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Disciplina QUI034
Engenharia Bioqumica
5. ESTERILIZAO
EQUIPAMENTOS, MEIOS, AR
Francisco Beltro
Abril, 2017
5. ESTERILIZAO
VISO GERAL
SUMRIO
1. Introduo
2. Esterilizao do Equipamento
a) Agentes Fsicos
b) Agentes Qumicos
3. Esterilizao de Meios por Calor mido
a) Tipos de processos em escala industrial
b) Cintica da destruio trmica de microrganismos
c) Destruio de nutrientes
d) Clculo do tempo de esterilizao
4. Esterilizao de Ar
a) Amostradores
b) Mtodos de esterilizao
Leitura Obrigatria
1. INTRODUO
1. INTRODUO
Concepo do Biorreator:
Contato eficiente entre as fases;
Boa transferncia de O2 para a clula;
Boa transferncia de calor do meio 2
para a clula e vice-versa;
Proteger o MO de contaminaes. 1
5
3
Esquema geral de um processo fermentativo.
(SchmidellW. et al., 2001)
1. INTRODUO
O sistema pode ser:
No assptico, no estritamente necessrio se operar com culturas puras.
Assptico, condies de assepsia so pr-requisitos para a formao do produto com
sucesso...
Questes...
Como efetuar a assepsia de grandes
volumes de meios e de ar?
Qual o mtodo usado para eliminar os
MO? Ex. filtrao ou aquecimento...
Se aquecimento (batelada ou
contnuo)... em qual regime de tempo
e temperatura?
Antibiticos
Vacinas
Vitaminas...
DAENQ Engenharia Bioqumica 6
5. ESTERILIZAO
2. ESTERILIZAO DE EQUIPAMENTOS
Significa eliminar todas as formas de vida de seu interior ou superfcie;
A eliminao pode ser parcial ou no... efeito na qualidade do produto, ex.:
Pasteurizao (80oC, laticnios): destroe parte dos MO - assepsia mais rigorosa destruiria
propriedades importantes do alimento e seus subprodutos.
DESINFECO no esteriliza,
ESTERILIZAO mas garante a assepsia adequada.
2. ESTERILIZAO DE EQUIPAMENTOS
Tcnicas de assepsia - aplicao de mtodos fsicos ou qumicos:
Mtodos fsicos: calor seco, calor mido, radiao UV, radiao ionizante e
ultrassom;
Mtodos qumicos: lquidos ou gases que matam ou danificam a capacidade
reprodutiva dos MO (hipoclorito, xido de etileno, O3).
2. ESTERILIZAO DE EQUIPAMENTOS
2. ESTERILIZAO DE EQUIPAMENTOS
2. ESTERILIZAO DE EQUIPAMENTOS
a) Agentes fsicos
CALOR SECO
Destri os MO pela oxidao de seus
constituintes qumicos; Calor seco
Mais lenta e menos eficaz do calor mido;
Vidrarias, metais e slidos resistentes ao calor
TC lenta e nvel de hidratao das clulas
tende a diminuir conferindo certa Fornos ou estufas (t2 h e T>150C)
proteo s protenas.
- transferncia de calor mais lenta
- MO com resistncia inativao
- t de 3 a 4 horas para garantir a eficincia
2. ESTERILIZAO DE EQUIPAMENTOS
a) Agentes fsicos
CALOR MIDO
Vapor dgua saturado;
T elevada + alto grau de umidade: mtodo efetivo para a destruio dos MO!!
Vantagens: facilidade de obteno, manuseio, eficcia e baixo custo...
Na indstria obtido em caldeiras e distribudo em tubulaes de inox isoladas
termicamente;
Aplicaes: reatores (vazios ou carregados) e tubulaes;
Modo de ao: desnaturao irreversvel das protenas... essenciais na sobrevivncia e
multiplicao celular;
A resistncia das protenas ao calor uma funo da hidratao da clula:
Quantidade de gua: facilita entrada nas molculas de protena, promovendo
mudanas irreversveis.
