CULTIVOS CELULARES

1. Introduccin

El cultivo celular es el proceso mediante el que clulas, ya sean clulas procariotas o

eucariotas, pueden cultivarse en condiciones controladas. En la prctica el trmino "cultivo
celular" se usa normalmente en referencia al cultivo de clulas aisladas de eucariotas
pluricelulares, especialmente clulas animales. El desarrollo histrico y metodolgico del cultivo
celular est ntimamente ligado a los pptidos cultivares del cultivo de tejidos y el cultivo de
rganos.

2. Cultivo de clulas microbianas

Aunque el papel de microorganismos en la biotransformacin no se reconoci hasta el siglo

XIX, los microorganismos han sido usados por los humanos desde que los tiempos
prehistricos en la preparacin de comida, bebidas alcohlicas, los productos de leche, los
textil, y as sucesivamente. Hoy, el uso de microorganismos est ms aun extendido que antes
de. Ellos no slo se usan para los procesos microbianos tradicionales pero tambin para los
nuevos procesos como la produccin de farmacuticos, qumicos industriales, enzimas,
qumicos agrcolas, tratamientos de agua desechados y en muchas cosas ms.

2.1. Las clulas microbianas

Los organismos todos vivientes eran clasificados por el haekel en 1866 como el reino animal, el
reino de la planta, y los protistas como mostrado en la tabla 1. Los protistas se refieren
organismos biolgicos relativamente simples comparados a las plantas y animales e incluyen
algas, protozoarios, hongos, y bacterias. El desarrollo del microscopio del electro les permitido a
los cientficos reconocer esa estructura de la unidad de organismos todo vivientes es dividido en
dos categora, procariotas y eucariotas.

La clula del procariota: es la unidad de estructura en dos grupos microbianos: las bacterias y
las algas azul-verdes. La clula del procariota es el centro comercial y simple, como mostrado
en figura 1. La clula estructuralmente se divide en dos regiones interiores: el citoplasma y la
regin nuclear.

El citoplasma: tiene las manchas oscuras granosas como resultado de su volumen de

ribosomas que est compuesto de protena y cido del ribonucleico (ARN). La ribosoma es el
sitio de reacciones bioqumicas importantes para la sntesis de la protena. La regin nuclear es
de forma irregular, grandemente segreg aunque no se limita por la membrana. La regin
nuclear contiene informacin gentica que determina la produccin de protenas y otras
substancias celulares y estructuras.

Tabla 1: Clasificacin de organismos vivientes

multicelular Animales
Plantas
unicelular Protistas Alga
Protozoos
Fung eucariotas
Mohos
Levaduras
Bacteria procariotas
Figura 1: Estructura de la clula del procariota

La clula procariota le rodea una pared celular y una membrana celular. La pared celular,
considerablemente ms espeso que la membrana celular, protege la clula de las influencias
externas. La membrana celular (o membrana del citoplasma) es una barrera selectiva entre el
interior de la clula y el ambiente externo. Las molculas ms grandes conocidas para cruzar
esta membrana son ADN fragmenta y protenas del bajo-molecular-peso. La membrana celular
puede plegarse y puede extenderse en el citoplasma o las membranas interiores. La membrana
celular sirve como la superficie hacia que otras substancias celulares atan y en que muchas
funciones celulares importantes toman el lugar.
Figura 2: Estructura de la clula eucariota animal

La clula del eucariota ms complejo es la estructura de la unidad en las plantas, animales,

protozoarios, hongos, y algas. La clula del eucariota tiene sistemas de membrana de unidad
interiores que segregan muchos de los componentes funcionales de la clula, como mostrado
en figura 2.

l es 1000 a 10000 veces ms grande y ms complejo que las clulas del procariota. El ncleo

se rodea por una membrana doble con los poros 40 a 70 m ancho, conteniendo el

cytologically los cromosomas discernibles. El ncleo controla las propiedades hereditarias y las
actividades vitales de la clula. Los cromosomas son largos y se encuentra en los ncleos de
clulas que contienen los genes colocados en la sucesin lineal en el nucleoprotenas (las
protenas ms el cido nucleico). El citoplasma contiene que los nmeros grandes de grnulos
llamados ribosoma. La ribosoma se concentra sobre todo a lo largo de la superficie spera del
reticulum del endoplasmtico, una red irregular de cauces membrana-delimitados
interconectados.

La nomenclatura microbiana

Los microorganismos usan el sistema binomio en que cada organismo tiene dos nombres,
Siempre se ponen nombres apropiados de organismos. La primera palabra es el gnero (el
plural, genera) y se capitalizan. Los ejemplos de nombres del gnero y sus significados son:

Bacillus: una vara pequea

Lactobacillus: una vara de leche pequea

 Micrococos: un grano pequeo

clostridium -. Un huso pequeo

pasteurella: despus del pasteur del louis, latinized

salmonella: despus del daniel salmn de E., el latinized,

saccharomyces: azucare el hongo

Puede haber varias especies con el mismo gnero nombre, por ejemplo, subtilis del bacilo,
albus de B., y coagulans de B. Note que cuando el mismo nombre del gnero se repite varios
tiempos, se abrevia.

2.2. Las bacterias

Son los organismos unicelulares. Hay aproximadamente 1,500 especies conocidas que ocurren
en prcticamente ambientes todo natural. El dimetro tpico de los rangos celulares de 0.5 a 1
m. las longitudes de clulas bacterianas varan grandemente. Las bacterias ocurren en una
variedad de formas como:

coco: esfrico u ovoide

bacilo: cilndrico o la vara form

espirilo: helicoidalmente se enrollado

vibrios: bacilos curvados.

El modelo de crecimiento: las bacterias se reproducen predominantemente por un proceso

conocido como el hendimiento binario como se ilustra en la figura 5.3. Este proceso involucra
varios pasos: el alargamiento celular de la distribucin de la pared celular de material nuclear,
formacin de la pared celular transversa, la distribucin de material celular en dos clulas, y
separacin en dos nuevas clulas. ste es el proceso reproductor asexual.

FIGURA 3: Reproduccion asexual

Los requisitos nutritivos: es importante ser capaz para cultivar las bacterias bajo el
laboratorio condiciona para estudiar sus caractersticas. Para poder hacer esto, se requieren
material y las condiciones fsicas. Clulas bacterianas que estn creciendo activamente son
aproximadamente 90% de agua. La composicin elemental de bacterias se lista en tabla 5.2. El
medio nutritivo para cultivar las bacterias debe contener esos componentes bsicos listados.

Los sistemas biolgicos de los microorganismos para tripular, comparte un juego de requisitos
nutritivos que son:

1 -. Las fuentes de energa

1) fototrofos: organismos que son capaz de emplear la energa radiante.

b) quimiotrofos: organismos que obtienen la energa por sus actividades y mismo-sntesis de

reacciones qumicas que pueden ocurrir en la oscuridad.

2 -. Las fuentes de carbono

a) auttrofos: organismos que pueden crecer en una dieta completamente inorgnica, mientras
usando CO2 o carbonatos como una sola fuente de carbono.

b) el hetertrofos: organismos que no pueden usar CO2 como una sola fuente de carbono pero
pueden requerir, adems de minerales, uno o substancias ms orgnicas, como glucosa o
aminocidos, como las fuentes de carbono.

3 -. Las fuentes de nitrgeno: el nitrgeno atmosfrico, el nitrgeno inorgnico compone, u

otro nitrgeno derivado.

4 -. Las fuentes de azufre y fsforo: el azufre elemental, azufre inorgnico, o el azufre

orgnico.

