DETERMINACIN DE PROTENAS

1. INTRODUCCIN

La presencia de aminocidos y protenas en una disolucin puede ponerse de

manifiesto por gran nmero de ensayos, generales o especficos (segn el
grupo funcional con el que reaccione el reactivo), basados en la formacin de
un compuesto coloreado entre el aminocido o la protena y un reactivo
especfico. Los distintos mtodos, lgicamente, tienen diferencias de
sensibilidad, especificidad, etc. Entre los mtodos ms utilizados para
protenas destaca el Ensayo de Biuret: Compuestos con enlaces peptdicos
producen un cambio de color del azul al prpura cuando reaccionan con Cu
(II) en medio alcalino. Para este caso se ha empleado tambin las tcnicas de
espectrofotometra de absorcin para determinar la cantidad de protena
presente y la relacin que hay entre esta y la absorbancia.

2. FUNDAMENTO

El mtodo de Biuret permite determinar la concentracin de protenas de

una muestra. Se basa en la reaccin que tiene lugar entre los iones de
cobre del reactivo de Biuret y los tomos de nitrgeno de los enlaces
peptdicos de las protenas. Se produce un complejo de color azul que
absorbe entre 540 y 550 nm. La intensidad del color es una medida directa
de la concentracin del complejo y, por tanto, de la concentracin de
protena presente en la muestra, las cuales son determinadas por el mtodo
de espectrofotometra de absorcin.

3. OBJETIVOS

Familiarizarnos con el mtodo de Biuret para la determinacin de

protenas.
Adiestrarnos en el manejo adecuado de un espectrofotmetro, su
funcionamiento y aplicaciones prcticas.
Construir una recta de calibracin con una solucin de albmina de
clara de huevo como protena patrn para el mtodo colorimtrico del
Biuret.
4. MATERIALES

Homogenizador
Centrifugadora
Probetas
Pipetas volumtricas
Tubos de ensayo
Gradilla para tubos
Reactivo de Biuret
Espectrofotmetro
Vortex
Muestra de hgado de pollo
Agua destilada

5. METODOS

PREPARACIN DE LOS TUBOS CON ALBMINA:

Seleccionar los tubos y enumerarlos

Agregar una determinada cantidad de albmina a cada uno de ellos
de menor a mayor, con excepcin del blanco.
Agregar agua en cantidades correspondientes para completar 1 ml en
cada tubo
Adicionar 5 ml del reactivo de biuret.
Llevar al vortex para la homogenizacin
Colocar en bao mara por 10 minutos a 37C.
Llevar al vortex para la homogenizacin.
Proceder a la lectura de la absorbancia.

PREPARACIN DE LA MUESTRA:

Muestra: Hgado de Pollo

Pesar 6 gramos de hgado en una balanza analtica.

 Colocar los 6 gramos de hgado en el homogenizador y agregar 24 ml
de agua destilada.
Triturarlo hasta que se disuelva y no quede tejido.
Centrifugar por 30 minutos a mxima velocidad (6000RPM)
Separar y medir el sobrenadante (donde se encuentran las protenas)
Medir el volumen en una probeta y tomar la muestra.
6. REVISIN LITERARIA

La reaccin o prueba de biuret es un mtodo que detecta la presencia de

compuestos con dos o ms enlaces peptdicos y, por tanto, sirve para todas
las protenas y pptidos cortos.

La reaccin del biuret es un mtodo que se puede utilizar para determinar la

cantidad de protena soluble en una solucin. El reactivo del biuret (sulfato
de cobre en una base fuerte) reacciona con los enlaces del pptido y cambia
el color cuando entra en contacto con otra sustancia. El espectrofotmetro
se puede entonces utilizar para medir la intensidad del color que se produjo.
Mientras ms cantidad de protena est presente en la solucin, ms oscuro
es el color.

