuevas propiedades y funciones debido a
su tamao. Nanomtro (del latn nanus, enano)
significa la milmillonsima parte de 1 metro. Lo
ms interesante de la nanotecnologa no es la
posibilidad de trabajar con materiales de reduci-
das dimensiones, sino el cambio a menudo radi-
cal que sufren las propiedades fsicas y qumicas
de la materia cuando se trabaja a esta escala: la
conductividad elctrica, el color, la resistencia o
la elasticidad, entre otras propiedades, se com-
portan de manera diferente a como lo hace el
material volumtrico (fig. 1). Por ello, la nano-
tecnologa tiene gran aplicacin en diferentes
campos, entre los que destacan los materiales,
la electrnica, la medicina y la energa. Se han
alcanzado ya avances significativos en la fabri-
cacin de materiales de mayor dureza y resis-
tencia, ordenadores ms veloces y con mayor
capacidad de procesamiento gracias a los mi-
croprocesadores con componentes nanotecno-

98 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana

 Baln de ftbol Hormiga
220.000.000 nm 10.000.000 nm
Microchip ordenador Nanoprisma de oro
70 nm lado 50 nm
Nanotubos de carbn Molcula de C60
anchura 1,4 nm
Figura 1. Las medidas de la nanotecnologa.
lgicos, diagnsticos mdicos ms eficaces o la
obtencin de energa a bajo coste y respetuosa
con el medio ambiente. Ya existen multitud de
productos nanotecnolgicos en el mercado,
como cosmticos ms eficaces y protectores,
raquetas de tenis ms flexibles y resistentes, ga-
fas que no se rayan, ropa que no se arruga ni se
mancha, por citar algunos ejemplos.
La irrupcin de la nanotecnologa en las cien-
cias de la salud ha dado lugar a una nueva disci-
plina denominada nanomedicina, cuyo objetivo
principal es el desarrollo de herramientas para
diagnosticar, prevenir y tratar enfermedades
cuando estn todava en estados poco avanza-
dos o en el inicio de su desarrollo. La nanomedi-
cina estudia interacciones a la nanoescala y para
Cabello humano Glbulos rojos
80.000 nm 7.000 nm
Virus polio Molcula de ADN
10 nm anchura 2 nm
tomo de hidrgeno
0,7 nm 0,1 nm
ello utiliza dispositivos, sistemas y tecnologas que
incluyen nanoestructuras capaces de interactuar
a escala molecular y que se interconectan a nivel
micro para interaccionar en el nivel celular. Uno
de los grandes retos en este proceso reside en
el desarrollo de nanoterapias, dirigidas espe-
cficamente a los tejidos y rganos enfermos,
evitando daar a las clulas sanas circundantes y,
por tanto, evitando los temidos efectos secunda-
rios de los tratamientos actuales.
En los orgenes de la nanotecnologa se lleg
a predecir la fabricacin de nanorobots, que
se inyectaran directamente y atacaran selecti-
vamente los tejidos daados, incluso protegien-
do de ataques externos y reparando posibles
desperfectos. A pesar de que esto sigue siendo
Nanomedicina: ampliacin de la nanotecnologa en la salud 99
ciencia ficcin, s se puede afirmar que se ha
avanzado notablemente en el diseo de nanoes-
tructuras que incorporan distintas funcionalida-
des y pueden desempear un papel muy similar.
El progresivo aumento que se observa de gra-
ves dolencias como el cncer, las enfermedades
cardiovasculares, la diabetes, o las enfermedades
neurodegenerativas (Alzheimer y Parkinson),
para las que no existen tratamientos definitivos,
hacen necesarios nuevos mtodos diagnsticos
y teraputicos ms rpidos, eficaces y especfi-
cos que los actuales y que adems reduzcan al
mximo los costes implicados. La nanomedicina
promete resolver algunos de estos grandes re-
tos mediante la capacidad de detectar de forma
precoz la presencia de enfermedades (como el
cncer) o la capacidad de regenerar los rganos
y tejidos que estn daados dentro del orga-
nismo proporcionado un diagnstico precoz,
una terapia adecuada y un seguimiento poste-
rior efectivo de la evolucin del paciente. En un
futuro prximo se podr incluso disponer de
tratamientos individualizados a distancia en el
propio hogar o lugar de trabajo del paciente.
La nanomedicina agrupa tres reas princi-
pales: el nanodiagnstico, la liberacin contro-
lada de frmacos (nanoterapia) y la medicina
regenerativa. El nanodiagnstico consiste en el
desarrollo de sistemas de anlisis y de imagen
para detectar una enfermedad o un mal funcio-
namiento celular en los estadios ms tempranos
posibles tanto in vivo como in vitro. La nanote-
rapia pretende dirigir nanosistemas activos que
contengan elementos de reconocimiento para
actuar o transportar y liberar medicamentos
exclusivamente en las clulas o zonas afectadas,
a fin de conseguir un tratamiento ms efectivo,
minimizando los efectos secundarios. La medici-
na regenerativa tiene como objetivo reparar o
reemplazar tejidos y rganos daados aplicando
herramientas nanotecnolgicas.
Dado que es imposible abarcar con profun-
didad todas las tecnologas que pueden surgir
de conceptos basados en nanomateriales y
nanodispostivos, se han seleccionado para este
100 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
captulo algunos ejemplos clave de avances
conseguidos en las tres lneas principales de la
nanomedicina, haciendo especial hincapi en el
rea del nanodiagnstico.
Nanodiagnstico
El objetivo del nanodiagnstico es la identifi-
cacin de enfermedades en sus estadios inicia-
les en el nivel celular o molecular e, idealmente,
al nivel de una sola clula, mediante la utilizacin
de nanodispositivos y sistemas de contraste.
Una identificacin temprana permitira una r-
pida capacidad de respuesta y la inmediata apli-
cacin del tratamiento adecuado, ofreciendo as
mayores posibilidades de curacin.
Los nanosistemas de diagnstico se pueden
utilizar in vitro o in vivo. El diagnstico in vivo nor-
malmente requiere que los dispositivos puedan
penetrar en el cuerpo humano para identificar
y (idealmente) cuantificar la presencia de un de-
terminado patgeno o de clulas cancergenas,
por ejemplo. Esto conlleva una serie de proble-
mas asociados con la biocompatibilidad del ma-
terial del dispositivo, pero adems requiere de
un sofisticado diseo para asegurar su eficacia y
minimizar los posibles efectos secundarios. Por
su parte, el diagnstico in vitro ofrece una mayor
flexibilidad de diseo, ya que se puede aplicar a
muestras muy reducidas de fluidos corporales o
de tejidos, a partir de los cuales se puede llevar
a cabo una deteccin especfica (de patgenos
o defectos genticos, p. ej.) en tiempos muy
cortos, con gran precisin y sensibilidad. Debido
a estas diferencias fundamentales, se prev que
la deteccin in vitro usando nanodispositivos lle-
gue al mercado de una forma mucho ms rpi-
da y se pueda consolidar ms fcilmente que los
mtodos in vivo.
Dentro del nanodiagnstico, dos son las
principales reas de trabajo: los nanosistemas
de imagen y los nanobiosensores, dispositivos
capaces de detectar en tiempo real y con una
alta sensibilidad y selectividad agentes qumicos
y biolgicos. Los principales sistemas de nano-
diagnstico dentro de estas dos grandes reas
se recogen en la tabla 1.
Nanosistemas de imagen
Estos sistemas se basan en el uso de nano-
partculas, generalmente, semiconductoras, me-
tlicas o magnticas, como agentes de contras-
te para marcaje in vivo. Estos nuevos sistemas
permiten aumentar la sensibilidad y dan mayor
contraste en las tcnicas de imagen.
Uno de los primeros sistemas de nanopart-
culas que se han propuesto para marcaje celu-
lar e identificacin de zonas daadas o tumo-
res son las nanopartculas de semiconductores,
tambin conocidas como puntos cunticos
(quantum dots).
Cuando el tamao de estos semiconducto-
res se reduce a unos pocos nanmetros (t-
picamente entre 1 y 10 nm), se produce una
modificacin de su estructura electrnica, de
tal manera que se pierde la caracterstica es-
tructura de bandas y surgen niveles electrnicos
discretos. Esta nueva estructura electrnica les
Tabla 1. Resumen de los sistemas de nano-
diagnstico ms desarrollados
Principales sistemas de nanodiagnstico
Dispositivos de nanodiagnstico
Nanobiosensores
Biochips genmicos y protemicos
Lab-on-a-chip
Diagnstico por imagen
Resonancia magntica muclear
Espectroscopia y fluorescencia
Microscopios de campo prximo (AFM, STM)
Microscopia y tomografa electrnica
Marcadores y agentes de contraste
Puntos cunticos
Nanopartculas magnticas
Nanopartculas metlicas
confiere una respuesta ptica (fluorescencia, en
particular) que vara con el tamao. Por lo tanto,
se pueden fabricar puntos cunticos del mismo
material que emiten luz en diferentes longitudes
de onda (con distintos colores) dependiendo
de su tamao, por lo que son extremadamente
tiles como marcadores biolgicos (fig. 2).
De entre la gran variedad de materiales que
se han estudiado, los semiconductores ms uti-
lizados son los de CdSe y CdTe, ya que se pue-
den producir en grandes cantidades mediante
procesos qumicos, con un excelente control
del tamao, lo que permite obtener bandas de
emisin estrechas e intensas en una amplia va-
riedad de colores y con un tiempo de vida muy
prolongado. Todas estas caractersticas, a las que
se puede aadir que la excitacin de puntos
cunticos de distintos tamaos se puede realizar
con una nica lmpara (permitiendo as realizar
marcajes mltiples de forma simultnea), han
promovido su desarrollo como competencia a
los marcadores moleculares habituales. Existen
ya mltiples demostraciones de la utilidad de
los puntos cunticos para la localizacin de pe-
queos tumores, lo cual significa que se podra
proceder a su extirpacin inmediata. En la figura
2 se muestran algunos ejemplos.
Sin embargo, el diseo de los puntos cunticos
(al igual que otros sistemas de nanopartculas)
es bastante ms complicado. No es suficiente
con obtener un material de alta luminiscencia y
estabilidad, la nanopartcula tambin debe llegar
a su destino de forma selectiva e, idealmente,
debe eliminarse del organismo una vez realiza-
da su funcin para evitar efectos secundarios.
Uno de los problemas a resolver es la captacin
de las nanopartculas por los macrfagos antes
de alcanzar la zona afectada. Para ello es nece-
sario recubrir las nanopartculas con materiales
que acten como una capa de invisibilidad, p.
ej., con polmeros como el polietilenglicol. Una
vez resuelto este problema, es preciso indicar-
les cmo localizar el tumor, y para ello hay que
recubrir su superficie con biomolculas (biorre-
ceptores, como anticuerpos monoclonales) con
Nanomedicina: ampliacin de la nanotecnologa en la salud 101
afinidad selectiva hacia un compuesto especfi-
co de la zona a reconocer (p. ej., la clula can-
cerosa). As, hay ciertas protenas o molculas
que se encuentran en mayor proporcin en la
membrana de las clulas cancerosas (como los
receptores de cido flico o la hormona lutei-
nizante) y son caractersticas de cada tipo de
cncer. Cuando los puntos cunticos en funcin
con el biorreceptor especfico se acercan a una
muestra que contiene dicha protena, se produ-
ce una reaccin de reconocimiento biomolecu-
lar (fig. 2), de forma que se acumularn all, per-
mitiendo la deteccin mediante iluminacin con
luz ultravioleta y observacin de la emisin de
fluorescencia caracterstica del punto cuntico
empleado. La eliminacin de las nanopartculas
a travs del hgado o los riones parece ser bas-
tante eficiente para los tamaos de los puntos
cunticos, pero pueden existir problemas liga-
dos a procesos de agregacin, que es necesario
resolver en algunos casos.
Hasta ahora, los experimentos in vivo con
puntos cunticos se han realizado con anima-
les, pero se prev que una vez superados los
controles de las agencias de salud, se puedan
realizar estos ensayos en seres humanos.
Otra posibilidad para los agentes de contraste
es emplear nanopartculas metlicas, ya que su
frecuencia de resonancia (el color) es muy sen-
sible a su tamao y a su forma, lo cual permite
disearlas para que absorban o dispersen luz en
la regin espectral que interese. Por ejemplo, se
pueden fabricar nanopartculas de oro que sean
muy eficientes absorbiendo o reflejando luz en
el infrarrojo cercano (700-900 nm), donde los
tejidos son ms transparentes, de forma que es
posible disear mtodos de marcaje celular, en
una forma similar a lo que se ha descrito para
los puntos cunticos. Uno de los mtodos uti-
lizados se denomina tomografa de coherencia
ptica (optical coherence tomography, OCT), y
permite obtener mapas tridimensionales de los

A B

Figura 2. A) Disoluciones de puntos cunticos de distintos tamaos, con color de fluorescencia ca-
racterstico para cada tamao. B) Esquema de funcionamiento de un punto cuntico. C) Imgenes de
experimentos en los que se han inyectado puntos cunticos y cmo se acumulan en clulas u rganos
daados..

102 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana

tejidos y detectar las zonas en las que se han
acumulado las nanopartculas.
Otra posibilidad es utilizar nanopartculas
magnticas (tpicamente xidos de hierro como
la magnetita) para aumentar el contraste en me-
didas de resonancia magntica. Estas nanopart-
culas podran sustituir a los marcadores actuales
de metales pesados, reduciendo su toxicidad.
Adems, el carcter magntico de estos mate-
riales podra facilitar su transporte a travs del
organismo mediante la utilizacin de un campo
magntico externo (como un imn).
Nanobiosensores
Dentro del nanodiagnstico, los principales
dispositivos de anlisis que se estn desarrollan-
do son los nanobiosensores, dispositivos capa-
ces de detectar en tiempo real, sin necesidad de
marcadores fluorescentes o radioactivos y con
una alta sensibilidad y selectividad, todo tipo de
sustancias qumicas y biolgicas.
Un biosensor es un dispositivo integrado por
un receptor biolgico (enzimas, ADN, anticuer-
pos, etc.) preparado para detectar especfica-
mente una sustancia y un transductor o sensor,
capaz de medir la reaccin de reconocimiento
biomolecular y traducirla en una seal cuantifi-
cable (fig. 3). Los dos constituyentes del biosen-
sor estn integrados conjuntamente y es preci-
samente esta ntima unin la que le confiere a
los dispositivos biosensores sus especiales ca-
ractersticas de sensibilidad y selectividad. Otra
de las caractersticas fundamentales que hace
atractivos a los biosensores es la posibilidad de
realizar el anlisis de la sustancia a determinar
en tiempo real y de forma directa (sin necesi-
dad de marcador) a diferencia de cualquier an-

A B
Muestras
S(CH2)6-N=CH(CH2)3-CH

S(CH2)6-N=CH(CH2)3-CH

S(CH2)6-N=CH(CH2)3-CH

S(CH2)6-N=CH(CH2)3-CH

S(CH2)6-N=CH(CH2)3-CH

S(CH2)6-N=CH(CH2)3-CH

S(CH2)6-N=CH(CH2)3-CH

S(CH2)6-N=CH(CH2)3-CH

S(CH2)6-N=CH(CH2)3-CH

S(CH2)6-N=CH(CH2)3-CH

S(CH2)6-N=CH(CH2)3-CH

S(CH2)6-N=CH(CH2)3-CH

S(CH2)6-N=CH(CH2)3-CH

S(CH2)6-N=CH(CH2)3-CH

S(CH2)6-N=CH(CH2)3-CH

S(CH2)6-N=CH(CH2)3-CH

S(CH2)6-N=CH(CH2)3-CH

S(CH2)6-N=CH(CH2)3-CH

S(CH2)6-N=CH(CH2)3-CH

S(CH2)6-N=CH(CH2)3-CH
= = = = = = = = = = = = = = = = = = = =
O

O
analtico
Superficie del nanosensor

Receptor Biolgico

Transductor

Proceso datos

Seal

Figura 3. A) Esquema del funcionamiento de un biosensor. B) Fabricacin de nanobiosensores con tec-

nologa microelectrnica. El biosensor est formado por un transductor similar a los circuitos integrados
de silicio y una capa bioreceptora para el anlisis especfico.

