Ultrasonido El pretratamiento de una herramienta til

para aumentar la clara de huevo Protena Hidrlisis:

Cintica, modelo de reaccin, y Termodinmica
Jelena R. Jovanovic, Andrea B. Stefanovic, Natasa Z. Sekuljica, Sonja M. Jakovetic Tanaskovic,
Marina B. Dojcinovic, Branko M. Bugarski, and Zorica D. Knezevic-Jugovic
C: Food Chemistry

Resumen: El impacto de ondas de ultrasonido generadas por sonicador tipo sonda y ultrasonido limpieza bao en susceptibilidad de la
protena de clara de huevo a la hidrlisis por fresas comparado ambas hidrlisis enzimtica pre-tratamiento y convencional trmica
fue investigado cuantitativamente. Una serie de reacciones hidrolticas se llev a cabo en un reactor de tanque agitado en las
concentraciones de sustrato diferentes, las concentraciones de enzima y temperaturas utilizando protenas de clara de huevo sin tratar
y pretratados (EWPs). El modelo cintico basado en la desactivacin de sustrato inhibicin y segundo orden enzima con xito predice
el comportamiento experimental proporciona una herramienta eficaz para la comparacin y optimizacin.

El ultrasonido pretratamientos parecen mejorar la hidrlisis enzimtica de EWPs bajo diferentes condiciones cuando se compara con
otros mtodos. Las constantes de tarifa de reaccin aparente de protelisis (k2) son 0,009, 0.011, 0.053, minutos1 0.045 para EWPs
untreated y sos pretratada con calor, sonicador tipo sonda y tecnologas de bao limpieza ultrasonido, respectivamente. El
tratamiento previo de ultrasonido tambin disminuye la activacin de la hidrlisis (Ea) y enzima desactivacin (Ed) energa, entalpa
(H) y entropa (S) de activacin y para la sonicacin de tipo sonda esta disminucin es de 61.7%, 61.6%, 63.6% y 32.2%,
respectivamente, pero el ultrasonido ha cambiado poco en el valor de la energa libre de Gibbs en el rango de temperatura de 318 a
338 K. El contenido de grupos sulfhidrilos y potencial muestran un aumento significativo (P < 0.05) para pretratamientos de
ultrasonido aplicado y la reduccin de la granulometra se obtienen, proporcionando pruebas de que el ultrasonido causa EWP
cambios estructurales que afectan a la tasa de protelisis.

Palabras claves: hydromaticis, EWPs, modelo cintico, particleadura, pretratamiento de ultrasonido.

Aplicacin prctica: Una combinacin de hidrlisis de pretratamiento y enzimtica de ultrasonido de alta intensidad de las
protenas de la clara de huevo (EWPs) ha demostrado ser una alternativa aceptable para el desarrollo de valor agregado
nuevo EWP hy-drolysates. Comprensin fundamental y un estudio cuantitativo del impacto de pretratamiento del
ultrasonido en la hidrlisis enzimtica de EWPs por evaluacin de los parmetros cinticos realizado aqu podran ser tiles
al proceso de escala de banco de laboratorio a planta industrial. Hidrolizados de EWP son una fuente atractiva de protena
en la nutricin humana, que puede ser utilizado en productos para nutricin especial como frmula definida, dietas o
"alimento mdico", as como para la fortificacin de la protena de los alimentos para uso general.

Introduccin
Hidrlisis enzimtica de protenas de clara de huevo (EWPs) es un
proceso biotecnolgico de impor-tante que puede utilizarse para
mejorar las propiedades phys ical, qumicas y funcionales de la clara
de huevo natural, sin alterar su valor nutritivo y tambin para
obtener productos de valor agregado huevo (Clemente 2000;
Abeyrathne y otros 2013). En comparacin con la protena nativa,
hidrolizados son significativamente ms digestible, menos viscoso,
ms fcil de mezclar, tienen mayor solubil-dad en agua y reduccin
el potencial alergnico. Tambin es un mtodo eficaz para la

MS 20160518 Submitted 4/2/2016, Accepted 8/18/2016. Authors Jovanovic, Stefanovic,

Jakovetic Tanaskovic, and Knezevic-Jugovic are with Dept. of Biochem-ical Engineering
and Biotechnology, Faculty of Technology and Metallurgy, Univ. of

Belgrade, Karnegijeva 4, 11000 Belgrade, Republic of Serbia. Author Sekuljica is

with Innovation Center, Faculty of Technology and Metallurgy, Karnegijeva 4,
11000 Belgrade, Republic of Serbia. Author Dojcinovic is with Dept. of General
Technical Sciencies, Faculty of Technology and Metallurgy, Univ. of Belgrade,
Karnegijeva 4, 11000, Belgrade, Republic of Serbia. Author Bugarski is with
Dept. of Chemical Engineering, Faculty of Technology and Metallurgy, Univ. of
Belgrade, Karnegijeva 4, 11000, Belgrade, Republic of Serbia. Direct inquiries to
author Knezevic-Jugovic (E-mail: zknez@tmf.bg.ac.rs).

