Ao del buen

servicio al
cuidadano

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERA

AGROINDUSTRIAL

INFORME FINAL DEL EXPERIMENTO N01

CURSO:
LABORATORIO DE INGENIERA DE
BIOPROCESOS
DOCENTE:
CASTILLO CALDERN AUGUSTO

TEMA:
INGENIERA DEL CULTIVO CELULAR
POR LOTES DE PICHIA STIPITIS NRRL Y-
7124
INTEGRANTES:

FARFN ZAPATA JAVIER

NOLASCO MALDONADO ARNOLD
RODRGUEZ TOMAS ANDY
VSQUEZ BACILIO EVELYN FABIOLA
 2017
INDICE
 RESUMEN

Se llev acabo el desarrollo del cultivo celular de la cepa Pichia stipitis NRRL
Y 7124, aplicando toda la metodologa de un diseo de cultivo por lote con la
manipulacin desde su estado inactivo en agar. Se sigui una serie de
procedimientos secuenciales tales como activacin en el shaker, inoculacin en
agar, proporcionndoles todas las condiciones y facilidades para que pueda
crecer, asimismo siguiendo con la secuencia se inoculo en un medio
denominado rico (15ml), el cual contiene todos los nutrientes que esta bacteria
requiere para su ptimo desarrollo.
Se evidencio el crecimiento en el medio rico, la totalidad de este medio es
diluido dentro de otro medio al que se denomina mnimo (200 ml) por sus
limitaciones en cuanto a nutrientes, ya que este contiene solo los componentes
necesarios para que el microorganismo pueda subsistir, tales como fuente de
carbono que en nuestro caso fue Xilosa.
Se procedi a observar y comparar como se va produciendo el crecimiento
celular con los nutrientes exactamente necesarios y establecidos para tal efecto
y al mismo tiempo como va disminuyendo el sustrato en este caso
principalmente la Xilosa, por el consumo que realiza el microorganismo como
fuente principal para su desarrollo. Y esto es posible determinar haciendo
evaluaciones tales como crecimiento de biomasa mediante absorbancia (640
nm en el espectrofotmetro) y el ensayo con reactivo DNS para el caso del
sustrato con una absorbancia de 540 nm en el espectrofotmetro y la
generacin de productos como el etanol el cual ser medido mediante GC
(cromatografa de gases) usando como factor externo n-propanol.
Los tres aspectos (crecimiento de biomasa, consumo de sustrato y generacin
de producto) evaluados en un determinado tiempo, son expresados en grficas
adems de ser comparados en una curva de calibrado para ambos casos, nos
darn informacin sobre el microorganismo tales como un max igual 0.382 h -1,
un tiempo de crecimiento (t) equivalente a 10 horas (Pichia stipitis NRRL Y
7124).
 INTRODUCCION

En la actualidad los productos bioindustrializados son obtenidos gracias al

manejo y conocimiento del crecimiento de microorganismos. La cintica de
crecimiento y produccin de metabolitos resulta fundamental en el tratamiento
cuantitativo de los procesos biotecnolgicos. Basta por ahora con establecer
que el adecuado conocimiento de la cintica de un cultivo permite la prediccin
del transcurso de la fermentacin, la evaluacin de velocidades, rendimiento,
productividades y entrega informacin til para establecer estrategias de
produccin y optimizacin del proceso.
El comportamiento cintico de una poblacin est determinado por un complejo
conjunto de factores genticos y ambientales. Entre estos ltimos destacan las
llamadas condiciones de operacin (composicin del medio, temperatura, pH y
otras) y la modalidad de cultivo, entre las que distinguimos el cultivo por lotes.
Para ello la preparacin de medios de cultivo para estos microorganismos es
un buen punto de partida para conocer sobre su comportamiento as como
tambin el seguimiento de la cintica nos proporciona datos mucho ms
prcticos y exactos sobre la velocidad y caractersticas del crecimiento del
microorganismo tratado.
En esta modalidad de cultivo se cargan los nutrientes inicialmente y luego se
inocula con una determinada cantidad de clulas viables. Se inicia as el
cultivo, el que transcurre de una forma caracterstica, dada por la llamada curva
de crecimiento, hasta que algn evento, tal como el agotamiento de un
nutriente lo detiene.
Es as que para esta prctica hemos centrado nuestra atencin en el
tratamiento de un microorganismo (Pichia stipitis NRRL Y 7124), iniciando
desde su resiembra, para luego sembrarlo en medio rico procurando su rpida
activacin, para que luego de un determinado tiempo podamos sembrar la
bacteria pero en un medio mnimo; es decir con los mnimos requerimientos; en
el cual es ms factible determinar la cintica de crecimiento.
 I. OBJETIVOS:

I.1. Objetivos Generales:

Disear y realizar una experiencia de cultivo celular por lotes en matraces
empleando una cepa de Pichia stipitis NRRL Y 7124.
Determinacin de los parmetros cinticos de la cepa Pichia stipitis
NRRL Y 7124.
I.2. Objetivos Especficos:
Disear el medio lquido de cultivo.
Activacin celular y desarrollo del inculo
Determinar la cintica de crecimiento de la biomasa.
Determinar de la cintica de consumo de la fuente de carbono.
Determinar la cintica de generacin de Etanol.
Determinacin del M y ks ; los rendimientos del nutriente limitante en
clulas y en etanol adems de las respectivas productividades en clulas
y en etanol.