5 -. Las fuentes de elementos metlicos: el sodio, potasio, calcio, magnesio, manganeso,

hierro, cinc, cobre, y cobalto.

6 -. Las fuentes de vitaminas.

Las condiciones fsicas: despus de determinar los nutrientes apropiados para el cultivo de
bacterias, es necesario determinar el ambiente fsico en que los organismos crecern ms
buenos. Tres factores fsicos se toma en cuenta que: son temperatura, el ambiente gaseoso, y
pH.
Subsecuentemente la actividad microbiana y crecimiento son manifestaciones de accin
enzimtica, y desde las proporciones de reacciones de la enzima aumente con las temperaturas
crecientes, la proporcin de crecimiento microbiano es la persona a cargo de temperatura. El
rango de temperatura encima de que ellos crece, se llaman las bacterias el psychrophiles,
mesophiles, o thermophiles. La temperatura va en que cada grupo es capaz de crecimiento y
las temperaturas ptimas se resumen en tabla 5.3.

Los gases principales en el cultivo de bacterias son oxgeno y anhdrido carbnico. Hay cuatro
tipos de bacterias, segn su contestacin a oxgeno.

1 -. Las bacterias aerobias crecen en la presencia de oxgeno libre.

2 -. Las bacterias anaerobias crecen en la ausencia de oxgeno libre.

3 -. Las facultativas son que las bacterias anaerobias crecen en o la ausencia o la presencia
de oxgeno libre.

4 -. Las bacterias del microaerofilas crecen en la presencia de cantidades diminutas de

oxgeno libre.

Para la mayora de las bacterias el pH ptimo para el crecimiento queda entre 6.5 y 7.5, para la
mayora de las especies los lmites mnimos y mximos se caen en alguna parte entre pH 4 y
pH 9.

La formacin de la espora: algunas bacterias forman las esporas cuando el crecimiento cesa
debido a inanicin u otras causas. Las esporas son ms resistentes que las clulas normales al
calor, secado, radiacin, y qumicos. Las esporas pueden permanecer vivas durante muchos
aos; sin embargo, ellos pueden convertir atrs a las clulas normales a las condiciones
apropiadas. Normalmente se encuentran las bacterias espora-formando la mayora en la tierra.

El Gram en la reaccin: el Gram es uno del diferencial ampliamente usado en tcnicas que
separa las bacterias en dos grupos: Gram-positivo y Gram-negativo. El procedimiento es el
siguiente:

1 -. Teir la bacteria con la violeta de cristal y durante 20 segundos y luego enjuagar con agua.
Todas las clulas quedaran manchadas de violeta.

2 -. Cubra la mancha con la solucin de yodo durante 1 minuto. La violeta cristal formar un
complejo con el yodo dentro de las clulas. Todas las clulas permanecern de color de violeta.
 3 -. Decolorar la mancha con 95% de alcohol del etilo durante 10 a 20 segundos y enjuague el
agua. Las clulas Gram-positivas permanecern que las clulas de color de violeta, pero Gram-
negativas sern descoloridas.

4 -. Cubra la mancha con safrina, durante 20 segundos, lavar por unos segundo, al final
secamos. Las clulas Gram-positivas permanecern que las clulas de color de violeta, pero
Gram-negativas se pondrn rojas.

Hay diferencias caractersticas entre la mayora bacterias gramo-positivas y gramo-negativas

que pueden resumirse en tabla 3

2.3. Los hongos

Son plantas que carecen de clorofila y por lo tanto son incapaces de sintetizar su propia
comida. Varan en tamao y forma a partir de levaduras unicelulares a pluricelulares setas.
Entre ellos, levaduras y mohos son industrialmente importantes.

Las levaduras: las levaduras son extensamente distribuidas en la naturaleza. Ellos se

encuentran en las frutas, granos y otra comida que contienen el azcar. Ellos tambin estn en
la tierra, en el aire, en la piel y en los intestinos de animales. Desde que las levaduras no tienen
la clorofila, ellos dependen de las plantas ms altas y animales para su energa. Las levaduras
generalmente son los organismos del unicelular y su forma es esfrica a ovoide. Su tamao 1 a
5um en la anchura y de 5 a 30um en la longitud. la pared celular est bastante delgada en las
clulas jvenes pero espesa con la edad.

El modelo de crecimiento ms comn para las levaduras est brotando que es un proceso
asexual como se ilustra en la figura 4. Un brote pequeo (o clula de la hija) se forma en la
superficie de una clula madura. El brote crece y est lleno con nuclear y material del
citoplasmtico de la clula del padre. Cuando el brote es tan grande como el padre, el aparato
nuclear en ambas clulas se reorienta y las clulas estn separadas. La clula de la hija puede
aferrarse al clula del padre.

Figura 4: un modelo de crecimiento tpico de levadura brotando

 Las levaduras ms importantes son tensiones de cerevisiae del saccharomyces que se usa en
la fabricacin de vino y cerveza y el haciendo fermentar de pan.

Los mohos: los mohos son los hongos filamentosos (figura 5). Una sola clula reproductora o
espora se germina para formar un hilo largo, que echa ramas repetidamente como l alarga
para formar una estructura vegetativa llamada un mycelium. Desde que un mycelium es
indefinidamente capaz de crecimiento, puede lograr las dimensiones macroscpicas. Las clases
ms importantes de mohos industrialmente son aspergillus y penicillium. Se usan en la
produccin de antibiticos, qumicos industriales, enzimas, y aditivos de comida.

Figura 5. parte de crecimiento de hongo del filamentoso echando ramas

2.4. Los medios de cultivo

Se llama el crecimiento de poblacin microbiana en los ambientes artificiales el cultivo. Una

cultura que contiene slo un tipo de microorganismo es una pura cultura. Una cultura mixta es
que uno que contiene ms de un tipo de microorganismos es:

1-. Preparando un medio de cultivo en que un microorganismo puede crecer mejor.

2-.esterilizando para eliminar los organismos todo viviente en el vaso.

3-. Inoculando el microorganismo en el medio preparado.

Para cultivar los microorganismos, el medio de cultivo tiene que ser preparado en uno de los
vasos de la cultura normalmente empleados: un tubo de la prueba, un frasco, un plato del petri,
o un fermentador. Hay dos tipos principales de medios de cultivos: natural (o emprico, o
complejo) y sinttico (o qumicamente defini). Ellos varan ampliamente en el formulario y
composicin, mientras dependiendo de las especies de organismo ser cultivado y el propsito
del cultivo.
Los medios cultivos naturales: son aqullos usados en base a la experiencia y no en base al
conocimiento exacto de su composicin y accin. Los medios de comunicacin natural o
complejos normalmente contienen peptones, extracto de carne, o extracto de levadura. Cuando
un medio slido se desea, agente solidificando como gelatina o agar puede incorporarse en el
medio. Los ejemplos de un lquido relativamente simple y un medio slido que apoya en el
crecimiento de muchos heterotropos, comn es caldo nutriente y los agar nutrientes. Su
composicin es la siguiente:

El caldo nutriente: 3g de extracto de carne, 5g de peptona, 5g de extracto de levadura,

y riega para hacer 1L
El agar nutriente: el mismo ingrediente como el caldo nutriente, 15g de agar y riega
para hacer 1L.

El medio de crecimiento tpico para las levaduras se lista en la tabla 5.