C2664 Journal of Food Science Vol. 81, Nr. 11, 2016


liberacin de di-, tri y oligopptidos con potencial actividad
biolgica y, por tanto, los hidrolizados obtenidos puede utilizarse
como alimento funcional bioactivo suplementos (Choi y oth-res
2009; Chen y otros 2012; Lopez Barrios y otros 2014; Soares de
Castro y otros 2015).
Trmico pretratamiento de EWPs a menudo se requiere en el
pliegue de su susceptibilidad a la digestin por fresas, tripsina, -
quimotripsina y otras proteasas sino tambin para garantizar la
seguridad microbiana de los alimentos que contienen hidrolizados
de EWP. Sin embargo, energa trmica conduce inevitablemente a la
destruccin de nutrientes sensibles calor, textura, color y sabor (Guo
y otros 1999). Este mtodo tambin se divulga para destruir otras
propiedades funcionales del huevo, como gelificante y espuma, que
a menudo son deseables para la fabricacin de alimentos, y en
muchos casos, muestra efectos sobre la actividad bio-lgica de los
hidrolizados obtenidos (mina de 1995). Antes de all, un montn de
trabajos de investigacin se ha realizado para investigar la
efectividad de la sustitucin de pretratamiento trmico convencional
con nonthermal varias tecnologas para mejorar la general procesan
de actuaciones de la hidrlisis EWP y contribuyan al desarrollo cin
de huevo nuevos productos funcionales (Lei y otros 2011;
Knezevic-Jugovic y otros 2012; Wang y otros 2013).
C R
2016 Institute of Food Technologists
doi: 10.1111/1750-3841.13503
Further reproduction without permission is prohibited
Tratamiento previo de ultrasonido para mejorar la hidrlisis de la clara de huevo.
sino tambin en el tipo de l
ultrasonido equipar-ment. En i
El uso de alta intensidad de general, existe informacin
ultrasonido, es decir, la limitada sobre la hidrlisis de
aplicacin de las ondas de EWPs desde diferentes
sonido con frecuencias bajas ultrasonido pretreatments y
(entre 20 y 100 kHz) y gran enzima proteoltica sistemas.
intensidad (10 a 1000 W/cm2), Se han realizado algunos
est ganando importancia en la estudios sobre el efecto del
asistencia del hidrlisis ultrasonido en las propiedades
enzimtica o como funcionales de EWPs
pretratamiento del sustrato de incluyendo la superficie hy-
protenas antes de la hidrlisis drophobicity, granel
enzimtica porque este viscosidad, espumoso, y
nonthermal tcnica de propiedades emulsificantes,
procesamiento es leve, y evita pero para nuestro
la formacin de malos sabores conocimiento, no existen
y el deterioro de los estudios que han investigado
componentes de los alimentos y el efecto de la alta intensidad
nutrientes (Ren y otros, 2014; de ultrasonido sobre el
Jin y otros, 2015; Ozuna y proceso cintica (Arzeni y
otros, 2015; Wang y otros, otros, 2012).
2015; Zou y otros, 2016). El
sistema tradicionales-eficacia
El objetivo de esta
del ultrasonido pretratamiento
investigacin es estudiar los
para mejorar la hydroly-sis de
efectos de 2 tipos de
varias protenas incluyendo
ultrasonido pretreatments
avena aislados de protena
sobre EWP susceptibilidad a la
(Wang y otros, 2015), clara de
hidrlisis por alcalase, basado
huevo (Stefanovic' y otros,
en el principio de la cintica
2014a), cscara de huevo
enzimtica y la evaluacin de
protenas de membrana (Jain y
la cintica y termodinmica de
Alan 2016), u otros han
constantes. Las generalmente
demostrado en una serie de
aceptadas emprico
investigaciones con ambas
exponential kinetic ecuacin
sondas tipo sonicator y
con slidos antecedentes en la
ultrasonido bao de limpieza.
enzima mecanismo de
Los efectos de las ondas
reaccin ha sido aplicado para
ultrasnicas en protenas son
el modelado de EWP
muy complejos y un aumento o
hidrlisis. Tambin es
una disminucin de la protena
importante para determinar los
hidrolticas susceptibilidad
efectos del ultrasonido en
puede tener lugar en funcin de
algunos EWP propiedades
las condiciones y la intensidad
estructurales. Dicha
del tratamiento previo, as
informacin podra mejorar
como sobre la naturaleza de la
bajo el pie del mecanismo de
proteasa o protena utilizada
ultrasonido efecto sobre la
(Uluko y otros, 2015). Por
reaccin enzimtica y ayuda
ejemplo, el sonicaci en
en el diseo de un adecuado
ambos 20 y 60 kHz en diversas
tratamiento industrial
tervals utilizando una sonda de
tipo sonicator no afecta la condicin.
digestibilidad de uno de los
principales EWPs
(ovotransferrin) por Materiales and
thermolysin en el modelo de Mtodos
sistema utilizando la protena
purificada (Lei y otros, 2011). Materiales
Sin embargo, el control Clara de huevo de pollo fresco
ultrasonido del pretratamiento (pH 7.6 a 8.6) pasteurizada en
con bao ultrasnico (15 min, intercambiadores de calor a 60
40 kHz) se tradujo en un C por 2 min fue
aumento del ndice inicial de amablemente proporcionado
EWP hidrlisis y equilibrio de Jata Emona d.o.o.
grado (Stefanovic' y otros, Ljubljana y almacenado a 4
2014b). Las diferencias C. El complejo de la enzima
encontradas en estos estudios utilizado en esta investigacin
entre el modelo de protenas y fue fresas 2.4L (Sigma
alimentos reales matrix podra Aldrich, St. Louis, Missouri,
deberse a factores relacionados Estados Unidos), un endo-
con el origen y el tipo de peptidasa bacteriana
tratamiento de las protenas, inespecfica del Bacillus
hemoglobina a una velocidad
inicial tal que hay liberado una
cantidad de producto soluble en
TCA por minuto que da el
mismo color con el reactivo de
fenol segn Folin-Ciocalteu que
uno miliequivalentes de tirosina
a 25 C y pH 7.50. La
actividad proteoltica
determinada por un
procedimiento estndar
azocasein es 7.3 kIU por gramo
de solucin de enzima en una
unidad de proteasa con este
mtodo se define como la
cantidad de enzima que
aumenta la absorbancia a 440
nm por 1.0/min a 50 C y pH 8
en las condiciones de ensayo
(Ahmed y otros 2009). Todos
los otros productos qumicos
utilizados en esta investigacin
fueron de grado analtico.
EWP pre tratamientos
Antes de la reaccin de
hidrlisis enzimtica, las
muestras EWP fueron tratadas
por 2 tipos de pretratamientos
de ultrasonidos con un
sonicador tipo sonda y un bao
de limpieza de ultrasonido. Para
comparar el impacto de los
tratamientos previos de la
ecografa en la hidrlisis
enzimtica de EWPs, el
pretratamiento trmico
convencional tambin llev a
cabo por calentamiento de
solucin EWP a 75 C durante
30 minutos. Las muestras de
todos los pretratamientos se
prepararon en un vaso de
precipitados de 600 mL en el
volumen de trabajo
(aproximadamente 360 mL) se
mantuvo constante en todos los
juegos de experimento y cada
tratamiento se realiz por
triplicado.
El bao de limpieza por
ultrasonidos con el
pretratamiento se llev a cabo a
temperatura ambiente reduce la
probabilidad de protena
degrada-cin. Solucin acuosa
de huevo fue sometido a ondas
de ultrasonido durante un
perodo de 15 min. El proceso
se llev a cabo colocando las
muestras en un ultrasonido
bao de agua (EINIS-RO-VEP,
Serbia). La frecuencia de las
ondas de ultrasonido fue de 40
kHz, gen-erator y calentador
poderes fueron 600 y 1200 W,
respectivamente.
Una sonda de tipo sonicator
trabaja con una frecuencia de
20 0,2 kHz (durante 15 min
y la temperatura de
funcionamiento de 25 1 C)
se utiliza para proporcionar un
ms eficaz la cavitacin en el
EWP solucin frente a la
ecografa, bao de limpieza.
Es decir, en este caso, los
experimentales se muestra en
el esquema 1, consista en un
generador de alta frecuencia
de 360 W, electrostrictive
transductor, transformador
para vibraciones mecnicas, y
bao de agua que contiene la
muestra de ensayo.
El poder del ultrasonido
aplicado a la muestra fue
calculado a un nivel de
amplitud particular, con la
temperatura registrada como
una funcin del tiempo en
condiciones adiabatic (usando
un termopar estndar). El
poder tanto de bao de
limpieza del ultrasonido como
de hijo-icator del tipo de la
sonda fue determinado
calorimetricamente segn el
siguiente
Ecuacin (1) (Jambrak y otros
2014):
donde m es la masa, Cp es la
capacidad de calor especfico
(4.18 kJ kg C) y (dT/dt) es la
tasa inicial de cambio de
tempera-tura en
pretratamientos de
ultrasonidos. Esto se
determin introduciendo los
datos obtenidos para
temperatura levantan contra el
tiempo a una curva polinmica
y extrapolando a tiempo
(Stefanovic y otros 2014b).
Los valores reales de
ultrasonidos de potencia
disipada en el lquido se han
calculado en 21,3 y 30,7 W
para el bao de agua con la
frecuencia de 40 kHz y la
sonda de tipo sonicator con
una frecuencia de 20 0,2
kHz, respectivamente. Durante
el ultrasonido pretreatments, la
solucin fue colocado en un
bao de hielo para limitar con
ultrasonido de rived aumentos
de temperatura (la temperatura
se mantiene constante a 25
C).
C: Food Chemistry
 Vol. 81, Nr. 11, 2016 Journal of Food Science C2665
Tratamiento previo de ultrasonido para mejorar la hidrlisis de
la clara de huevo...
La hidrlisis enzimtica a 4 C. El control se llev a
de EWPs cabo con una agitacin en vez
La hidrlisis enzimtica de pretratamientos ultrasonido y
aparato constaba de un agitado trmica a 25 C y una
tanque reactor, un impulsor velocidad de 240 rpm, despus
agitador (Heidolph RZR 2020, fue enviado al proceso de
Alemania) a una velocidad de hidrlisis y por-formado en las
240 rpm, la unidad de mismas condiciones. Todos los
calefaccin (C-MAG HS 7, juegos de experimentos de
C: Food Chemistry