II. FUNDAMENTO TEORICO:

II.1. MEDIO DE CULTIVO

Un microorganismo necesita para crecer nutrientes que le aporten energa y

elementos qumicos para la sntesis de sus constituyentes celulares.
Dependiendo de la fuente de carbono que utilizan, los microorganismos se
pueden clasificar en auttrofos si es el CO2 atmosfrico (microorganismos que
fotosintetizan) y hetertrofos si utilizan carbono orgnico.
La frmula elemental de un microorganismo es, aproximadamente, C4H7O2N
lo que supone que los componentes de las clulas son: carbono que
representa alrededor del 50% del peso seco, oxgeno (32%), nitrgeno (14%),
fsforo (3%), azufre (entorno al 1%) y otros elementos traza entre los que se
encuentran Fe, K, Mg, Mn, Co, Mb, Cu y Zn.
La preparacin de medios para el desarrollo de procesos de fermentacin es
una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos.
Como ya se explic, los componentes de los medios constituyen los efectores
externos de naturaleza qumica que desempean un rol esencial en los
procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de
formacin de productos y adems suministrar energa para la sntesis de
metabolitos y para el mantenimiento celular.
En el caso de Pichia stipitis NRRL Y 7124 la frmula elemental ms concreta
es CH1.79 O0.6 N0.17 esta composicin puede variar ligeramente en funcin
de las condiciones de cultivo o de fase de crecimiento. El conocimiento de la
frmula elemental del microorganismo que se cultiva facilita la formulacin del
medio de cultivo ms adecuado para el mismo.

II.2. DISEO
El diseo de un medio de fermentacin tiene como finalidad la eleccin de
los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formacin de
productos correspondientes al proceso a desarrollar. Con tal objeto se debe
tener en cuenta todos aquellos aspectos relacionados con el
microorganismo, el proceso y los sustratos a ser empleados como son los
requerimientos nutricionales del microorganismo y algunos especficos del
proceso, la disponibilidad real de los componentes y consideraciones sobre
las materias primas. Otros aspectos que son tambin importantes se
refieren a todos los procesos y operaciones previas y posteriores a la etapa
de fermentacin y al conocimiento de los mecanismos bioqumicos que
regulan la formacin de algunos productos.

II.3. CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO LQUIDO

Si la

bacteria crece en un medio lquido, en la mayora de los casos las

 clulas que se producen en cada divisin continan su vida
independientemente formndose una suspensin de clulas libres.
En un cultivo discontinuo de bacterias en medio lquido, se pueden
diferenciar cuatro fases en la evolucin de los parmetros que miden el
crecimiento microbiano:
a) Fase logartmica o de adaptacin
Durante la que los microorganismos adaptan su metabolismo a las nuevas
condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y condiciones de
cultivo) para iniciar la fase de crecimiento exponencial.
b) Fase exponencial o logartmica:
En ella la velocidad de crecimiento es mxima y el tiempo de generacin es
mnimo. Durante esta fase las bacterias consumen a velocidad mxima los
nutrientes del medio. La evolucin del nmero de clulas durante esta fase
se explica con los modelos matemticos que describiremos a continuacin.
c) Fase estacionaria:
En ella no se incrementa el nmero de bacterias (ni la masa u otros
parmetros del cultivo). Las clulas en fase estacionaria desarrollan un
metabolismo diferente al de la fase exponencial y durante ella se produce
una acumulacin y liberacin de metabolitos secundarios que pueden tener
importancia industrial.
Los microorganismos entran en fase estacionaria porque se agota algn
nutriente esencial del medio o porque los productos de desecho que han
liberado durante la fase exponencial hacen que el medio sea inhspito para
el crecimiento microbiano. La fase estacionaria tiene gran importancia
porque probablemente represente con mayor fidelidad el estado metablico
real de los microorganismos en los ambientes naturales.
d) Fase de muerte:
Se produce una reduccin del nmero de bacterias viables del cultivo.
II.4. COMPOSICION DE LOS MEDIOS
Los carbohidratos son tradicionalmente las fuentes de carbono utilizadas en
la industria de la fermentacin. Por razones econmicas la glucosa la
sacarosa puras rara vez son utilizadas como nica fuente de carbono,
excepto en los procesos que exigen un control exacto de la fermentacin.