Los medios de cultivo sinttico: consista de diluya, soluciones del reproducible de

qumicamente puro, conocido inorgnico y / o los compuestos orgnicos. ellos se requieren a
menudo para los propsitos de la investigacin. El medio puede ser tan simple como el amonio
inorgnico de sal ms mineral o tan complejo como la casena purificada con las vitaminas
agregadas, minerales, y un azcar. Estos medios de comunicacin tienen la ventaja agregada
que ellos pueden producirse con un ao de la composicin constante despus de ao.

La esterilizacin: despus de que un medio de la cultura conveniente se selecciona para el

cultivo de un microorganismo especfico, se entra a raudales en un vaso de la cultura. si usted
usa tubos de la prueba o frascos como su vaso de la cultura, el deben cubrirse los fines de
tubos de la prueba o frascos con un cierre conveniente permitir el intercambio de gases con la
atmsfera, todava dejar fuera los organismos extranjeros de los medios de comunicacin. Se
usan varios tipos de cierres en el laboratorio moderno incluso los tapones de algodn, espuma
plstica, gorras del tornillo, gorras de metal, y la lmina lumnica.

El medio se esteriliza para eliminar los organismos todos vivientes en el vaso entonces, el
mtodo ms comn de esterilizacin est por el calor hmedo (el vapor bajo la presin) en una
autoclave. Generalmente, la autoclave se opera a las aproximadamente 15psi a las 121c. El
tiempo de esterilizacin depende de la naturaleza del material, el tipo de recipiente, y el
volumen. Por ejemplo, pueden esterilizarse tubos de la prueba de medios de comunicacin
lquidos en 15 a 20 minutos a las 121c.
 La inoculacin: la inoculacin es el sembrando de un vaso de la cultura con el material
microbiano (el inoculum). Se introduce con un alambre de metal o vuelta que se esterilizan
rpidamente simplemente antes de su uso calentndolo en una llama. Los traslados de cultura
lquida son a menudo hecho usando una pipeta esterilizada. La inoculacin normalmente se
hace en una capucha de flujo de laminar para minimizar el riesgo de contaminacin. Es
importante conocer las tcnicas del pipetting apropiadas por inocular o probar durante el cultivo.

3. Cultivos de clulas animales

El cultivo de clulas animales es el trmino general que se le ha dado al aislamiento de un tipo

especfico de clulas provenientes de tejidos u rganos animales, que posteriormente son
colocadas en un ambiente artificial que favorece su divisin, crecimiento, multiplicacin y en
algunos casos, diferenciacin. El cultivo de clulas animales ha permitido estudiar la actividad
intracelular, los flujos metablicos, las interacciones con el medio ambiente, las interacciones
clula-clula, la gentica y la generacin de metabolitos de inters. Estos principios bsicos han
sido aplicados en muy diversas disciplinas de las ciencias naturales, abarcando desde la
biologa celular, biologa del desarrollo y la fisiologa hasta ciencias como la toxicologa y
farmacologa. La metodologa de cultivo de tejidos ha dado a los investigadores la oportunidad
de estudiar las clulas del cncer, para clasificar los tumores malignos, para determinar la
compatibilidad de tejidos en trasplantes, y para el estudio de clulas especficas y sus
interacciones.
La tcnica de cultivo de clulas de mamfero se puede emplear para producir productos
bioqumicos clnicamente importantes como el crecimiento humano hormonas, interfern,
activador del plasmingeno, vacunas virales, y anticuerpos monoclonicos.
Algunos productos gnicos de mamferos pueden ser producidos por sistemas bacteriana que
utilizan la tecnologa de ADN recombinante. Tasa de crecimiento rpido y requisitos medianas
baratas de clulas bacterianas hacen una alternativa econmica al cultivo de clulas de
mamfero. Sin embargo, las bacterias carecen de la capacidad de las modificaciones post-
traduccionales, que implican la escisin proteoltica, la asociacin de la subunidad, o una
variedad reacciones de glicosilacin adicionales, tales como, la metilacin, fosforilacin, o
acilacin. Estas modificaciones son importantes para la actividad biolgica adecuada de un
producto.
 Sin embargo, es difcil de cultivar grandes cantidades de clulas de mamferos, debido a las
siguientes razones:

Son ms grandes y ms complejos que la mayora de los microorganismos.

Su tasa de crecimiento es muy lento en comparacin con los microorganismos. Por lo
tanto, la productividad es baja y el mantenimiento de la esterilidad es difcil.
Ellos estn encerrados con una membrana plasmtica delicada sin la pared celular dura,
normalmente se encuentran en microorganismos o plantas las clulas y como resultado,
son frgiles.
Sus requerimientos nutricionales no estn an definidos plenamente, el requiriendo del
suero sanguneo es caro para el medio.
Ellos son parte de un tejido organizado en lugar de un individuo organismo celular.
La mayora de las clulas animales slo crecen cuando se une a una superficie.

3.1. Clula animal

Las clulas animales son clulas eucariotas de la que se componen los distintos tejidos de los
animales. El tejido se divide habitualmente en cuatro categoras: epitelio, tejido conectivo,
msculos, y nervio. .

Tejido epitelial. Protege la superficie de algunos rganos internos como el estmago, los
intestinos y las cavidades como la boca. Tambin reviste el interior de estructuras como el
tubo digestivo, las vias respiratorias, los vasos sanguneos y otros conductos.
En el tejido conectivo, las clulas son siempre incrustadas en una extensa matriz
intercelular, que puede ser lquido, semislido, o slido.
Tejido muscular. Es uno de los tejidos que permiten el movimiento de los rganos
internos y la locomocin de los animales. El tejido muscular puede ser tambin de varios
tipos: estriado, liso y cardiaco.
Tejido nervioso. Participa en la integracin y coordinacin de todas las funciones que
realiza el organismo.El tejido nervioso est constituido por dos tipos principales de
clulas: las neuronas, formadas por un cuerpo glandular, dendritas y axn y, las
neuroglicas, que protegen y sostienen al sistema nervioso.
 Clulas animales de uso comn en la cultura:
(a) linfocitos, (b) clulas epiteliales, y (c) clulas de fibroplastos
fibroblastos.
Las clulas de suspensin: las clulas se encuentran dispersas en el medio de cultivo. Su
crecimiento no depende del anclaje. Este tipo de cultivo se restringe a las clulas
hematopoyticas, clulas madre, lneas celulares transformadas y clulas tumorales. Alcanzan
la confluencia cuando el nmero de clulas es grande y los nutrientes son insuficientes.
Clulas dependientes de anclaje: son clulas que requieren una superficie para su fijacin y
crecimiento. Estas clulas se encuentran interaccionando con clulas vecinas, una membrana
basal o una matriz extracelular.
Las superficies de adhesin que comnmente se utilizan son de vidrio o plstico. Placas de
Petri y el rodillo botellas son los dispositivos ms utilizados.

Los tipos de clulas dependientes de anclaje ms utilizados son las clulas epiteliales (fig. a) o
de fibroblastos (fig. b) (en sentido amplio clasificados como conectivo).

3.2. Crecimiento de Medios

En el cultivo de clulas animales (mamferos) los requerimientos nutricionales son ms estrictas

que las de los microorganismos, ya que, a diferencia de los microorganismos, los animales no
metabolizan el nitrgeno inorgnico. Por lo tanto, muchos aminocidos y vitaminas deben ser
proporcionados. El Medio tpico contiene aminocidos, vitaminas, hormonas, factores de
crecimiento, mineral sales, y glucosa. Adems, el medio debe ser complementado con dos a
veinte por ciento (en volumen) de suero de la sangre de los mamferos.