IKA, Alemania), un medidor hidrlisis se realizaron por

de pH (Eutech instrumento, triplicado.
Pases Bajos), el termmetro
(ETS-D6, IKA, Alemania), y la Determinacin del grado
bureta, se ilustra en el esquema de hidrlisis.
1. El substrato para la hidrlisis Los progresos de la hidrlisis
enzimtica fue la solucin enzimtica fue seguida por
acuosa de ONU-tratadas o mon-itoring la hidrlisis grado
pretratados de huevo (5 a 20 por medio del pH-stat mtodo.
mg/mL, el contenido de La hidrlisis grado fue
protena determinado segn el calculada segn la ecuacin (2)
estndar el mtodo de Kjeldahl,
N 6,25). Fue ajustado a pH 8 (Adler-Nissen 1986):
con 0,2 M de HCl 0,2 M
NaOH, revuelve y permiti
equilibrar a la temperatura de
funcionamiento durante 15 min
(normalmente de 50 C). Las
reacciones fueron iniciados por
la adicin de la cantidad donde h es el nmero de
apropiada de la clase (E/S equivalentes de enlaces
relacin vara en el rango de peptdicos hidrolizados en el
0,29 a 3,03 UA/g de protena). tiempo por unidad de peso, htot
Durante el curso de la reaccin, es la cantidad total de enlaces
el pH se mantuvo en un valor peptdicos por unidad de peso
constante, aadiendo 0,2 M de una protena y se puede
NaOH, utilizando el pH-stat calcular su composicin de
mtodo con dosificacin aminocidos (para EWPs htot es
automtica de la base. Al final 7.67 mmol/g Protena), Nb es la
de la hidrlisis enzimtica, la normalidad de la base, B es el
reaccin fue terminado por consumo de la base en
hervir-ing la mezcla durante 15
min. Luego la mezcla de la
protena y la enzima se
centrifug a 12000 x g durante
10 min a una habitacin
temperatura. El sobrenadante
de hidrolizado fue recogido y
almacenado
Esquema 1 esquema de representacin de la configuracin
experimental de la hidrlisis enzimtica de EWP: (A) sonicator tipo
sonda y reactor de tanque (B) agitado enzima consisti en: 1,
recipiente de vidrio; 2, girando el impulsor con hlice de 4 palas
conectado a un dispositivo agitador, bureta de 3, 4-electrodo sensor
conectado a un medidor de pH digital, unidad 5, termmetro, vlvula
de 6, 7-lcali y 8-calefaccin.