Nanomedicina: ampliacin de la nanotecnologa en la salud 103

lisis biolgico o clnico que siempre requiere un
marcador (ya sea fluorescente o radioactivo).
Todo ello confiere a los biosensores la posi-
bilidad de realizar no slo un anlisis cualitativo
(s/no) y cuantitativo, sino tambin la posibilidad
de evaluar la cintica de la interaccin (constan-
te de afinidad, asociacin, disociacin, etc.) y, por
tanto, elucidar los mecanismos fundamentales
de dicha interaccin. Las tcnicas de anlisis de
laboratorio ms habituales, ya sea de sustancias
qumicas o biolgicas, suelen ser laboriosas, con-
sumen mucho tiempo y en la mayora de la oca-
siones requieren personal especializado para su
empleo. Frente a ellas, los biosensores ofrecen
la posibilidad de hacer medidas directas, conti-
nuas, de forma rpida y con alta sensibilidad.
El trmino nanobiosensor designa a los
biosensores cuyas propiedades vienen modu-
ladas por la escala nanotecnolgica con la que
estn fabricados. Los nanobiosensores pueden
mostrar una sensibilidad mucho mayor que la
de los dispositivos convencionales y adems
ofrecen las ventajas del pequeo tamao y la
portabilidad, lo que posibilita su utilizacin en
cualquier lugar, como el hogar o la consulta del
mdico. Con estos nanodispositivos la cantidad
de muestra para hacer el anlisis es relativamen-
te baja (de micro a nanolitros), lo que significa
que los mtodos de extraccin de muestras de
pacientes pueden ser menos invasivos y menos
traumticos. Adems podran ser fcilmente in-
troducidos en el interior del cuerpo humano,
proporcionando datos mucho ms fiables del
estado de salud real de un paciente.
Dentro de los desarrollos de nanobiosensores
son de destacar los nanobiosensores fotnicos,
nanoplasmnicos, basados en nanoestructuras
(nanopartculas, nanotubos de carbono, nanoa-
lambres, etc.) y los biosensores nanomecnicos.
Biosensores nanofotnicos
Los biosensores nanofotnicos han demos-
trado un nivel de sensibilidad extremo para la
deteccin directa de protenas y ADN. En estos
sensores (tambin llamados de onda evanescen-
104 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
te) se hace uso de la forma particular en que se
transmite la luz en el interior de los circuitos
pticos; esta transmisin tiene lugar a lo largo
de la gua ptica mediante mltiples reflexiones
internas. A cada reflexin, una componente de
la luz, denominada onda evanescente, se propa-
ga en el medio que envuelve a la gua. La longi-
tud de penetracin de la onda evanescente es
de unos cientos de nanmetros y ofrece una
oportunidad nica e ideal para medir cualquier
interaccin biomolecular que tenga lugar en su
interior. Con estos sensores es posible evaluar
concentraciones de protenas en el nivel pico-
molar o variaciones de una nica base en el
ADN en tan slo unos minutos, necesitando
volmenes de muestra del orden de microlitros
y, en ocasiones, las muestras a analizar (orina,
suero) no necesitan un pretratamiento previo.
Los nanosensores fotnicos tambin permiten
la medida en el interior de una nica clula de su
estado metablico. Para este fin existen nano-
sensores que consisten en una fibra ptica muy
afilada (su extremo final tiene slo 30-50 nm)
lo que le permite penetrar a travs de la mem-
brana celular sin causar ningn dao y sin alterar
el funcionamiento normal de la clula. La fibra
ptica se biofuncionaliza con receptores espec-
ficos antes de su introduccin. Una vez dentro, la
nanosonda puede detectar especies qumicas y
sealizar procesos moleculares en localizaciones
especficas del interior de la clula. La deteccin
se realiza a travs de la interaccin del campo
evanescente de la luz que circula por la fibra p-
tica con la interaccin biomolecular, debida al bio-
rreceptor especfico anclado en la superficie del
extremo final de la fibra. Con esta tcnica se abre
la posibilidad de identificar cambios patolgicos
dentro de una clula individual e incrementar el
conocimiento sobre las funciones celulares in vivo,
como la divisin celular, la apoptosis, el funciona-
miento de las nanomquinas biolgicas, etc.
Biosensores nanoplasmnicos
El biosensor de Resonancia de Plasmn Su-
perficial (SPR) est basado en la variacin de
reflectividad de una capa metlica en contacto
con un medio biolgico. El biosensor SPR ha
sido ampliamente desarrollado, cientos de pu-
blicaciones aparecen cada ao en la literatura
especializada y numerosas compaas lo comer-
cializan en diferentes versiones. Este sensor per-
mite detectar de forma directa concentraciones
en el rango nanomolar de forma directa y sin
necesidad de marcadores fluorescentes.
En este sensor se deposita una capa metlica
delgada (generalmente una capa de oro de 50
nm de espesor) sobre un material dielctrico (p.
ej., un cristal). Excitando la interfase del metal y
el dielctrico en condiciones de reflexin inter-
na total, se obtiene una resonancia plasmnica
para un cierto ngulo de incidencia de la luz,
resonancia que se manifiesta en una absorcin
de la luz y, por tanto, un mnimo agudo en la
intensidad de la luz reflejada. La caracterstica
ms interesante de este efecto es que el n-
gulo de resonancia al que se genera la onda
plasmnica (de carcter evanescente) es muy
sensible a cualquier variacin que tenga lugar
en la superficie metlica, como puede ser una
inmunorreacin o cualquier otro tipo de inte-
raccin biomolecular. La interaccin se detecta
entonces como una variacin del ngulo de re-
sonancia. En la figura 4 se muestra el esquema
de un sensor de SPR y su mecanismo de fun-
cionamiento.
Como alternativa, se estn desarrollando ac-
tualmente biosensores basados en el fenmeno
de resonancia de plasmn en nanopartculas. En
el caso de stas, y debido a su pequeo tamao,
la oscilacin de los electrones est muy locali-
zada en ciertas zonas de las nanopartculas (v.
mapas de intensidad en la fig. 4), por lo que el
fenmeno se denomina resonancia de plasmn
superficial localizada (LSPR). Tal como se indica
en la figura 4, la adsorcin de (bio)molculas
sobre las nanopartculas provoca cambios de
color, que se pueden emplear para la deteccin.
A pesar de que los lmites de deteccin podran
ser similares que los obtenidos con los biosen-
sores SPR, el sistema experimental es mucho
ms sencillo en LSPR, ya que se mide transmi-
sin en lugar de reflexin y adems se puede
facilitar la miniaturizacin.
En ambos casos, los dispositivos permiten
portabilidad y requieren una cantidad de mues-
tra relativamente baja (de micro a nanolitros)
para hacer el anlisis y ya se ha demostrado su
utilidad en la deteccin de protenas en el ni-
vel nanomolar en muestras de pacientes (orina,
suero) sin necesidad de pretratarlas o de mu-
taciones puntuales en las cadenas de ADN sin
necesidad de marcadores fluorescentes.
Existen otros mtodos de deteccin que ha-
cen uso del fenmeno de LSPR de una forma
diferente. Por ejemplo, se han desarrollado de-
tectores de ADN basados en los cambios de
color que se producen debido a la agregacin
de nanopartculas de oro marcadas con cade-
nas de ADN complementarias a la que se in-
tenta reconocer.
Biosensores nanomecnicos
Otro tipo de nanobiosensor con grandes
perspectivas en nanodiagnstico son los bio-
sensores nanomecnicos, que emplean como
sistema de transduccin la deflexin nanom-
trica de una micropalanca o el desplazamiento
de su frecuencia de resonancia al interaccionar
con el sistema biolgico. El cambio en la posi-
cin y movimiento de la micropalanca induci-
do por el reconocimiento molecular ocurre a
escala de unos pocos nanmetros, y de aqu
deriva el nombre de biosensores nanome-
cnicos. La figura 5 muestra las imgenes de
algunos de estos sensores. Las micropalancas
tienen un rea sensora muy pequea (del or-
den de 1.000 m2), lo que permite el anlisis
de cantidades de sustancia inferiores al fe-
mtomol. Adems se fabrican con tecnologa
microelectrnica estndar, lo que proporciona
produccin en masa a bajo coste y permite la
fabricacin de miles de micropalancas en un
mismo proceso, que podran ser empleadas
para la deteccin simultnea de miles de anali-
tos de la misma muestra.
Nanomedicina: ampliacin de la nanotecnologa en la salud 105
 Desarrollos como los nanosensores fotnicos
o los nanomecnicos, fabricados a miles gracias
a la tecnologa microelectrnica, abren un ca-
mino para la fabricacin de nanobiochips gen-
micos y protemicos, que a diferencia de los
actuales biochips, llevan incorporado un sistema
de transduccin de la interaccin (no se nece-
sitaran marcadores fluorescentes), con los que
sera posible conseguir en muy poco tiempo
una inmensa cantidad de informacin gentica
y protemica que permitir elaborar vacunas,
identificar mutaciones indicativas de enferme-
dades, identificar nuevos frmacos, identificar
patgenos, etc. de forma mucho ms rpida que
utilizando las tecnologas convencionales.
Sistemas laboratorio-en-un-
chip
La integracin en sistemas lab-on-a-chip
ser otra de las reas fundamentales de trabajo,
que permitir la descentralizacin de las medi-
das. El trmino lab-on-a-chip (o laboratorio
en un chip) describe el desarrollo de platafor-

A
LASER Photodetectora array

I II

I
II
priam

Au layer

Flow of anlytea

1.200
1 2
Scattering Intensity

800

400

0
450 500 550 600
Wavelength (nm)

Figura 4. A) Funcionamiento de un biosensor SPR. La interaccin biomolecular que tiene lugar sobre
el oro se detecta mediante el desplazamiento de la curva plasmnica. B) Fotografas de microscopia
electrnica de nanopartculas de oro (esferas y cilindros) y la localizacin de la resonancia plasmnica.
La resonancia vara cuando se colocan los analitos en la superficie.

106 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana

mas integradas y miniaturizadas donde tienen
lugar complejas reacciones qumicas y bioqu-
micas. Estas plataformas se estn constituyendo
como una tecnologa revolucionaria en el sec-
tor clnico. Las micro y las nanotecnologas han
proporcionado las herramientas necesarias para
llevar a cabo esta innovacin en el diagnstico
molecular, al permitir la fabricacin e integracin
de micro/nanobiosensores, microcanales, micro-
actuadores, etc. en un mismo chip. El empleo de
estos dispositivos aporta las ventajas de rapidez
en el anlisis, reducido volmenes de muestra,
alto grado de automatizacin y su carcter por-
ttil y desechable.
Un simple microsistema con nanosensores in-
corporados podra ofrecer un diagnstico com-
pleto a partir de una gota de sangre mediante
la identificacin (de otra manera imperceptible)
de cambios moleculares; esto implica que los
anlisis podran hacerse a domicilio. Cuando se
empiecen a reemplazar los caros y lentos anlisis
de laboratorio por estos anlisis de microchips
ms baratos, rpidos y cmodos, el impacto en
organizaciones sanitarias y sus pacientes ser
muy importante.
Pero, a pesar de estos incipientes desarrollos,
todava queda mucho camino por recorrer y para
al futuro, sera deseable contar con nanodisposi-
tivos que cumplieran la mayora de los siguientes
requisitos: robusto, barato, posibilidad de multia-
nalito, deteccin a niveles de pico/femtomolar o
incluso en el nivel de una sola molcula, rpidos y
directos, porttiles, de fcil manejo por parte de
personal no especializado, de multiuso o suficien-
temente barato para ser de un nico uso.
El trabajo futuro se encamina tanto al desarrollo
de nuevas estrategias de inmovilizacin y de pro-
teccin, para permitir nanobiosensores comple-
tamente reversibles y regenerables y que puedan
funcionar in situ en muestras complejas (como
es la sangre) y que sean biocompatibles para ser
implantados in vivo. La inclusin de los nanodis-
positivos en el interior del cuerpo preservando
su funcionalidad ser un logro paradigmtico en
nanodiagnstico. Los nanobiosensores implanta-
dos podran funcionar como centinelas dentro
del cuerpo humano y emitir una seal de alarma
ante la aparicin de las primeras clulas enfermas.
Ya se han obtenido pequeos avances (a nivel
micro), como pldoras con cmaras de imagen
que pueden tragarse, sensores que pueden reali-
zar medidas in vivo durante operaciones, etc. Est
ser sin duda una de las grandes reas de trabajo
de la nanomedicina en los aos venideros. La fi-
gura 6 recoge una visin del empleo futuro de
los dispositivos nanobiosensores.
Figura 5. Biosensores nanome-
cnicos empleados en nanodiag-
nstico.Las micropalancas se do-
blan unos nanmetros cuando
tiene lugar una reaccin de re-
conocimiento molecular en su
superficie. El nanobiosensor de
matrices de micropalancas pue-
de emplearse como biochip de
ADN o protemico segn la
biofuncionalizacins.
Nanomedicina: ampliacin de la nanotecnologa en la salud 107
Liberacin controlada
de frmacos
La nanomedicina se ha propuesto como una
posible solucin para el desarrollo de nuevos
sistemas de liberacin controlada de frmacos.
La idea consiste en utilizar nanoestructuras que
transporten el frmaco hasta la zona daada y,
solamente cuando han reconocido esa zona, lo
liberen como respuesta a un cierto estmulo.
Para ello es necesaria la previa encapsulacin o
desactivacin de los frmacos para que no ac-
ten durante su trnsito por el cuerpo hasta lle-
gar al lugar afectado, de forma que mantengan
intactas sus propiedades fsico-qumicas y que
se minimicen posibles efectos secundarios en
otras zonas del cuerpo. Una vez que el frmaco
ha llegado a su destino, debe liberarse a una
velocidad apropiada para que sea efectivo, lo
cual se puede hacer mediante una variacin de
ciertas condiciones (pH o temperatura, p. ej.)
en la zona daada, o mediante un control preci-
so de la velocidad de degradacin del material
encapsulante, permitiendo que la liberacin del
frmaco sea controlada.
Para la administracin de frmacos se ha pro-
puesto una gran variedad de nanoestructuras,
como nanopartculas, nanocpsulas, dendrme-

Nanobiosensores en urgencias

Tecnologas Beneficios
Nanofotnica Datos en tiempo real e in-situ
Nanotubos, nanopartculas Imagen a nivel celular
Nanomecnica, NEMS Herramientas quirrgicas de precisin guiadas por sensores

Nanobiosensores en la consulta

Beneficios
Tecnologas Anlisis completo en minutos
Biochips Diagnsticos rpidos y precisos
Nanoarrays de alta densidad Tratamientos especficos y personalizados

Nanobiosensores en casa

Tecnologas Beneficios
Wireless Auto pruebas diagnsticas simples
Dispositivos porttiles con batera Transmisin automtica de datos a historial clnico
Displays de alta resolucin

Figura 6. Futuro de la utilizacin de nanobiosensores como sistemas de nanodiagnstico. Adaptado de

General Electric.

108 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana

 Nanopartculas Dendrmeros Nanocpsulas Liposomas
polimricas

Figura 7. Diferentes tipos de nanosistemas que pueden emplearse en la dosificacin de frmacos.

ros, liposomas, micelas, nanotubos, conjugados algunos de ellos se recogen en la tabla 2, as

polimricos, microgeles, etc. (fig. 7). La nanotec-
nologa permite que la liberacin del frmaco
sea mnimamente invasiva, ya que estos nano-
sistemas pueden atravesar poros y membranas
celulares. Otra gran ventaja es que la efectividad
del medicamento se ve incrementada mediante
el control preciso de la dosis requerida y del
tamao, la morfologa y las propiedades superfi-
ciales del compuesto.
En la actualidad ya se encuentran disponibles
en el mercado numerosos frmacos desarrolla-
dos basados en principios de la nanotecnologa;
como la fase de desarrollo en la que se encuen-
tran actualmente.
Terapia basada
en nanopartculas
Adems de elementos de reconocimiento y
diagnstico, las nanopartculas pueden utilizar-
se tambin como agentes teraputicos. Una
vez que las nanopartculas se unen a tejidos

Tabla 2. Ejemplos de frmacos nanoestructurados

Nano estructura Fase de desarrollo Ejemplos

Liposoma
Albuminoso
Micela polimrica
Conjugado polmero/frmaco
Liposoma dirigido
Nanopartcula de polmero
Partcula inorgnica o metlica
Dendrmero
Aprobado por la FDA DaunoXone, Docil
Aprobado por la FDA Abraxane
Ensayos clnicos Genesol-FM, SP1049C, NK911, NCQ12,
NC105, NC-6004
Ensayos clnicos XYQTAX, Pegamotrecan, APS346, etc.
Ensayos clnicos MCC-465,MBP-426, SGT-53
Ensayos clnicos FCE28069 (PK2), CALAA-01
Ensayos clnicos (oro) y Nanotubos de carbono, partculas de slice,
preclnicos nanopartculas de oro
Ensayos preclnicos Poliamidoamina (PAMAM)

Nanomedicina: ampliacin de la nanotecnologa en la salud 109

daados o a clulas cancerosas, se puede indu-
cir su calentamiento mediante aplicacin de un
campo magntico de baja intensidad (para na-
nopartculas magnticas) o por irradiacin con
luz infrarroja (para nanopartculas metlicas). A
pesar de que los mecanismos son diferentes, en
ambos casos el calentamiento provoca la des-
truccin de las clulas tumorales por hiperter-
mia, sin afectar a las clulas o tejidos sanos que
las rodean. La utilizacin de esta tecnologa para
el tratamiento del cncer evitara los graves pro-
blemas de efectos secundarios de los actuales
tratamientos de quimioterapia o radioterapia.
Estos experimentos ya han demostrado
su utilidad en pacientes humanos. Una de las
principales nanoterapias es la desarrollada por
la empresa alemana MagForce Nanotechnolo-
gies AG, que ha recibido recientemente (julio
de 2010) la aprobacin de la Agencia Europa.
El sistema de nanoterapia de MagForce se basa
en el uso de nanopartculas de xido de hierro
recubiertas de aminosilano. La aplicacin con-
creta, recientemente aprobada para su uso en la
clnica para tratamiento de tumores cerebrales,
consiste en inyectar estas nanopartculas mag-
nticas en la zona del tumor y posteriormente
aplicar un campo magntico alternante de alta
frecuencia, que produce un calentamiento local
de la zona tumoral debido la vibracin de las
nanopartculas y, por consiguiente, la destruc-
cin de las clulas cancerosas. La terapia podra
aplicarse a diferentes tipos de tumores slidos.
La aprobacin de este nuevo mtodo terapu-
tico abre las puertas a los mtodos teraputicos
basados en la nanotecnologa.
Nanomedicina regenerativa
La nanomedicina regenerativa se ocupa de la
reparacin o sustitucin de tejidos y rganos
enfermos o daados mediante la aplicacin de
mtodos procedentes de la terapia gnica, la
terapia celular, la dosificacin de sustancias bio-
rregenerativas y la ingeniera de tejidos, estimu-
110 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
lando los propios mecanismos reparadores del
cuerpo humano. Las principales aportaciones
de la nanotecnologa a la medicina regenerativa
estn relacionadas con la produccin de nuevos
materiales y sistemas de soporte, la utilizacin
de clulas madre embrionarias y adultas y la
produccin de molculas bioactivas que sirvan
como seales de diferenciacin celular.
En la ingeniera de tejidos, la nanotecnologa
puede jugar un papel predominante, al facilitar
nuevos materiales y tcnicas que permiten una
integracin de los tejidos de forma ms eficien-
te por la posibilidad de generar microambien-
tes ms propicios para la regeneracin tisular.
La principal dificultad radica en encontrar ma-
teriales adecuados que permitan la fabricacin
de estructuras que mantengan activo el rgano
afectado mientras se regenera la zona daada.
Entre los materiales que se estn utilizando
cabe destacar los nanotubos de carbono, las
nanopartculas como hidroxiapatita o zirconia,
las nanofibras de polmeros biodegradables, los
nanocomposites, etc.
Uno de los mayores logros es el desarrollo
de biomateriales con capacidad de imitar a la
matriz extracelular, constituyendo un autntico
soporte, idntico al que aparece de forma natu-
ral en las clulas, sobre el que pueden crecer las
clulas progenitoras para posteriormente im-
plantarlo en el paciente y as reparar o sustituir
el rgano daado.
Tambin se pueden utilizar superficies na-
noestructuradas que pueden actuar como in-
cubadoras de lneas celulares, favoreciendo el
proceso de diferenciacin celular. Un ejemplo
se muestra en la figura 8, donde una superficie
nanoestructurada con nanotubos de carbono
ha permitido el crecimiento y proliferacin de
redes neuronales; tambin puede observarse
una estructura tridimensional con huecos or-
denados, fabricada mediante replicacin inversa
de un cristal opalino, en cuyo interior se han
crecido hepatocitos. Esta estructura podra pro-
porcionar la rigidez necesaria para mantener el
hgado mientras se desarrolla el crecimiento de
las clulas encargadas de regenerarlo.
Otra posibilidad es el diseo de biomateriales
inteligentes que incorporen en su seno mol-
culas de sealizacin que, una vez insertadas en
el paciente, sean liberadas de forma gradual y
activen la regeneracin tisular in vivo.
Gracias a la nanomedicina, las clulas madre
pluripotenciales y los factores de sealizacin se-
rn componentes esenciales de implantes inteli-
gentes y multifuncionales que podrn reaccionar
en funcin del microambiente que le rodee y fa-
cilitar entonces la regeneracin del tejido daado
de forma especfica y en el mismo lugar.
Es de prever tambin que se puedan desa-
rrollar nanoestructuras artificiales que puedan
detectar y reparar daos en el organismo, de la
misma forma que las nanoestructuras naturales
lo hacen (p. ej., los linfocitos de la sangre). As,
se ha propuesto de forma terica la fabricacin
de unas nanoestructuras para sustituir la hemo-
globina, denominadas respirocitos. Los respi-
rocitos son clulas rojas nanofabricadas con una
enorme capacidad para transportar oxgeno y
que puede permitir pasar varias horas bajo el
agua sin respirar. Segn los clculos de su crea-
dor, con una inyeccin de respirocitos podramos
vivir con el corazn parado durante 4 horas o
bucear durante 2,5 horas. Otros interesantes
desarrollos incluyen motores biomoleculares,
interruptores moleculares o nanoagujas que pe-
netren en el ncleo de clulas vivas con un alto
grado de precisin para realizar ciruga celular.

A B

C D

Figura 8. A) Red bidimensional nanoestructurada con nanotubos de carbono y utilizada como soporte
para la proliferacin de redes neuronales. B) Imgenes de microscopia electrnica del crecimiento de
osteoblastos. C) Crecimiento de vasos sanguneos artificiales. D) Crecimiento de clulas de fibroblasto
sobre un sustrato nanoestructurado.