Los medios de cultivo son generalmente tamponados para mantener un pH alrededor de 7,4 y
tienen, adems, indicadores de pH, como el rojo fenol, que cambian de color a medida que
aparecen catabolitos cidos como resultado del metabolismo celular. Suelen agregarse tambin
antibiticos y antimicticos para impedir la contaminacin con microorganismos.
 El suero en el medio no slo es caro, sino que tambin puede ser la fuente de contaminacin
por virus o micoplasma. Dado que la naturaleza del producto qumico del suero no est bien
definido, su contenido puede variar de un lote a otro, lo que puede afectar el resultado de la
cultura. La presencia de muchas diferentes protenas en el suero tambin puede complicar el de
aguas abajo procesos de separacin. Por estas razones, muchos intentos han sido hechos para
formular medios libres de suero. Estas formulaciones contienen hormonas y factores de
crecimiento purificados que puedan sustituir a los suplementos de suero.

Composicin del medio esencial mnimo de Eagle

mg/L mg/L
L -Aminocidos Vitaminas
Arginina 105 Colina 1
Cistina 24 cido flico 1
Glutamina 292 Inositol 2
Histidina 31 Nicotinamida 1
Isoleucina 52 Pantotenato 1
Leucina 52 Piridoxal 1
Lisina 58 Riboflavina 0,1
Metionina 15 Tiamina 1
Fenilalanina 32
Treonina 48 Sales
Triptfano 10 NaCl 6800
Tirosina 36 KC1 400
Valina 46 CaC12 200
Carbohidrato MgCl2 6H2O 200
Glucosa 1000 NaH2PO4 2H2O 150
Suero 5-10% NaHO3 2000

3.3. Anticuerpos Monoclonales

Los anticuerpos son molculas proteicas compuestas de cuatro cadenas, dos ligeras y dos
pesadas unidas por puentes disulfuro, los cuales tienen diversas funciones tales como
reconocimiento y neutralizacin de antgenos, opsonizacin, presentacin de antgenos a
clulas efectoras y activacin del sistema de complemento.
Desde el punto de vista funcional, los anticuerpos presentan una fraccin que reconoce al
antgeno y otra fraccin cristalizable que meda funciones efectoras como la respuesta T
citotxica dependiente del anticuerpo y aquella que depende del complemento. La fraccin que
reconoce al antgeno tiene una regin variable y una regin constante
Las regiones variables es muy diversa en virtud de la variedad de antgenos
La regin constante permite la estabilizacin de la fraccin variable.

Los anticuerpos son producidos por clulas B del sistema inmune y responden a un solo
determinante antignico.
El B-linfocito son glbulos blancos especializados, productores de anticuerpos que participan en
la respuesta inmune; est presente en el bazo, los ganglios linfticos y sangre.

Los anticuerpos pueden unirse a los antgenos, neutralizar y eliminar las sustancias extraas
que entran en el cuerpo de los animales vertebrados.

Debido a su especificidad para identificar molculas o clulas particulares, los anticuerpos han
sido herramientas importantes para los investigadores y clnicos en detectar la presencia y el
nivel de drogas, productos bacterianos y virales, hormonas, y otros anticuerpos en muestras de
sangre.

Existen cinco clases principales de anticuerpos, llamados isotipos. El isotipo de un anticuerpo

es determinado por su regin constante. Las cinco clases de anticuerpo son IgG, IgD, IgA, IgE,
y IgM; cada isotipo est asociado con una especfica reaccin del sistema imunolgico. Por
ejemplo, anticuerpos del isotipo IgG a menudo reclutan clulas T citotxicas que destruyen a las
clulas blanco.

La figura ilustra la estructura del anticuerpo, inmunoglobulina G (IgG), que tiene una estructura
de la protena en forma de Y compuesto por un par de cadena pesada y polipptidos de cadena
ligera, unidos por enlaces disulfuro.
Cuando un animal se inyecta con un agente inmunizante, se responde al hacer diversas
mezclas de anticuerpos, que son prcticamente imposible de separar. Para producir grandes
cantidades de anticuerpo idntico (anticuerpo monoclonal) que reconocen solamente una
estructura qumica, que debe ser capaz de hacer crecer una lnea celular especfica de B-
Linfocitos. Sin embargo, se encontr que las clulas secretoras de anticuerpos no se pueden
mantener en un medio de cultivo.

Fusin celular: La produccin de anticuerpos monoclonales (provenientes de una sola clona

de linfocitos B) surgi con la tecnologa creada por Milstein y Khler en 1975 que permiti la
fusin de linfocitos B, productores de inmunoglobulinas especficas, con clulas de mieloma
tumoral que se encuentran permanentemente en crecimiento.

Con esta fusin se obtienen los hibridomas que crecen de manera casi ilimitada produciendo
anticuerpos especficos contra un antgeno particular. Con el advenimiento de las tcnicas de
biologa molecular la produccin de hibridomas ha llegado ms lejos y se han logrado reducir
las respuestas de rechazo que se producen cuando los anticuerpos son producidos en ratn.
Con el objeto de reducir el rechazo, se incluyen secuencias humanas en los anticuerpos, en un
proceso que se ha llamado quimerizacin, a pesar del cual el 40% de los anticuerpos
quimricos producen cierto tipo de rechazo.
Un procedimiento tpico para la fusin celular es el siguiente:
 a. Inyectar un antgeno seleccionado en un ratn. El sistema inmune en el ratn responde
por la proliferacin de clulas de linfocitos B que secretan anticuerpos.
b. Retire el bazo del ratn y separada las clulas de B- linfocitos.
c. Cultivar unas adecuadas clulas de mieloma malignos deficientes en HPGRT (guanina
fosforribosil transferasa de hipoxantina), que es un marcador gentico para la seleccin
de las clulas hbridas despus de la fusin.
d. Fusione las clulas de linfocitos B con clulas de mieloma mezclando en un medio que
contiene 40 por ciento a 50 por ciento polietilenglicol (PEG). El medio contendr las
mezclas de los linfocitos B, mielomas, e hbridos de mieloma- las clulas. Los linfocitos
B contienen HPGRT y tambin las clulas de hibridoma hacen. Por lo tanto, la clulas de
mieloma se observan como HPGRT-, mientras que los linfocitos B y hibridoma son como
HPGRT +.
e. Seleccionar HPGRT + clulas por culturmg la mezcla en un medio que contiene HAT
(hipoxantina, aminopterina, y timidina), que es inhibidora del crecimiento a las clulas
HPGRT +. Por lo tanto, la clulas de mieloma morirn en este medio mientras que el
hibridoma clulas proliferan. Los linfocitos no fusionados mueren debido a su vida til
limitada.

4. Cultivos clulas vegetales

El cultivo de tejidos vegetales se define como un conjunto muy heterogneo de tcnicas que
presentan en comn el hecho de que un explanto o sea, una parte separada del vegetal, tales
como protoplastos, clulas, tejidos u rganos se cultiva aspticamente en un medio artificial de
composicin qumica definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Cada
fragmento origina una planta idntica a la que se le tom el fragmento, aunque puede ser
modificada genticamente para tener variedades artificiales.

Estas tcnicas pueden ser utilizadas en vegetales como herramientas para micropropagacin,
propagacin rpida de clones, eliminacin de virus y enfermedades, produccin de haploides,
aislamiento y utilizacin de protoplastos, cultivo de embriones, produccin de fitoqumicos,
ingeniera gentica, mutacin y seleccin celular, produccin de semillas sintticas y estudios
bsicos de anatoma, desarrollo, fisiologa y nutricin vegetal.