C2666 Journal of Food Science Vol. 81, Nr. 11, 2016

Ultrasound pretreatment to enhance egg white hydrolysis . . .
mL, es el grado de
disociacin de la -grupos
amino (1/ = 1,13 a 50 C y pH
8,0) y mp es la masa de
protena en g. El grado de
conversin (X) se define como
la racin de la escinde pptidos
y el total enzimticamente
cleavable pptidos.
La hidrlisis enzimtica
emprico kinetic modelo
EWPs
Para interpretar y analizar los
resultados experimentales
obtenidos, se aplica un modelo
cintico semi empiric que toma
en cuenta la inhibicin de la
desactivacin y el substrato de
enzima. Aunque la hidrlisis
en-zymatic de EWPs es un
proceso complejo debido al
patrn de la especificidad de la
proteasa y la diversidad de los
sustratos involucrados, es decir,
fragmentos de pptidos son
productos como reactivos de la
reaccin siguiente, a efectos
prcticos suele ser suficiente
usar un modelo matemtico
descriptivo, que conduce a una
polation entre confiable de los
datos experimentales (Marquez
y Vazquez 1999; Qi y el 2006).
En tal caso, el mecanismo de la
reaccin puede representarse
como sigue:
La termodinmica de la
hidrlisis enzimtica.
La dependencia de la
temperatura de la constante de
1
velocidad k2 (min ) est
descrito por la ecuacin de
Arrhenius:
donde A es el factor pre
exponencial (minutos1), T es
la temperatura absoluta (k), R
es la constante universal de
gas (8.314 J/molk) y Ea es la
energa de activacin de la
reaccin (J/mol). Los cambios
de una y ab causada por la
temperatura as seguir la
ecuacin de Arrhenius (Figura
4 y 5):
donde Ea y Ed estn la energa
de activacin de la hidrlisis
enzimtica y la desactivacin
enzimtica del energa
(kJ/mol), respectivamente, Aa
y Ad son factores de
frecuencia.
Los cambios en la entalpia de
la activacin (H), entropa de
activa-cin (S) y energa libre
de Gibbs (G) de la hidrlisis
enzimtica se pueden calcular
segn las siguientes
ecuaciones:
 C: Food Chemistry
donde E y S son gratis enzima
y sustrato, respectivamente,
ES y SES son complejos
enzima-sustrato intermedio, at
y Ei son nativas (activo) y
formas inactivas de enzimas,
respectivamente P1 y P2 son
los productos finales de
enzimtico reaccin y k1, k1,
k2, k3, k3, k4 son las
constantes de velocidad de
reaccin.

Segn el siguiente
mecanismo, la velocidad de
reaccin para la reaccin de
hidrlisis se puede expresar
como (Marquez y Vazquez
1999; Qi y 2006):

(3)donde
T es la

temperatura absoluta en K, kb
es la constante de Boltzmann,
hp es la constante de Planck.
Partculas de
caracterizacin de EWP.
Luz dinmica dispersin las
mediciones se realizaron
utilizando un

(4) Aparato de Zetasizer Nano

ZS (Malvern Instruments Ltd.,
Malvern, Worces tershire, Reino
Unido) en = 633 nm producido
por un lser de He-Ne en el
donde d x / d t es la velocidad de reaccin, e es la concentracin de
enzima, e0 la concentracin inicial de enzima, KM es la constante
de Michaelis-Menten, y KI es la constante de inhibicin de sustrato.
Pa-rameters cinticas para este proceso se dan por
ngulo de dispersin 173 a 25
0,1 C a tamao de partcula
promedio de determinar en las
muestras diluidas de EWP
obtenidos despus de
tratamientos de ultrasonido y
trmicos previos, cuando las
partculas todava se dispersaron
en el dispersante. El mismo
aparato fue utilizado para el
clculo del valor potencial de
zeta de la electroforesis.
 (5) movilidad donde es el potential, es
la

mobidad , es la
viscosidad de la
solucin, y es la
constante dielctrica
constante del solvente.
Con el fin de
utilizando la confirmar el impacto del
ecuacin de tratamiento previo de ultrasonido
Smoluchowski en los cambios estructurales de
(Shaw 1999) EWPs, la influencia de
tratamientos previos en los
cambios en la concentracin de
sulfidrilo total
 Ultrasound pretreatment to enhance egg white hydrolysis . . .
Anlisis estadstico: EWPs con ambas sondas tipo
En esta investigacin, todos los sonicator y ultrasonido bao de
experimentos fueron realizados limpieza se muestran en la
en triplicado y expresados Figura 1A y B, respectivamente.
como medias con desviacin Para el objetivo de
estndar. Se realizaron anlisis comparacin, los resultados
de vari-ance, seguido por la para los tratados
prueba de Tukey para examinar convencionalmente muestra por
los efectos de diferentes calor y sin tratar EWPs tambin
C: Food Chemistry

pretratamientos en el nivel de se presentan en la Figura 1C y

significancia de P < 0.05. D. Se puede observar que la tasa
Todos los anlisis estadsticos de hidrlisis aumenta
incluyendo clculos fueron con considerablemente con el
conductos utilizando OriginPro tiempo y que X tiende hacia un
8.5 (OriginLab Corp., valor lmite, que aumenta con la
Massachusetts, Estados inicial en-Zyme concentracin.
Unidos). Adems, los grficos El menor grado de hidrlisis es
fueron creados en OriginPro observado por la menor
8.5. concentracin de enzima de
Resultados y Discusin 1,56 UA/g para todos los pre-
tratamientos probados. Cuando
Los efectos de una concentracin suficiente del
tratamientos previos de sustrato disponible, aumentando
la ecografa en la cintica la concentracin de enzima
de la reaccin de provoca un aumento de la
hidrlisis enzimtica hidrlisis enzimtica velocidad
de reaccin. Sin embargo,
Para lograr la verificacin
bastante pequeo difieren-encia
experimental del mecanismo de
en tasa inicial y final de las
reaccin, la hidrlisis
conversiones es aparente entre
enzimtica de EWPs ha llevado
la enzima concentraciones de
a cabo con las tecnologas de
2.12 y 2.83 UA/g. Esto revela
pretratamiento 3 bajo diversas
que efectos estricos y
enzimas y concentraciones sub-
adsorcin de limitaciones tales
strate en condiciones
como binding site defi-eficacia
constantes (50 C y pH 8.0) y
ocurren en mayor enzima
los resultados se ilustran en la
concentraciones e impedir el
figura 1 y 2.
acceso de EWPs a la enzima. El
Inicial de los resultados
proceso de hidrlisis enzimtica
preliminares de la reaccin de
de EWPs en diversos enzima
hidrlisis de lote, pre-presenta
concentraciones est en
el grado de hidrlisis (X) como
conformidad con el proyecto
funcin del tiempo de reaccin
emprico kinetic modelo y est
a diferentes concentraciones de
de acuerdo con los resultados
enzima para el tratamiento de
reportados en varios estudios
ultrasonido
sobre la hidrlisis enzimtica de
protenas naturales (Gonzlez-
Tello y otros 1994; Klc' Apar y
Ozbek 2007).
Figura 1 hidrolizacin progreso curvas de EWPs para las concentraciones de enzimas diferentes, que fueron obtenidas por 3 diferentes tecnologas d
pretratamiento con fresas en reactor de 600 mL a 50 C y pH 8.0. (A) pretratamiento de la sonda de ecografa tratamiento previo bao limpieza
ultrasonido (B), (C) trmico pretratamiento y (D) control.