2. ESTERILIZAO DE EQUIPAMENTOS
a) Agentes fsicos
CALOR MIDO
Reatores vazios:
1. Injeo direta no interior e expulso do ar;
2. Fechar reator e pressurizar (1atm e 121oC): novas injees somente para manter P e
T;
3. Injeo de ar esterilizado para resfriamento e estabilizao da P interna.
4. Introduo do meio de cultura esterilizado (externamente);
5. Incio do processo.
2. ESTERILIZAO DE EQUIPAMENTOS
a) Agentes fsicos
CALOR MIDO
Reatores com meio (processo descontnuo):
1. Circular vapor pela serpentina ou camisa at Tmeio > 96-97oC e introduzir vapor no
topo do tanque para expulsar o ar. Vlvulas, filtros e tubulaes tambm so
esterilizados;
2. Injetar vapor no meio at T=100C, fechar o reator, e manter injeo at T e P
adequadas pelo tempo necessrio;
3. Resfriar se necessrio (T constante) e injetar ar esterilizado no tanque para evitar
formao de vcuo devido a condensao do vapor.
Injeo direta de vapor no meio: preparado concentrado, devido sua posterior diluio
pelo condensado aumento de 10-15% do V.
Tempo de esterilizao: 20-40min, 121oC;
Reator multipropsito: limpeza qumica prvia, com esterilizao num t=60min.
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5. ESTERILIZAO
2. ESTERILIZAO DE EQUIPAMENTOS
a) Agentes fsicos
CALOR MIDO
Serpentinas/camisa:
Aquecimento entre Tamb e
T=96-97C etapa crica!
Uma relao adequada
entre a REA da
serpentina/camisa e o
VOLUME de meio
favorece o aquecimento.
2. ESTERILIZAO DE EQUIPAMENTOS
a) Agentes fsicos Operao:
CALOR MIDO 1. Completar o nvel de gua indicado;
Autoclave: 2. Adicionar o material dentro da autoclave e fechar a
porta;
Esterilizao de reatores
3. Aquecer, com vapor gerado ocupando todo o espao
pequenos - at 30 L - e interno, devendo fluir para fora pela vlvula de descarga
vidrarias; (10-20min, expulsando o ar).
dimenses, os verticais 4. Fechar a vlvula de descarga, esperar T e P estabilizarem
apresentam a porta de (1atm e 121oC).
acesso na parte superior;
Aquecimento eltrico, mas
o vapor tambm pode ser
gerado externamente em
uma caldeira e injetado na
autoclave.
2. ESTERILIZAO DE EQUIPAMENTOS
a) Agentes fsicos
CALOR MIDO
Autoclave: Curva de aquecimento:
2. ESTERILIZAO DE EQUIPAMENTOS
a) Agentes fsicos
RADIAO UV
Absorvida por muitas substncias celulares, de modo significativo pelos c. nuclicos,
onde geralmente ocorrem as leses... efeito letal proporcional dose de radiao;
Morte celular depende do tempo de exposio;
Regio do espectro de UV com ao esterilizante 220-300 nm;
Baixa capacidade de penetrao;
Esterilizao de slidos: vidraria, metais, embalagens.
2. ESTERILIZAO DE EQUIPAMENTOS
a) Agentes fsicos
RADIAO IONIZANTE
Radiaes ionizantes eletromagnticas , , , raios-X, etc.;
Causa grande variedade de efeitos fsicos e bioqumicos nos MO;
O principal alvo que leva perda de viabilidade a molcula de DNA;
Esterilizao de slidos: vidraria, metais, embalagens.
2. ESTERILIZAO DE EQUIPAMENTOS
b) Agentes qumicos
GERMICIDAS QUMICOS (Sanitizantes lquidos)
Usados quando os equipamentos no admitem esterilizao por calor mido:
Incompatibilidade trmica: filtros, bombas, centrfugas, secadores, vlvulas, linhas
de fluidos e equipamentos de medio.