El cultivo de clulas vegetales en lugar de toda la planta para la produccin de

metabolitos puede proporcionar varias ventajas:

1. Las clulas vegetales pueden cultivarse donde ms se necesitan, independientemente de

tiempo y las condiciones geogrficas. Como resultado, no hay es tenga que enviar o almacenar
materias primas voluminosas.

2. Los metabolitos primarios se producen en mayores cantidades que los metabolitos

secundarios y tienen funciones metablicas especficas. Metabolitos primarios obtenidos a partir
de plantas superiores se utilizan como alimentos, aditivos alimentarios, y materias primas
industriales, tales como hidratos de carbono, aceites vegetales, protenas, y cidos grasos. Por
lo general son de gran volumen y bajo valor mayor materiales.

3. La totipotencia es la capacidad de generar o regenerar un organismo completo a partir de

una parte.

4. La calidad y rendimientos de producto pueden ser tambin bien controlados con eliminando
los problemas encontrados en el procesamiento de botnicos, tales como la calidad de la
materia prima, la uniformidad dentro y entre lotes, y daos en el transporte y almacenamiento.

5. Algunos productos metablicos pueden producirse a partir de suspensin cultura en

cantidades mayores que la observada en plantas enteras.

Es el desafo de un ingeniero bioqumico para poder cultivar la planta clulas a gran escala y
para maximizar la produccin y acumulacin de metabolitos secundarios. Esto se puede lograr
por la seleccin de los genotipos adecuados y clones de clulas que producen altos la
formulacin de medios adecuados para cultivar las clulas, y el diseo y la operacin de
sistemas de cultivo de clulas eficaces. Podemos utilizar nuestra experiencia y el conocimiento
que hemos obtenido del cultivo microbiano.

Diferencias entre las clulas microbianas y clulas vegetales para modificar las
condiciones de cultivo

1. Las clulas vegetales son de 10 a 100 veces ms grande que bacterias y hongos las clulas.

2. El metabolismo de las clulas vegetales es ms lento que las clulas microbianas en el un

orden de magnitud, lo que requiere el mantenimiento de esterilidad durante un perodo de
tiempo ms largo.

3. Las clulas vegetales tienden a crecer en grupos que causan sedimentacin, mala mezcla,
conectar las lneas de entrada y salida, el crecimiento de la pared, etctera.

4. Las clulas vegetales son ms sensibles a la cizalla que las clulas microbianas.

5. La produccin metablica en las clulas vegetales est sujeta a ms complejo mecanismos

de regulacin que la produccin metablica en microbiana las clulas.

6. Las clulas vegetales son ms genticamente inestables que las clulas microbianas.

Tipos de Planta de cultivo de tejidos

Aunque cultivo de tejidos vegetales debera referirse slo a las de agregados no organizados de
clulas, que se usa comnmente como un colectivo trmino para describir todos los tipos de
cultivos in vitro de plantas en (George y Sherrington, 1984).

El crecimiento desorganizado se produce con frecuencia cuando trozos de plantas enteras se

cultivan in vitro. El tejido carece de cualquier estructura reconocible de la planta original intacto.
 Cultivo de tejidos in vitro de plantas de patata

1. Los cultivos de callos son agregados de clulas amorfas derivados del crecimiento
desorganizado de los explantes en nutrientes slidos aspticos medios. Los explantes son
los pequeos rganos o secciones de tejido.

Los agregados de clulas no se corresponden con cualquier particular, el tejido de la planta

entera. Se eligi el cultivo de callos plazo porque la proliferacin celular se cree que est
inducida por una lesin del explante durante la escisin. Sin embargo, se ha encontrado que es
inducida por los reguladores del crecimiento de plantas en el nutriente slido medio. (O
celulares) culturas

2. Suspensin consisten en clulas y agregados de clulas, creciendo dispersado en un medio

lquido. Por lo general, se inician mediante la colocacin de las piezas de un cultivo de callo
friable en lquido en movimiento medio. Los cultivos en suspensin son por lo tanto el resultado
de la la progresin de la planta con la explantacin, a callo, y finalmente a suspensin. Cultivo
en suspensin es ms adecuado para la masa la propagacin de clulas de plantas de cultivo
de callo porque se puede mantener y manipular similar a fermentaciones microbianas
sumergido.

3. Cultivos de protoplastos Implican el crecimiento de protoplastos en slido o medio lquido.

Los protoplastos se pueden preparar mediante o mecnicamente la eliminacin de
enzimticamente la pared celular. Los protoplastos aislados se pueden utilizar:

(1) para modificar la informacin gentica de clulas vegetales,

(2) para crear hbridos de planta a travs de la fusin de protoplastos,

(3) a estudio planta de infecciones virales, y as sucesivamente.

Otra prometedora aplicacin de cultivos de protoplastos es la micropropagacin de plantas.

Despus de las divisiones de protoplastos, las paredes celulares pueden ser regeneradas para
dar lugar a callo y posteriormente a todas plantas, lo que proporciona una ruta mediante el cual
las plantas pueden ser multiplicadas.

Crecimiento organizado: Se produce cuando partes de las plantas se transfieren

organizadamente en un medio de cultivo donde pueden continuar creciendo con; su estructura
preservada.
1. Los Cultivos de raz se pueden establecer de puntas de races tomadas de muchas plantas.
Cultivos de races en crecimiento rpido puede ser obtenido a partir de especies de plantas
dicotiledneas por la infeccin con el microorganismo Agrobacterium rhizogens.

2. Los cultivos de embriones pueden establecerse a partir de embriones retirados a partir de

semillas esterilizadas, vulos, o frutas. Los embriones producidos de la tcnica de cultivo de
clulas, conocida como embriones somticos, puede ser aislados y germinados de proporcionar
una planta por explante.

Medios de Cultivo

Para el cultivo de suspensiones celulares de una gran variedad de plantas se ha utilizado el

medio MS desarrollado por Murashige y Skoog (1962) para el cultivo de tejidos de tabaco,
como tambin el medio B-5 de Gamborg et al. (1968). Tambin se han utilizado otros medios,
pero su composicin no difiere mucho de los citados.

A menudo, los medios ptimos para la induccin y crecimiento de callos a partir de explantes
primarios no son los mismos que para el establecimiento de suspensiones celulares; el nivel
ptimo de auxinas y citocininas, p.ej. puede ser diferente.

En ocasiones las clulas en suspensin necesitan de suplementos orgnicos, aminocidos, CH,

extracto de levadura, y AC; la auxina ms utilizada es 2,4-D.

Iniciacin de las suspensiones

Las suspensiones celulares se inician generalmente mediante la incubacin de trozos de callos

friables en medios lquidos que, estn en movimiento continuo.

Comnmente se emplean matraces Erlenmeyer, en los cuales se deposita el medio lquido con
los trozos de callo dispersos en el, hasta llenar aproximadamente 1/5 de la capacidad de tos
frascos; estos se ponen luego a incubar en un agitador giratorio a 80-150 rpm, bajo luz continua
y a 25 C de temperatura. Mediante subcultivos semanales, las suspensiones celulares quedan
establecidas despus de varios das.

Durante los primeros subcultivos es recomendable usar una tasa de dilucin baja (por ej. 1:1 a
1:4) utilizando cuatro partes de medio fresco por cada parte de suspensin celular.
Posteriormente se puede utilizar una tasa de dilucin ms alta, segn el objetivo para el cual se
haya establecido la suspensin.