Nanomedicina: ampliacin de la nanotecnologa en la salud 111

Conclusiones
El enorme avance de la nanotecnologa du-
rante las ltimas dcadas ha permitido grandes
desarrollos en muchos campos, incluidas las
ciencias de la salud. Los conceptos de la nano-
tecnologa se estn aplicando en mtodos de
diagnstico ms sensibles, sistemas de terapia y
de administracin controlada de frmacos, as
como en herramientas que permiten la regene-
racin de tejidos y rganos daados. Los siste-
mas y mtodos descritos en este captulo son
solamente ejemplos seleccionados de la ingente
actividad que se est desarrollando en miles de
laboratorios de todo el mundo para mejorar
las condiciones de salud y la calidad de vida de
toda la sociedad.
En el futuro, estos sistemas se integrarn en
microchips implantables que permitirn la admi-
nistracin programada de frmacos con un tra-
tamiento personalizado y que, al mismo tiempo,
podrn medir los parmetros vitales del pacien-
te y trasmitir esta informacin directamente a
una estacin central de datos, para tener con-
trolado al paciente mientras ste hace su vida
normal.Ya existen chips subcutneos para medir
de forma continua parmetros cruciales como
el pulso o la temperatura, nanopartculas que
pueden reconocer, detectar y atacar selectiva-
mente clulas cancerosas, as como nanosenso-
res que permiten detectar en fluidos biolgicos
cantidades extremadamente bajas de molculas
que revelan la existencia de cncer u otras en-
fermedades. Se estn fabricando actualmente
dispositivos laboratorio-en-un-chip y se ha
pasado a la etapa de ensayo clnico para nano-
partculas que realizan una liberacin controla-
da de frmacos. Sin embargo, los largos proce-
sos de aprobacin en los sectores mdicos y
farmacuticos pueden significar que los benefi-
cios para la salud slo podrn apreciarse a largo
plazo. Aunque todava es necesario llevar a cabo
una gran cantidad de investigacin y desarrollo,
112 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
no cabe duda de que la nanotecnologa seguir
sorprendindonos con avances que redundarn
en una mejora de la calidad de vida de nuestra
envejecida sociedad y que ayudar a resolver
los problemas causados por las principales en-
fermedades (cncer, desrdenes neurodegene-
rativos y enfermedades cardiovasculares).
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 8 Farmacocintica
de los medicamentos
obtenidos por biotecnologa
Alfonso Domnguez-Gil Hurl
Servicio de Farmacia
Hospital Universitario de Salamanca
Introduccin
Los medicamentos obtenidos por biotecnolo-
ga constituyen una clase teraputica emergente
en la clnica que presenta unas caractersticas
diferenciales no slo por su origen, sino tambin
por su estructura qumica y algunas propieda-
des farmacolgicas.
Los medicamentos biotecnolgicos incluyen
protenas obtenidas por ingeniera gentica,
anticuerpos monoclonales producidos me-
diante la tecnologa del hibridoma, vectores
para el transporte de material gentico, frag-
mentos de anticuerpos, oligonucletidos anti-
sentido, vacunas, etc. Estos productos presen-
tan algunas caractersticas que los diferencia
de los medica-mentos tradicionales. Su estruc-
tura qumica, por ejemplo, es ms compleja, ya
que se trata con frecuencia de protenas que
contienen un nmero elevado de aminoci-
dos (filgastrim 174, somatropina 191, alteplasa
527, etc.) con una determinada secuencia, con
especificidad en el nmero y localizacin de
los puen-tes disulfuro e incorporacin de una
o varias molculas de carbohidratos que son
necesarias para la actividad biolgica. La cade-
na proteica puede presentar adems hlices
en distinto nmero, tamao y configuracin.
Asimismo, algunas protenas activas requieren
Farmacocintica de los medicamentos obtenidos por biotecnologa
la asociacin de varias subunidades proteicas
para formar un gran agregado activo, estructu-
ra cuaternaria, como ocurre, por ejemplo con
el interfern--1b formado por dos protenas
idnticas de 165 kDa unidas por uniones no
covalentes [1].
Toda sustancia con actividad farmacolgica
queda definida no solamente por su configura-
cin estructural, sino tambin por sus propieda-
des fisicoqumicas y biolgicas, entre las que se
incluye el perfil farmacocintico que cuantifica,
mediante diversos parmetros, los procesos de
absorcin, distribucin, metabolismo y excre-
cin [2].
La farmacocintica se ha consolidado du-
rante los ltimos aos como una disciplina de
gran inters sanitario. Su aplicacin se dirige,
principalmente, hacia el desarrollo de nuevos
medicamentos y a la optimizacin de los trata-
mientos farmacolgicos [3]. Otras aplicaciones
menos conocidas son la deteccin diagnstica
de respuestas anmalas, el anlisis retrospectivo
de errores teraputicos o tratamientos inade-
cuados y las actividades educativas encaminadas
a asegurar el uso seguro y eficaz de los medica-
mentos. Dentro de la investigacin farmacol-
gica, la farmacocintica puede dirigirse tambin
a la resolucin de aspectos clnicos concretos,
como la deteccin de interacciones, problemas
113
 Parmetros farmacocinticos
Relacionados con el rgimen de dosificacin
Cmx, AUC
Otros:
F, Vd, CI
Parmetros farmacodinmicos
CE50
Respuesta farmacolgica
Figura 1. Relacin de la farmacocintica y de la farmacodinamia con la respuesta teraputica.
de biodisponibilidad, o a la definicin de par-
metros tiles para el diseo de regmenes de
dosificacin individualizados. La farmacocintica
es hoy de gran utilidad para todos los profe-
sionales implicados en el desarrollo, evaluacin
y uso de los medicamentos. Para la profesin
farmacutica tiene un especial inters, aunque
para su dominio se requiere, adems, una slida
formacin en teraputica farmacolgica y en el
seguimiento clnico de los pacientes.
La actividad intrnseca que presenta un fr-
maco es condicin necesaria, pero no suficiente
para asegurar la eficacia teraputica. El frmaco
precisa, necesariamente, alcanzar su lugar de ac-
cin, no siempre bien definido, en ocasiones dif-
cilmente accesible o cuya accesibilidad se modi-
fica con la gravedad de la enfermedad. Para ello
se puede requerir, por ejemplo, una biodisponi-
bilidad elevada, una amplia distribucin tisular o
un lento aclaramiento plasmtico. Unas propie-
dades farmacocinticas desfavorables pueden
llegar a condicionar el potencial teraputico de
un nuevo frmaco y aconsejar la interrupcin
de los ensayos clnicos programados en su de-
sarrollo. La figura 1 muestra esquemticamente
la contribucin de la farmacocintica y la far-
macodinamia en la respuesta a un tratamiento
farmacolgico [4].
114 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
Frmaco
en el lugar de accin
Fijacin a receptores
Procesos posreceptor Efecto
teraputico
Efectos bioqumicos
Los resultados obtenidos en los estudios far-
macocinticos, junto a los procedentes de los
ensayos de eficacia y seguridad, configuran el
perfil farmacolgico de un nuevo medicamen-
to, permitiendo establecer los principios bsicos
para su correcta utilizacin en la prctica clnica.
La investigacin de nuevos frmacos se
orienta, con frecuencia, a mejorar algunas ca-
ractersticas farmacocinticas, especialmente la
absorcin gastrointestinal, la distribucin tisular
y la velocidad de eliminacin. Ello se consigue
mediante cambios en la estructura qumica o
en la formulacin farmacutica, que puede mo-
dificar la cintica de liberacin, el acceso a los
tejidos e incluso los procesos de metabolismo y
excrecin [5]. Estos cambios permiten mejorar
la efectividad de los tratamientos, bien por cam-
bios en el perfil de la respuesta o facilitando la
administracin y mejorando el cumplimiento de
la prescripcin.
La estructura qumica que presentan la mayo-
ra de los productos biotecnolgicos condiciona
algunas propiedades que pueden dificultar su
utilizacin teraputica y que se reflejan en su
perfil farmacocintico. Entre ellas destacan la
baja biodisponibilidad por va oral, ciertas exi-
gencias en la distribucin tisular y celular y un
aclaramiento plasmtico elevado.
Biodisponibilidad oral,
pulmonar y nasal
Los pptidos y las protenas presentan una
baja biodisponibilidad por va oral, general-
mente inferior al 1%, por lo que en principio
no son candidatos idneos para utilizar esta
va de administracin. Ello es debido a su ines-
tabilidad en el medio fuertemente cido del
estmago, al efecto producido por las pepti-
dasas intestinales y, especialmente, a su escasa
permeabilidad como consecuencia del tamao
molecular, la carga elctrica y la elevada polari-
dad. La mayora de las protenas recombinan-
tes se incluyen dentro de la clase III del sistema
de clasificacin biofarmacutica, solamente al-
gunas pertenecen a la clase IV y es excepcio-
nal que algunas biomolculas se incluyan en la
clase I. Es decir, los productos obtenidos por
biotecnologa suelen presentar una solubilidad
en agua alta o moderada y una permeabilidad
intrnseca baja o muy baja [6]. Actualmente se
estn desarrollando diferentes estrategias para
mejorar la biodisponibilidad oral de pptidos
y protenas.
La va pulmonar constituye una alternativa a
la va oral para la administracin de pptidos y
protenas destinadas tanto a conseguir una ac-
cin local en el sistema respiratorio como para
producir efectos sistmicos. El empleo de bio-
molculas se inici hace ms de 70 aos, cuando
se comprob la absorcin parcial de la insulina
administrada en forma de aerosol.
Para ejercer un efecto localizado, el frmaco
debe alcanzar de forma eficiente la superficie
a travs del flujo areo, penetrando o incluso
atravesando la barrera mucosa para alcanzar su
lugar de accin. La tecnologa de los aerosoles
ha alcanzado en los ltimos aos un desarrollo
que permite el control de las variables que pue-
den reducir el rendimiento del proceso.
Los agentes mucolticos (dornasa-) y las anti-
proteasas (inhibidores leucoproteasa, proteinasa-
1, etc.) son ms efectivos cuando se dispersan
Farmacocintica de los medicamentos obtenidos por biotecnologa
en las secreciones del flujo areo en las zonas en
las que se produce una mayor obstruccin. Los
antioxidantes y los factores de crecimiento pre-
cisan, sin embargo, alcanzar las clulas epiteliales,
mientras que la terapia de transferencia gnica
precisa no slo alcanzar el epitelio pulmonar,
sino tambin las glndulas submucosas o las c-
lulas progenitoras de epitelio.
La mucosa pulmonar constituye una barrera
importante para el paso de los frmacos que
estn destinados a alcanzar el epitelio, acentua-
da en presencia de procesos inflamatorios o
infecciosos.
Diversos factores dependientes del frmaco,
como carga de las partculas, solubilidad y ta-
mao, as como las propiedades biofsicas del
mucus, afectan a la capacidad para atravesar esta
barrera [7]. As, se ha demostrado la existencia
de una relacin inversa entre el peso molecular
del frmaco y la difusin a travs del mucus, que
es especialmente manifiesta a partir de 30 kDa.
La difusin a travs del mucus se ve dificultada
por la fijacin a algunos componentes, como la
mucina, ADN, etc. y al efecto de diversas enzi-
mas. Entre los factores que aumentan la capa-
cidad de difusin figuran la superficie efectiva
de tensoactivo y el incremento en el tiempo de
retencin de las partculas.
La va inhalatoria presenta algunas caracters-
ticas ideales para la consecucin de efectos sis-
tmicos; as, destaca especialmente la superficie
de absorcin, aproximadamente de 100 m2 con
pequeo espesor, de 100-200 nm.
Las molculas pequeas se absorben por di-
fusin pasiva o transporte mediado por recep-
tores. En el caso de macromolculas, los ppti-
dos pequeos, con un peso molecular inferior
a 40 kDa, pueden absorberse por transporte
paracelular, mientras que para valores superio-
res participa la transcitosis, mediada, en algunos
casos, por receptores de membrana. El proceso
puede ser relativamente rpido, con valores de
Cmx de 10-30 minutos para pequeos pptidos
solubles, hasta varias horas cuando se trata de
grandes protenas.
115
 La va nasal ha recibido en los ltimos aos
considerable atencin debido a algunas carac-
tersticas diferenciales respecto al tracto gas-
trointestinal y otras mucosas, como la escasa
actividad proteoltica, la reducida cobertura
mucosa, el pH, que se mantiene prximo a la
neutralidad, y la ausencia de alimentos o pro-
ductos de la digestin que pueden reducir la
biodisponibilidad.
La va nasal tambin puede utilizarse para la
administracin de pptidos y protenas destina-
das a ejercer efectos sistmicos. Para molculas
pequeas, constituidas por 10 aminocidos, la
biodisponibilidad es elevada, alcanzando en al-
gunos casos el 100%. Sin embargo, para mol-
culas mayores de 25 aminocidos se produce
un descenso muy acusado de la biodisponibili-
dad, hasta el 1% o incluso valores inferiores.
Las posibilidades de la va nasal para la ad-
ministracin de biomolculas pueden verse
aumentadas con la incorporacin de agentes
viscosizantes, que aumentan su tiempo de con-
tacto con la mucosa, y molculas bioadhesivas,
que incrementan la permeabilidad.
La va nasal ha sido utilizada por sus ventajas
para la administracin de hormonas peptdicas
(desmopresina, oxitocina, calcitonina, etc.), aun-
que debe asegurarse el cumplimiento terapu-
tico por parte de los pacientes. Se encuentran
formulaciones en avanzado estado de desarro-
llo para administracin endonasal de glucagn,
insulina, hormona de crecimiento, hormona
liberadora de hormona de crecimiento, soma-
tostatina, etc. La formulacin de insulina ha teni-
do mayores dificultades, debido a su tendencia a
la agregacin de hexmeros en disolucin acuo-
sa y a su naturaleza hidroflica. Por ello, para su
introduccin en clnica ha precisado de la incor-
poracin de promotores de absorcin.
La va nasal parece ofrecer buenas expectati-
vas para la administracin de vacunas. Los ant-
genos administrados por va intranasal pueden
absorberse a travs de los ndulos linfticos
cervicales, pasar directamente a la circulacin
sistmica debido a la alta densidad en la vas-
116 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
cularizacin de la mucosa o ser captados por
el tejido linfoide nasal (NALT) rico en clulas
M con capacidad para el transporte vesicular
transcelular de partculas y macromolculas.
Administracin parenteral
Debido a las limitaciones de la va oral, los
pptidos y las protenas se administran habi-
tualmente por va parenteral, preferentemente
intravenosa. La mayora de estas molculas pre-
sentan un rpido aclaracin, lo que conduce a
valores bajos en la semivida de eliminacin.
Los problemas que surgen con la administra-
cin parenteral de macromolculas que presen-
tan un rpido aclaramiento ha estimulado el de-
sarrollo de diferentes actuaciones dirigidas, en
principio, a modificar el perfil farmacocintico y,
en consecuencia, facilitar su administracin. Esto
se ha conseguido mediante cambios estructu-
rales, por conjugacin con diversos polmeros,
por hiperglicosilacin de las protenas y con el
desarrollo de formulaciones parenterales de li-
beracin controlada [8-10].
La conjugacin de pptidos y protenas con
diversos polmeros constituye actualmente un
rea de gran inters, especialmente en la tera-
putica oncolgica, a la que se han incorporado
protenas antitumorales, enzimas, citocinas, etc.
La conjugacin con polmeros produce cambios
significativos en el perfil farmacocintico de las
macromolculas, permitiendo superar algunas
de las limitaciones que presentaban para su
utilizacin clnica. El principal cambio es un in-
cremento en la semivida de eliminacin con un
aumento de la captacin celular por endocitosis.
Una vez en sangre, se produce la liberacin del
conjugado a los compartimentos endosmicos
y lisosmicos de la clula, con descenso del pH
(5,5-6,0). Una vez alcanzado el lisosoma se pro-
duce la degradacin metablica por accin de
las hidrolasas intracelulares.
La pegilacin de protenas con una o varias
cadenas de polietilenglicoles (PEG) es, posible-
mente, el mecanismo de conjugacin ms de-
sarrollado. Los PEG son polmeros lineales o
ramificados constituidos por unidades de xido
de etileno (-CH2-O-CH2-) que presentan dos
grupos hidroxilo terminales, los cuales pueden
ser activados qumicamente [11]. La reaccin
de pegilacin ms frecuente implica al grupo
-amino de la lisina o grupos amino terminales
de las protenas. Las biomolculas conjugadas
presentan propiedades fisicoqumicas diferentes
de las protenas originales, como cambios en la
conformacin, impedimento estrico, capacidad
de unin electrosttica, valores de pK locales de
la lisina, hidrofobia, punto isoelctrico, etc. Estos
cambios pueden quedar reflejados, en principio,
por variaciones en la actividad, detectada me-
diante ensayos in vitro, y en la eficacia, estableci-
da con ensayos in vivo. La fijacin a receptores
se reduce progresivamente al aumentar la masa
molecular del polmero, lo que produce un des-
censo de la actividad in vitro con tiempos de
incubacin cortos. Sin embargo, la eficacia de la
protena se incrementa como consecuencia de
los siguientes mecanismos:
Retraso en el aclaramiento renal de la pro-
tena, que produce un incremento en la se-
mivida de eliminacin y en el valor del rea
bajo la curva de niveles sricos. Este ltimo
parmetro refleja el periodo de exposicin
y se relaciona, en ocasiones, con la eficacia en
modelos pK-pD.
Mayor estabilidad frente a las enzimas respon-
sables de la degradacin de pptidos y prote-
nas, frecuentemente como consecuencia del
impedimento estrico.
Menores efectos adversos debido a que el
PEG reduce significativamente la inmunoge-
nicidad y antigenicidad de las protenas.
La pegilacin produce importantes cambios
en el perfil pK-pD de los pptidos y protenas
utilizados en clnica. Actualmente se dispone de
varias protenas pegiladas y son numerosas las
que se encuentran en diferentes fases de de-
Farmacocintica de los medicamentos obtenidos por biotecnologa
sarrollo. La PEG-ADA (adenosina desaminasa)
est aprobada para el tratamiento de la defi-
ciencia de ADA en pacientes con inmunodefi-
ciencia combinada grave. Se trata de un conju-
gado de ADA con mltiples cadenas de PEG de
un peso molecular de 5 kDa. La consecuencia
ms inmediata es un cambio en la semivida de
eliminacin de la enzima de unos pocos minu-
tos a aproximadamente 24 horas.
La pegilacin de interferones tambin produ-
ce cambios significativos en el perfil farmaco-
cintico-farmacodinmico que pueden suponer
un progreso en el tratamiento de la hepatitis C
y otras indicaciones. La figura 2 muestra el efec-
to provocado en las concentraciones sricas
del interfern--2a como consecuencia de su
conjugacin con el PEG. El efecto depende del
tamao del polmero y se ha considerado que
dos cadenas ramificadas de 20 kDa proporcio-
naban un perfil farmacolgico idneo para el
desarrollo clnico [12].
Durante los pasados 20 aos se han estu-
diado numerosos conjugados de protenas
con PEG (citotxicos, antioxidantes, enzimas,
trombolticos, citocinas y factores de creci-
miento hematopoytico, etc.), aunque slo
algunos se encuentran en fase de desarrollo
clnico. La conjugacin con PEG tambin se ha
aplicado a oligonucletidos y lpidos para au-
mentar su solubilidad, estabilizar las molcu-
las, incrementar la permeabilidad o disminuir
el aclaramiento [13].
Los glucoconjugados son los compuestos re-
sultantes de la unin covalente de una fraccin
glucdica con otro compuesto, que puede ser
protdico o lipdico. La eritropoyetina recombi-
nante es una glucoprotena utilizada desde hace
ms de 10 aos en el tratamiento de la anemia
renal. Su excrecin renal es mnima, y es amplia-
mente metabolizada en el hgado va recepto-
res de la galactosa. Los residuos de cido silico
eliminados en el proceso de biotransformacin
aseguran la estabilidad de la hormona y su ac-
tividad biolgica. El metabolito desprovisto de
cido silico es rpidamente eliminado, siendo
117
 Interfern--2a PEG-Interfern--2a (5 kDa)
12 1,6
Concentracin

Concentracin
1,2
8
0,8
4
0,4

0 0
0 25 50 75 100 125 150 0 25 50 75 100 125 150
Tiempo (h) Tiempo (h)

25 PEG-Interfern--2a (40 kDa)

20
Concentracin

15
10
5
0
0 25 50 75 100 125 150
Tiempo (h)

Figura 2. Farmacocintica de interfern y dos derivados pegilados.

