UNIVERSIDAD NACIONAL SAN ANTONIO ABAD DEL

CUSCO
FACULTAD DE INGENIERIA DE PROCESOS

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

TEMA: PREPARACION DE MEDIOS, FORMACION DEL

PICO DE FLAUTA Y SIEMBRA DE MICROORGANISMOS

POR PUNTURAS Y ESTRIADO

o CURSO : MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

o DOCENTE : Bgo. WILBERT QUISPE ZUNIGA

o ALUMNO :

JUNIOR GALVEZ VENEGAS

LA
CONVENCION
CUSCO - PER
PRESENTACION
Un cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones
fsicas, qumicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de
forma controlada. En general, podemos distinguir cultivos lquidos y slidos en
funcin de las caractersticas del medio y cultivos discontinuos y continuos en
funcin de la disponibilidad de nutrientes en el medio.

1. OBJETIVOS

o Preparar los medios : agar citrato de Simmons; agar triple azcar de

hierro; agar tripticasa de soya
o Formar el pico de flauta en los tubos de ensayo
 o Sembrar microorganismos por puntura y estriado

2. FUNDAMENTO

I. AGAR CITRATO DE SIMONS

Medio utilizado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la
capacidad de usar citrato como nica fuente de carbono y energa.

FUNDAMENTO
En el medio de cultivo, el fosfato mono amnico es la nica fuente de nitrgeno
y el citrato de sodio es la nica fuente de carbono. Ambos componentes son
necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un
sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimtico. El cloruro de sodio
mantiene el balance osmtico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH,
que vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en
base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como nica fuente
de carbono, usan sales de amonio como nica fuente de nitrgeno, con la
consiguiente produccin de alcalinidad.

El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de

citrato permeasa, a travs del ciclo del cido tricarboxlico. El desdoblamiento
del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este ltimo, en
presencia de un medio alcalino, da origen a cidos orgnicos que, al ser
utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos
alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la produccin
de citrato permeasa.

Siembra

A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar en superficie un inculo

ligero, usando un asa sin arrastrar el agar.

Incubacin

A 35-37 C, durante 24-48 horas, en aerobiosis. Algunos microorganismos

pueden requerir hasta 4 das de incubacin.

Interpretacin de resultados:

o Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.

o Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay
desarrollo bacteriano y no hay cambio de color.
Limitaciones

Si se usa un inculo denso para sembrar el medio de cultivo, puede variar el

color del pico del verde al amarillo-amorronado. Esto no afecta el color verde
del resto del medio de cultivo, pero puede afectar la visualizacin azul de un
resultado positivo.
Inculos muy densos, pueden originar resultados falsos positivos.
Cuando se siembra una serie de pruebas bioqumicas a partir del mismo
cultivo, se debe esterilizar la aguja de inoculacin antes de inocular la prueba
del citrato o sino inocularla primero. Cualquier arrastre de materia orgnica
puede originar resultados falsos positivos.

Caractersticas del medio.

Medio preparado: verde

II. Agar TSI

Medio universalmente empleado para la diferenciacin de entero bacterias, en
base a la fermentacin de glucosa, lactosa, sacarosa y a la produccin de
cido sulfhdrico.

Siembra
A partir de un cultivo puro, sembrar en TSI, picando el fondo y extendiendo
sobre la superficie del medio.

Incubacin
A 35-37C durante 24 horas, en aerobiosis
FUNDAMENTO
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los
nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano.

La lactosa, sacarosa y glucosas son los carbohidratos de carbono

fermentables.
El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de cido
sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio ,es la fuente de iones Fe3+, los cuales
se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de color
negro.
El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance
osmtico. Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan
por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio
cido.
El to sulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego
con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro.

COMPOSICION EN 1 g/L

Extracto de carne 3

Extracto de levadura 3

Peptona 14

Cloruro sdico 5

Lactosa 10

Sacarosa 10

Glucosa 1

Citrato frrico 0,3

Ti sulfato sdico 0,3

Rojo fenol 0,024

Agar bacteriolgico 13,5

INTERPRETACION DE RESULTADOS

1-Pico alcalino/fondo cido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo

solamente fermenta la glucosa.
2-Pico cido/fondo cido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo
fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa.
3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es
no fermentador de azcares.
4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el
microorganismo produce gas.
5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce cido
sulfhdrico.