Base biolgica

La reproduccin asexual de plantas por cultivo de tejidos es posible gracias a que, en general,
las clulas de una planta poseen la capacidad necesaria para permitir el crecimiento y el
desarrollo de un nuevo individuo, sin que medie ningn tipo de fusin de clulas sexuales o
gametos. Esta capacidad se denomina totipotencialidad celular y es caracterstica de un grupo
de clulas vegetales conocidas como clulas meristemticas, presentes en distintos rganos de
la planta. La potencialidad de una clula diferenciada (una clula de conduccin, epidrmica)
para generar tejidos nuevos y eventualmente un organismo completo, disminuye con el grado
de diferenciacin alcanzado por esa clula, pero puede revertirse parcial o completamente
segn las condiciones de cultivo a las que se la someta. 5

El xito en la propagacin de una planta depende de que se logre la expresin de la

potencialidad celular, es decir, de que algunas clulas recuperen su condicin meristemtica.
Para ello debe inducirse primero la desdiferenciacin y luego la rediferenciacin celular.

En condiciones naturales, un proceso de este carcter sucede durante la formacin de las

races adventicias en el enraizamiento de estacas, la formacin de yemas adventicias o cuando
se busca la propagacin de cualquier planta.

Entre los factores ms importantes para lograr la respuesta morfogentica deseada se

encuentra la composicin del medio de cultivo. En todo intento de propagacin vegetal, ya sea
in vitro o in vivo, el carcter del proceso de diferenciacin est regulado por el balance
hormonal propio y por el estado fisiolgico del rgano, tejido o clula puesta en cultivo. Sin
embargo, ese balance puede ser modificado por el agregado de compuestos que imiten la
accin de las hormonas vegetales. Esos compuestos, denominados reguladores del
crecimiento, son los que se emplean en los medios de cultivo para conseguir la
micropropagacin de una planta

Etapas del proceso

El cultivo de tejidos vegetales es el proceso que se inicia con un explanto y termina con la
obtencin de plantas completas, lo que involucra una serie de etapas, las cuales se enumeran a
continuacin:

Eleccin de la planta y/o tejido donante de explantos. En esta fase se incluyen los
tratamientos, preparacin y seleccin de las plantas madre a partir de las cuales se
inicia el cultivo, siendo imprescindible comprobar la identidad (especie, variedad o
cultivar) y su estado de salubridad (libre de patgenos, deficiencias o estrs).

Establecimiento: consiste en la desinfeccin de los explantos (generalmente con

hipoclorito de sodio) y su posterior adaptacin al medio artificial para inducir: callo, brote,
raz o embrin somtico, segn se desee. Se requiere desinfectar superficialmente el
material escogido para evitar que en el medio de cultivo crezcan microorganismos,
principalmente bacterias y hongos, que competirn ventajosamente con el explanto

Multiplicacin: consiste en generar una cantidad de masa vegetal suficiente para la

regeneracin del nmero de plantas necesarias.

Enraizamiento: es el proceso de induccin de la formacin de races con el fin de

convertir a los brotes o embriones somticos en plntulas completas. El enraizamiento
puede realizarse tanto en condiciones in vitro como ex vitro. En el primer caso se
transfieren los brotes obtenidos en la etapa anterior a un medio libre de reguladores de
crecimiento o que slo contenga auxinas. Esta operacin se realiza en condiciones de
esterilidad (en cabina de flujo). En el segundo caso los brotes se sumergen en una
solucin concentrada de auxinas y se transfieren a un sustrato limpio, no
necesariamente estril, que puede ser una mezcla de turba con perlita o vermiculita. Los
brotes que se utilicen en el enraizamiento ex vitro deben ser vigorosos y poseer hojas
bien desarrolladas, ya que las plantas deben realizar la fotosntesis para obtener la
energa necesaria para desarrollarse y formar las races.

Rusticacin: es el paso de aclimatacin de las plntulas obtenidas in vitro a las

condiciones del ambiente usuales fuera del tubo o frasco, es decir al suelo o algn
sustrato inerte
5. Medicin del crecimiento celular

En cualquier sistema biolgico, el crecimiento se puede definir

Como el aumento ordenado de todos los componentes qumicos.

Crecimiento equilibrado crecimiento en el que todos los constituyentes celulares

(protenas, ADN, ARN, H2O intracelular) se duplican en un mismo tiempo.

Los cultivos sometidos a crecimiento equilibrado mantienen una composicin qumica

constante.

El crecimiento celular se puede determinar por:

1.-el nmero de clulas

2.-la masa celular

3.-la actividad celular

1.- medicin del nmero de clulas.

recuentos microscpicos.- tcnica comn, rpida y barata; para estos recuentos se

utilizan cmaras para contar el nmeros de clulas en muestras liquidas, existen 2 tipos
de cmaras:
o Hemocitometro: cmara plana de vidrio reticulada a 0.1 mm. para el uso con los
organismos de 3 um de dimetro o ms grandes.
Cmara cuenta glbulos.
 o Petroff- Hausser.- cmara de recuento, para uso principalmente con bacterias.

Las caractersticas de los mtodos de recuento microscpico directo son:

Recuento de placa Viable:

Una clula viable es aquella capaz de dividirse y formar una colonia en el medio de
cultivo.
Ventajas desventaja
Se requiere equipo mnimo. Las clulas muertas no pueden por lo
Los resultados se obtienen general se distinguen de las clulas
rpidamente. vivas.
Las caractersticas El mtodo no es adecuado para
morfolgicas de los suspensiones de clulas de baja
organismos pueden ser densidad.
observados. Las clulas pequeas son difciles de
ver bajo el microscopio y se puede
perder cuando se cuentan.
El procedimiento de recuento real es
tedioso y puede causar fatiga visual
considerable.
No es adecuado para las clulas
altamente floculantes tales como
micelio.
 Se basa en que cada colonia surge de una sola celula.
Cada colonia contiene una sola especie bacteriana
El nmero de bacterias viables por muestra se expresa en :
UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (UFC)
Hay dos formas de realizar un recuento:
- mtodo de extensin en placa plato
- mtodo de verter la placa.

1.- mtodo de extensin en placa plato

Este mtodo consiste en que un volumen de no ms de 0,1 ml se extienda sobre la
superficie del agar.
Es el mtodo de eleccin para anaerobios facultativos y cultivo de micro aerofilos.

2.- - mtodo de verter la placa.

Este mtodo consiste en que la muestra se mezcla con agar fundido y se vierte en una placa
estril. La placa se incuba a continuacin, hasta que aparecen las colonias, y se empieza el
conteo del nmero de colonias.
Esta tcnica se usa generalmente para bacterias aerobias obligatorias.

Conteo de clulas viables

Es importante que el nmero de colonias en desarrollo en las placas debe ser ni demasiado
grande ni demasiado pequea.

Se toman en cuenta nicamente aquellas cajas Petri que tengan entre 30-300colonias.

Aquellas placas que tengan ms de 300 colonias se reportan como incontables

Para obtener el nmero apropiado de clulas por unidad de volumen, la muestra tiene que ser
diluida. Para la dilucin ms grande, es comn el uso de la tcnica de dilucin en serie.

Contador Coulter: es un aparato utilizado para contar y medir el tamao de partculas en

solucin. Se utiliza principalmente para contar clulas sanguneas en su aplicacin como
contador hematolgico, pero tambin se puede utilizar para bacterias, clulas y partculas
virales. .
La desventaja de esta es que no puede distinguir entre las clulas y las partculas impuras.
Tambin es difcil de usar un poco con organismos en cadenas y es intil con los organismos de
micelio.
2.- Medicin de la masa celular
Peso seco de la clula: se puede medir directamente mediante la adopcin de una
alcuota de la suspensin celular y centrifugando la misma.Despus se desecha el
sobrenadante, las clulas se lavan a fondo con agua destilada para eliminar toda la
materia soluble. La suspensin se vuelve a centrifugar y las clulas sedimentadas se
secan en un horno y se pesa.
Consiste en dejar secar volmenes conocidos de cultivo celular lentamente hasta que
alcanzen un volumen constante.
Esta tcnica slo se puede utilizar con suspensiones de clulas densas, y las clulas se
deben lavarse completamente libre de toda materia extraa.