Modo de ao:
Em Tamb exigindo tempo de contato.
Eficcia tem relao com:
Propriedades fsicas do material: plstico, metal, liso, rugoso e porosidade;
Caractersticas qumicas do ambiente: pH, presena de matria orgnica
contaminante, depsitos no material e dureza da gua.
2. ESTERILIZAO DE EQUIPAMENTOS
b) Agentes qumicos
GERMICIDAS QUMICOS
(Sanitizantes lquidos)
Tabela 3.2. Ordem decrescente de
resistncia a germicidas qumicos e
nvel de atividade requerido para
esterilizao (Schmidell et al. 2001).
2. ESTERILIZAO DE EQUIPAMENTOS
b) Agentes qumicos
GERMICIDAS QUMICOS
(Sanitizantes lquidos)
Tabela 3.3. Utilizao tpica de
agentes qumicos (Schmidell et al.
2001).
C5H8O2
H2O2
CH2O
2. ESTERILIZAO DE EQUIPAMENTOS
b) Agentes qumicos
GERMICIDAS QUMICOS (Sanitizantes lquidos)
Protocolo para o ciclo de desinfeco/esterilizao qumica de um equipamento:
1. Desmontagem do equipamento;
2. Limpeza com o uso de detergentes;
3. Lavagem com gua de baixa dureza para remover os detergentes;
4. Montagem do equipamento, introduo do germicida, propiciando t necessrio de
exposio;
5. Drenagem da soluo germicida do sistema;
6. Remoo dos resduos de germicida pela circulao de gua.
2. ESTERILIZAO DE EQUIPAMENTOS
b) Agentes qumicos
AGENTES GASOSOS
Salas e laboratrios (vapores de formaldedo).
Agentes mais importantes:
xido de etileno: itens hospitalares e plsticos de laboratrio (cmaras semelhantes
autoclave);
xido de propileno: alimentos;
Vapores de formaldedo: cmaras, salas e ambientes onde assepsia desejvel.
Tempo de esterilizao depende:
Agente e sua concentrao;
Umidade relativa do ambiente;
T do processo.
Contnuo
Processo descontnuo
Vapor direto: esterilizao in situ, meio colocado no fermentador, ocorrendo o
borbulhamento de vapor aquecido (ocorre diluio do meio);
Vapor indireto: vapor passa pela serpentina/camisa.
Agitao mecnica assegurando T homognea;
Ocorre em trs fases:
2. Esterilizao:
1. Aquecimento com vapor 3. Resfriamento
Manuteno da Te
(direto ou indireto): com gua:
por um dado de
T0 at Tel20C At T de fermentao
tempo
T de fermentao
Variao de T durante
a esterilizao
contnua
N = no de MO vivos
T3>T2>T1 Funo decrescente do t!
t ln(N)
0 N0
... ...
t (min) N ln(N) 12
25 85000 11.4
= 0
10
50 35000 10.5 8
100 6000 8.7
lnN
200 200 5.3 6
250 40 3.7 4
100000 y = -0.0341x + 12.1626
2
R = 0.9998
80000 0
60000 0 100 200 300
t (min)
N
40000
105 = 0.03411 0 = 12.1626
20000
0
Linear
0 100 200 300
t (min)
0 = 191.000
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5. ESTERILIZAO
Importante!!
Taxa de decrscimo da populao
inicialmente baixa e depois
aumenta.
105 = 0.03411
120 = 3.01
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5. ESTERILIZAO
= 0
ln(0,1 0 ) = 0
2,303
D=
Conhecendo os valores de k
para T encontramos:
A, A, e
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5. ESTERILIZAO
B. stearothermophilus
E. coli
Efeito da T no
valor de k T (K) 105/T (K-1) k (min-1)
373 ... ...
... ... ...