El extracto de malta
Un extracto acuoso de la cebada malteada (cebada germinada que produce
enzimas que hidrolizan el almidn), es un sustrato excelente para muchos
hongos filamentosos, levaduras y actinomicetos. El extracto seco de malta
contiene aproximadamente 90-92% de carbohidratos y est compuesto de
hexosas (glucosa y fructosa), disacridos (maltosa, sacarosa), trisacridos
(maltotriosa) y dextrinas (polmeros de glucosa 1,4 con ramificaciones 1,6).
Las sustancias nitrogenadas presentes en el extracto de malta incluyen
protenas, pptidos, aminocidos, purinas, pirimidinas y vitaminas. Los
medios de cultivo que contienen extracto de malta deben ser esterilizados
cuidadosamente. Cuando existe sobrecalentamiento se produce la reaccin
de Maillard debido al bajo pH y a la alta proporcin de azcares reductores.
En esta conversin los grupos aminos de las aminas, aminocidos
(especialmente lisina) o las protenas reaccionan con los grupos carbonilo
de los azcares reductores, aldehdos y cetonas, lo que resulta en la
formacin de productos de condensacin de color tostado. Estos productos
de reaccin no son sustratos adecuados para los microorganismos.

Los extractos de levadura

Son excelentes sustratos para muchos microorganismos. El extracto de
levadura contiene aminocidos, pptidos, vitaminas solubles en agua y
carbohidratos.

Las peptonas (hidrolizados de protenas).

Las fuentes de peptonas incluyen la carne, casena, gelatina, queratina,
semillas de cacahuete, harina de soja, semillas de algodn y semillas de
girasol. La composicin de las peptonas vara dependiendo de su origen. El
 producto final est tambin influido por el tipo de hidrlisis (cida o
enzimtica) especialmente en relacin a su contenido en triptfano

El agar
Presenta algunos inconvenientes; el principal consiste en ofrecer una
aireacin insuficiente que puede afectar el crecimiento de algunos tejidos.
Por otra parte, la composicin del agar es variable y, a veces, mal definida y
podra aportar oligoelementos que actan favorablemente sobre el
crecimiento
2.5. PARMETROS A TENER EN CUENTA EN UN MEDIO DE CULTIVO
Aporte de nutrientes:
La cantidad y naturaleza de los nutrientes en un medio de cultivo viene
determinada por el rendimiento de un producto en especial adems de los
requerimientos nutricionales del microorganismo
pH:
Un microorganismo puede alterar el pH del medio de cultivo como resultado de
las sustancias producidas por el propio microorganismo; por ejemplo:
Utilizacin de carbohidratos Produccin de cidos orgnicos
Acidificacin

Catabolismo de protenas Produccin de materiales nitrogenados

Alcalinizacin

Estos cambios durante el crecimiento los microorganismos modifican el pH del

medio de cultivo, normalmente hacindolo disminuir; por tal motivo es frecuente
incluir en el medio substancias que acten como tampn (buffer) a fin de evitar
que el pH se aleje del ptimo.

Necesidades de gases:
Los gases principales que afectan al desarrollo microbiano son el oxgeno y el
dixido de carbono. Las bacterias presentan una respuesta amplia y variable al
oxgeno libre clasificndose en cuatro grupos:

Aerobias: bacterias que se desarrollan en presencia de oxgeno libre.

 Anaerobias: bacterias que se desarrollan en ausencia de oxgeno libre.

Anaerobias facultativas: bacterias que se desarrollan tanto en

presencia como en ausencia de oxgeno libre.

Microaerfilas: bacterias que crecen en presencia de pequeas

cantidades de oxgeno libre.
Para desarrollar bacterias aerobias se incuban los medios de cultivo en
agitacin constante o introduciendo aire estril en el medio.
Los anaerobios estrictos son muy sensibles al O2 por lo que se debe evitar la
exposicin de estos microorganismos al O2. Se puede obtener un ambiente de
anaerobiosis por los siguientes mtodos:
Agregando al medio de cultivo un compuesto reductor, como es el
tioglicolato sdico, para disminuir el contenido de O2.

Quitando el O2 por procedimientos mecnicos y reemplazndolo por N2

o CO2.

Mediante reacciones qumicas dentro del recipiente que contiene el

medio de cultivo inoculado para combinar el oxgeno libre con otro
compuesto. Por ejemplo: al encender una vela se transforma el oxgeno
en dixido de carbono

Control de la temperatura:
El desarrollo de las bacterias depende de reacciones qumicas, y la
velocidad con que se efectan estas reacciones est influida por la
temperatura, por lo que la temperatura puede en parte determinar la
velocidad de crecimiento de los microorganismos.
El efecto de la temperatura sobre el crecimiento es complejo. Por un
lado cada reaccin qumica individual, de todas las que conforman el
metabolismo, es afectada por la temperatura, por lo que un incremento
de sta resulta en una mayor velocidad de reaccin.

Por otra parte, aumentos posteriores de temperatura inactivan las

enzimas que catalizan las reacciones, con lo que la velocidad de
 reaccin decrece rpidamente. La temperatura ptima resulta de la
interaccin de estos dos efectos.

2.6. FACTORES QUE INTERVIENEN EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO

El pH

Es un parmetro crtico en el crecimiento de microorganismos ya que

cada tipo de microorganismo slo puede crecer en un rango estrecho de
pH fuera del cual mueren rpidamente.