la semivida de eliminacin de la eritropoyetina crocpsulas, microesferas, nanoesferas e implan-

de 4-8 horas.
Diversos estudios experimentales han demos-
trado que hay una relacin directa entre el conte-
nido de cido silico y la semivida de eliminacin
de las glucoprotenas, lo que ha sido un estmulo
para la bsqueda de nuevas molculas.
Darbepoetina es un anlogo hiperglicosilado
de eritropoyetina que presenta distintas pro-
piedades fisicoqumicas y biolgicas. La figura 3
recoge la estructura de ambas molculas esti-
mulantes de la eritropoyesis, as como la evo-
lucin de los valores sricos obtenidos tras su
administracin por va intravenosa. La principal
consecuencia del cambio producido en el perfil
farmacocintico es la modificacin del intervalo
de la posologa, que pasar de 3 a 4 das con eri-
tropoyetina a 7-14 das con darbepoetina [14].
En los ltimos aos se han desarrollado nu-
merosas matrices polimricas biodegradables y
biocompatibles que se han incorporado a mi-
tes para conseguir una liberacin prolongada de
pequeas molculas. Actualmente algunos de
estos polmeros se utilizan en el diseo de for-
mulaciones parenterales de medicamentos ob-
tenidos por biotecnologa [15]. Entre ellos des-
tacan los poli (-hidroxicidos) como el cido
polilctico y el polihidroxibutrico y los copol-
meros, especialmente el cido lctico-cido gli-
clico. Estos productos no son inmunognicos
y permiten, por sus propiedades fisicoqumicas,
controlar la velocidad de liberacin de pptidos
y de protenas.
Distribucin tisular
y celular
La incorporacin de los frmacos a rganos y
tejidos corporales es un proceso cintico com-

118 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana

 Darbepoetina
10 Eritropoyetina

Concentracin srica (ng/ml)

Eritropoyetina Darbepoetina
1

3 enlaces-NH-glicosdicos 5 enlaces-NH-glicosdicos
0,1
14 residuos cido sialico 22 residuos cido sialico
30.400 Da 38.500 Da
40% carbohidratos 52% carbohidratos 0,01
0 12 24 36 48 60 72 84 96
Tiempo posinyeccin i.v. (horas)

Figura 3. Estructura y farmacocintica de eritropoyetina y darbepoetina.

plejo con una gran repercusin en la respuesta miento de fibroblastos (FCF) no produce res-
teraputica. La velocidad de distribucin puede puesta angiognica en modelos experimentales
estar limitada por la perfusin sangunea o por de isquemia miocrdica. Por esto ha sido nece-
la permeabilidad lo que condiciona el acceso y sario recurrir a la administracin directa en el
permanencia en su lugar de accin. La fraccin miocardio, en el saco pericrdico o en el espa-
de la dosis de un frmaco que alcanza finalmen- cio perivascular para alcanzar la respuesta tera-
te los tejidos o incluso los espacios intracelula- putica deseada. La eficacia de estas alternativas
res obedece a numerosos factores, muchos de fue confirmada y evaluada por la medida del flu-
ellos dependientes de sus propiedades fisico- jo y funcin miocrdica, aunque se hace preciso
qumicas. Por ello, las pequeas molculas con an aplicar nuevas tcnicas, como la tomografa
un ptimo coeficiente de reparto acceden con de emisin de positrones o la resonancia mag-
facilidad a los compartimentos perifricos y pre- ntica para establecer, de forma ms precisa, la
sentan valores elevados del volumen aparente extensin de la respuesta angiognica.
de distribucin, a diferencia de los pptidos y Una situacin ms problemtica se plantea
protenas que muestran valores relativamente cuando se precisa el acceso intracelular de ge-
pequeos. El elevado peso molecular de algunas nes y oligonucletidos antisentido cuya diana
biomolculas constituye un factor limitante de est localizada en el compartimento citosol/
la distribucin tisular. Sin embargo, en algunos ncleo [17]. Se han propuesto diferentes meca-
casos es posible alcanzar el lugar de accin en nismos para explicar la interiorizacin de estas
concentracin suficiente para producir una res- molculas, como la endocitosis en fase fluida y
puesta teraputica adecuada. la endocitosis mediada por receptores, ya que
La especificidad en la localizacin del lugar no hay evidencia de paso por difusin pasiva,
de accin de muchos frmacos obtenidos por ni siquiera recurriendo a biomolculas neutras.
biotecnologa obliga a mayores exigencias en su En el momento actual, la escasa capacidad de
perfil de distribucin. El desarrollo de los facto- interiorizacin y la inadecuada compartimenta-
res de crecimiento y genes recombinantes para cin intracelular constituyen un problema bsi-
promover la angiognesis en el infarto de mio- co en el progreso de la teraputica antisentido.
cardio es un buen ejemplo de la importancia Recientemente se han desarrollado diferentes
de esta caracterstica farmacocintica [16]. La mtodos fsicos (microinyeccin, permeabili-
administracin intravenosa del factor de creci- zacin, electroporizacin, etc.), que mejoran