C2668 Journal of Food Science Vol. 81, Nr. 11, 2016

Ultrasound pretreatment to enhance egg white hydrolysis . . .
La hydrolyzation curvas de
progreso de EWPs tratadas
El ultrasonido del con 2 tipos de ultrasonido y
pretratamiento con la sonda de thermal pretreatments en
tipo sonicator conduce a las diversas primeras sub-strate
ms evidentes cambios en el concentraciones (5, 7.5, 10 y
curso de la EWP hydroly-sis. El 20 mg/mL) se presentan en la
pretratamiento aparentemente figura 2. Todos los ensayos se
aumenta la eficiencia de la realizaron con la misma
actividad de la enzima reaccin condi-ciones y
permitiendo mayores adopt la primera
conversiones a bajar los niveles Concentracin de enzima.
de enzimas que se logra cuando
se comparan con los efectos del Una disminucin significativa
bao de ultrasonidos y el calor. de los valores X se observa en
En este caso, un nmero mayor sustrato
significativamente mayor concentraciones hasta alcanzar
frecuencia inicial logrado en la un valor mximo en el bajo-
primera Concentracin de est sustrato concentracin (5
enzima de 2,12 UA/g que el de mg/mL) para todos
2,83 UA/g. Los resultados pretreatments. El nmero de
tambin indican un relativo equivalentes de pptidos
incremento brusco de los hidrolizados en el momento
valores X en la primera 50 min tambin disminuye con el
cuando la concentracin de aumento de la concentraci
enzima es superior a 1,56 de sustrato (datos no
UA/g. Especialmente, la mostrados), sugiriendo que el
mencionada tendencia es appar- sustrato inhibicin ocurre
ent para alcalase concentracin durante el EWP hidrlisis y no
de 2,12 UA/g dentro de los pueden ser ignoradas porque
primeros 50 min al menos del los inactivos inter-mediar
20% del sustrato inicial complejos de la enzima y un
cantidad es convertida. Los exceso de sustrato no se puede
resultados revelan que la descomponer en un producto
cavitacin de la eficacia de la de reaccin (Wang y otros,
sonda de tipo sonicator mejora 2014). Simi-lar a otro proceso
significativamente la reaccin de hidrlisis enzimtica
inicial tasa de enzy-matic el (Gonzlez-Tello y otros,
proceso de hidrlisis. El 1994), la disminucin de cada
present influencia podra ser curva experimental podra ser
ex-plained por el hecho de que de tributar a uno de los
la cavitacin causas siguientes factores: reduccin
moleculares de ONU-Plegado de la efectiva peptide bond
de EWPs que es beneficioso concentracin, sustrato y/o
para un ataque por alcalase, producto de la inhibicin,
bajada de la difusin-limitar la
barrera para la enzima/sustrato
bind-ing y se traduce en un
aumento de la velocidad de
reaccin. Gulseren y otros
(2007) han informado de que la
aplicacin de la alta intensidad
de ul-trasound probe provoca
cambios en la estructura
secundaria de BSA.
 C: Food Chemistry

es de sustrato diferentes obtenidos por 3 diferentes tecnologas de pretratamiento

nda pretratamiento (B) ultrasonido limpieza bao pretratamiento c trmico

Vol. 81, Nr. 11, 2016 Journal of Food Science C2669

 Ultrasound pretreatment to enhance egg white hydrolysis . . .
y la enzima de la inhibicin y segundo orden la
desactivacin. Agregando una enzima desactivacin (ecuacin
nueva cantidad de sustrato af- (5) y (7)), que proporciona una
ter 90 min de la realizacin de herramienta eficaz para la
la reaccin enzimtica, ningn comparacin y optimizacin.
aumento significativo de
valores X (datos no mostrados) Determinacin de
ha sido evidente que llevan a la constantes cinticas y
conclusin de que la parmetros cintica
C: Food Chemistry

concentracin de pptidos no Parece claro que la cintica de

es un factor limitante para la las constantes a y b dependen de
inicial de hidrlisis enzimtica pretratamiento, tipo y en gran
de la tasa. Adems, el grado de reaccin factores incluyendo la
hidrlisis aumenta primera Concentracin de
significativamente como enzima, sustrato inicial de
consecuencia de la adicin de concentracin y temperatura.
una cantidad extra de alcalase, Por lo tanto, junto con el
sugiriendo que la enzima cambio inicial de la enzima y el
desactivacin ocurre (datos no sustrato de las concentraciones,
mostrados). Hay varios los valores de los parmetros a
factores que se han reportado y b fueron probados antes de
para desactivar la proteasa, que determinar la hidrlisis
ne-cessitate mayor enzima enzimtica las tasas de reaccin
cantidad para catalizar la y estos valores se calculan a
hidrlisis reaccin. Los efectos partir de la regresin no lineal
trmicos, distorsionar la fuerza, de anlisis. Las constantes
y la presencia de gas-lquido de cinticas a y b pueden ser
interfaz se han demostrado ser utilizados para comparar el
uno de los principales motivos pretratamiento, la eficiencia y el
de la enzima desactivacin sustrato suscepti-bilidad de la
(Margot y otros, 1997; hidrlisis. Parmetro una
Mrquez" y Vazquez' 1999; muestra evidente tendencia
Ghadge y otros, 2003). inicial enzima y el sustrato
Autodigestin ha demostrado concentracin y esta
tambin repercuten dependencia est en
negativamente en la actividad conformidad con cada
de la enzima, dependiendo de experimento de juegos (con
la Concentracin de enzima, ultrasonido y thermal
pH y temperatura (Ahmed y pretreatments y controlar la
oth-ers 2009). Un buen acuerdo hidrlisis enzimtica). Un
entre experimental y resultados aumento inicial de
predichos puede observarse en concentracin de enzima lleva a
la figura 1 y 2 (P &lt; 0,05), un aumento del parmetro a y
sugiriendo que la inherente la viceversa, un aumento en el
cintica de la hidrlisis de sustrato de las concentraciones
diferente pretratados EWPs
catalizada por alcalase puede
ser descrito por las semi-
emprico modelo cintico con
sustrato de
Figura 3 Las relaciones entre un 1 y eo-1 (A), b-1 y (B), R-1 y 1 (C) de los diferentes hidrlisis enzimtica. EW, sin tratamiento, el 10% (w/w) EWPs;
UPEW-15, sonda de ultrasonido Tratamiento EW durante 15 min; UBEW-15, bao de ultrasonidos tratados EW durante 15 min; TEW-30, tratamiento
trmico previo a 75 C durante 30 minutos.