Hay que considerar que, como consecuencia del metabolismo, el pH del

medio de crecimiento suele tender a bajar durante el cultivo. Por otra
parte, la bajada del pH del medio que producen ciertos microorganismos
les confiere una ventaja selectiva frente a otros microorganismos
competidores.
La bajada del pH se puede deber a varios factores, uno de los cuales es
la liberacin de cidos orgnicos de cadena corta (frmico, actico,
lctico) por ciertos microorganismos.

Biomasa

Se representa mediante una formula basada en su composicin

elemental. De ella es posible calcular un peso molecular promedio
aparente, que es un submltiplo de lo que sera el verdadero peso
molecular calculado en base a la composicin de la clula. La masa
celular est correctamente representa por el producto del peso molecular
por el coeficiente estequiomtrico respectivo.

Para su desarrollo y reproduccin las clulas necesitan de ciertos

nutrientes en el medio. Estos nutrientes deben, a lo menos, aportar los
elementos de los que aquellos estn compuestos.

Tabla N01: Composicin qumica de las levaduras

 Se puede apreciar que cuantitativamente los elementos ms importantes
son: el C, H, O y N, luego viene un segundo grupo compuesto por Mg, S,
P, Ca, Fe y K; mientras que los restantes elementos se encuentran
presentes en niveles muy bajos.

2.7. CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO SLIDO

Las fases, parmetros y cintica de crecimiento discutidas para el caso
de los cultivos lquidos se presentan tambin en cultivos slidos. La
cintica de crecimiento, en este caso, se puede estudiar siguiendo la
evolucin del nmero de clulas viables por unidad de superficie o por
unidad de masa.
Cuando una clula aislada e inmvil comienza a crecer sobre un
substrato slido, el resultado del crecimiento al cabo del tiempo es una
colonia. Por consiguiente, se denomina unidad formadora de colonia
(UFC) Se le denomina as a una clula bacteriana viva y aislada que si
se encuentra en condiciones de substrato y ambientales adecuadas da
lugar a la produccin de una colonia en un breve lapso de tiempo.

2.8. Pichia stipitis NRRL Y 7124

Stipitis Pichia (aka stipitis Scheffersomyces) es una especie de levadura,
que pertenece a la "CUG Clade" de levaduras ascomycetous. Este es un
grupo de hongos que serina sustituto de leucina cuando se encuentra el
codn CUG. S.
stipitis est lejanamente relacionado con la levadura de cerveza,
Saccharomyces cerevisiae, que utiliza el sistema codn convencional.
Encontrado, entre otros lugares, en los intestinos de los escarabajos
passalid, S. stipitis es capaz tanto de fermentacin aerbica limitada y
oxgeno, y tiene la capacidad natural de la mejor conocida de cualquier
levadura para fermentar directamente xilosa, la conversin a etanol, un
potencial valor econmico rasgo. La xilosa es un azcar hemicelulosa se
encuentra en todas las plantas angiospermas. Como tal xilosa constituye
el segundo resto de carbohidrato ms abundante en la naturaleza. La
xilosa puede ser producido a partir de madera o residuos agrcolas a
travs de la hidrlisis automtica o cido. La produccin de etanol a
partir de tales residuos lignocelulsicos no compite con la produccin de
alimentos a travs del consumo de grano.

Dada la abundancia de xilosa y su potencial para la bioconversin de

materiales lignocelulsicos a los combustibles renovables, Pichia stipitis
se ha estudiado ampliamente. La secuenciacin completa de su genoma
se anunci en 2007. cepas nativas de S. stipitis han demostrado producir
50 g / l de etanol en 48 h a partir de xilosa pura en medio mnimo
definido usando urea como fuente de nitrgeno. S. stipitis es una
levadura haploide predominantemente pero las cepas puede ser
inducido a aparearse con ellos mismos o con otras cepas de S. stipitis
por cultivo de clulas en medio mnimo que contiene cantidades
limitantes de fuentes de carbono y nitrgeno. Una amplia caja de
herramientas gentica se ha desarrollado para S. stipitis que incluye
marcadores de resistencia a frmacos sintticos para gen nourseotricina
acetiltransferasa (NAT1), higromicina (HPH) y una forma sinttica de Cre
que permite la extirpacin de los marcadores. Cepas manipuladas
genticamente de S. stipitis producirn 57 g / l de etanol a partir de
xilosa pura en menos de 48 h y cepas adaptadas producirn cantidades
significativas de etanol a partir de hidrolizados cidos de lignocelulosa
 pH:

Este es un factor importante en la fermentacin, debido a su importancia

en el control de la contaminacin bacterial como tambin al efecto en el
crecimiento de las levaduras, en la velocidad de fermentacin y en la
formacin de alcohol. Durante la fermentacin la levadura toma el
nitrgeno de los aminocidos orgnicos, perdiendo su carcter anftero
y pasando a cidos, lo cual origina una disminucin del pH del medio.
Cuanto ms bajo el pH del medio, tanto menor el peligro de infeccin,
pero si se trabaja con pH muy bajos la fermentacin es muy lenta, ya
que la levadura no se desarrolla de la forma conveniente.