Turbidez: La masa celular se puede medir pticamente mediante la determinacin de la

cantidad de luz dispersada por una suspensin de clulas. La tcnica se basa en el hecho de
que pequeas partculas dispersan la luz de forma proporcional, dentro de ciertos lmites, a su
concentracin. Cuando un haz de luz pasa a travs de una suspensin de organismos, la
reduccin en la cantidad de luz transmitida como consecuencia de la dispersin es por lo tanto
una medida de la densidad celular Tales mediciones se hacen generalmente en un
espectrofotmetro, que lee en unidades de absorbencia (A). La absorbencia se define como el
logaritmo de la relacin de la intensidad de la luz que incide sobre la suspensin (Io) a la
transmitida por la suspensin (I):

Una curva de calibracin se puede obtener mediante la medicin de la absorbancia de las

muestras con concentracin de clulas conocida. Las mediciones se hacen generalmente a una
longitud de onda de 600, - 700 nm.

6. Inmovilizacin Celular

Como en el caso de las enzimas, las clulas enteras se pueden inmovilizar para varias ventajas
sobre las tcnicas de cultivo tradicionales. Por inmovilizar las clulas, diseo de procesos
pueden simplificarse ya que las clulas asociadas a grandes
partculas o en superficies estn separadas fcilmente de corriente de producto.
Este asegura operacin fermentador continuo sin el peligro de celda lavado. La inmovilizacin
tambin puede proporcionar condiciones favorables a la diferenciacin celular y la
comunicacin de clula a clula, con lo produccin alentador de altos rendimientos de
metabolitos secundarios. La inmovilizacin puede proteger a las clulas y de ese modo
disminuir los problemas relacionada con las fuerzas de cizallamiento.

Mtodos de inmovilizacin celular

 Mtodos Materiales
El apego a una superficie virutas de madera, colgeno, micro portadores, resinas
de intercambio inico, xidos metlicos
Atrapamiento dentro porosos La cordierita, vidrio de poro, acrilamida, alginato,
Matrices colgeno, K-carragenina
Contencin detrs de una polilisina, etilcelulosa, emulsin, membrana sinttica
Barrera
Auto agregacin sedimentos miceliales, tmpanos microbianos,
polielectrolitos, agentes de reticulacin

Mtodos de inmovilizacin celular se pueden dividir en cuatro grandes categoras: fijacin a una
superficie, atrapamiento dentro de un porosa matriz, contencin detrs de una barrera, y la
auto-agregacin como resumen en la Tabla 5.8 (Karel et al., 1985).

El apego a una superficie: Las clulas se pueden fijar en la superficie de virutas de madera,
colgeno, microportadores, o resina de intercambio inico. Uno ejemplo de este tipo de
inmovilizacin es el uso de micro portadores para las clulas animales dependientes de anclaje.
La principal ventaja de micro portadores es que proporcionan una gran rea superficial para la
clula. Los materiales para los micro portadores incluyen de intercambio inico, resinas, perlas
basadas en dextrano recubiertos con gelatina, poliacrilamida perlas, perlas de poliestireno,
perlas de vidrio huecas, celulosa cilndrica perlas, y las gotitas de fluorocarbono estabilizadas
con polilisina. A presentes, microvehculos basados en dextrano son los ms utilizados para la
inmovilizacin de clulas de mamferos (Hu y Dodge, 1985).

Atrapamiento dentro de una matriz porosa: A lasas clulas se les permite difundir en
matrices porosas preformadas como ladrillos, cordierita y vidrio de poro, en la que van a crecer
y ser atrapados. Las principales ventajas de este mtodo son que los materiales de soporte
preformados son ms resistentes a la desintegracin en lechos de relleno o calderas de
agitacin que otros materiales de soporte, y el atrapamiento no es por lo general perjudicial
para las clulas. Sin embargo, es difcil alcanzar una concentracin celular alta debido al
limitado volumen de poros por lo general disponible para atrapamiento dentro de los materiales
de soporte tpicos.
Otra forma es atrapar las clulas dentro de matrices porosas formadas in situ. Diversos
materiales gelatinosos tales como acrilamida, alginato, colgeno y K-carragenina, se pueden
mezclar con las suspensiones de clulas y se gelifican en diferentes formas y tamaos.
Un procedimiento simple para hacer esfera de gel de alginato de calcio es tan de la siguiente
manera:
Clulas en suspensin concentrados se mezclan con alginato para dar un alginato de
concentracin definida entre 1 por ciento a 3 por ciento y la mezcla de clulas de alginato se
bombea a travs de una aguja hipodrmica gota a gota en una solucin de cloruro de calcio.
Las perlas se forman instantneamente con dimetros entre 1 mm a 5 mm, dependiendo del
alginato
y contenido de la celda del lquido y el tamao de la aguja. Extrema precaucin debe tomarse
para mantener la esterilidad durante este proceso de inmovilizacin.

La principal desventaja del uso de la inmovilizacin de alginato es la prdida de las clulas de la

divisin celular que ocurren dentro de los granos individuales. Las fugas pueden ser
minimizadas ya sea aumentando las concentraciones de alginato o cloruro de calcio en perlas o
haciendo perlas mas pequeas. Sin embargo, el aumento de la concentracin de cloruro de
calcio en alginato y las perlas puede disminuir la velocidad de difusin del sustrato a travs del
gel y puede afectar a la viabilidad de las clulas atrapadas (Cheetham et al., 1979).

Contencin detrs de una barrera: Las clulas pueden ser inmovilizados en microcpsulas
que tienen una membrana permanente o no permanente semipermeable. La ventaja de las
tcnicas de encapsulacin es la gran rea superficial para el contacto de sustrato y clulas.
La membrana semipermeable tambin pasa selectivamente los componentes slo bajo peso
molecular.
Las clulas pueden ser atrapadas por la inclusin dentro de filtro de membrana dispositivos,
como de fibra hueca, placa plana, y las unidades de la herida en espiral.

Membranas de fibra hueca forman una estructura tubular que normalmente se visti como un
haz de fibras en paralelo dentro de un contenedor cilndrico. Las clulas se encuentran
atrapados en el lado de la carcasa de las fibras huecas mientras medio nutriente aireada se
recircula rpidamente a travs de las fibras. Este tipo de soporte de membrana puede
proporcionar proteccin adicional contra la contaminacin. Sin embargo, las principales
desventajas de los sistemas de membrana son de alto costo, ensuciamiento de la membrana
resultante en la resistencia de transferencia de masa aadido, y las dificultades de aireacin.

Auto-agregacin: clulas auto-agregado o floculada tambin puede ser considerado como

clulas inmovilizadas debido a su gran tamao ofrece ventajas similares a los de inmovilizacin
por otros mtodos. Mientras moldes formarn grnulos, naturalmente, algunas bacterias o
 clulas de levadura requieren floculacin. Artificial agentes o reticulantes floculacin puede ser
aadido para mejorar el proceso.

PROBLEMAS CON LA INMOVILIZACIN DE CLULAS.