C2670 Journal of Food Science Vol. 81, Nr. 11, 2016

Ultrasound pretreatment to enhance egg white hydrolysis . . .
Sin embargo, un aumento de 4
veces en la velocidad de (
Tabla 1 valores de constantes
reaccin constante afecta L
cinticas para la hidrlisis
levemente al nivel global de
enzimtica de la EWPs con o
distintos pretratamientos. hidrlisis de EWPs (hy-
drolysis grado aumenta slo P
1 a
k2 (min un 3,5%). Cabe sealar que
Control enzymatic 0.009 0.001 tanto la inhibicin y velocidad
hydrolysis de reaccin constantes de
Ultrasound probe 0.053 0.002 desactivacin tambin typi-
pretreatment camente varan
Ultrasound batch 0.045 0.001 considerablemente a lo largo
pretreatment
del pretratamiento, tecnologa,
Thermal 0.011 0.003
pretreatment Rang-ing desde 52.82 mg/mL
y 0,052 min-1 para centrales
trmicas pretreat-ment a 67,89
Conduce a la disminucin del
mg/mL y 0,450 min-1 para la
valor del parmetro (Material
sonda de ultrasonidos del
complementario).
pretratamiento,
Como se ilustra en la figura 1 y
respectivamente. Es plausible
2 con un aumento inicial de
que la protena pretreat-miento
concentracin de enzima y
por el ultrasonido provoca
disminuyendo el sustrato inicial
cambios estructurales de
concentra-cin, la hidrlisis
EWPs a una forma con una
enzimtica de la velocidad de
mayor susceptibilidad a
reaccin aumenta y este hecho
alcalase sino una disminucin
coincide con el discutido
enlace a enzima que puede
anteriormente la dependencia
afectar tanto la inhibicin de
del parmetro a. Asimismo,
enzimas por el sustrato y la
parece que el parmetro b slo
enzima de la estabilidad. Es
depende de sub-strate
decir, el valor de la constante
concentracin y su valor
de inhibicin para el control
tambin aumenta cuando el
reaccin enzimtica inferiores
sub-strate concentracin
a los obtenidos por la sonda de
disminuye. Sin embargo, la
ultrasonidos la hidrlisis
constante b es ms estable que
enzimtica, sugiriendo que el
el Kinetic constante cuando otra
ultrasonido del pretratamiento
reaccin condi-ciones cambiar
reduce la inhibicin de la en-
incluida la primera
Zyme con el sustrato.
Concentracin de enzima y
Exactamente puede atribuirse
temperamento-maduros. Estos
al efecto de la sonda de
resultados estn en buen
ultrasonido ondas a la
acuerdo con las encontradas en
estructura del sustrato
la literatura para la hidrlisis
molculas que estn
enzimtica de otros globulares e
vinculados a los grupos
incluso las protenas fibrosas
funcionales del centro activo
(Gonzlez-Tello y otros 1994;
de la enzima. Para resumir, en
El Qi y l 2006).
general, disminucin de la
Utilizando regresin lineal
inhibicin de la enzima con el
mtodos sobre la dependencia
sustrato proteico, as como un
de los parmetros a y b de la
aumento de la actividad
enzima y el sustrato
enzimtica y la reaccin la
concentracin, constantes
velocidad indicada por el
cinticas pueden determinarse
Kinetic kinetic anlisis
dibujo 3 lneas rectas (Figura
sugieren una mejor reaccin
3): b- 1 s0, 1e0-1 y R-1 so-1.
enzimtica despus de tanto el
Mediante la combinacin de la
ultrasonido pretreatments.
ecuacin (6) y (7), las
Este aumento de la hidrlisis
constantes cinticas puede
grado por un promedio de
calcularse a partir de suficientes
3,5% es con-sistent con los
pistas e intersecciones de la
resultados de Zou y otros
figura 3 (Tabla 1).
(2016) quienes observaron
mejoras similares para el
Sobre la base de los valores
porcino cerebral hidrlisis de
calculados para la velocidad de
protenas. Sin embargo, el
reaccin constante, la sonda de
efecto del ultrasonido en la
ultrasonido del pretratamiento
velocidad de reaccin parece
aumenta la velocidad de
ser mucho ms alto.
reaccin de la hidrlisis
enzimtica de EWPs al
comparar con otros meth-SAO.
vencer la energa barrera de la
hidrlisis enzimtica de la
reaccin. Asimismo, el Ea val-
ues de la hidrlisis enzimtica
con sonda y bao ultrasonido
pretreatments son
significativamente menores en
comparacin con el control en-
zymatic hidrlisis y las
reducciones de velocidad de
reaccin son 61,7% y 53,1%,
respectivamente.
Es interesante que los valores
de activacin y desactivacin
en-ergy para la sonda de
ultrasonido se tratan la
hidrlisis enzimtica son
similares (Ea = 33.21 kJ/mol,
Ed = 33.64 kJ/mol) que
conduce a la conclusin de que
ambas reacciones deben superar
anlogos en-ergy barreras.
Adems, una diferencia
significativa entre la Ea y Ed
para trmicas tradicionales la
hidrlisis enzimtica se obtiene
(Ea = 72.93 kJ/mol, Ed = 78,64
kJ/mol). Este comportamiento
podra ser explicado por la
influencia de ultrasonication en
el EWPs. De hecho, bajo la
influencia de la cavitacin
efectos (20 0,1 kHz) la
ruptura de los enlaces qumicos
de las protenas puede ocurrir
incluso as como cambios en la
conformacin de protenas
haciendo pptidos ms
accesible a la enzima.
Los valores de activacin de
entalpa, entropa, Gibbs y libre
en-ergy para todos
pretreatments utilizado en cada
temperatura se presentan en la
Tabla 2. Es evidente
congruentes tendencias como
para Ea. Sobre la base de pre-
representado valores se puede
determinar que la hidrlisis de
tratados y no tratados EWPs
son endotrmicas, as como que
los cambios de H tienen la
mayor influencia en los
cambios de G en el rango de
temperatura de 318 a 338 k. La
entropa de activacin ( S)
aumenta con el aumento de la
temperatura por tanto de
ultrasonidos como de ther-mal
pretreatments y EWP solucin
es ms ordenada distribuido
despus pretreatments (Tabla
2). En relacin con el control la
hidrlisis enzimtica, el
descenso ms pronunciado en
H, S y G
C: Food Chemistry
 Ultrasound pretreatment to enhance egg white hydrolysis . . .
Not que la
hidrlisis
enzimtica de
EWPs tratada por
sonda-tipo
sonicator y
ascendi al
63,6%, 4,2% y
32,2%,
respectivamente.
La indicada tasa
decreciente
C: Food Chemistry