Concentracin de nutrientes:

Como ya se dijo, la presencia de sustancias nutritivas adecuadas es una

condicin necesaria para el crecimiento y desarrollo de la levadura,
siendo su concentracin un factor primordial en la actividad vital de la
levadura. Las principales sustancias nutritivas y las ms influyentes son
el nitrgeno, fsforo, azufre, vitaminas y trazas de algunos elementos.

Aireacin:

El aire es un factor decisivo en toda fermentacin, ya que su presencia

hace ms vigoroso el crecimiento de la levadura. Hay tres puntos de
vista de gran importancia que favorecen el rendimiento debido a una
buena aireacin:

El libre y constante abastecimiento de oxgeno de cada clula en

el sustrato.
La eliminacin rpida del CO2, porque en concentraciones
relativamente pequeas inhibe el crecimiento.
 El mantener en suspensin las clulas de levadura, a fin de que
en la tumultosidad de la mezcla se renueve constantemente el
contacto entre la membrana celular y el sustrato nutritivo.

En este trabajo se ha utilizado el microorganismo Pichia stipitis, tambin

llamado Scheffersomyces stipitis, debido a sus buenas cualidades, ya
que puede fermentar glucosa y xilosa con buenos rendimientos de
etanol. Por tanto, se evita la complejidad de utilizar un microorganismo
modificado genticamente o un cocultivo. La figura siguiente muestra la
ruta metablica de obtencin de etanol caracterstica de la levadura P.
stipitis a partir de glucosa y xilosa.

Figura 1.10. Ruta metablica de la levadura Pichia stipitis a partir de glucosa y

xilosa (Fuente: Pea, 2008)
 III. MATERIALES Y METODOS
3.1 Materiales
Preparacin del medio solido de mantencin (50ml)
a) Materiales
02 Pipetas de 10 ml.
07 Tubos de ensayo con tapas
Varilla de vidrio
Matraz Erlenmeyer 250 ml
Probeta graduada
Mechero Bunsen
Esptula grande y pequea
Guantes.
06 Capachos de aluminio
Vaso de precipitados 250ml

b) Instrumentos e Equipos

Balanza analtica
Olla a presin (autoclave)
Mechero Bunsen

c) Reactivos
Componentes segn la
tabla N1
Extracto de levadura 3g/L
de solucin
Peptona 5g/L de solucin
Extracto de malta 3g/L
Agar 20g/L de sokucin
Glucosa 10g/L
Muestra: Pichia sttpitis NRRL Y
7124
Sustrato: Xilosae
Agua destilada

Agua destilada

Preparacin de la curva de calibrado DNS

Hidrolisis de la xilosa
 a) Materiales

7 tubos de ensayo con tapa

Gradilla
Micro pipeta con punta
2 pipetas para NaOH y HCl
2 vasos precipitados (50ml y 500ml)
Papel aluminio
Olla con trpode
Hielo
b) Instrumentos y equipos

Mechero Bunsen
Agitador Maxi Mix
Bao Maria

c) Reactivos

HClcc
Sacarosa
NaOH 1.7M
Agua destilada
DNS
a) Materiales

7 tubos de ensayo con tapa

Gradilla
Micro pipeta con puntas
Vasos precipitado
Olla con trpode
Hielo
Celdas
Papel toalla

b) Instrumentos y equipos

Mechero Bunsen
Agitador Maxi Mix
Espectrofotmetro

c) Reactivos
 DNS
Agua destilada

Preparacin del medio de activacin (20ml)

a) Materiales

1 Matraz de 125ml
2 tubos de ensayo con tapa
1 pipeta de 5ml
Gradilla

b) Instrumentos e Equipos

Autoclave
Mechero bunsen

c) Reactivos

Glucosa
Extracto de levadura
Extracto de malta
Solucin de sales
Agua destilada

1 Matraz de 500ml
2 tubos de ensayo con tapa
Gradilla

b) Instrumentos e Equipos

Autoclave
Mechero bunsen
 c) Reactivos

Sacarosa
Extracto de levadura
Solucin de sales
Tampn citrato
Agua destilada
Cintica de cultivo
d) Materiales

Alcohol 96
Algodn
Jabn
2 Pipeta 10 ml y 5 ml
7 viales
Tubos de celda
Papel toalla
Taper de plstico

a) Instrumentos e Equipos

Mechero bunsen
Centrifuga
Espectrofotmetro
Refrigeradora

b) Reactivos

Agua destilada
Determinacin de la concentracin celular por D.O.
Diluciones
a) Materiales
1 matraz (medio rico)
2 pipeta (5ml y 2 ml)
1 gradilla
3 tubos de ensayo
Tubos de celda
b) Instrumentos y equipos
Espectrofotmetro
c) Reactivos
 Agua destilada
Peso Seco
a) Materiales
3 capachos de aluminio
1 matraz (medio rico)
2 pipetas 5ml
Celdas (tubo)
3 tubos de ensayo
b) Instrumentos y equipos
Espectrofotmetro
Centrifuga
Estufa
Balanza analtica
c) Reactivos
Agua destilada