Farmacocintica de los medicamentos obtenidos por biotecnologa 119

la captacin celular de los oligonucletidos en
relacin con los mtodos convencionales de
conjugacin o los que recurren a transporta-
dores (liposomas, lipoplexes, policationes, etc.).
Tambin puede recurrirse a la administracin
de estos medicamentos en el tejido diana, como
el fomivirsen, administrado por inyeccin intra-
vtrea directa en el tratamiento de la retinitis
por citomegalovirus.
La selectividad en la distribucin permite me-
jorar la relacin beneficio-riesgo de numerosos
medicamentos, lo que puede incrementar su
potencial teraputico. Esta ltima consideracin
ha vuelto a poner de actualidad el concepto de
bala mgica, idealizacin introducida por Paul
Erlich hace casi un siglo y que, gracias a la biotec-
nologa, puede convertirse en una realidad [18].
Los sistemas de transporte coloidal, como
liposomas, nanopartculas, microsferas, etc., se
han utilizado para prolongar el tiempo de circu-
lacin de numerosas molculas, protegerlas de
la degradacin y dirigirlas a tejidos diana. Estos
sistemas tienen dificultades para acceder a los
tejidos sanos, debido, entre otros factores, a su
tamao, especialmente si supera 20 nm, consi-
derado el tamao crtico para la mayora de los
tejidos.
El desarrollo de los anticuerpos monoclona-
les representa una de las tcnicas ms pode-
rosas para dirigir frmacos, txicos, istopos y
enzimas a su lugar de accin. El gemtuzumab
es un anticuerpo recombinante humanizado
dirigido frente al antgeno CD33 y unido a la
calicheamicina, un potente antibitico tumoral.
Se trata del primer frmaco vectorizado intro-
ducido en quimioterapia y fue aprobado por la
FDA a finales del ao 2000 en el tratamiento
de la leucemia mieloide aguda en casos de re-
cidivas. Gemtuzumab se une al antgeno CD33,
expresado en el 80-90% de los pacientes con
leucemia mieloide aguda, penetrando en la clu-
la y liberando el agente citotxico que provoca
la muerte celular.
El potencial teraputico de estos agentes se
ha incrementado desde la introduccin de la
120 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
tecnologa del hibridoma en la dcada de 1970,
y actualmente se dispone de frmacos inhibido-
res de la reactividad aloninmune y autoinmune,
antitumorales, antiplaquetarios antivirales, etc. En
Espaa, se han introducido recientemente tras-
tuzumab, infliximab y rituzimab, aunque otros
muchos se encuentran en diferentes fases de
desarrollo, alcanzando casi el 25% de todos los
productos obtenidos por biotecnologa [19].
A pesar de las ventajas potenciales que pre-
sentan al fijarse selectivamente a las clulas
diana, su incorporacin a la teraputica mostr
mayores dificultades de las inicialmente previs-
tas. Entre ellas, la capacidad limitada de penetra-
cin tisular que depende, entre otros factores,
de las dimensiones del anticuerpo. Los anticuer-
pos convencionales son protenas de elevado
peso molecular que presentan una baja capa-
cidad de acceso a los tejidos especialmente
los que tienen una escasa vascularizacin. En
teraputica oncolgica con anticuerpos mono-
clonales, la relacin de concentraciones entre el
tumor y la circulacin sistmica se incrementa
lentamente durante varios das debido, a la eli-
minacin del anticuerpo y, en menor grado, a la
captacin tumoral [20].
Conclusin
La efectividad clnica de los medicamentos
obtenidos por biotecnologa est condicionada
por su perfil farmacocintico. Algunas relaciones
pK-pD confirman que los parmetros farmaco-
cinticos son buenos factores de prediccin de
la respuesta teraputica.
Por su estructura qumica, estas biomolculas
presentan algunas limitaciones para su utiliza-
cin clnica, especialmente una biodisponibilidad
oral baja y un rpido aclaramiento plasmtico.
Por ello, se han realizado importantes esfuerzos
para mejorar sus caractersticas farmacocinti-
cas, entre las que debe destacarse la importan-
te contribucin de la tecnologa farmacutica
mediante el diseo de diferentes formulaciones
que mejoran sensiblemente el perfil farmaco-
cintico. El profesor Robert S. Langer, del Mas-
sachusetts Institute of Technology, uno de los
investigadores de mayor prestigio en el diseo
de formas de liberacin de medicamentos sea-
laba recientemente: I am very excited by the fact
that the first protein delivery systems are coming
on the market and that a lot of a protein delivery
systems are moving into the clinic....
De forma progresiva se van incorporando
nuevas biomolculas al arsenal teraputico, in-
dicadas especialmente en el diagnstico y tra-
tamiento de patologas graves. Una progresin
similar experimenta la formulacin farmacutica,
que ha culminado recientemente con la presen-
tacin de un microchip aplicado a la liberacin
controlada de medicamentos, incluidos ppti-
dos y protenas.
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121
 9 Aplicaciones
de la biotecnologa
recombinante vegetal
a la teraputica humana
Fernando Ponz
Centro de Biotecnologa y Genmica de Plantas (UPM-INIA)
Campus de Montegancedo. Pozuelo de Alarcn. Madrid
Desarrollo
de la biotecnologa vegetal
Durante las dos ltimas dcadas se han pro-
ducido en el conjunto de las actividades liga-
das a la investigacin gentica en plantas una
serie de innovaciones y cambios tecnolgicos
que se han englobado bajo la denominacin
de biotecnologa vegetal y que constituyen una
verdadera revolucin, no slo de la investiga-
cin y el desarrollo agrario, sino de toda una
concepcin de la agricultura tradicional y de la
utilizacin econmica de las plantas. Sin duda
la capacidad de generar plantas transgnicas
constituye una de estas nuevas tecnologas so-
bre las que pivota el cambio global que se est
produciendo. Hoy da, prcticamente ya no hay
ninguna especie vegetal cultivada importante
para la que no se disponga de la capacidad de
transgnesis.
Transgnesis vegetal mediante
Agrobacterium tumefaciens
La transgnesis vegetal no se realiza en la
actualidad de un modo nico. Los primeros
122 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
desarrollos, todava ampliamente utilizados,
se basaron en la capacidad natural de la
bacteria A. tumefaciens y relacionadas para
integrar de forma estable par te de su ma-
terial gentico en el genoma de sus plantas
husped. La manipulacin subsiguiente del
genoma de Agrobacterium permiti dispo-
ner en breve plazo de vectores desarmados
(exentos de la capacidad de inducir enfer-
medad que poseen los aislados naturales de
la bacteria) para llevar a cabo integraciones
estables de genes forneos. La clonacin de
estos genes en los vectores de Agrobacte-
rium permite que la bacteria los integre en el
genoma de las futuras plantas transgnicas.
En general, el proceso de transformacin se
complementa con un conjunto de tecnolo-
gas de cultivo in vitro de tejidos vegetales,
que permiten regenerar plantas enteras fr-
tiles a par tir de determinados tejidos trans-
formados cultivados. Como se ha dicho, esta
tecnologa de generacin de plantas trans-
gnicas se utiliza todava ampliamente, aun-
que ms recientemente se han desarrollado
otras formas de transformacin de plantas,
lo cual a su vez ha permitido ampliar el aba-
nico de especies transformables.
Otros mtodos
de transformacin de plantas
De entre todos los desarrollos habidos des-
de las primeras transformaciones de discos de
hojas de tabaco con Agrobacterium, merecen
destacarse 2 por la simplicidad que han aadi-
do al proceso. En primer lugar la biolstica, que
implica el disparo de microproyectiles de oro,
wolframio, etc., recubiertos del ADN que se
desea integrar en el genoma de la planta. Esta
tcnica evita la utilizacin de la bacteria en el
proceso de transformacin y es especialmente
interesante en los casos de especies vegetales
que no son huspedes naturales de la bacteria,
como es el caso de los cereales (en general, de
las plantas monocotiledneas). El otro desarro-
llo reciente es el que permite en algunas espe-
cies, sobre todo experimentales, llevar a cabo
la transformacin con la bacteria directamente
sobre las flores, lo que posibilita la obtencin
directa de semillas de plantas transgnicas sin
necesidad de recurrir al cultivo in vitro.
Genmica y protemica
vegetales
Disponer de plantas transgnicas constituye
un hito importante en el desarrollo de la bio-
tecnologa vegetal, pero no es el nico. En efecto,
la capacidad para el anlisis pormenorizado de
los genomas vegetales, tanto en su vertiente es-
tructural como funcional, se ha desarrollado en
paralelo con la transgnesis y empieza a permi-
tir la racionalizacin de muchos de los procesos
clsicos de la mejora gentica y, tambin, de la
propia transgnesis. Las nuevas disciplinas de la
genmica y la protemica, cuyas aplicaciones al
estudio del genoma humano estn provocando
toda una nueva forma de buscar y disear fr-
macos, estn tambin teniendo un fuerte impac-
to en la biotecnologa vegetal. La conjuncin de
ambas tecnologas supone un potencial enorme
de incidencia en procesos de desarrollo contro-
lado de las plantas, as como de su utilizacin para
otras reas biotecnolgicas, como por ejemplo
Aplicaciones de la biotecnologa recombinante vegetal a la teraputica humana
la farmacia. Como en tantas otras ocasiones an-
teriores, el desarrollo tecnolgico ha permitido
poner de manifiesto conceptos de ndole ms
fundamental, en un proceso de alimentacin mu-
tua muy caracterstico de todas las actividades
de I + D. As, por ejemplo, fenmenos como la
cosupresin y el silenciamiento gnico mediado
por ARN se han descubierto y estudiado por
primera vez en plantas, gracias al propio desarro-
llo tecnolgico de la biotecnologa vegetal. Tras
su descubrimiento en el campo vegetal, se ha
demostrado en los ltimos 2-3 aos la existen-
cia de fenmenos similares en animales, incluido
el hombre, abarcando todo un nuevo sistema
de regulacin de la expresin gnica basado en
micro-ARN. Las implicaciones de este descubri-
miento en las aproximaciones teraputicas a en-
fermedades, tanto genticas como infecciosas, se
estn revelando en la actualidad de una enorme
importancia.
Generaciones de productos
vegetales biotecnolgicos
Primera generacin de plan-
tas y productos vegetales
transgnicos
Las primeras variedades transgnicas de al-
gunas plantas de cultivo mundial muy extenso
como, por ejemplo, el maz, la soja, la colza o
el algodn, ya han llegado al mercado y tanto
ellas como sus productos derivados estn en
estos momentos en el centro de una fuerte po-
lmica social que se est desarrollando en va-
rios frentes y a diferentes niveles. Los ejemplos
citados forman parte de lo que se ha dado en
llamar la primera generacin de plantas y pro-
ductos transgnicos. Su principal caracterstica
es que las modificaciones genticas que se les
han introducido van a dirigidas a mejorar ca-
ractersticas de las plantas que son de inters
fundamentalmente para sus productores, o sea,
para los agricultores. As, plantas que expresan
123
constitutivamente un gen de una toxina para
insectos procedente de una bacteria, que so-
brexpresan una enzima que inactiva la accin
de un herbicida o que son resistentes a una
virosis gracias a la resistencia conferida por la
produccin en planta de fragmentos del propio
virus, son plantas de un inters obvio e inmedia-
to para el productor primario. La Organizacin
para la Cooperacin y Desarrollo Econmico
(OCDE), que ha estudiado intensamente en los
ltimos aos el fenmeno de la biotecnologa
desde muchos ngulos, ha definido esta primera
generacin de cultivos transgnicos centrada
en caractersticas agronmicas para conferir
mayores rendimientos en las cosechas median-
te la reduccin de prdidas y espaciamientos
menores entre hileras, y para reducir costes de
insumos mediante la disminucin del uso de
plaguicidas y herbicidas. Otras dos caractersti-
cas de los productos de la primera generacin
son su irrelevancia para el consumidor final, as
como que no suponen un cambio de mercado.
Se trata, en definitiva, de plantas cuyos produc-
tos van dirigidos a los mismos mercados que
sus parientes no transgnicas y que no suponen
cambios sustanciales para el consumidor, excep-
to quiz su menor precio, consecuencia de unos
menores costes de produccin.
Segunda generacin
de plantas y productos vegetales
transgnicos
Existen ya una segunda y una tercera genera-
cin de plantas transgnicas, cuya llegada al mer-
cado se est produciendo an con timidez, pero
de las que se espera un gran impacto comercial
en los prximos aos. De nuevo segn la OCDE,
la segunda generacin de plantas transgnicas
se centra en una serie de caracteres relaciona-
dos con la calidad, que mejorarn su aplicacin
en los sistemas de produccin de alimentos as
como sus caractersticas de uso finales. Cose-
chas con modificaciones en las grasas, aceites
y almidones para mejorar el procesamiento y
124 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
la digestibilidad, como sojas de alto contenido
en cido oleico, colzas de alto estearato o cido
lurico (cultivndose ya en los Estados Unidos),
maz de bajo fitato o cido ftico. Desde un
punto de vista industrial se pueden esperar, p.
ej., plantas de algodn coloreado que eviten o
disminuyan la necesidad de tintes qumicos (al-
gunas ya disponibles). Se aprecian en esta se-
gunda generacin algunos cambios sustanciales
en relacin con la primera. En primer lugar hay
un cambio de mercado final. Las modificaciones
genticas ya no se hacen pensando fundamen-
talmente en el productor, sino en el consumidor
del producto final, al cual se le proporciona un
producto de mayor calidad. Por supuesto es
posible combinar caractersticas tpicas de esta
segunda generacin con otras de la primera, si
se desea o el mercado lo demanda. As, es po-
sible producir patatas con unas caractersticas
de almidn ms adecuadas para su congelacin
y fritura directa en freidora, que adems sean
resistentes al escarabajo de la patata median-
te la expresin de la toxina bacteriana. La otra
caracterstica de algunos de los productos de
la segunda generacin es que presentan un
aspecto de interfase con cuestiones ms clsi-
camente relacionadas con problemas de salud
humana que con consideraciones meramente
agroalimentarias. Por ejemplo, la produccin de
aceite de soja con un mayor contenido en cido
oleico se har teniendo muy en cuenta factores
de salud relacionados con enfermedades car-
diovasculares, adems de otros factores de pro-
duccin agraria,o algunas de las modificaciones
en los metabolismos de hidratos de carbono de
plantas como la patata o algunos cereales con-
siderarn el tamao creciente de mercado que
suponen los consumidores diabticos.
Tercera generacin de plantas
y productos vegetales
transgnicos
Si la segunda generacin de productos bio-
tecnolgicos vegetales supone un grado de so-
fisticacin considerable en relacin con los de la
primera, aun lo ser ms con los productos de
la tercera generacin. La OCDE predice que es-
tas plantas producirn ms factores de calidad
de cara a un producto final, como productos
de nutricutica o alimentos funcionales, que son
cosechas modificadas para producir medicinas
o suplementos alimentarios en la planta. Estas
plantas podran inducir inmunidad a enferme-
dades o mejorar caractersticas sanitarias de los
alimentos tradicionales, como, p. ej., colza con -
carotenos o arroz suplementado con vitamina
A. Tambin se prevn plantas que fijen nitrge-
no con mayor eficacia, disminuyendo por tanto
la necesidad de abonos, o plantas resistentes a
la sequa, las inundaciones y las temperaturas
extremas, as como plantas que se puedan utili-
zar en procesos de biorremediacin de suelos
y aguas. Tambin se ha sugerido la posibilidad
de producir plantas de algodn incombustible o
que no se arrugue, o plantas de colza que pro-
duzcan plsticos biodegradables (esto ya se ha
conseguido). Es en estos productos de tercera
generacin donde se producir el verdadero
cambio que aporta la biotecnologa a la produc-
cin vegetal. Los mercados a los que se dirigen
estos productos pueden ser tradicionales del
producto agrario, pero sern bsicamente mer-
cados nuevos. La interfase entre la produccin
vegetal e industrias que son en estos momentos
ajenas a la agricultura o utilizan productos agra-
rios de manera muy minoritaria, se ver fuer-
temente incrementada cuando estos productos
alcancen masivamente el mercado. De entre
todas estas industrias es quiz la farmacutica la
que se prev que se afecte antes en sus estruc-
turas de produccin de determinados produc-
tos por el impacto de la biotecnologa vegetal.
Hay dos niveles de impacto entre productos
biotecnolgicos vegetales y la produccin de
medicamentos. El primero es el de utilizar las
plantas como biofactoras de produccin de
frmacos o productos de inters farmacutico.
Esta actividad constituye el factor ms impor-
tante de lo que se denomina agricultura mo-
Aplicaciones de la biotecnologa recombinante vegetal a la teraputica humana
lecular (molecular pharming) y que se describe
con algo ms de detalle en el siguiente apar-
tado. La otra constituye una verdadera sntesis
entre la agricultura, la alimentacin y la farmacia,
y es la base de una nueva disciplina cientfica
emergente, la nutricutica, como parte de un
concepto ms general que es el del alimento
funcional. Conferir una funcionalidad sanitaria
al hecho de alimentarse supone profundizar en
una tendencia creciente en las sociedades avan-
zadas, como es la de la comida sana, confi-
riendo al hecho de alimentarse una vertiente
curativa, o ms bien, y en mayor medida, pre-
ventiva. Quedan mencionadas anteriormente
las posibilidades de plantas con suplementos
vitamnicos, pero quiz el paradigma de lo que
puede ser esta nueva actividad farmacutica lo
constituyan las llamadas vacunas comestibles.
Esta idea intenta explotar la inmunidad mucosal
de las personas y los animales (tambin aplica-
ciones veterinarias) mediante la presentacin
de antgenos con potencial vacunal por medio
de alimentos procedentes de plantas transgni-
cas que expresen dichos antgenos. Algunas de
las primeras pruebas realizadas en animales de
experimentacin han resultado muy promete-
doras y las pruebas clnicas ya han empezado
en algn caso. Adems de la posible implanta-
cin de este tipo de vacuna alimenticia en las
poblaciones infantiles de pases desarrollados,
lo cual resulta algo cuestionable desde el punto
de vista de la rentabilidad y ventajas econmi-
cas y de gestin, esta aproximacin presenta
una vertiente social de indudable valor, como
es poder alcanzar segmentos de poblacin que
en estos momentos no est sometida a pro-
gramas de vacunacin, fundamentalmente por
motivos econmicos especialmente en pases
no desarrollados. Ello podra incluir enferme-
dades infecciosas tropicales de baja incidencia
en pases desarrollados, como el clera, la ma-
laria o la fiebre amarilla, para las que se podran
plantear vacunaciones fundamentadas en vacu-
nas comestibles basadas en productos de alto
consumo (yucas, bananas, etc.).
125
Produccin de frmacos
en plantas
Produccin en plantas
transgnicas
La agricultura molecular ha comenzado su
andadura orientada bsicamente a la produc-
cin de frmacos en plantas y, de entre ellas,
los primeros productos que han despertado
el mayor inters entre los biotecnlogos ve-
getales han sido las protenas teraputicas.
Existen ya en la literatura cientfica numerosos
ejemplos de plantas transgnicas productoras
de protenas humanas con valor teraputico.
Los resultados obtenidos hasta el momento
permiten ser muy optimista con respecto a la
evolucin creciente de esta tecnologa, pero al
tiempo ilustran con claridad la complejidad de
situaciones que se pueden producir al generar
las plantas productoras. Algunos de los puntos
que se estn revelando claves para el xito o el
fracaso de esta aproximacin global son varia-
dos como, p. ej., las enormes diferencias de ex-
presin del transgn que se encuentran en los
distintos casos, la problemtica de extraccin
de las protenas producidas, el grado de simi-
litud en el procesamiento post-traduccional
de las protenas, etc. Cada uno de estos pun-
tos requerir un esfuerzo de afinamiento de
las condiciones de produccin que necesita-
r soluciones parcialmente distintas para cada
caso, por lo que es difcil en estos momentos
ir mucho ms all en las generalizaciones. En
la actualidad no hay todava ninguna protena
teraputica humana producida en plantas que
se encuentre en el mercado, pero ya hay al-
gunas en las fases de pruebas clnicas. Quiz
la ms avanzada sea un anticuerpo producido
en la planta del tabaco que se pretende utili-
zar, por medio de colutorios, en el tratamien-
to y prevencin de las caries y enfermedades
infecciosas de las encas. Los costes menores
de produccin de grandes volmenes de un
anticuerpo de estas caractersticas en plantas
126 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
de tabaco posiblemente permitan lanzar al
mercado ese tipo de producto sin disparar el
precio para el consumidor final. Al margen de
los problemas nuevos que se vayan poniendo
de manifiesto en la produccin de frmacos
en plantas segn se vayan desarrollando los
procesos, esta estrategia de produccin pre-
senta algunas ventajas inherentes respecto de
los mtodos tradicionales de extraccin de
tejidos humanos y animales o de procesos de
fermentacin. Queda ya mencionado el proba-
ble menor coste, pero hay ms: p. ej., el de la
seguridad sanitaria del frmaco. La reciente cri-
sis de las encefalopatas espongiformes bovinas
y su probable relacin con algunas enferme-
dades humanas del tejido nervioso ha puesto
claramente de manifiesto el riesgo de arrastrar
desde tejidos animales en los procesos de ex-
traccin, patgenos de difcil deteccin o eli-
minacin. Este riesgo se elimina totalmente en
las plantas, ya que stas no permiten la mul-
tiplicacin de estos patgenos (priones, virus
del SIDA, virus de las diferentes hepatitis, etc.).
Adems, las plantas pueden constituir el nico
sistema capaz de producir eficientemente cier-
tas protenas humanas, como reguladores del
crecimiento e inhibidores del ciclo celular, que
tendran un impacto negativo en los animales
transgnicos o en las clulas animales cultivadas
en las que se expresaran. Otra consideracin
es la de capacidad de produccin del frmaco,
la cual puede llegar a ser limitante en algunos
casos. Un caso citado con frecuencia de esta
ltima situacin es el del potencial tratamiento
del cncer mediante inmunoterapia. Clculos
efectuados en Estados Unidos predicen que
cada paciente puede llegar a necesitar entre
10 y 200 mg de anticuerpo recombinante an-
titumoral, lo cual, dado el ritmo de diagnstico
de nuevos casos (al ao, 650,000 de cnceres
de mama, pulmn y colon slo en los Estados
Unidos), puede llegar a crear una demanda de
unos 130 kg por ao en aquel pas. Prctica-
mente, slo la produccin en plantas puede
asegurar ese nivel de produccin a un precio
razonable.
Produccin mediada por virus
vegetales
El punto de la produccin de grandes can-
tidades del frmaco que se desea obtener ha
puesto de manifiesto un problema al que se
enfrentan las plantas transgnicas como va de
produccin. Como se ha mencionado previa-
mente, con la tecnologa disponible en la actua-
lidad es prcticamente imposible predecir los
niveles de expresin del gen forneo que se
alcanzarn en una lnea transgnica determina-
da y, de todas formas, parece razonable pensar
que la expresin a partir de un promotor tiene
que presentar lmites cuantitativos difciles de
sobrepasar. Por otra parte, establecer una lnea
transgnica productiva y genticamente estable
puede llevar muchos meses, incluso aos. Situa-
ciones como la de los anticuerpos antitumora-
les, mencionada anteriormente, son claramente
incompatibles con estas limitaciones pues se
trata de frmacos personalizados de los que se
necesitan grandes cantidades en perodos bre-
ves de tiempo (semanas a unos pocos meses).
Este tipo de consideraciones, junto con algunas
otras de carcter ms cercano a la estrategia
comercial, han hecho que bastantes investiga-
dores y empresas de biotecnologa se hayan
fijado en los virus vegetales como vehculos de
expresin de los genes forneos. Los virus vege-
tales suelen ser agentes infecciosos muy simples
genticamente, por lo que su manipulacin ge-
ntica no resulta excesivamente compleja. Ge-
neralmente se multiplican hasta alcanzar niveles
de acumulacin de viriones bastante elevados,
lo cual se encuentra tambin para algunos de
sus productos gnicos individuales y, por extra-
polacin, para protenas producidas a partir de
genes forneos introducidos en ellos. Adems,
desde el punto de vista de la rapidez de pro-
duccin, resulta mucho ms rpido generar un
virus transgnico que una planta transgnica. Es-
tas caractersticas hacen de los virus vehculos
de expresin muy interesantes y que se estn
desarrollando rpidamente en la actualidad. Una
consideracin adicional para algunas aplicacio-
Aplicaciones de la biotecnologa recombinante vegetal a la teraputica humana
nes es que es factible combinar ambas estrate-
gias (plantas transgnicas y vectores virales), lo
cual permitira elegir lo mejor de ambas.
La interfase virus vegetales/
nanobiotecnologa biomdica
En los ltimos 5 o 6 aos varios grupos pio-
neros en algunos centros de investigacin es-
tn explorando intensamente la posibilidad de
aprovechar los viriones vegetales como nano-
partculas con aplicaciones biomdicas. El desa-
rrollo de la nanotecnologa en biomedicina est
acelerndose notablemente y el hecho de que
los viriones sean en s mismos nanopartculas
biolgicas naturales, no ha pasado desapercibi-