A: cido
K: alcalino

Caractersticas del medio

Medio preparado: rojo

III. AGAR TRIPTICASA DE SOYA

Medio utilizado para propsitos generales,favorece el desarrollo y aislamiento
de una gran variedad de microorganismos aerobios, y anaerobios facultativos y
estrictos.
El agregado de sangre, permite el aislamiento y cultivo de microorganismos
aerobios y anaerobios nutricionalmente exigentes y la observacin de
reacciones de hemlisis.
Tambin, este medio de cultivo, puede utilizarse como medio base para
preparar el medio agar chocolate.

Fundamento
La triptena y la peptona de soya aportan nutrientes ricos en pptidos,
aminocidos libres, bases pricas y pirimdicas, minerales y vitaminas. La
peptona de soya aporta tambin carbohidratos que estimulan el crecimiento de
muchos microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico.
Adicionado con 5-10 % sangre , se logra un medio enriquecido y adecuado
para observar reacciones de hemlisis.
Cuando se prepara como agar chocolate, es til para el cultivo de Neisseria
spp., Haemophilus influenzae y microorganismos exigentes similares. Incubado
en forma anaerobia, permite el crecimiento de Clostridium spp. y anaerobios
NO esporulados. Es un medio adecuado para cultivar y mantener cepas de
Aeromonas, y aumentando el porcentaje de cloruro de sodio, para mantener
cepas de algunos Vibrios (excepto V. cholerae).

Instrucciones
Disolver 40 g de polvo deshidratado por litro de agua destilada. Mezclar y dejar
reposar 5 minutos. Calentar suavemente agitando y hervir durante 1 o 2
minutos hasta su disolucin. Distribuir y esterilizar en autoclave durante 15
minutos a 118-121C.
Preparacin de la placa de Agar Sangre: aadir en forma asptica un 5% de
sangre estril desfibrinada a temperatura ambiente, el agar debe estar a 45C.
Preparacin de Agar Chocolate: despus de aadir la sangre y agitando
frecuentemente se mantiene el medio de cultivo a 80C por 10 minutos hasta
que adquiera un color pardo chocolatado.
Siembra
Por inoculacin directa del material en estudio, sobre la superficie del medio de
cultivo.

Incubacin
Las condiciones de temperatura, tiempo y atmsfera de incubacin, sern
acuerdo al material a estudiar.

Resultados
Caractersticas del medio
Medio preparado: mbar.
Medio preparado con 5% de sangre: rojo cereza.

Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10-35 C.
Medio preparado: a 2-8 C.

INOCULACIN DE MEDIOS SLIDOS (TUBO): PICO DE FLAUTA O

COLA DE PESCADO
a) Por puncin (picadura)
b) Por estra
c) Por puncin y estra
Los picos de flauta (planos inclinados) de agar se inoculan de la siguiente
forma: primero se atraviesa todo el fondo del agar con el asa recta de
inoculacin, esto cuando sea necesario ya que no todos los medios lo
requieren, posteriormente ste se retira con un movimiento en S a travs del
agar que se disemina el inculo. Se utiliza el asa recta.

Procedimiento simplificado para el uso del autoclave

o Comprobar el nivel del agua.
o Colocar en su interior el material a esterilizar.
o Atornillar la tapa, apretar los tornillos por parejas diametralmente
opuestas de forma que la tapa
o encaje perfectamente.
o Abrir la vlvula de vapor y encender la fuente de calor.
o Una vez que salga el vapor por la vlvula, se espera al menos 5 minutos
para expulsar todo el aire y
o cerrar la vlvula.
o Vigilar el manmetro y la vlvula de seguridad. Cuando se alcanza la
presin requerida, disminuir la
o intensidad de calor.
o Dejar que transcurra el tiempo necesario. Apagar la fuente de calor.
o Esperar que el manmetro descienda a cero, abrir la llave de vapor.
o Esperar 5 minutos y abrir la tapa.

3. MATERIALES Y METODOS
3.1 MATERIALES
Equipos
Autoclave
Incubadora
Balanza analtica
Bao mara
Materiales
Pipetas
Tubos de ensayo
Aza
Insumos
agar tsi (triple azcar hierro)
agar tripticasa de soya
agar citrato Simmons
agua destilada

3.2 METODOS
3.2.1 PREPARACION DE MEDIOS

A. Preparacin del Agar citrato de Simmons

Medir 200 ml de agua

Pesar 4.8 gr de agar citrato de Simmons
Poner en la botella de preparacin de medios con agua
Remover la botella (homogenizar)
Pasar por bao mara para que se diluya y homogenice completamente
(tiempo 2 min)
Dejamos enfriar el agar ya preparado
Realizamos el autoclavado de materiales y medio en un tiempo de 15
min a 121c
El viraje del agar preparado tomo un color verde turquesa
Dejar enfriar un poco
Separamos el agar en cada tubo de ensayo en un ambiente estril
Tubos usado:
I. 6 tubos gordos se le vierte 10 ml
II. 11 tubos delgados se le vierte 15 ml
Tapar rpidamente antes de que se seque
Colocamos los tubos a un a inclinacin formando los picos de flauta
Se sec en un tiempo de 30 min aproximadamente
 Llevamos a refrigeracin