valores reconocer
el mencionado
hecho que la
hidrlisis
enzimtica de la
ultra-sonido
probe tratados
EWPs es

significativamente ms
rpido que el control
trmico y la hidrlisis
enzimtica. Estos
significativamente
menores valores de
termodinmica de
p s sobre el ultrasonido bao
a u de limpieza. Este aumento
E l del contenido total y
lE f expuestos sulfhydryl
h grupos pueden explicarse
n
y por con ultrasonido-
d inducida con-formativas
r cambios que pueden
y provocar parcial o
l completo despliegue de
polipptidos resultando en
g la exposicin de los
r enterrados grupos SH.
u Cuando el tratamiento
p trmico aplicado, no hay
o diferencias significativas
s entre los contenidos
, totales de grupos SH entre
acalorado y ONU-tratados
d muestras (P &gt; 0,05),
o pero el contenido de
n expuestos sulfhydryl
d grupos aumenta despus
e del tratamiento (P &lt;
0,05). Calefaccin de
l EWPs durante 30 min
a parece conducir a un
aumento en la exposicin
sulfhydryl grupos debido a
s
la evolucin de las
o
protenas pero con
n
acompaamiento de ag-
d
gregation, causando
a
disminucin en el total
sulfhydryl contenido, y
d probablemente un
e aumento de disulfuro de
bonos.
t La principal funcin de la
i sulfhydryl grupos reside
p en determinar y sta-
o bilizing la estructura
tridimensional de las
s protenas; por lo tanto, el
o cambio en el sulfhydryl
n contenido de sonicado
i protenas podra ser una 1
c indica-cin de que algunos
a de los cambios
t estructurales
o fundamentales en la
r protena funcionalidad
existe. As, parece que la
m influencia de la sonda de
u tipo sonicaci
e pretreatment se refleja en
s trminos de la protena
t estado natal desplegar
r haciendo el EWPs cadena
a ms accesible a alcalase
penetracin mejora la
u velocidad de reaccin. La
n sonda de tipo sonicator
a podra causar la rotura de
una protena agregada y
v los grupos SH podr tomar
e parte en este fenmeno
n reduciendo el nmero de
t S-S bonos que son
a responsables de mantener-
j ing agregado estructura.
a Al igual que nuestros
C2672 Journal of Food Science Vol. 81, Nr. 11, 2016
Ultrasound pretreatment to enhance egg white hydrolysis . . .