do. Viriones vegetales pertenecientes a distintos
virus han sido convertidos en plataformas por-
tadoras de pptidos, anticuerpos, antgenos de
todo tipo, molculas contraste para utilizacin
en diagnstico por imagen, o nanovasijas por-
tadoras de drogas antitumorales, por citar slo
unas cuantas aplicaciones. Aunque todava lejos
de la utilizacin clnica, los resultados obtenidos
hasta la fecha permiten ser muy optimista en
este campo, que sin duda va ser uno de los de
mayor expansin en el futuro prximo.
La estructura de la empresa
biotecnolgica farmacutica
vegetal
El rpido desarrollo de la biotecnologa vege-
tal est contribuyendo tambin, junto con otros
desarrollos biotecnolgicos, a la profunda trans-
formacin que se est experimentando en la ac-
tualidad en la estructura empresarial de varios
sectores industriales ligados a las ciencias de la
vida. Hay caractersticas muy llamativas de la nue-
va situacin. Por un lado, surgen constantemente
(sobre todo en Estados Unidos) nuevas peque-
as empresas con un alto contenido tecnolgico
que contribuyen de manera muy significativa al
rpido desarrollo de la biotecnologa; muchas
de estas empresas fracasan en su proyecto em-
presarial o son finalmente absorbidas por otras
127
empresas mayores. Por otro, este proceso de ab-
sorcin empresarial se da tambin entre grandes
empresas multinacionales, lo cual est generando
una situacin de concentracin empresarial sin
precedentes. Otra caracterstica es la de la crea-
cin de un sector industrial completamente nue-
vo, que se denomina de empresas de ciencias
de la vida. Este tipo de empresas se diferencian
de las clsicas farmacuticas o de productos
agrarios o alimentarios en que integran en su
seno ambos mundos, reflejo de la interfase cre-
ciente entre ambas actividades, que se ha co-
mentado varias veces a lo largo de este captulo.
Con referencia al futuro, es razonable pensar que
ambas tendencias (nuevas pequeas empresas
tecnolgicas y grandes grupos empresariales) se-
guirn desarrollndose, creando una estructura
de produccin farmacutica nueva. Sin embargo,
el fenmeno es todava muy reciente y habr que
estar atento a su evolucin.
Referencias
El nmero de trabajos que abordan de mane-
ra pblica los temas referidos a la produccin de
frmacos en plantas mediante biotecnologa es
an limitado, dada su relativa novedad. Adems,
bastantes de estos trabajos se publican en revis-
tas especializadas de investigacin en plantas de
menor difusin en los ambientes mdicos o far-
macuticos. Sin embargo, en los ltimos aos se
han publicado un nmero importante de bue-
nos artculos de revisin sobre este tema que
proporcionan una visin general y un buen nivel
de informacin al lector interesado. Se presenta
a continuacin, como orientacin, una lista de
algunas de estas revisiones.
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 10 Evaluacin de medicamentos
biotecnolgicos en la Agencia
Europea de Medicamentos
(EMA), BWP (Grupo
de Biolgicos) y CHMP
(Comit de Medicamentos
de Uso Humano)
Sol Ruiz
Agencia Espaola de Medicamentos y Productos Sanitarios (AEMPS)
Introduccin
Durante la dcada de 1980, los avances en
ingeniera gentica y en el establecimiento y
cultivo de lneas celulares han permitido la ob-
tencin de multitud de protenas teraputicas
(p. ej., eritropoyetina, hormona de crecimiento,
interfern) que nunca hubiese sido posible ob-
tener en cantidad suficiente de sus fuentes na-
turales. Adems, el desarrollo de las tcnicas de
ingeniera de protenas ha permitido disponer
de protenas modificadas respecto a sus equi-
valentes naturales que presentan una mejor efi-
cacia clnica, un mejor perfil de seguridad o una
nueva aplicacin teraputica. As, se encuentran
disponibles anlogos de insulina o eritropoyeti-
na (p. ej., insulina lispro, darbepoetin alfa), pro-
tenas de fusin que combinan caractersticas
de dos protenas diferentes (p. ej., etanercept),
protenas conjugadas a polietilnglicol (p. ej., pe-
ginterferon, pegfilgrastim) o anticuerpos mono-
clonales humanizados (p. ej., alemtuzumab).
Evaluacin de medicamentos biotecnolgicos en la Agencia Europea de Medicamentos (EMA)...
Desde la creacin de la EMEA, actualmen-
te EMA, en 1995, la evaluacin de estos me-
dicamentos obtenidos mediante tecnologa
del ADN recombinante se realiza, por reque-
rimiento legal, mediante un procedimiento de
tipo centralizado, es decir, efectuado en todos
los pases de la Unin Europea a la vez y coor-
dinado por la EMA. Hasta la fecha se han auto-
rizado ms de 70 productos biotecnolgicos y
se espera que este nmero siga aumentando
durante los prximos aos. Adems, la investi-
gacin en nuevos sistemas de expresin per-
mitir obtener medicamentos biotecnolgicos
de fuentes menos convencionales como, p.
ej., animales transgnicos o plantas. La EMEA
autoriz en junio de 2006 el primer medica-
mento biotecnolgico (antitrombina III humana
recombinante) producido en la leche de cabras
transgnicas. Otros productos obtenidos en
conejos transgnicos, como C1 inhibidor, lac-
toferrina y fibringeno humano, se encuentran
en fase de desarrollo clnico o preclnico. Otros
129
medicamentos considerados de alta tecnologa
incluyen las denominadas terapias avanzadas,
que incluyen terapia gnica, terapia celular so-
mtica e ingeniera de tejidos. Las solicitudes de
comercializacin para estos productos se eva-
lan tambin mediante el procedimiento cen-
tralizado (solamente la autorizacin de ensayos
clnicos es responsabilidad nacional).
La legislacin comunitaria actual permite la
autorizacin de medicamentos biosimilares, es
decir, medicamentos biotecnolgicos equivalen-
tes a otros ya autorizados y cuya patente ha
expirado. Su autorizacin es tambin mediante
el procedimiento centralizado coordinado por
la EMA. Hasta ahora, siguiendo esta nueva va de
autorizacin, se han aprobado 14 medicamen-
tos biotecnolgicos que incluyen la hormona de
crecimiento humana, la eritropoyetina humana y
los factores estimuladores de colonias de granu-
locitos.
Marco legal y bases
para la creacin de una agencia
europea de evaluacin
de medicamentos
Los fundamentos de la UE se recogen en
el Tratado de Roma, ratificado inicialmente en
1957 por 6 pases. Aunque el tratado compro-
meta a sus signatarios a establecer un amplio
rango de medidas de armonizacin, dejaba la
organizacin de la sanidad y los sistemas de se-
guridad social a la decisin de cada pas. Cada
EM, por tanto, desarroll su propia regulacin
farmacutica.
Desde 1965, fecha de adopcin de la prime-
ra directiva de la UE, la legislacin farmacutica
comunitaria ha buscado dos objetivos funda-
mentales: la proteccin de la salud pblica y la
creacin de un mercado comn que permita la
libre circulacin de medicamentos.
La Comisin Europea (en adelante referida
como Comisin) comenz en 1965 a promulgar
Directivas (del ingls, Directives), es decir, leyes o
disposiciones comunitarias de carcter obligato-
rio, relacionadas con la regulacin farmacutica.
130 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
La Directiva 65/65/EEC del Consejo de 26 de
enero de 1965 estableci el principio de conce-
sin de autorizaciones de comercializacin de
especialidades farmacuticas en todos los EM
sobre criterios cientficos de calidad, seguridad
y eficacia, sin tener en cuenta consideraciones
de tipo socioeconmico. Diez aos ms tarde,
los EM consolidaron la experiencia adquirida
y se pusieron de acuerdo sobre principios co-
munes para la autorizacin y control de medi-
camentos de uso humano (Directivas 75/318/
CEE y 75/319/CEE del Consejo de 20 de mayo
de 1975). No obstante, cada EM mantena la
responsabilidad de conceder o denegar la auto-
rizacin para comercializar cada medicamento
en particular. Actualmente, tanto las directivas
citadas anteriormente como otras relacionadas
con medicamentos humanos han sido deroga-
das y sustituidas por la Directiva 2001/83/EC
del 6 de noviembre, posteriormente modifi-
cada y ampliada por la Directiva 2003/63/EC
del 25 de junio. Estas dos directivas constituyen
actualmente la legislacin bsica que regula los
medicamentos para uso humano. Otra directiva
posterior, 2004/27/EC, y la Regulacin (EC) No.
726/2004 modifican y delimitan tambin el m-
bito de aplicacin de la directiva 2001/83/EC.
En 1977 se constituy el denominado Co-
mit de Especialidades Farmacuticas o CPMP
(Committee for Proprietary Medicinal Products),
formado por representantes de todos los EM
y de la Comisin. A solicitud de un EM o de la
Comisin, el CPMP poda emitir un dictamen
consultivo sobre temas relacionados con la au-
torizacin de medicamentos y sobre el control
de reacciones adversas de los mismos (farma-
covigilancia).
En 1981 se adoptaron provisiones similares
para medicamentos de uso veterinario (Directi-
vas 81/51/CEE y 81/52/CEE del Consejo de 28
de septiembre de 1981), incluyendo la creacin
del Comit de Medicamentos Veterinarios o
CVMP (Committee for Veterinary Medicinal Pro-
ducts). Al igual que para medicamentos huma-
nos, estas directivas han sido sustituidas por otra
ms reciente, la Directiva 2001/82/EC.
 La creacin de estos comits supuso tam-
bin el inicio de un procedimiento coordinado
de evaluacin, con dictamen no vinculante, que
marc un paso importante en la cooperacin
entre EM. Aparte de los procedimientos de re-
gistro nacionales, las compaas farmacuticas
podan utilizar dos tipos de procedimiento de
registro comunitario: el procedimiento multi-
estado (ampliacin de la autorizacin existen-
te en 1 EM a 2 o ms de los restantes EM) o
el procedimiento de concertacin (evalua-
cin coordinada de la solicitud de autorizacin
en todos los EM; ningn EM poda tomar una
decisin individual sobre una autorizacin de
comercializacin antes de su discusin previa y
dictamen por el CPMP). Este ltimo procedi-
miento estaba reservado a los medicamentos
obtenidos por procesos biotecnolgicos y para
otros medicamentos de alta tecnologa.
Con el objeto de colaborar con el CPMP en
determinados aspectos de la evaluacin de me-
dicamentos, se crearon grupos de trabajo so-
bre calidad, seguridad y eficacia con objeto de
aproximar la forma en que cada EM pona en
prctica las obligaciones derivadas de las direc-
tivas comunitarias. Estos grupos de trabajo han
tenido su continuacin en grupos equivalentes
en el seno de la EMA.
Primeros pasos en la creacin
del grupo de biotecnologa
En 1985 se cre el denominado Ad Hoc Wor-
king Group on Biotechnology/Pharmacy (prece-
dente del grupo de biotecnologa de la EMA)
con dos objetivos fundamentales: asesorar al
CPMP sobre solicitudes de autorizacin de pro-
ductos biotecnolgicos y establecer recomen-
daciones especficas sobre la produccin y con-
trol de calidad y seguridad de estos productos.
Esta segunda finalidad se llev a cabo median-
te la elaboracin de directrices (guidelines) (dis-
posiciones de carcter no obligatorio basadas
en los conocimientos cientficos del momento
sobre un aspecto concreto). Se ha preferido la
utilizacin de directrices, que no obligan jurdi-
Evaluacin de medicamentos biotecnolgicos en la Agencia Europea de Medicamentos (EMA)...
camente, en vez de un instrumento jurdico for-
mal, como una directiva, con el fin de mantener
la flexibilidad y no poner obstculos legales al
progreso cientfico. Se admite que en algunos
casos, como resultado de los avances cientficos,
pueda ser adecuado otro enfoque. Sin embar-
go, cuando un solicitante decida no seguir una
determinada directriz debe explicar y justificar
dicha decisin en los informes que presente la
compaa en apoyo de su solicitud.
El Ad Hoc Working Group on Biotechnology/
Pharmacy estaba formado por expertos (alre-
dedor de 20) procedentes de diferentes reas
relacionadas con la biomedicina, desde auto-
ridades reguladoras, laboratorios nacionales
de control o investigadores a un representan-
te (observador) de la Farmacopea Europea
(PhEur). En esta etapa inicial se completaron
y/o iniciaron varias directrices sobre citocinas,
anticuerpos monoclonales y reduccin del ries-
go de transmisin de encefalopatas espongifor-
mes por medio de medicamentos. Este grupo
ha tenido continuacin como el Biotechnology
Working Party (BWP) dentro de la estructura de
la EMA, y recientemente ha pasado a denomi-
narse Biologics Working Party (BWP) sin que sus
funciones hayan variado.
Agencia Europea
de Medicamentos.
Procedimientos
de autorizacin
A finales de 1990 se publicaron varias pro-
puestas relacionadas con la creacin de la Agen-
cia y el nuevo sistema comunitario para autori-
zacin de medicamentos. En 1993 se decidi
fijar la sede de la EMEA en Londres y comenz
a funcionar como tal en febrero de 1995. La
funcin principal de la EMEA (hoy EMA) es
coordinar y organizar el sistema de autoriza-
cin de medicamentos en Europa. Este sistema
evala cualquier solicitud de comercializacin
131
bien mediante el denominado procedimiento
centralizado (autorizacin de comercializacin
en todos los pases de la UE a la vez; decisin
unnime o por mayora) o descentralizado
(tambin conocido como reconocimiento
mutuo, equivalente al anterior procedimiento
multi-estado (extensin de la autorizacin
existente en un EM a otros). El procedimiento
centralizado de autorizacin est reglamentado
por la Regulacin (EC) No. 726/2004. Este pro-
cedimiento es obligatorio para los medicamen-
tos que se describen a continuacin:
Obtenidos a partir de tecnologa del ADN
recombinante, o de la expresin controlada
de genes que codifican protenas biolgica-
mente activas en procariotas o eucariotas, in-
cluyendo las clulas de mamfero transforma-
das, u obtenidos a partir de hibridomas o que
emplean anticuerpos monoclonales durante
su produccin
Veterinarios empleados como potenciadores
para aumentar el crecimiento o rendimiento
de los animales tratados
Humanos para el tratamiento del sndrome
de inmunodeficiencia adquirida, cncer, dia-
betes y enfermedades neurodegenerativas. A
partir de 2008 tambin ser aplicable a en-
fermedades autoinmunes u otras alteraciones
inmunitarias y para enfermedades virales.
Medicamentos hurfanos (segn la Regula-
cin (EC) No 141/2000).
Existen actualmente 6 comits cientficos
principales dentro de la EMA: CHMP (Comi-
t de Medicamentos Humanos, previamente
CPMP), CVMP (Comit de Medicamentos Ve-
terinarios), COMP (Committee for Orphan Me-
dicinal Products; encargado de la concesin este
tipo de clasificacin a un medicamento), HMPC
(Committee for Herbal Medicinal Products;
encargado de plantas medicinales), PDCO
(Paediatric Committee; revisin de planes de in-
vestigacin peditricos) y CAT (Committee for
Advanced Therapies; propuesta de opinin sobre
132 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
medicamentos basados en terapias avanzadas
al CHMP) . Cada uno de estos comits est
formado por un representante de cada uno de
los EM. La EMA acta como el eje central del
sistema europeo, organizando y coordinando el
trabajo de evaluacin que es llevado a cabo por
expertos nacionales de cada una de las agencias
reguladoras.
Los comits PDCO y CAT son los de ms re-
ciente creacin. La funcin del PDCO (comit
peditrico) es evaluar los planes de investiga-
cin peditricos y emitir opiniones de acuerdo
a la Regulacin (EC) 1901/2006 (y sus modifi-
caciones posteriores). Este comit, sin embargo,
no es responsable de las autorizaciones de co-
mercializacin de medicamentos para uso pe-
ditrico, ya que esto sigue siendo competencia
del CHMP. El otro comit, CAT (Comit de Te-
rapias Avanzadas), comenz a trabajar en enero
de 2009. Su funcin principal es la evaluacin
de medicamentos de terapia avanzada (es decir,
de terapia gnica, terapia celular somtica e in-
geniera de tejidos) aunque su autorizacin final
corresponder tambin al CHMP. Se puede en-
contrar informacin adicional sobre este comit
en la Regulacin (EC) 1394/2007.
Evaluacin
de medicamentos de uso
humano y veterinario:
CHMP y CVMP
Desde la creacin de la EMEA ambos comi-
ts de medicamentos humanos y veterinarios,
CHMP y CVMP, respectivamente, continan su
labor mediante reuniones mensuales de varios
das de duracin. Una gran parte de la agenda
consiste en la discusin y emisin de dictmenes
respecto a nuevas solicitudes de comercializacin,
bien por el procedimiento centralizado o por el
descentralizado. En el procedimiento centraliza-
do, 2 miembros del comit (representantes de
pases distintos) son designados como ponen-
tes (rapporteur y co-rapporteur) para coordinar la
evaluacin de cada solicitud. Tras la evaluacin
en el mbito nacional, los informes de cada uno
de los ponentes son discutidos en las reuniones
del comit cientfico correspondiente (CHMP o
CVMP), y se emite un informe final vinculante
sobre dicho producto. La decisin final se trans-
mite a la Comisin que convertir dicha opinin
en una nica autorizacin de comercializacin
para toda la UE. Solamente quedan a decisin
nacional los aspectos relacionados con el precio
del medicamento y su posible financiacin por el
sistema nacional de salud.
El procedimiento descentralizado est basado
en el principio de reconocimiento mutuo de au-
torizaciones nacionales. Permite la extensin de
una autorizacin de comercializacin dada por
un EM (denominado EM de referencia o RMS) a
otro(s) EM identificados por el solicitante. Cuan-
do no sea posible llegar a un acuerdo porque
algn EM no acepte la autorizacin nacional ori-
ginal concedida por el RMS, los puntos de des-
acuerdo sern discutidos en el recientemente
creado Grupo de Coordinacin. Si el desacuer-
do permanece, la decisin del comit correspon-
diente (CHMP o CVMP) es siempre vinculante.
Independientemente del procedimiento
seguido, la decisin final la toma la Comisin
Europea o, en caso de desacuerdo importante
entre EM, el Consejo de la UE.
Los productos que vayan a comercializarse
nicamente en 1 EM pueden continuar utili-
zando la va de autorizacin nacional. Como se
ha descrito anteriormente, los productos bio-
tecnolgicos nunca podran utilizar esta va de
autorizacin.
Grupos de trabajo del CHMP
Con objeto de emitir una opinin sobre cual-
quier cuestin planteada a la EMA relacionada
con medicamentos, el CHMP cuenta con el
apoyo de grupos de trabajo que le asesoran en
aspectos especficos relacionados con la calidad,
Evaluacin de medicamentos biotecnolgicos en la Agencia Europea de Medicamentos (EMA)...
eficacia y seguridad de medicamentos y que
participan en las actividades de armonizacin
internacionales (ICH).
Actualmente existen diferentes grupos de
trabajo del CHMP y uno conjunto del CHMP/
CVMP (QWP). Algunos de ellos se mencionan
a continuacin:
Grupo de biolgicos (Biologics Working Party,
BWP; previamente Biotechnology Working
Party): asesora al CHMP, CAT y COMP sobre
aspectos relacionados con la produccin y
control de productos biolgicos y biotecno-
lgicos, incluyendo terapias avanzadas.
Grupo de eficacia (EfficacyWorking Party,EWP),
responsable de elaborar recomendaciones
metodolgicas en reas teraputicas estable-
cidas y documentos de opinin sobre aspec-
tos de eficacia de medicamentos en reas en
desarrollo clnico.
Grupo de seguridad (SafetyWorking Party,SWP),
discusin y recomendaciones sobre aspectos
de seguridad preclnicos.
Grupo de farmacovigilancia (Pharmacovigilan-
ce Working Party, PhWP), grupo de discusin
y evaluacin de aspectos relacionados con la
seguridad o cambios en la relacin riesgo/be-
neficio de medicamentos autorizados.
Grupo de hemoderivados (Blood Products Wor-
king Group, BPWG), encargado de aspectos de
seguridad y evaluacin clnica de productos
derivados de sangre o plasma humanos.
Grupo de vacunas (VaccineWorking Party,VWP),
evaluacin y discusin de aspectos relacio-
nados con la calidad, eficacia y seguridad de
vacunas.
Grupo de biosimilares (Similar Biological Me-
dicinal Products, BMWP), grupo encargado de
aspectos de seguridad y evaluacin clnica de
medicamentos biolgicos o biotecnolgicos
que se presentan como equivalentes a otro
ya autorizado.
Grupo de farmacogentica (Pharmacogenetics
Working Party, PgWP), grupo asesor del CHMP
en materias relacionadas con farmacogentica.
133
 Grupo de calidad (QualityWorking Party, QWP),
grupo conjunto del CHMP y CVMP para ar-
monizar y asesorar sobre aspectos de calidad
de medicamentos humanos y veterinarios.
Grupo de biolgicos (BWP)
Desde 1995 hasta ahora, el BWP viene cele-
brando unas 10-12 reuniones anuales, de varios
das de duracin, en la sede de la EMA. Este gru-
po est formado por un representante de cada
uno de los EM de la UE, un representante de la
Comisin, un representante de la Farmacopea
Europea, personal tcnico de la EMA y, desde
febrero de 2000, un representante de Norue-
ga y otro de Islandia se han incorporado como
miembros de pleno derecho (presentes desde
1999 en calidad de observadores).
El BWP es responsable de proporcionar asis-
tencia tcnica al CHMP y CAT sobre aspectos
relacionados con la fabricacin y control de
medicamentos biotecnolgicos y de origen bio-
lgico, incluyendo aquellos derivados de sangre
o plasma y productos inmunolgicos y medica-
mentos de terapias avanzadas. El BWP es tam-
bin el grupo asesor del COMP para productos
de origen biolgico o biotecnolgico y de la
OMS en los casos en que este organismo lo
solicite.
Las actividades principales del BWP se descri-
ben a continuacin:
Elaboracin de informes sobre los procesos de
produccin y control de las solicitudes de co-
mercializacin de medicamentos humanos de
origen biolgico y biotecnolgico. Los aspectos
relacionados con la calidad este grupo de me-
dicamentos se discuten en la reunin corres-
pondiente del BWP y se emite un informe
para su consideracin por el CHMP que, tras
la discusin de los aspectos toxicolgicos y
clnicos del medicamento en cuestin, emitir
un dictamen final sobre la aprobacin o re-
chazo de la solicitud correspondiente.
Elaboracin de directrices o recomendaciones
europeas e internacionales sobre temas espe-
cficos relacionados con productos biolgicos y
134 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
biotecnolgicos. Al igual que el resto de grupos
de trabajo, una de las tareas fundamentales
del BWP es la elaboracin de directrices o
recomendaciones, que sern despus apro-
badas por el CHMP, sobre temas especficos
relacionados con productos biolgicos y bio-
tecnolgicos. Con este fin, se suelen crear
subgrupos dentro del BWP que elaboran un
documento inicial sobre un tema especifico
que es discutido posteriormente en las se-
siones plenarias del BWP. En general, las di-
rectrices elaboradas por el BWP son objeto
de evaluacin continua a medida que se pro-
ducen avances cientficos en temas especfi-
cos. Expertos del BWP participan tambin en
grupos de trabajo internacionales para armo-
nizar criterios y recomendaciones entre la UE,
Estados Unidos y Japn (actividades ICH) so-
bre este grupo particular de medicamentos.
El BWP tambin proporciona asesoramiento
al CHMP en forma de documentos de opi-
nin o recomendaciones puntuales (Points to
Consider) sobre aspectos concretos relaciona-
dos con un grupo particular de medicamentos
(p. ej., aspectos relacionados con la evaluacin
de posibles vacunas de gripe atenuadas), intro-
duccin de nuevos requerimientos de control
(p. ej., test de PCR para la deteccin del virus
de la hepatitis C en volmenes de plasma para
la obtencin de hemoderivados), etc.
Asesoramiento cientfico. Las compaas farma-
cuticas tienen la posibilidad de solicitar ase-
soramiento cientfico en cualquier momento
durante el desarrollo de un medicamento
previo a la presentacin de una solicitud de
autorizacin de comercializacin o antes de
introducir determinados cambios en la fabri-
cacin de un medicamento ya autorizado. El
asesoramiento en aspectos de produccin y
control de medicamentos biotecnolgicos lo
realiza el BWP.
Organizacin de workshops y reuniones sobre
temas relacionados con medicamentos biolgi-
cos y biotecnolgicos. El BWP organiza reunio-
nes con expertos europeos e internacionales
con objeto de discutir los ltimos avances
 cientficos en determinadas reas que per-
mitan la elaboracin de recomendaciones
especificas, p. ej. productos de terapia gni-
ca, ensayos para la deteccin de marcadores
de encefalopatas espongiformes y su posible
aplicacin a medicamentos, etc. El BWP tam-
bin efecta reuniones con representantes de
la industria farmacutica implicados en temas
concretos con objeto de evaluar las implica-
ciones o consecuencias de la introduccin
de determinadas medidas de control o de
discutir la aplicacin de las mismas de forma
coordinada, p. ej. con representantes de fa-
bricantes de gelatinas y derivados de grasas
animales empleados en la fabricacin de me-
dicamentos.
Reuniones con otros grupos de trabajo de la EMEA
y de la PhEur.Miembros del BWP participan tam-
bin en reuniones conjuntas con miembros de
otros grupos de trabajo con objeto de coor-
dinar y facilitar la adopcin de recomenda-
ciones concretas, p. ej. la discusin sobre as-
pectos de seguridad del tiomersal (empleado
en la fabricacin de determinadas vacunas) se
llev a cabo junto con los Grupos de Seguri-
dad (SWP) y el de Farmacovigilancia (PhWP).
Miembros del BWP tambin forman parte de
grupos de trabajo de la PhEur para coordinar
actividades y recomendaciones en temas rela-
cionados con el control de calidad de produc-
tos biolgicos y biotecnolgicos en general.
Bibliografia
www.ema.europa.eu Informacin adicional sobre el BWP
y actividades de la EMA en general (incluyendo los do-
cumentos elaborados por los grupos de trabajo).
http://ec.europa.eu/health/index_en.htm
Salud Pblica y legislacin sobre medicamentos en la
Unin Europea.