B. PREPARACIN DEL AGAR TSI

Cortar el papel aluminio

Tarar la balanza
Pesar 8 gr de agar Triple azcar de hierro
Medimos 200 ml de agua y vertemos a la botella de preparacin de
medios
Mezclamos con el agar en la botella
Lo llevamos a bao Mara para que se disuelva y que se homogenice
completamente durante 5 min
Llevamos al autoclavado a 121 c por 15 min a 15 psi de presin
Enfriar un poco y verter en los tubos de ensayo
10 ml de medio en 20 tubos de ensayo y colocar en una inclinacin para
que forme el pico de flauta
Esperar que se seque o solidifique por 10 min.
Se midi el pH el cual resulto entre 8-9

C. Preparacin de agar TSA

Pesar 8 gr de agar tripticasa de soya

Medir 200 ml de agua
Homogenizar en la botella para preparar medios
Llevamos a bao Mara para que se disuelva y se homogenice
completamente por un tiempo de 3 min
Llevar al autoclavado a 121 c durante 15 min a 15 lb de presin
Verter en 20 tubos de ensayo y realizar el pico de flauta
Refrigeramos a 4 C

3.3 SIEMBRA E INCUBACIN

1) TSI

se siembra en tsi una colonia de un medio primario , picando el fondo y

extendiendo sobre la superficie del medio por estra en condiciones de
 asepsia (cerca de un mechero) se incuba a 35c en una incubadora
durante 24 horas.

2) Citrato simons

Se toma una colonias aislada de medio y se siembra por estra

nicamente en pico de flauta en condiciones de asepsia (cerca de un
mechero) se incuba a 35c en una incubadora.

3) TSA

al igual que la anterior se toma una colonias aislada de medio y se

siembra por estra nicamente en pico de flauta en condiciones de
asepsia (cerca de un mechero) se incuba a 35c en una incubadora.

4. RESULTADOS

AGAR ENDO FC AZUL FC S.S

AMARILLO
+++- +++- +- ++
A/A A/A A/A A/A
TSI
2
TSA ++- ++- +- +-
A/A A/A A/A A/A
SIMONS Positivo.- positivo positivo positivo

K: ALCALINO
A: ACIDO

INTERPRETACIN TSI
 K/A A/A K/K H2S GAS

AGAR ENDO
POSITIVO fermentacin de glucosa y lactosa (Pico de flauta cido/
profundidad cida). Con formacin de gas caractersticos de E. coli y grupo
Klebsiella-Enterobacter.

FC AZUL
(A/A+++-): fermentacin de glucosa y lactosa (Pico de flauta cido/
profundidad cida). Con formacin de gas caractersticos de E. coli y grupo
Klebsiella-Enterobacter.

FC AMARILLO
(A/A+-): fermentacin de glucosa y lactosa (Pico de flauta cido/
profundidad cida). Con formacin de gas caractersticos de E. coli y grupo
Klebsiella-Enterobacter
AGAR SS
(A/A+-): fermentacin de glucosa y lactosa (Pico de flauta cido/
profundidad cida). Con formacin de gas caractersticos de E. coli y grupo
Klebsiella-Enterobacter.

$"Interpretacin
1. Rojo en pico de flauta: alcalino; degradacin aerbica de glucosa. Amarillo
en capa profunda: cido; degradacin anaerbica de la glucosa.
2. Amarillo en pico: cido Amarillo en capa profunda: cido
3. Rojo en pico de flauta: alcalino Sin cambio de color en capa profunda:
alcalina.
4. Produccin de H2S: precipitado negro
5. Produccin de gases: Produccin de burbujas, descomposicin del medio,
ligera muesca del medio sobre el costado del tubo o desplazamiento del medio
del fondo, dejando un espacio libre.

$"Observaciones
Una bacteria productora de H2S puede dar tal cantidad de precipitado negro de
sulfuro ferroso que oculte completamente la acidez producida en la capa
profunda. Sin embargo, si se forma H2S es que existe en la capa profunda
una condicin cida, aun cuando no se observe, y debe ser registrada como
tal. Es esencial que se interprete la fermentacin al trmino de 18 24 horas
de incubacin, ya que una interpretacin prematura o demorada dar formas
de fermentacin no vlidas que llevarn a errores en el agrupamiento del
gnero o especie.