La caracterstica ms importante de la reaccin es que la reaccin del Biuret

se aplica, a partir de los tetrapptidos, a todos los pptidos y protenas.
(BRICEO JURES, YCELA, 1970)

Los mtodos espectrofotomtricos se basan en la medicin de la radiacin

electromagntica emitida o absorbida por los analitos. Los mtodos de
emisin utilizan la radiacin emitida cuando un analito es excitado por
energa trmica, elctrica radiante. Los mtodos de fluorescencia tambin
se basan en la radiacin emitida por el analito. En la fluorescencia, sin
embargo, la radiacin emitida se genera por exposicin de la muestra a un
haz de radiacin electromagntica proveniente de la lmpara. Por el
contrario los mtodos de absorcin se basan en la disminucin de la
potencia (o atenuacin) de un haz de radiacin electromagntica como
consecuencia de su interaccin con el analito. (SKOOG, DOUGLAS A.,
1997)
MANEJO DEL ESPECTROFOTMETRO

El espectrofotmetro debe de encenderse y esperar un momento

antes de hacer una medicin.
Se selecciona la longitud de onda del mximo de absorcin del
compuesto a medir.

Se selecciona la opcin de medir en absorbancia.

Se toma una cubeta de plstico de 3 ml, procurando cogerla de

manera que no se manchen las paredes de la cubeta que se
expongan al haz de luz del espectrofotmetro.

Se vierte en la cubeta un volumen de la solucin del blanco tal que

ocupe las tres cuartas partes del volumen de la cubeta.

Se coloca la cubeta en el compartimiento de cubetas del

espectrofotmetro, procurando que las paredes lisas de la misma se
coloquen en la direccin del haz de luz del espectrofotmetro.

Se realiza el ajuste del cero de absorbancia.

Se saca la cubeta bota el contenido y se vierte en la misma cubeta la

solucin que contenga la muestra problema.

Se introduce la cubeta en el compartimiento de muestra del

espectrofotmetro y se procede a la lectura. De igual modo se
procede con los dems tubos.
 7. RESULTADOS

Cuadro 1

BLANCO TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 TUBO 5 MUESTRA

Albumina _ 0.2 ml 0.4 ml 0.6 ml 0.8 ml 1 ml _

H2O 1 ml 0.8 ml 0.6 ml 0.4 ml 0.2 ml _ 0.9 ml

Exc. Hgado _ _ _ _ _ _ 0.1 ml

BIURET 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml

VORTEX

BAO MARA 10 MINUTOS A 37C

VORTEX

Cuadro 2

Blanco Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Muestra

Absorbancia 1 0,044 0,086 0,099 0,114 0,185 0,078

Absorbancia 2 0,041 0,082 0,096 0,11 0,195 0,075

A. Promedio 0,0425 0,084 0,0975 0,112 0,19 0,0765

CV (%) 4,99 3,37 2,18 2,53 3,72 2,77

Concentracin 0,17 0,33 0,5 0,97 0,83

 Grfica 1

8. DISCUSIONES

En la prctica pudimos observar que la coloracin en los tubos

aumentaba en intensidad de forma directamente proporcional a la
concentracin de albmina, lo que ocurre debido a que el reactivo de
Biuret se torna violceo cuando se une a los enlaces peptdicos de las
protenas.
De la grfica 1, observamos que los valores de concentracin vs.
Absorbancia que se encuentran alejados de la lnea de tendencia
corresponden a los Tubos 4 y 5, lo que refleja errores en la titulacin
por fallas personales y/o del equipo, ya que algunos se encontraban
daados.

Tanto en el tubo 4, como en el tubo de la muestra, encontramos los

valores ms altos de concentracin de protena, lo que tericamente
debera significar una absorbancia elevada, segn la ecuacin de
Lambert y Beer; sin embargo esto no ocurre as porque los valores de
absorbancia fueron de 0.112 y 0.190 respectivamente. (Ver cuadro 2)
9. BIBLIOGRAFA

BRICEO JURES, YCELA, (1970). Manual de laboratorio de

Bioqumica.

DOCON NAVAZA, MARA CARMEN, (1999). Fundamentos y

tcnicas de anlisis bioqumico. Impreso en Espaa.

SKOOG, DOUGLAS A., (1997). Quimica Analtica. 6ta ed. Impreso en

Colombia.

BIURET. Wikipedia (En lnea). Disponible en:

http://es.wikipedia.org/wiki/Biuret. Consultado el 09 de octubre del
2007.