393 255 3
= 68,7 kcal/mol
E (kcal/gmol)
cido flico 16,8
1
Vitamina B1 22,0 =
Vitamina C e B12 23,1
Vitamina A 14,6
B. stearotermophilus 67,7 MO 65<<85kcal/mol
B. subtilis 76,0
Clostridium botulinum 82,0
c) Destruio de nutrientes
Alteraes na composio pela longa exposio Te:
Velocidades das reaes indesejveis com T (ex. decomposio de vitaminas);
Prejudicam a atividade dos MO;
rendimento ou produtividade.
0
= = 0 =
1 0 1 1000 1 0
t= = =
3 0,03
1 0
t =
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5. ESTERILIZAO
1 0 1 2,51010
t = t= =7,7min
3,41 0,1
1 2,51010
t= =8,4min
3,41 0,01
1 2,51010
t
t= =9,1min P
3,41 0,001
N2
N3
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5. ESTERILIZAO
Aquecimento Resfriamento
t (min) T' (oC) k (min-1) t (min) T' (oC) k (min-1)
24 80 0.0002 0 120 1.5999
30 87 0.0022 2 114 0.4819
40 97 0.0161 4 109 0.1773
50 105 0.0797 6 105 0.0797
60 112 0.3230 8 101 0.0358
70 116 0.7189 10 97 0.0161
80 120 1.5999 15 88 0.0027
20 80 0.0005
Variao de T durante a
esterilizao contnua
Exerccio 6.
2 4
F= == 2 =
4
4 1
=
= =
L=
Dados:
V = 100 m3 = 1,0.108 cm3
te = 4 h = 1,44.104 s
= l,06 g/cm3 F = = 6,94 103 3 /
= 0,55 cp = 5,5.10-3 p
= 3,5 min = 2,1.102 s
4. ESTERILIZAO DE AR
4. ESTERILIZAO DE AR
4. ESTERILIZAO DE AR
a) Amostradores
Determinao da concentrao de MO suspensos no ar;
Verificao da esterilizao do ar destinado ao processo;
Forma de operao: i. Reteno dos MO em um dadoVar
ii. Condies para a proliferao das clulas
iii. Quantificao dos contaminantes no Var
Limitaes:
Reteno pode no ser total eficincias de coleta para amostradores;
Clulas aderidas as partculas de poeira;
MO se desenvolvem em meios.
Soluo? Uso de marcadores! MOs modelo, mais resistentes termicamente.
4. ESTERILIZAO DE AR
a) Amostradores
Impinger
Lquido coletor: 10 mL de gua Entrada
destilada; Sada de ar
de ar
Liga-se a sada de ar a uma bomba
de vcuo, o ar entrar borbulhando
no lquido;
MO ficaro retidos no lquido!
Medidas de vazo e tempo: Var;
Problema: reteno de MO no tubo
de entrada de ar e Morte de clulas.
4. ESTERILIZAO DE AR
a) Amostradores
Filtrao
Suporte de ao inoxidvel com
membranas de poros de 0,22 m;
Ar passa atravs do papel-filtro;
Vantagem: Incubao direta da
membrana em placa de Petri e
contagem.
4. ESTERILIZAO DE AR
b) Mtodos de esterilizao
Aquecimento
Calor seco pouco eficaz;
Dificuldade em aquecer grandes Var pequenas instalaes (escala piloto);
Mtodo pouco utilizado.
4. ESTERILIZAO DE AR
b) Mtodos de esterilizao
Filtrao
Mais adequado, presente em quase todas as
instalaes industriais!
Filtros:
At 1970 carvo, algodo, papel.
Aps 1970 l de vidro, materiais sinterizados
(metais, vidros, cermicas), membranas polimricas
(nylon, teflon).
Filtros de membranas: reteno por tamanho
(absolutos), polmeros hidrofbicos com vida til
de 1-3 anos.
4. ESTERILIZAO DE AR
b) Mtodos de esterilizao
Filtrao
Filtros de membranas:
Leitura Obrigatria!
Obrigada!