Abreviaturas
BWP Biologics Working Party (previamente Biotechnology Working Party)
CAT Committee for Advanced Therapies
CHMP Committee for Human Medicinal products (previamente CPMP)
COMP Committee for Orphan Medicinal Products
CPMP Committee for Proprietary Medicinal Products (actualmente CHMP)
CVMP Committee for Veterinary Medicinal Products
EM Estado(s) Miembro(s)
EMA/EMEA European Medicines Agency (actualmente EMA)
HMCP Committee for Herbal Medicinal Products
ICH International Conference for Harmonization of Technical Requirements for Registration
of Pharmaceuticals for Human Use
OMS Organizacin Mundial de la Salud
PDCO Paediatric Committee
PhEur Farmacopea Europea
RMS Reference Member State
UE Unin Europea

Evaluacin de medicamentos biotecnolgicos en la Agencia Europea de Medicamentos (EMA)... 135

 11 Las empresas biotecnolgicas
y su importancia
en la terapia humana
Jos Luis Motelln
AMGEN
Resumen
Ante la creciente demanda de nuevos frma-
cos que mejoren la salud humana, la biotecnolo-
ga proporciona una nueva solucin a las nece-
sidades mdicas no cubiertas por el desarrollo
tradicional de frmacos qumicos. Hace 30 aos
se formaron las primeras compaas de biotec-
nologa, y su crecimiento ha sido exponencial
en los ltimos 5 aos, tanto en Estados Unidos,
cuyas empresas lideran el sector, como en la
Unin Europea. Las nuevas tcnicas diagnsticas
que aplican la inmunologa y la biologa molecu-
lar han ayudado a este crecimiento, junto con
las previsiones de un adecuado retorno de la
inversin. Las grandes empresas farmacuticas
tienden cada vez ms a fusionarse o comprar
biotecnolgicas para incrementar su pipeline
de productos. En Espaa se ha cuadriplicado el
nmero de empresas biotecnolgicas en los l-
timos 5 aos, contabilizndose 305 en el 2008.
Catalua y la Comunidad de Madrid concentran
la mayor actividad. La colaboracin en el futu-
ro entre empresas, universidades, laboratorios
pblicos e instituciones reguladoras ser im-
prescindible para impulsar la biotecnologa en
Espaa.
136 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
Introduccin: retos
para la terapia humana
en el futuro
La evolucin demogrfica de la poblacin
mundial, marcada por un nmero creciente
de habitantes y un envejecimiento progresivo,
comportar un aumento exponencial en la ne-
cesidad de nuevos medicamentos. Para el ao
2020 se estima una poblacin de 7.600 millones
de personas, frente a los 6.500 millones actua-
les, de los cuales casi el 10% sern mayores de
65 aos, con un aumento esperado del 3% en
esta franja de poblacin con respecto al ao
2005 [PDDESAUNS, 2004] La poblacin de
edad avanzada requiere un mayor nmero de
tratamientos. Se calcula que 3 de cada 4 perso-
nas con ms de 75 aos consume al menos 1
frmaco de prescripcin, mientras que el 36%
consume 4 o ms [UKDH, 2001].
Por otro lado, la mejora en las condiciones
econmicas de los pases emergentes, como
Brasil, China, India, Indonesia, Mxico, Rusia y Tur-
qua (pases E7), repercutir en un aumento de
la esperanza de vida y un cambio en el patrn
de alimentacin y costumbres. Se estima que el
producto interior bruto de estos pases se tripli-
car en los prximos 13 aos, y que los cambios
asociados convertirn la diabetes y la obesidad,
por ejemplo, en un problema pblico. El nmero
de pacientes con diabetes en pases en desarro-
llo podra pasar de 84 millones en 1995 a 228
millones en 2025. Por todo ello, se calcula que
en el ao 2020 los pases emergentes represen-
tarn el 20% de la demanda de medicamentos.
Adems de estos cambios demogrficos, los
avances en la medicina estn permitiendo que
enfermedades que antes presentaban una ele-
vada mortalidad a corto plazo se conviertan
en enfermedades crnicas. Las enfermedades
cardiovasculares, el SIDA y el cncer consti-
tuyen los principales ejemplos. El nmero de
muertes por ataques al corazn ha descendi-
do un 50% en la mayora de los pases indus-
trializados [TCU, 2004] y la expectativa de vida
a los 5 aos de pacientes con cncer entre
1999-2005 ha aumentado el 68% entre 1975
y 1977 [ACS, 2010]. Este aumento en la espe-
ranza de vida se asociar al repunte de otras
enfermedades distintas que antes presentaban
una incidencia muy baja, por lo que ser ne-
cesario desarrollar nuevos frmacos dirigidos
contra estas patologas.
Otro factor que puede generar la necesidad
de nuevos medicamentos es la aparicin de
resistencias a frmacos clsicos o de mutacio-
nes de organismos patgenos en el caso de las
enfermedades infecciosas. El CDC (Centers for
Disease Control and Prevention) de Estados
Unidos calcula que ms del 70% de las infeccio-
nes en hospitales americanos son resistentes al
menos a 1 de los antibiticos que ms frecuen-
temente se emplean para tratarlas [USNIAID,
2006]. Al mismo tiempo, estn apareciendo mu-
taciones en enfermedades existentes, como es
el caso del SARS (sndrome respiratorio agudo
severo), y el virus H5N1 de la gripe aviar. Por
todo ello deber continuar la bsqueda de nue-
vos antiinfecciosos.
Las empresas biotecnolgicas y su importancia en la terapia humana
El cambio climtico aumentar la temperatu-
ra del planeta, con una media aproximada de
0,2 C por dcada. Aunque se desconoce el im-
pacto que ello puede tener en la salud mundial,
se teme que enfermedades como la malaria, el
clera, la difteria y el dengue se trasladen a pa-
ses industrializados de latitudes ms elevadas.
En estos pases se ha observado ya un aumento
de la incidencia de asma y bronquitis, atribuido
al calentamiento del clima por una mayor pre-
sencia de polen en la atmsfera.
Todos estos cambios repercutirn de modo
significativo en la industria farmacutica, que de-
ber invertir en I + D (investigacin y desarro-
llo) para desarrollar nuevos medicamentos para
una mayor poblacin de edad avanzada y con
numerosas comorbilidades. En el marco de esta
investigacin, las compaas biofarmacuticas
sern imprescindibles para afrontar los nuevos
retos de la salud global, dadas las caractersticas
diferenciales de sus productos y procesos, que
representan un avance en el desarrollo de nue-
vos frmacos frente a los mtodos tradicionales.
La crisis en la generacin
de nuevos medicamentos
La productividad de la I + D en la industria
farmacutica debe aumentar en el futuro, en
paralelo con el incremento y envejecimiento
de poblacin mundial. Pero en la actualidad, el
desarrollo de nuevos frmacos representa un
enorme esfuerzo y se lleva a cabo con gran di-
ficultad. Como reflejo de ello, la industria farma-
cutica gasta mucho ms en I + D y produce
menos medicamentos que hace 20 aos.
Diversos factores intervienen en esta cre-
ciente complejidad. La preocupacin por la se-
guridad de los frmacos hace que las agencias
reguladoras cada vez sean ms conservadoras y
tengan requerimientos ms estrictos. Los ensa-
yos clnicos son ms difciles de iniciar, requieren
137
mayor nmero de pacientes y tiempo de segui- 318 a 802 millones de dlares), principalmente
miento, y son mucho ms caros de realizar que porque se han multiplicado por 4 los costes
hace 20 aos. Esto se debe a los crecientes re- en la fase de desarrollo clnico. El coste total
quisitos de control y rigurosidad que se aplican de la I + D de un nuevo frmaco ha pasado
para proteger la seguridad en los pacientes, la del equivalente a 100 millones de euros (M)
primera prioridad de las empresas farmacuti- (( ?? )) en 1975 a 1.000 M en la actualidad
cas y los profesionales sanitarios. Por otra par- [PhRMA, 2005].
te, estas exigencias acarrean unos costes que Aunque existen importantes diferencias en-
disparan la inversin en I + D de las empresas; tre pases industrializados, la investigacin que
muchas pequeas compaas, o las entidades fi- genera la industria farmacutica representa alre-
nancieras que las respaldan, no pueden asumir dedor del 2% del producto interior bruto (PIB)
dicho riesgo. A la vez, la presin en los precios de cada pas (fig. 1). Espaa se encuentra en un
y, en algunos casos, una inadecuada poltica de nivel relativamente bajo de gasto en I + D por
la proteccin de la propiedad intelectual por al- parte de la industria farmacutica, con un 1,3%
gunas autoridades, hace ms difcil un retorno del PIB en el ao 2007. Este gasto ha aumento
de la inversin y tiene un efecto negativo en el progresivamente en los ltimos aos. En 2006,
desarrollo de ciertos frmacos, sobre todo en las principales empresas biofarmacuticas invir-
determinadas reas teraputicas. tieron 55.200 millones de dlares en I + D, el
doble de lo invertido en 1996 [USFDA, 2006] y
esto representa tan slo las tres terceras partes
El coste de la investigacin de todo el gasto mundial en investigacin bio-
tecnolgica [PhRMA, 2007]. Entre 1995 y 2005,
en la industria farmacutica el porcentaje que representa la I + D en la in-
versin total de la industria farmacutica pas
Los costes del desarrollo de un nuevo fr- del 15,0% al 17,1% [Barrie; 2006].
maco en Estados Unidos casi se han triplica- En paralelo con el aumento en la inversin en
do entre la dcada de 1980 y la de 1990 (de I + D por parte de la industria farmacutica, se
Gasto total en I + D en porcentaje del PIBpm

4,0
3,44

3,5
3,40

2000 2005 2006 2007

3,32

3,21
3,10
3,04

3,0
2,79

2,71

2,66
2,61
2,57

2,53
2,53
2,49
2,45

2,5
2,30

2,28
2,24
2,21
2,19

2,15
2,10
2,10

2,06c
2,04

2,06

2,05
1,97

2,0
1,91

1,90
1,78b

1,82

1,77
1,81

1,76
1,76

1,74
1,74
1,73
1,51

1,5
1,27
1,20

1,18
1,13
1,12

1,09
1,05

1,0
0,91

0,64
0,57

0,57
0,56

0,5
0
Japn Coreaa EE.UU. Alemania OCDE Francia Australia Canad Reino UE-27 Espaa Italia Polonia
Unido
a
No incluye la I + D en ciencias sociales y humanidades. b Dato de 2004. c Dato de 2006.

Figura 1. Esfuerzo en I + D en los pases industrializados. Gasto total en I + D en porcentaje del produc-
to interior bruto (PIB) a precios de mercado (PIBpm) en 2000, 2005, 2006 y 2007. Fuente: Main Science
& Technology Indicators. Vol. 2009/2 [OECD, 2009]. Tabla 1.8, 2. parte [Fundacin COTEC, 2010].

138 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana

ha observado un progresivo declive en el n-
mero y, especialmente, la proporcin relativa de
frmacos aprobados anualmente con respecto
a todos los que inician el proceso de desarrollo
clnico [DiMasi, 2001]. En el ao 2006, la Food
and Drug Administration (FDA) autoriz nica-
mente 22 molculas, frente a las 53 de 1996.
Aproximadamente el 5% de nuevas molculas
con potencial teraputico llegan a iniciar la fase
de ensayos preclnicos y, de ellas, se comercializa
tan slo el 11% de los productos que inician la
fase I, el 16% de los que alcanzan la fase II, el
44% de la fase III y el 79% de los se presentan a
registro [Galduf et al., 2006].
La creciente complejidad del proceso debido
al aumento de requisitos de las agencias regula-
doras, como se ha comentado anteriormente, es
la principal causa del incremento en el coste de
la investigacin. Desde la fase de cribado hasta
la comercializacin pasan unos 10-15 aos. Ade-
ms, debido a la caresta de frmacos en inves-
tigacin potencialmente atractivos, las empresas
de biotecnologa que venden sus productos a las
grandes farmacuticas han exigido un mayor pre-
cio por sus compuestos en etapas iniciales [Chan,
2006]. Como resultado, los nuevos frmacos de-
ben financiar su propio desarrollo y el de mu-
chas otras molculas que no fueron aprobadas.
Esta realidad confronta con la enorme presin
pblica para la contencin del gasto sanitario. La
investigacin farmacutica en el futuro, pues, de-
ber realizar un gran esfuerzo para equilibrar la
contencin del gasto farmacutico y la creciente
inversin necesaria para el descubrimiento y de-
sarrollo de medicamentos. Para ello, ser nece-
saria la participacin tanto de entidades pblicas
como privadas, y la racionalizacin y renovacin
de recursos y conocimientos.
Posibles soluciones
Frente a esta situacin, la industria farmacu-
tica tendr que apoyarse cada vez ms en el
desarrollo de nuevas tecnologas que permitan
desarrollar medicamentos ms eficaces y se-
Las empresas biotecnolgicas y su importancia en la terapia humana
guros de una manera ms eficiente; entre ellas,
la genmica y la biologa computacional en la
identificacin y validacin de las dianas biol-
gicas, el diseo y cribado virtual de potenciales
candidatos moleculares y la biomodelizacin/
biosimulacin de los ensayos clnicos. Los dos
grandes mtodos de produccin de frmacos,
la sntesis y la biotecnologa, debern sufrir una
revolucin y una mejora en los procesos que
les permita afrontar un necesario aumento de la
productividad en la I + D de la industria.
nfasis en la fisiopatologa
de la enfermedad
La industria est en un punto de inflexin en
la manera en que investiga nuevos frmacos. Un
anlisis reciente ha demostrado que aproxima-
damente el 50% de las molculas que fallaron
en fase III se debi a la falta de eficacia [Gordian
et al., 2006]. En medicamentos con un mecanis-
mo de accin novedoso (primeros en clase), el
fallo fue el doble de los que tienen un mecanis-
mo de accin probado. Esto quiere decir que la
industria est invirtiendo ingentes cantidades de
dinero en desarrollar molculas cuyo impacto
farmacolgico no es bien comprendido debido
a la falta de conocimiento de la fisiopatologa de
la enfermedad.
Hasta ahora, el tpico proceso ha sido conocer
las vas, las dianas potenciales y la epidemiologa
de la enfermedad a travs de la informacin cien-
tfica pblica. Posteriormente, se generan datos
internamente in vitro o in vivo en modelos celula-
res y animales, y cuando se ha establecido cierta
confianza en el racional, se realiza un cribado ma-
sivo de molculas y de optimizacin de las selec-
cionadas, que pasan a ser testadas en humanos.
Estos primeros estudios en muchos casos no se
centran en probar el racional para esa diana y esa
molcula, sino en caracterizar su farmacodinamia
o farmacocintica aunque esta aproximacin
est ya cambiando. No es hasta la fase II en la
que realmente se testa la prueba o racional del
concepto, y esto es normalmente entre 5 y 7
aos despus del cribado masivo inicial.
139
 Con el incremento de los costes y la presin
para desarrollar nuevas molculas, este modelo
ser insostenible en los prximos aos. La investi-
gacin de la industria en el futuro se deber foca-
lizar en probar el concepto o racional de la diana
y la molcula en el hombre de una forma segura,
tan pronto sea posible, e invertir mucho ms en
entender la fisiopatologa antes de embarcar-
se en costosos ensayos clnicos fase III. De esta
manera, al igual que ahora las grandes empresas
farmacuticas utilizan las pequeas biotecnolgi-
cas como fuente de molculas prometedoras, es
probable que en los aos venideros se formen
compaas especializadas en el estudio de vas
biolgicas y la validacin de conceptos que ven-
dan sus datos a las compaas farmacuticas.
La medicina personalizada
El proceso de desarrollo de medicamentos
est en la actualidad basado en el mtodo es-
tadstico, que proporciona una probabilidad de
que poblaciones semejantes a las que han sido
estudiadas respondan a un determinado trata-
miento. Sin embargo, los mdicos no tratan a
poblaciones, sino a pacientes individualmente.
El futuro est en la medicina estratificada o
medicina personalizada.
El primer paso en esta personalizacin del
tratamiento es entender el mecanismo fisiopa-
tolgico de la enfermedad y las vas alteradas
que crean dicha patologa. Una vez identifica-
das, se analiza cual es la diana ms adecuada
para activar o inhibir dicha va. Posteriormente,
se desarrolla la molcula que mejor interacta
con dicha diana. Estas terapias dirigidas han
supuesto un gran paso en el tratamiento de
muchas enfermedades. Sin embargo, no todos
los pacientes responden de la misma manera,
o presentan los mismos efectos secundarios. La
medicina estratificada depende de la posibilidad
de identificar a los pacientes ms susceptibles
de responder a una determinada terapia.
La medicina estratificada o individualizada ha
impulsado el estudio de factores predictivos
140 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
de respuesta, que permiten diferenciar ciertos
tipos de pacientes segn unos determinados
biomarcadores. Por medio de esta diferen-
ciacin, el paciente recibir el tratamiento que
ms beneficios le aporte. Se individualiza as el
tratamiento, paciente a paciente.
Estamos dando los primeros pasos para uti-
lizar este tipo de biomarcadores, pero existen
ya ejemplos interesantes en oncologa, como
el gen K-ras en cncer de colon. Panitumumab,
un anticuerpo monoclonal totalmente humano
frente al receptor del factor de crecimiento epi-
drmico (EGFr), ha demostrado un aumento de
la supervivencia libre de progresin en pacien-
tes con cncer colorrectal metasttico previa-
mente tratados con quimioterapia [Van Cutsem
et al., 2007]. Sin embargo, los pacientes con un
gen K-ras no mutado (wild type) presentan
una respuesta mucho mayor que los que pre-
sentan mutaciones en este gen [Amado et al.,
2008]. Esto tiene unos claros beneficios, dado
que se identifica a la poblacin susceptible de
ser tratada con xito. De esta manera, la efica-
cia del frmaco aumenta, no se administra a los
pacientes en los que no ser beneficioso y no se
expone a estos pacientes a los efectos secunda-
rios innecesarios que todo tiene frmaco.
Los tratamientos dirigidos unidos a la utiliza-
cin de biomarcadores presentan un modelo
econmico muy diferente al de las medicinas
convencionales. La poblacin a tratar es mucho
ms reducida. Por ejemplo, antes de conocer el
gen K-ras como factor de prediccin, la inhibi-
cin del EGFr con panitumumab se utilizaba en
los pacientes con cncer colorrectal metasttico
en general. Sin embargo, aproximadamente el
50% de los pacientes presentan K-ras mutado y
no son susceptibles de ser tratados: el gasto po-
tencial en este frmaco se reduce tericamente
a la mitad. Adems, debido a su especificidad, la
utilizacin de biomarcadores mejora la identifi-
cacin de los pacientes susceptibles de lograr un
beneficio, por lo que la relacin coste-beneficio
del tratamiento es ms positiva. Tiene tambin
un impacto en el proceso de desarrollo farma-
cutico, dado que al estudiar subpoblaciones
ms limitadas se reduce el nmero y tamao de
los ensayos clnicos requeridos en el proceso de
investigacin.
Por lo tanto, la introduccin de biomarcado-
res permitir a la industria desarrollar terapias
ms seguras, efectivas, y de una manera ms
econmica, que permitirn a la larga una mejora
de la eficiencia en el sistema de salud.
Mejora de la sntesis qumica
La sntesis qumica ha sido la tecnologa tra-
dicional para la produccin de potenciales
candidatos de frmacos (llamados tambin pe-
queas molculas, a diferencia de las grandes
molculas producidas mediante procesos bio-
tecnolgicos) en los que se ha basado la I +
D en la industria. El futuro de esta tecnologa
depender, sin duda, en mejoras en la qumica
combinatoria, que permitir obtener compues-
tos con una rapidez y variedad muy superior a
la de la qumica convencional. La identificacin
de estos compuestos mediante uHTS (ultra-
High Throughput Screening methods) permite
ya hoy en da producir hasta 50-60.000 mol-
culas por semana [Snchez, 2002] que pueden,
a travs de la bioinformtica, ser integradas en
bibliotecas masivas de compuestos con poten-
cial inters teraputico.
Impulso a la biotecnologa
Sin embargo, la aparicin de la biotecnologa
ha supuesto la verdadera gran revolucin en la
industria. El futuro de la I + D industrial depen-
der en gran medida de su expansin. Hoy en
da, los pacientes tienen acceso a 160 frmacos
biotecnolgicos, y se estima que 325 millones
de pacientes se han beneficiado ya de estas te-
rapias. En la actualidad representan el 20% de
todos los frmacos que estn en el mercado y
el 50% de todos los nuevos frmacos que es-
tn en desarrollo. Hace 30 aos se formaron las
primeras compaas de biotecnologa, y ya en
Las empresas biotecnolgicas y su importancia en la terapia humana
2006 existan slo en Europa 2.330 empresas,
con 98.800 trabajadores y un gasto en I + D de
7.600 M. En Estados Unidos estas cifras son
mucho mayores [European Association for Bio-
industries, 2008]. Con este crecimiento expo-
nencial, dentro de 20-30 aos gran parte de la
I + D la realizarn compaas biofarmacuticas
o divisiones biotecnolgicas de las tradicionales
empresas farmacuticas.
El cncer es con gran diferencia el rea en la
que la biotecnologa se est concentrando con
ms intensidad (fig. 2). Segn la encuesta de Phar-
maceutical Research and Manufacturers of Ame-
rica [PhRMA], en el ao 2002 se estaban desa-
rrollando 178 compuestos oncolgicos, frente
a los 47 para tratar enfermedades infecciosas y
26 en las enfermedades autoinmunes, los cuales
ocupaban el segundo y el tercer lugar respecti-
vamente. Se espera que este predominio de la I
+ D de medicamentos oncolgicos dentro de la
industria aumente en los prximos aos.
En general, puede admitirse que la cifra de
fracaso en la etapa de I + D clnico para los
productos biotecnolgicos est en torno al
75%, mientras que se aproxima al 94% para los
frmacos de sntesis qumica [Farmaindustria,
2005]. Dada la mayor probabilidad de xito y las
aportaciones en su especificidad, el nmero de
estos frmacos en I + D en el ao 2030 habr
aumentado sin duda dramticamente.
Sin embargo, el predominio de los medica-
mentos biotecnolgicos incrementar la com-
plejidad de la I + D, ya que estas terapias presen-
tan caractersticas muy peculiares y diferentes
de los frmacos obtenidos mediante sntesis
qumica [Farmaindustria, 2005]. Su caractersti-
ca diferencial es que estas terapias estn pro-
ducidas mediante clulas de organismos vivos,
las cuales por su naturaleza son nicas y, por lo
tanto, el frmaco que elaboran es tambin ni-
co. Cada lnea celular (que es propiedad intelec-
tual de cada compaa farmacutica) produce
una molcula con atributos especficos y dife-
rentes a otra producida por otra lnea celular.
Adems, son molculas mucho ms complejas.
141
Por ejemplo, la darbepoetina es 200 veces ms alta dotacin tecnolgica para su investigacin,
grande que la molcula de la aspirina. Es la mis- desarrollo, produccin y purificacin, requirin-
ma escala que si comparamos un Airbus con dose una monitorizacin y unos controles de
una bicicleta. Por estas razones, es necesaria una calidad ms estrictos. Son necesarios alrededor

Frmacos biotecnolgicos en desarrollo

Factores estimuladores de colonia 2

Receptores solubles combinables 2
Sealizacin 3
Inhibidores de angiognesis 4
Terapia de sustitucin enzimtica 5
Factores de crecimiento 7
Interleuquinas 8
Inmunoterapia 10
Interferones 10
Terapia celular 11
Oligonucletidos antisentido 14
Terapia celular 23
Protenas recombinantes 23
Otros 34
Anticuerpos monoclonales 76
Vacunas 90

0 20 40 60 80 100
Nmero de frmacos

Aplicaciones teraputicas de frmacos biotecnolgicos

Trastornos sanguneos 2
Trastornos del crecimiento 3
Enfermedades oculares 5
Patologas dermatolgicas 7
Trastornos genticos 9
Diabetes 10
Patologas digestivas 11
Enfermedades respiratorias 14
Enfermedades neurolgicas 16
SIDA/VIH patologas relacionadas 17
Enfermedades cardiovasculares 19
Enfermedades autoinmunes 26
Enfermedades infecciosas 43
Cncer/patologas relacionadas 154

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Nmero de frmacos

Figura 2. Frmacos biotecnolgicos en desarrollo y aplicaciones teraputicas. Fuente: 2004 Survey

Medicines in Development [PhRMA, 2004]. En: Biotecnologa en la medicina del futuro [Fundacin
COTEC, 2006].