Reporte de resultados

1. K / A (Fermentacin de glucosa solamente)

2. A / A (Fermentacin de glucosa y lactosa)
3. K / K (No fermentacin de glucosa y lactosa).

Los resultados se escriben siempre siguiendo un patrn. Primero la reaccin

del pico de flauta seguida por la reaccin de la capa profunda, separadas por
una barra.

Reacciones de TSI

Pico de flauta alcalino / profundidad alcalina (K/K). No fermentacin de

hidratos de carbono. Caracterstico de bacterias no fermentadoras como
Pseudomonas aeruginosa.
Pico de flauta alcalino / profundidad cida (K/A). Glucosa fermentada,
lactosa no fermentada. Caracterstico de bacterias no fermentadoras de lactosa
como especies de Shigella.
Pico de flauta alcalino / profundidad cida (negra) (K/A/H2S). Glucosa
fermentada, lactosa no fermentada; produccin de H2S. Caracterstico de
bacterias no fermentadoras de lactosa y productoras de H2S como:
Salmonella, Arizona, Citrobacter y algunas especies de Proteus.

Pico de flauta cido / profundidad cida (A/A). Glucosa y lactosa

fermentadas. Caracterstico de coliformes que fermentan lactosa como: E. coli
y grupo Klebsiella-Enterobacter.

INTERPRETACIN CITRATO

AGAR ENDO
(POSITIVO) presentada por la produccin de color azul oscuro

FC AZUL
(A/A+++-): fermentacin de glucosa y lactosa (Pico de flauta cido/
profundidad cida). Con formacin de gas caractersticos de E. coli y grupo
Klebsiella-Enterobacter.

FC AMARILLO
(A/A+-): fermentacin de glucosa y lactosa (Pico de flauta cido/
profundidad cida). Con formacin de gas caractersticos de E. coli y grupo
Klebsiella-Enterobacter
AGAR SS
(A/A+-): fermentacin de glucosa y lactosa (Pico de flauta cido/
profundidad cida). Con formacin de gas caractersticos de E. coli y grupo
Klebsiella-Enterobacter.

INTERPRETACIN

Positivo: Crecimiento aunque no exista cambio de color.

Crecimiento y el medio de color azul intenso en
pico de flauta.

Negativo: No se observa crecimiento y medio de color

verde.

negativo

positivos
Si se utiliza carbono a partir de citrato de sodio, tambin se extrae nitrgeno del
fosfato de amonio contenido en el medio, liberndose amoniaco. En ocasiones
se detecta un crecimiento visible a lo largo de la lnea de siembra antes de la
aparicin de color. Este crecimiento visible tambin indica resultado positivo.

REPORTE DE RESULTADOS
Negativo (-)
Positivo (+)
Microorganismos positivos
Especies de:

o Salmonella
o Arizona
o Citrobacter
o Enterobacter
o Klebsiella
o Serratia licuefaciens
o Pseudomonas cepacia

Microorganismos negativos
o Edwarsiella
o Yersinia enterocoltica
o Escherichia coli
o Shigella
o Yersinia pseudotuberculosis
o Otras especies de Moraxella
o Proteus morganii

INTERPRETACIN TSA

Brucella, Corynebacterium, Listeria, Neisseria y Vibrio.

CONCLUSIN

Al elaborar esta prctica podemos comprender que los medios de cultivo son
muy importantes para el microorganismo, ya que ste le dar los nutrientes
necesarios para su crecimiento. El obtener un medio de cultivo limpio fue muy
importante para la realizacin de la siguiente prctica que es siembra de
microorganismo. Obtuvimos una gran experiencia debido a que nunca
habamos preparado ningn tipo de medio cultivo, para siembra de bacterias,
entendimos tambin que el cultivo siempre debe ser preparado bajo
condiciones controladas que permiten verificar sus caractersticas en
generaciones sucesivas en tiempos relativamente cortos. Adems aprendimos
la utilizacin de la autoclave para la esterilizacin de material.
BIBLIOGRAFIA

o MTODOS DE ANLISIS MICROBIOLGICOS DE ALIMENTOS

Por Corrie Allaert Vandevenne, Marta Escol Ribes
o Baker, F. J. Breach M. R, 1990, Manual de tcnicas de
microbiologa mdica, tercera edicin. Acribia, Espaa, pp 69-215.
o http://www.saudetotal.com/microbiologia/labmicro.htm#1.Isolament
o