Si bien, el uso de clulas inmovilizadas en matrices slidas ha permitido la implementacin de
procesos de fermentacin en sistemas de flujo contino. Existen numerosos problemas que se
presentan a nivel industrial, los cuales se describen a continuacin.
Los sistemas floculados presentan un difcil manejo debido a que la floculacin depende de
factores como el pH, la concentracin de Ca2+, temperatura y la agitacin (Verstrepen et al.,
2003; Sampermans et al., 2005). Adems, cada cepa de levadura presenta un comportamiento
diferente (Jin y Speers, 1999).

Otro caso, es el uso de membranas microporosas como filtros para retener las levaduras en el
reactor, lo cual resulta muy costoso cuando se emplean reactores continuos. El mayor problema
que presenta esta tcnica es el bloqueo que eventualmente sufren los poros de la membrana
debido a partculas o a las mismas levaduras (Lebeau et al., 1998). Por otro lado, la
inmovilizacin de clulas por adsorcin sobre la superficie de materiales es fcil de conseguir,
pero al ser la adsorcin un fenmeno fundamentalmente electrosttico, durante los procesos en
continuo, especialmente por efecto de la agitacin, las clulas se liberan del soporte. Adems,
por este mtodo es difcil inmovilizar grandes cantidades de biomasa (Verbelen et al., 2006).

7. Experimentos
7.1. Curva de crecimiento de la levadura

En este experimento, una cepa de levadura se cultiva en una Matraz Erlenmeyer, y el cambio
de la concentracin de clulas sern monitoreado mediante el uso de tres tcnicas diferentes:
recuento microscpico, medicin de peso seco, y la medicin de turbidez.

Materiales:

1. Cualquier cepa de levadura cultivada como un cultivo en suspensin. Puedes obtener una
cepa de la levadura a partir de un laboratorio de microbiologa. Puedes comprar un straitl
especfica de American Type Culture Collection
(ATCC), Rockville, MD.
Cepa recomendada es Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126.
2. glucosa, extracto de levadura, NH4Cl, MgSO4, CaCl2, Y antiespumante para hacer medio
3. Dos matraces de 125 ml Erlenmeyer
4. Pipeta estril
5. Mechero Bunsen
 6. Autoclave
7. Incubadora
8. Hemocitmetro
9. Centrfuga Equilibrio 10. Qumica
10. Espectrofotmetro.

Procedimientos:
1. Prepare los medios de cultivo de acuerdo con 5.4 y verter 50 ml cada una en dos
matraces Erlenmeyer de 125 ml.
2. Enchufe el matraces Erlenmeyer con uno de los siguientes: plstico, aluminio, tapa de
acero inoxidable, o de algodn.
3. Autoclave los matraces de 15 a 18 psi durante 20 minutos.
4. Inocular 1 ml cultivo de levadura en el matraz que contiene el medio esterilizado. Tenga
cuidado de no contaminar la pipeta, enchufe, o el frasco durante la inoculacin. Para
minimizar la posibilidad de contaminacin, la llama el tapn y el cuello del matraz despus
de quitar el tapn de la inoculacin.
5. Colocar los frascos en una incubadora a 37 C.
6. Tomar una muestra de 2 ml a intervalos predeterminados y medida la concentracin de
clulas mediante el empleo de recuento microscpico, seca medicin de peso y medicin
de la turbidez los intervalos de muestreo debe colocarse de manera que tenga una buena
curva de crecimiento que muestra las tres fases de crecimiento puede mostrarse.
Antes del muestreo, mezclar el contenido del matraz agitando.

7.2. Curva de crecimiento de la clula animal.

Materiales:
1. Una lnea celular suspensin planta bien establecida. El seguimiento
procedimientos se basan en el cultivo de clulas de tabaco. Si
se elige otra lnea celular, el medio puede ser modificado.
2. Murashige y Skoog mezcla de sal (Gibco), cido 2,4-diclorofenoxiactico 2,4-D), KH2P04,
inositol, HC1 tiamina, y sacarosa medio para hacer
3. Matraces de dos 125 ml Erlenmeyer
4. Esterilizada de boca ancha pipeta serolgica (10 ml) Agitador
5. Incubadora
6. Equilibrio qumico.
7. Centrfuga
8. Tubo Eppendorf

Procedimientos:

1. Preparar medio Linsmaier y Skoog modificado (Linsmaier y Skoog, 1965), que contiene
4,3 Gil de Murashige y Mezcla de sal Skoog, 0,2 mg / L de 2,4-D, 0,18 Gil KH2P0 inositol,
 1 mglL tiamina HCL, y 30 Gil sacarosa. Ajustar el pH a 5,8. con KOH 1N y dispensar el
medio en dos 125 ml Erlenmeyers as que cada matraz contiene 30ml de cada uno.
2. Conecte los matraces Erlenmeyer y autoclave ellos de 15 a 18 psi durante 20minutos.
3. inocular el matraz que contena 30 ml de medio con 1,5 ml de cultivo en suspensin de
siete das de edad, pomer en un agitador incubadora (150 rpm) a 27 C. Mantenga las
clulas oscuras bloqueando la ventana de cristal de la incubadora.
4. Tomar 1,5 ml de muestra cada da de la cultura bien mezclada y colocarlo en un tubo
Eppendorf asfaltada que sopesar. Centrifugar el tubo a 9.000 rpm durante 5 minutos a 4 y
eliminar el sobrenadante. Pesar de nuevo el tubo y calcular el peso celular hmedo
porcentaje. Poner el tubo en un horno (70 C) durante dos das y se vuelve a pesar para
calcular el porcentaje de peso seco.
5. Trazar el cambio de las concentraciones de clulas hmedas y secas con respecto
en cuando.
7.3. Planta de inmovilizacin celular
Materiales:
1. 30 ml de clulas en suspensin de tabaco cultivadas por el mtodo
descrito en el experimento anterior
2. Alginato
3. Cloruro de calcio
4. bomba peristltica
5. Autoclave
6. Equilibrio qumico

Procedimientos:

1. Mezclar 0,875 g de alginato, S ml de medio de cultivo de plantas, y 25 ml. De agua y

esterilizar.
2. Espere a que los 30 ml de cultivo de plantas de suspensin para resolver y eliminar el
sobrenadante. Normalmente se tarda unos 10 minutos.
3. Agregue la mezcla de alginato y se mezcla con clulas concentradas.
4. Bombear la mezcla de clulas a travs de un alginato de silicona esterilizado tubo (ID 1,6
mm) y alimentacin gota a gota en un matraz que contiene esterilizada 200 ml de 0,12 M
CaCl reaccionar con CaCl22.
Las gotitas instantneamente para formar perlas esfricas (3.75-4.5 mm de dimetro).
5. Mantener las perlas en la solucin durante 1 hora para asegurar que reaccin de
precipitacin alcanza la terminacin.
6. inocular el matraz que contena 30 ml de medio con alrededor de 30 inmovilizado cuentas
de clulas vegetales y la pusieron en una incubadora con agitador (150rpm) a 27 C.
Mantenga las celdas oscuras mediante el bloqueo de la copa ventana de la incubadora.
7. Usted puede medir la concentracin de clulas en hmedo y seco de la libre clulas y
clulas inmovilizadas suspendida durante el lote cultivo de clulas inmovilizadas. Para
determinar la clula concentracin de clulas inmovilizadas, se debe disolver el
perlas en fosfato de potasio 1 M durante 24 horas.

8. Bibliografas
Rajiv Dutta, Fundamentals of Buichemical Engineering: microbial cell cultivations,
animal cell cultivations, plant cell cultivations, cell growth measurement, cell
immobilization, experimentes. Printed Ane Books India, 2008.