Determinacin de la concentracin de Xilosa

Hidrolisis de la Xilosa
a) Materiales
8 tubos de ensayo sin tapa
Gradilla
Micropipeta con puntas
2 pipetas para NaOH y HCl
2 vasos precipitados (50ml y 500ml)
Olla con trpode
Hielo

b) Instrumentos y equipos
Agitador Maxi Mix
Bao Maria
c) Reactivos
Sobrenadantes (medio rico)
HClcc
NaOH 1.7M
Agua destilada
DNS
a) Materiales
 8 tubos de ensayo sin tapa
Gradilla
Micropipeta con puntas
Vasos precipitado
Olla con trpode
Hielo
Celdas

b) Instrumentos y equipos
Mechero Bunsen
Agitador Maxi Mix
Espectrofotmetro

c) Reactivos
DNS
Muestra de la hidrolisis de la sacarosa
Agua destilada

3.2 METODOLOGIA EXPERIMENTAL:

o Diseo de Medios de cultivos:

El diseo de un medio de fermentacin tiene como finalidad la eleccin de los

componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formacin de productos
correspondientes al proceso a desarrollar. Con tal finalidad se debe tener en
cuenta todos aquellos aspectos relacionados con el microorganismo, el
proceso y los sustratos que van a ser empleados, para ello se debe considerar
los requerimientos nutricionales del microorganismo y algunos especficos del
proceso.

Antes de disear un medio de cultivo es necesario saber el comportamiento y

las caractersticas del microorganismo.

La levadura usada es la Pichia stipitis NRRL Y 7124, siendo el sustrato

la D-xilosa. La frmula qumica de Pichia stipitis es la siguiente:

C1 H1.79 O0.60
N0.17
(Levadura -formula qumica)
No obstante que los microorganismos (Pichia stipitis NRRL Y-7124) varan
considerablemente respecto de los nutrientes que pueden necesitar es posible
efectuar la distincin de las siguientes categoras de componentes como son
los macronutrientes representados por las fuentes de C, N, S, P, K y Mg y
micronutrientes representados por las sales de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co.

Requerimientos nutricionales

Para ello utilizamos un Medio de cultivo mnimo.

Fuente
Fuente de de K
Xilosa N
Sulfat sulfato de fosfato fosfato
o de magnesio dicido dicido
Fuente de amoni de de
carbono y o Fuente Potasio Potasio
energa de Mg y S Fuente
de P
Solucin de sales: heptahidrat
ado
Solucin de sales concentrada (100 veces)

Fuente de Ca : CaCl2
Fuente de Na : NaCl
Fuente de Fe : FeSO4.7 H2O
Fuente de Cu : CuSO4.5 H2O
Fuente de Mn : MnCl2.6H2O
Fuente de Mo : MoO3
Fuente de Co : CoCl2.6H2O
Fuente de Zn : ZnSO4.7H2O

Condiciones de cultivo

Metabolismo celular Autotrfico

pH 4.5

Estado Medio liquido

Volumen del medio 30% - 40% del Fermentador

Composicin Qumicamente definido

 Temperatura
30C

Velocidad de agitacin(Shaker)
120 rpm

Volumen del medio

30 40 % del volumen del matraz

concentracion celular final "Xf"

No superior a 2 g/L
 Referencia de Composicin de medios de mantencin,
activacin y cultivo para Pichia Stipitis NRRL Y-7124 para la
produccin de etanol
 Medio Slido De Mantencin

Tabla 01: Concentracin de Nutrientes para el medio de mantencin (50 mL)

Medio Activacin: (T:30C y N: 150rpm)

Tabla 02: Concentracin de Nutrientes para el medio de activacin (20 mL)

Nutriente Concentracin (g/l) Peso (g)

Xilosa 10 0.2
Extracto de levadura 3 0.06 Medio
De Extracto de malta 5 0.10
Solucin de sales 5 ml/L 0.10

Nutriente Concentracin (g/L) Peso (g)

Extracto de levadura
Peptona de casena
Extracto de malta
Agar
Fermentacin: (Ajustar pH 4.5)
3 0.15
5 0.25
3 0.15
20 1

Tablas 03: Nutrientes Para El Medio De Fermentacin:

Element Nutriente P.M. % en % en Yx/s So S'o

o Clula Nutrient (g/g) (g/l) (g/l)
e
C C5H10O5 150 46.57 40 0.43 4.6 4.6
N (NH4)2SO4 132 9.24 21.19 2.29 0.57 1.74
S (NH4)2SO4 132 0.125 24.25 194.04 0.01 0.02
K KH2PO4 136 2.5 28.74 11.49 0.17 0.35
P KH2PO4 136 1.7 22.78 13.39 0.15 0.30
Mg (MgSO4.7H2 246 0.35 9.57 28.19 0.07 0.14
O)
S (MgSO4.7H2 246 0.125 13.01 104.05 0.02 0.04
O)

Nutriente Limitante: Xilosa

 Max =0.301(teorico)

Tiempo de fermentacin: 10 horas

Tabla 04: Concentracin de Nutrientes para el medio de fermentacin (200 ml)

Nutriente Concentracin (g/L) Peso (g)
xilosa 4.66 0.932
Extracto de levadura 3 0.6
(NH4)2SO4 0.87 0.348
KH2PO4 0.17 0.07
MgSO4-7H2O 0.06 0.028
Solucin de sales 5 ml/L 1ml
Tampn citrato 0,04M pH4,5 100ml/L 20ml

Tabla 05: Composicin del medio mnimo de cultivo de Pichia Stipitis NRRL Y-
7124 para un crecimiento en biomasa de 2 g/L.