142 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana

de 250 controles en la produccin de cada mo-
lcula, comparados con los 50 requeridos para
los frmacos qumicos tradicionales. Esto origina
que pequeas variaciones en la lnea celular, en
el proceso de fabricacin, en el almacenamiento
o transporte, creen cambios sustanciales en su
estructura, con repercusiones importantes en
su perfil de eficacia y, sobre todo, de seguridad,
fundamentalmente en relacin con la respuesta
inmunognica.
Como consecuencia de este incremento en
la biotecnologa, las relaciones de la I + D indus-
trial con las agencias reguladoras necesitarn en
el futuro un proceso de adaptacin. Las caracte-
rsticas especiales de las terapias biolgicas han
hecho que las exigencias de registro y aproba-
cin para estos productos sean diferentes a las
de los frmacos de sntesis qumica. Por ejemplo,
el proceso de aprobacin centralizado por la
EMA es obligatorio. Como consecuencia, el me-
canismo de reconocimiento mutuo por estados
miembros ir descendiendo sin duda.
Empresas biotecnolgicas
A nivel mundial
La industria biotecnolgica global ha venido
disfrutando de un incremento anual superior al
15% durante los ltimos 5 aos, con inversiones
en I + D que han aumentado anualmente un
34% [European Commission, EC, 2003]. En 2006
estaban identificadas 1.991 compaas biotecno-
lgicas en Estados Unidos frente a 2.330 en la
UE-15 [European Association for Bioindustries,
EUROPABIO, 2008]. A pesar de las cifras muy pa-
recidas de compaas en ambas reas geogrficas,
el nmero de empleados (190.500 trabajadores
frente a 98.500), la inversin en I + D (21.000
M frente a 7.600 M) y los ingresos (41.500
M frente a 21.500 M) son significativamente
mayores en Estados Unidos. Segn la Asociacin
Europea de Bioindustrias [EUROPABIO, 2008], la
principal causa de la menor competitividad eu-
Las empresas biotecnolgicas y su importancia en la terapia humana
ropea es la falta de una infraestructura adecuada
de financiacin, que hace que muchas compaas
desaparezcan en un periodo de 3 a 5 aos. En
la figura 3 se presentan las principales empresas
biotecnolgicas ordenadas por el volumen de
sus ventas en 2007; es significativo el predominio
absoluto de empresas americanas dentro de las
de mayor tamao.
Hay que destacar el crecimiento llamativo de
nuevas empresas pequeas en la Unin Euro-
pea, promovidas por la accin estatal y la volun-
tad de los gobiernos de impulsar el sector. Las
universidades, sobre todo las del Reino Unido y
Alemania, son el origen de un buen nmero de
nuevas empresas spin-off creadas a partir de los
laboratorios de investigacin bsica. Las oficinas
de transferencia de tecnologa en estos pases
han actuado de puente entre los investigadores,
las fuentes de financiacin y los emprendedores.
Otra herramienta ampliamente utilizada en la
UE es la generacin de biopolos o la potencia-
cin de desarrollos tecnolgicos regionales im-
pulsados por los gobiernos locales. En Espaa,
los proyectos ms ambiciosos en este sentido
se estn llevando a cabo en el Pas Vasco, dentro
del plan Biogune y su Centro de Investigacin
Cooperativo, y en Catalua, desde los parques
cientficos, ligados a las universidades y a la in-
vestigacin clnica. Segn datos del informe de la
Asociacin Espaola de Bioempresas [ASEBIO,
2009], la inversin en I + D de las empresas
biotecnolgicas espaolas dedicadas a salud hu-
mana fue de 460 M en 2008, el doble de la
dedicada a I + D en 2005. A efectos comparati-
vos, la inversin en I + D por las empresas bio-
tecnolgicas de Estados Unidos, en 2006, fue de
21.000 M, segn datos de BIO, la Asociacin
de Industrias Biotecnolgicas de aquel pas.
El diagnstico in vitro ha sido uno de los
mbitos de la medicina que ha crecido de un
modo ms espectacular gracias a los productos
biotecnolgicos, especialmente debido a la ma-
yor diversificacin de inmunoensayos y tcnicas
moleculares. Estas nuevas tcnicas han permiti-
do la ampliacin de nuevas reas de negocio en
143
compaas ya existentes, como Roche o Abbott, tas compaas dan empleo a unos 40.000 pro-
o la creacin de nuevas empresas, como Dige- fesionales, lo que representa aproximadamente
ne o Innogenetics, empresas norteamericana el 7% de la mano de obra de la industria farma-
y belga, respectivamente. En Espaa, cabe citar cutica europea [European Federation of Phar-
Genmica, Progenika, BioKit y Biotools. maceutical Industry Associations, EFPIA, 2002].
La investigacin biotecnolgica ha generado Segn datos del ao 2006 del Instituto Nacio-
adems un amplio mercado de clientes pbli- nal de Estadstica (INE) sobre la I + D en Espaa,
cos y privados de I + D que consumen reacti- el sector farmacutico se mantiene el segundo
vos, aparatos y material fungible de laboratorio en la clasificacin, por encima de sectores con
en cantidades cada vez mayores. Por ello han fuerte imagen en I + D como son la aeronutica,
surgido numerosas compaas de nueva crea- las comunicaciones o incluso la automocin. En
cin, como Qiagen o Promega, o por fusiones 2006, la industria farmacutica invirti en I + D
de compaas previas, como puede ser Apple- 792 M, dedicando a estas labores 4.615 perso-
ra (empresa resultante de la unin de Applied nas [INE; 2006]. Estas cifras representan el 17% y
Biosystems y Celera) y Perkin-Elmer, ambas de 5,57% respectivamente del total de la I + D de la
Estados Unidos, que constituyen una industria industria en Espaa. El porcentaje de la inversin
auxiliar de la investigacin biotecnolgica. respecto a facturacin es mucho ms alto que
en otros sectores. Adems, mientras que en el
periodo 1995-2005 la cifra de negocio del sector
Las empresas biotecnolgicas farmacutico creci a una tasa anual del 6,1%, el
en Espaa gasto en investigacin aument en este mismo
periodo un 12,2%, una tendencia que no se ob-
La investigacin de la industria farmacutica serv en otros sectores [INE, 2006].
en Espaa Durante las ltimas 2 dcadas, Espaa se ha
En la actualidad hay afincadas en Espaa al- transformado en un referente para muchos la-
rededor de 270 compaas farmacuticas con boratorios en las fases de investigacin clnica,
actividad de fabricacin y 375 laboratorios. Es- con una expansin muy notable del nmero

16.000,00 14.311,00
Volumen de ventas en 2007 (m$)

12.000,00
9.443,00

8.000,00

4.000,00 2.883,28 2.661,61 2.136,82

522,98 338,70 315,22 243,40 190,73 179,47 169,80 116,14 100,69 86,80
0,00
Amgen

Genentech*

Gwenzyme

CSL

Biogen Idec

Daewoong
Pharmaceutical

Biotest

Orchid
Pharmaceuticals

Crucell

CK Life Sciences

Simcere
BioSolutions
Emergent
BioSolutions

Enzon
Pharmaceutical
BioMarin
Pharmaceutical
Fornix
BioSciences

Figura 3. Principales empresas biotecnolgicas, segn volumen de ventas, en 2007. Fuente: Scrip Exe-
cutive Briefing [Informa UK Ltd]. Vol. 2008/1 n. 8; 2008. * Genentech se fusion con Roche en marzo
de 2009.

144 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana

de ensayos, centros sanitarios, colaboradores y
personal de los departamentos de I + D. Esto
se ha debido sin duda a su desarrollo como po-
tencia cientfica, y aporta unos claros beneficios
a la sociedad, en su conjunto, en cuanto a inver-
sin, creacin de puestos de trabajo y prestigio
en el mundo. Sin embargo, nos enfrentamos a la
posibilidad de perder una parte importante de
las inversiones del sector debido especialmen-
te a la creciente competitividad de otros pases,
bsicamente de Asia y Sudamrica, que ofrecen
unos costes ms bajos, un potencial inmenso
para el reclutamiento de pacientes y unos tiem-
pos de aprobacin razonables.
La investigacin en empresas biotecnolgicas
espaolas
En los ltimos 5 aos, los informes anuales de
la Asociacin Espaola de Bioempresas (ASE-
BIO) han puesto de manifiesto un crecimiento
exponencial del sector biotecnolgico espaol.
Segn datos del informe ASEBIO 2009, en el
ao 2008 haba 305 empresas en Espaa com-
pletamente dedicadas a la biotecnologa, ms de
cuatro veces las existentes en 2003 (71), y otras
637 que realizaban actividades relacionadas con
la biotecnologa (127 en 2003) (fig. 4). La tasa
de crecimiento de las empresas biotecnolgicas
entre 2007 y 2008 fue del 23,3%. Catalua y la
Comunidad de Madrid lideran a nivel auton-
mico los principales indicadores, seguidos por
Andaluca y Pas Vasco (fig. 4).
El empleo total proporcionado por estas em-
presas fue de 108.374 trabajadores en 2008,
el 4,3% ms que el ao precedente, y el gas-
to interno privado en I + D en biotecnologa
ascendi a 460 millones de euros en 2008, el
22,5% ms que en 2007. Esta cifra es el doble
de la dedicada a I + D en 2005, que llegaba a
los 201 millones de euros, lo que representa el
gran esfuerzo en I + D que estn haciendo las
empresas que utilizan la biotecnologa en su ne-
gocio. Dicho esfuerzo se vio recompensado por
un aumento paralelo en la cifra de negocio del
sector, que alcanz los 31.101 millones de euros
en 2008, el 18,9% ms respecto al ao anterior.
La mayora de estas empresas desarrollan sus
actividades en el campo de la salud humana, se-
guidas a distancia de las que trabajan en el rea
de la biotecnologa agroalimentaria.
El Parque Cientfico de Madrid, en colaboracin
con ASEBIO, identific 430 invenciones biotec-
nolgicas durante el ao 2009. De las mismas, el
84% correspondi a solicitudes y el 16% restante
a concesiones. En cuanto a las publicaciones cien-
tficas de empresas espaolas en distintas revistas
o medios especializados, se computaron un total
de 177 impactos, cuya titularidad correspondi a
24 entidades. Comparndolo con el ao anterior
(140 impactos de 22 empresas), se refleja el au-
mento de actividad de estas compaas.
En 2009 se crearon 58 nuevas empresas bio-
tecnolgicas. Las regiones en las que ms empre-
Inferior al 1% del total
Entre el 1% y el 5% del total
Entre el 5% y el 30% del total
Superior al 30% del total
Figura 4. Nmero de empresas del sector bio-
tecnolgico en Espaa en 2006, 2007 y 2008
(izquierda). Distribucin del gasto interno en I
+ D biotecnolgica del sector privado por co-
munidad autnoma en 2007 (derecha). Fuente:
Encuesta sobre Innovacin tecnolgica en las
empresas. Estadstica sobre el uso de biotecno-
loga. INE (2006 y 2007) [Fundacin COTEC,
2010; ASEBIO, 2009].
sas se crearon fueron Andaluca, el 26% del total, y
Catalua, el 24%, seguidas de Valencia (9%) y Ma-
drid (7%). En el mismo ao se contabilizaron 101
alianzas, de las cuales el 42% fueron entre empre-
sas biotec y entidades pblicas, el 38% con otra
empresa biotec y el 28% con empresas usuarias.
Entre las operaciones realizadas por las en-
tidades privadas en el rea de la biotecnologa
centrada en salud, destaca en el ltimo ao la
de Cellerix (grupo Genetrix) que encabeza el
ranking por un importe de 27,2 millones de
euros. Se trata de la segunda ronda de finan-
ciacin internacional de la compaa espaola
que trabaja en el desarrollo de medicamentos
con clulas madre, y en la que participaron Ysios
Capital Partners, Life Science Partners, Ventech,
Bankinter, Capital Riesgo Madrid, JV Risk Tech-
nologies; en ella destacaba la contribucin clave
del grupo Genetrix.
La segunda operacin ms grande del ao, si
bien se cerraba al comienzo de 2010, era rea-
lizada por la divisin biofarmacutica del grupo
Lipotec, GP-Pharm, por medio de un prstamo
sindicado. En esta operacin, que supuso un
total de 20 millones de euros, participaron las
siguientes entidades: Caixa Catalunya, Banco de
Sabadell, Bancaja, Institut Catal de Finances y el
Instituto de Crdito Oficial (ICO). Por su parte,
Noscira, compaa del Grupo Zeltia, consegua
su tercera ronda de financiacin alcanzando
11,1 millones de euros. Esta operacin, realizada
en 2009, fue suscrita por inversores privados.
Cabe destacar tambin en el ao 2009 la au-
torizacin de la Comisin Europea a comerciali-
zar Yondelis, de Pharmamar, para cncer de ova-
rio. En el rea de diagnstico, Araclon Biotech
comenz el estudio de su kit Abtest, nico kit
en el mercado para el diagnstico del Alzhei-
mer en sus estadios iniciales.
Entre los factores que pueden explicar el cre-
cimiento del sector se encuentran el esfuerzo
inversor realizado por el gobierno en los lti-
mos aos, tal y como reflejan los 958 millones
de euros que se han destinado a proyectos de
I + D en el mbito biotecnolgico desde 2005
146 9a edicin del curso de Biotecnologa Aplicada a la Salud Humana
hasta 2008. An as, sera necesario en los prxi-
mos aos poner en marcha incentivos fiscales
para dotar de liquidez a las empresas como, por
ejemplo, aumentar los porcentajes de la deduc-
cin por actividades de I + D biotecnolgica
del impuesto de sociedades, el lmite a la aplica-
cin de la deduccin por actividades de I + D
e innovacin biotecnolgica, e incentivar a los
inversores para conseguir un mayor dinamismo
del sector biotecnolgico.
Otro de los objetivos para las empresas bio-
tecnolgicas espaolas en los prximos aos
es la internacionalizacin. La maduracin de los
proyectos empresariales y la necesidad de acce-
der a nuevos mercados ante la difcil coyuntura
econmica actual, son en parte responsables de
que el negocio exterior se haya convertido en
una prioridad en la estrategia de crecimiento
del sector biotecnolgico espaol. En la actua-
lidad, la contribucin de las actividades interna-
cionales en la facturacin de las empresas ha
representado de media, en el ao 2009, el 26%.
Como menciona Genoma Espaa en su
Avance del Estudio Estratgico de la Biotec-
nologa en Espaa: descripcin e indicadores
[Genoma Espaa, 2004], el principal retorno
de la inversin pblica son las publicaciones
cientficas, que paradjicamente y en muchas
ocasiones, son utilizadas por empresas norte-
americanas para patentar. Los indicadores de
produccin cientfica biotecnolgica son exce-
lentes respecto a la investigacin bsica (Espaa
es la cuarta potencia europea en produccin
cientfica) y no se corresponden con la produc-
cin de patentes, que es muy escasa. Dado el
valor estratgico del sector biotecnolgico, as
como las peculiaridades propias de estas em-
presas, es importante trabajar en identificar los
criterios que den una idea real de su estado
actual y de su potencial evolucin. El objetivo es
completar la informacin actualmente disponi-
ble con una serie de indicadores que muestren
su grado de competitividad, a la vez que permi-
tan definir y evaluar la efectividad de las polticas
aplicadas. Los indicadores clave deberan cubrir,
aparte de la capacidad cientfica donde se va-
lore la formacin del personal o el nmero de
patentes, otras reas fundamentales para el xi-
to de estas empresas, como son su capacidad
financiera y de gestin junto a resultados en tr-
minos de alianzas estratgicas. Segn esto, sera
importante considerar la perspectiva temporal
en funcin de la caja disponible antes de una
ronda siguiente de financiacin (el valor medio
es 2 aos de vida), el origen de sus fuentes de
financiacin (el capital privado es un indicador
de profesionalizacin frente a las meras ayudas
pblicas), el nivel de ingresos (su modelo de ne-
gocio es la referencia), la composicin de los
equipos directivos (la existencia de directivos
independientes de los fundadores es una garan-
ta en la gestin), los acuerdos estratgicos o de
licencia realizados (los acuerdos internacionales
son un indicador) y la existencia de comits
cientficos y asesores.
El futuro de la I + D
en biotecnologa
El movimiento hacia Asia
Como en otros aspectos que ya se han co-
mentado, el movimiento de la investigacin bsi-
ca fuera de Estados Unidos y Europa aumentar
sin duda principalmente hacia Asia. El nmero
de doctorados en el mundo occidental ha ido
decreciendo desde la dcada de 1990 [USNSF,
2006]. El porcentaje de literatura cientfica pro-
ducida en Estados Unidos ha disminuido desde
1988 al 2003 del 38 al 30, y aunque en Europa
creci del 28,9 al 31, 5, en China lo hizo de un
530, y en los 8 pases ms importantes de Asia,
en un 235%. Asia ha pasado de contribuir con
menos del 4% de las publicaciones a ms del
10% en el ao 2003. Adems, los costes de la in-
vestigacin cientfica se han vuelto tan enormes
en el mundo occidental que no pueden compe-
tir con los de Asia, mucho ms reducidos.
Las empresas biotecnolgicas y su importancia en la terapia humana
Colaboraciones externas
La caresta de nuevos frmacos que se est
viviendo en la actualidad llevar cada vez ms
a la industria a intentar aumentar las fuentes de
potenciales entidades moleculares atractivas,
creando ms colaboraciones con investigado-
res externos, entidades acadmicas y pequeas
compaas especializadas. El mundo acadmico
ha entendido que su integracin en el mundo
industrial es crtica; desde el ao 2000 al 2004, el
nmero de patentes de instituciones acadmi-
cas americanas se ha incrementado en un 70%,
y en el futuro este nmero deber aumentar
aun ms.
Conclusiones
El descubrimiento y desarrollo de nuevas te-
rapias es un proceso cada vez ms complejo.
El nmero de nuevos frmacos aprobados ha
disminuido en la ltima dcada, mientras que los
gastos de investigacin y desarrollo han aumen-
tado. La sntesis qumica est siendo sustituida
por la biotecnologa, que abre la posibilidad de
desarrollar tratamientos con mecanismos de
accin distintos. Para mejorar la salud humana
con la biotecnologa, ser necesario en el futu-
ro garantizar el reembolso de nuevas terapias,
como las herramientas de diagnstico, que pue-
den mejorar considerablemente la atencin al
paciente (p. ej., evitar biopsias o cirugas inne-
cesarias en pacientes con cncer). El desarrollo
de nuevos marcadores biolgicos ser vital para
personalizar la medicina, as como la estratifi-
cacin de pacientes candidatos a cada terapia
en funcin de su perfil molecular. Traducir la
emergente ciencia genmica a la medicina per-
sonalizada es una tarea compleja, y se deberan
recompensar las intervenciones en funcin de
su eficacia, eficiencia y seguridad. Ser necesario
fomentar una nueva generacin de estudios de
colaboracin pblico-privados para conocer el
valor real de la medicina personalizada, inclu-
147
yendo pacientes en el mundo real, sin basarse
necesariamente en los tradicionales ensayos
clnicos controlados aleatorios. Se debern
aunar esfuerzos y mejorar los incentivos para
que todas las partes interesadas incluyendo las
compaas farmacuticas y de diagnstico, los
agentes reguladores, los responsables polticos y
las instituciones de investigacin pblicas par-
ticipen del objetivo comn de mejorar la salud
de los pacientes desarrollando frmacos ms
seguros y eficaces.
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