C: Food Chemistry
Figura 4: la influencia de tratamientos previos sobre las caractersticas de las partculas EWP. (A) efectos de diferentes pretratamientos sobre la
distribucin de tamao de partcula EWP. Recuadro: Los valores de potencial para trataron diferentemente EWPs. (B) cambios en el contenido
sulfidrilo de EWPs tratados diferentes. EW, untreated EWPs 10% (w/w); UPEW-15, sonda de ultrasonido tratamiento EW durante 15 min;
UBEW-15, bao ultrasnico tratados EW durante 15 min; TEW-30, trmico pretratamiento a 75 C durante 30 minutos.
Acuerdo con los datos encontrados en la literatura (Jambrak y otros,
Productos intermedios tales como el hidroxilo y el hidrgeno radicales 2014). Arzeni y otros (2015) ha informado de que la HIUS
libres provocando la ruptura de disulfuro de bonos. Xiong y otros pretratamiento con-calefaccin disminuir significativamente el tamao
(2016) tambin informaron de un aumento significativo sulfhydryl de las partculas de native EWPs y es muy eficaz para preparar
contenido como resultado de ultrasonication de ovoalbmina, pero nanopartculas. Como se muestra en la Figura 4, un incremento
pequeas subunidades y secundaria cambios estructurales han sido significativo (P &lt; 0,05) en la potencial a ultra-sound pretreatments
confirmados por dicroismo circular en este caso. Por el contrario, otros es aparente y este comportamiento tambin es atribuido al reajuste
estudios informaron tanto un significati-peralte aumento sulfhydryl estructural de las protenas derivadas de ul-trasonic cavitacin. Los
contenido y protena cambios estructurales como consecuencia de valores negativos de EWP dispersin sistema estn adscritas a la carga
ultrasonication (Huang y otros, 2008). Gulseren y otros (2007), sin negativa de las molculas de protenas y esto indica que grupos
embargo, tambin inform de los cambios en la estructura secundaria carboxilo se vuelven ms cargadas negativamente, hasta grupos amino
de seroalbmina bovina (BSA), pero la cantidad de espacio libre convertido en punto muerto durante la sonicaci (Chanamai y
sulfhydryl grupos en BSA pareca disminuir despus de 90 min de McClements 2002).
soni-catin que se explica por la formacin de agregados proteicos
como en tratamiento trmico previo. As pues, los efectos de las ondas En general, hay muchos informes contradictorios sobre el efecto de la
ultrasnicas en protenas parecen ser muy compleja debido a la alta intensidad en las propiedades estructurales y funcionales de las
variabilidad de los parmetros de tratamiento y las diferencias protenas naturales. Los resultados observados en estos estudios fueron
individuales de protenas naturales y sus mezclas. altamente dependientes de una combinacin de ultrasonido del
La influencia de pretratamiento sobre las caractersticas de EWP pretratamiento y la protena tipo. Otros componentes presentes en los
partculas se presenta en la figura 4. Parece que, junto con el aumento alimentos en concentraciones variables tambin pueden afectar los
de la sulfhydryl contenido de sonda de ultrasonido Tratamiento EWPs, resultados. El objetivo especfico de este estudio es investigar
tanto el tamao de las partculas y la distribucin del tamao de las cuantitativamente la influencia de los ultrasonidos pretreatments sobre
partculas son de-arrugadas. Este fenmeno puede atribuirse al efecto EWP como una protena alimentaria, con el fin de elucidar el potencial
de ultra-sonido, lo que conduce a la alteracin de la interaccin entre del ultrasonido sobre el verdadero sistema alimentario.
protenas responsables de la formacin de los agregados de darle
pequeas partculas con ms prominentes picos. En todos los casos Conclusin
examinados, las curvas presentan un poli-distribucin modal con un Los pretratamientos del ultrasonido de EWPs con sonica-colina del
pico pronunciado en valores por encima de 100 nm (Figura 4), pero la tipo de la sonda y ultrasonido limpiando el bao exponen el efecto
sonda de ultrasonido del pretratamiento provoca un cambio en la importante en talla de la partcula de la protena, uniformidad y precio,
distribucin del tamao de las partculas con dimetros inferiores (pico afectando tambin sulfhydryl el contenido y la susceptibilidad a la
superiores a 60 nm) y la mayora de las partculas presentes los hidrlisis alcalase y as determinando el precio de reaccin y la
dimetros inferiores a 100 nm. Asimismo, despus de que el bao de cintica. Se muestra que el modelo cintico que tiene en cuenta
ultrasonidos pretratamiento, una importante re-duccin tambin ha substrate inhibicin y segunda desactivacin de la enzima de pedido
sido observado (P &lt; 0,05), pero no en la medida en que para la encaja con xito los datos experimentales para todas las tecnologas de
sonda de tipo pretreatment. Esta diferencia puede ser explicada por la pretratamiento, pero los parmetros cinticos son muy dependientes
presencia de una mayor superficie de una fuente de mechani-cal del pretratamiento aplicado y de factores de reaccin principales. Los
vibraciones, pero no muy alta intensidad como en el caso de la sonda pretratamientos de sonda del ultrasonido, sobre todo tratamiento con el
que est directamente inmerso en tratar las muestras. Sin embargo, el tipo de la sonda sonicator con la frecuencia de 20 0.1 kilohercios,
tratamiento trmico previo parece influir fuertemente en el tamao de realzan la afinidad entre alcalase y EWPs, aumentan las constantes del
las partculas, debido al calor que la agregacin, causando un aumento precio de reaccin de la hidrlisis enzymatic (k2) y disminuyen la
en el tamao de las partculas (pico por encima de 500 nm). Estos energa de activacin (Ea), enthalpy de la activacin (H), entropa de la
agregados se podra dividir en pequeas partculas por tanto el activacin (S), y Gibbs energa libre de activacin (G).
ultrasonido pretratamiento que es experimentalmente confirmada y
est de
 Ultrasound pretreatment to enhance egg white hydrolysis . . .
Ambos pretratamientos
tambin han llevado a los
efectos positivos significativos
en la termodinmica de la
hidrlisis enzimtica con
relacin a la reaccin de
control, por lo cual los valores
de Ea, H, G, y S son reducidos
en el 61.7% y el 53.1%, el
C: Food Chemistry
Ei Forma inactiva de la enzima
Ea hydrolysis activation energy (kJ/mol)
Ed enzyme deactivation energy (kJ/mol)
e enzyme concentration (mg/mL)
e0 initial enzyme concentration (mg/mL)
ES enzymesubstrate complex
34
hp Planck constant, 6.6256 10 (J/s)
h hydrolysis equivalents (mmol/g proteins)
h

tot total number of peptide bonds in a protein (mmol/g

63.6% y el 54.7%, el 32.2% y
proteins)
el 27.9%, el 4.2% y el 3.3%, k 1
2 reaction rate constant for proteolysis (min )
respectivamente. 23
kb Boltzmann constant, 1.38 10 (J/K)
Generalmente, los resultados 1
ilustrados han demostrado k d reaction rate constant of deactivation (min )
obviamente que los KI inhibition constant (mg/mL)
pretratamientos del ultrasonido mp Masa de protenas (g)
sin tener en cuenta el tipo son P producto
beneficiosos para la hidrlisis r Promedio de reaccin
enzimtica de EWPs en R universal gas constant, 8.314 (J/kmol)
comparacin con el S Sustrato libre
pretratamiento termal. SES substrateenzymesubstrate complex
El reconocimiento s0 initial substrate concentration (mg/mL)
Los autores agradecen al s substrate concentration (mg/mL)
Ministerio de educacin,
ciencia y desarrollo
tecnolgico de la Repblica de
Serbia, por su apoyo financiero
en el proyecto EUREKA E!
6750 y proyecto III-46010.
Conflicto de intereses
Los autores no declaran
ningn conflicto de inters.

Contribuciones de los
autores
Jelena R. Jovanovic' y Andrea
B. Stefanovic' realizado
La investigacin, interpreta los
datos de prueba recolectados, y
redactado
El manuscrito. Marina B.
Dojcinovic' contribuy con la
recopilacin
Los datos experimentales.
Sonja M. Jakovetic' Tanskovic'

Y Natasa Z.
Sekuljica realiz el anlisis
estadstico. Branko M.
Bugarski revisado y editado el
manuscrito. Zorica D.
Knezevic'-Jugovic' concebido
y diseado los experimentos,
escribi el debate, as como la
revisin y edicin del
manuscrito. Todos los autores
han ledo y aprobado el
manuscrito.
Nomenclatura
A Factor pre-exponenciak (min
Aa, Ad frequencia de factores, adimensional
a Parmetro cintico (min
B Consumo nominal (mL)
b Parmetro cintico adimensionals
DH hydrolysis degree (cleaved peptide bonds/total peptide
bonds)
E free enzyme
En Forma activa de la enzima
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