Composicin de la solucin de sales utilizadas en los medios de cultivos

en g/L (1000ml = 1L)
 Nutriente Concentracin (g/l) Peso (g)
CaCl2.2H2O 1.45 1.45
ZnSO4.7H2O 0.2 0.2
FeSO4.7H2O 3.27 3.27
CuSO4.5H2O 0.125 0.125
CoCl2.6H2O 0.20.12 0.20.12
11
HCl 1 ml 1 ml
o
Preparacin de medios, programa de muestreos

La preparacin de medios para el desarrollo de procesos de fermentacin

es una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos.
Para ello debemos tener en consideracin los siguientes procesos:

1. ACONDICIONAMIENTO DE LOS MATERIALES

CONFECCIN DE LOS TAPONES

Gaza Gruesa
CORTAR

Perpendicularmente en
COLOCAR
la boca del matraz.

Encima de la gaza el
HUNDIR algodn a presin

Nudos para sujetar el

HACER algodn y para poder
manipular

2. ESTERILIZACIN DE LOS MATERIALES

(Vasos precipitados,
matraz y tubos de
ensayo). LAVAR

En la Estufa en
SECAR posicin vertical
 COLOCAR Un filtro de algodn
en las pipetas

(Vasos precipitados,
Con papel
matraz y tubos de ENVOLVER
ensayo). aluminio

A 121C por 1hora y

ESTERILIZAR
30minutos
3. PREPARACIN DEL MEDIO DE MANTENCIN, SEGN LA TABLA
01 PARA EL CULTIVO DE PICHIA STIPITIS NRRL Y-7124

Extracto de levadura,
peptona, extracto de
malta y agar
PESAR

50ml de agua En un Matraz de

destilada AADIR 250ml

CALENTAR

Constantemente con un
AGITAR varilla por un minuto
(aparicin de la primera
burbuja).
6 tubos de 6-7 ml de la mezcla en
ensayo con tapa. caliente a cada tubo de
DISTRIBUIR
ensayo, con pipeta de 10
ml

Con papel aluminio

ENVOLVER

Una vez tapados los tubos

ENFRIAR
de ensayos, por 1 hora.

COLOCAR En un vaso precipitado, y

llevarlos a la olla a presin
(auto clave).

121 C / 20 min
CALENTAR

4. PREPARACIN DEL MEDIO DE ACTIVACIN, SEGN LA TABLA 02

A posicin inclinada a T. Amb. para
ENFRIAR
PARA EL CULTIVO DE PICHIA STIPITIS NRRL
solidificacin Y-7124
del medio de cultivo
Antes de preparacin el medio de activacin preparar la solucin de
sales:

Todas las sales

PESAR

Con agua destilada cada sal una

DILUIR
por uno
Unir todas las diluciones En un agitar magntico en un vaso
AGITAR
1ml de HCl de 500ml
AGREGAR

AGITAR
REFRIGERA

5. MEDIO DE ACTIVACIN

Xilosa, extracto de
levadura, extracto de PESAR
malta

En 20ml de agua
DISOLVER
destilada

Solucin de sales
MEDIR

Al matraz que contiene el

AGREGAR extracto de levadura y
malta, con la ayuda de la
micro pipeta.
AJUSTAR EL pH a 7 de la solucin
que contiene xilosa.

Por separado cada

ESTERELIZAR componente antes pesado,
121C 15 min.

MEZCLAR
6. PREPARACIN DEL MEDIO DE
FERMENTACIN, SEGN LA TABLA 03
PARA EL CULTIVO DE PICHIA STIPITIS NRRL Y-7124

Antes de preparacin el medio de fermentacin debemos tener listo el

Tampn Citrato 0,004M a pH 4,5
(gr) cido ctrico sol.
A y (gr) citrato de PESAR
Sodio sol. B
 DILUIR Por separado en una fiola de
100ml
Ambas soluciones
HOMOGENI
(ml) cido ctrico sol.
A y (ml) citrato de AGREGAR
Sodio sol. B En una fiola de 100ml ambas
AFORAR soluciones
En un agitador magntico
AGITAR

MEDIR pH Incial y aadir Gotas de NaOH

hasta regular el pH a 4,5

7. MEDIO DE FERMENTACIN
Materiales a utilizar (garantizar asepsia)
ESTERILIZAR

Xilosa, extracto de levadura,

(NH4)2SO4 , KH2 PO4 y KH2
PO4 PESAR
ENCENDER
Mechero para mantener un ambiente estril

El Asa Bacteriolgica
Cada compuesto en agua
1ml Solucin de Sales destilada:
(Al rojo vivo) MEDIR
SOMETER
-
Xilosa en un matraz de 500
ml con 130 ml agua
destilada.
- Extracto de levadura con
DISOLVER 20ml de tampn citrato en
ENFRIAR Pormatraz
unos segundos
un de 125ml
- Las 3 sales en un tubo con
15ml de agua destilada.
ESTERELIZA - Solucin de sales en un
tubo con 14ml agua
Una azada EXTRAER
delR
Tubo de Ensayo que
Lascontena las clulas
disoluciones por desarrolladas
separado.

ENFRIAR
o RESEMBRAR
MONTAJE DEL EQUIPO En tubos de ensayo
EXPERIMENTAL, preparados
CULTIVO con medio slido (Agar
DEL M.O.,
ETC.

REALIZAR
Azada desde dentro hacia fuera en el tubo (Cruzado)

LLEVAR
A la Incubadora a 30C durante 24 a 48 horas.

El tubo de Ensayo
Para cerrarlo FLAMEAR
ACTIVACIN CELULAR Y DESARROLLO DEL INCULO

Con una asa

Bacteriolgica EXTRAER
De la cepa incubada en medio slido Pichia stipitis NRRL

INOCULAR
En el Matraz con los 20ml del medio de activacin

TAPAREl Matraz con un tapn de gasa y algodn.

LLEVAR Al Shaker a 150rpm, T = 30C

 Hasta alcanzar un desarrollo celular suficiente, evidenciado
por el incremento en la turbidez del medio

DETERMINACIN DE LA CINTICA DE CRECIMIENTO DE LA

BIOMASA (ESPECTOFOTOMETRO)

20ml de caldo (medio rico + En un matraz de 500mL

biomasa) INOCULAR contenido 180ml de
A partir de este definido.
medio paso se
determinar la cintica de
Una muestra de 5ml crecimiento de la biomasa
EXTRAER
del caldo.

MEDIR
Estas X0
se realizaran
y S0 con D.O
cada hora y media
Se toman las para la primera
5ml del medio
medidas de cultivo
de asepsia EXTRAER muestra y
en la zona de trabajo posteriormente cada
y el encendido del hora de la siguiente
mechero. manera:

3ml para el tubo de espectrofotmetro y el resto se le agreg al tubo de cen

SEPARAR

La toma de muestras
se inicia desde la
dilucin del medio
de activacin en el
medio de
MEDIR
fermentacin. Absorbancia a 640nm y pH

5ml en el tubo de centrifugado, se devuelve.

COMPLETAR

CENTRIFUGAR
A la mxima velocidad por 20 minutos

VERTER Y GUARDAR
El sobrenadante en viales y ponerlos en refrigerador
Con el fin de despus determinar el consumo de sustrato

Determinacin de la cintica de crecimiento de la biomasa

1. Utilizando la ecuacin ln(X/ X0) = t, determinamos distintos valores de .

2. Tabular Si vs. i

3. Con la ecuacin 1/ = 1/m + (KS/ m) 1/S, graficamos.

4. la intercepcin con el eje y ser el valor de 1/m siendo su inversa el

valor de m, adems la pendiente m= K S/ m conocido anteriormente m
determinamos KS.

dX / dt = m X .()

X = X0 e mt

Determinacin de la cintica de consumo de la fuente de carbono.

-dS / dt = (1/ YX/S) (dX/dt)

Reemplazando en esta ecuacin y conociendo YX/S.

Tenemos -dS / dt = (1/ YX/S) m X , conociendo m ya para diferente concentraciones

finales podemos determinar la cintica de consumo de sustrato.
Determinacin de los rendimientos del nutriente limitante en clulas.

Fuente de carbono y energa: Xilosa (C5 H10 O5), M= 150 g

YX/S = % de C en el nutriente / % de C en la clula

% de C en el nutriente = 12(5) x 100 / 150 = 40 %

% de C en la clula = 46.57 %

YX/S = (40/46.57) x 0.3 (este factor por ser aireado)

YX/S = 0.86 x 0.5 = 0.43 g/g

DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES: MTODO DEL

DNS (CIDO DINITROSALICLICO)

Para la preparacin de este reactivo, se disuelve el tartrato en

aproximadamente 500 o 600 ml de agua, paralelamente se disuelve el cido
DNS. Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 1 litro y se agita
hasta la completa disolucin de todos los componentes, para posteriormente
aforar hasta un litro.
Se precisa realizar los siguientes pasos para el anlisis de la muestra:

Volumen del reactivo

AADIR DNS a un volumen de
muestra a analizar

MANTENER bao: agua a

MEZCLA ebullicin
tiempo: 5

ENFRIAR
Agua
destilada
10
AADIR
volmenes

LEER Absorbancia a 540

nm blanco: agua
destilada

DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN CELULAR POR D.O

TOMAR Volumen conocido

CENTRIFUGA 5000 rpm ; Tiempo:

20

RESUSPENSE Sobrenadante

ELIMINAR Centrifugado con agua destilada

5000 rpm ; Tiempo: 20

CENTRIFUGA a fin de eliminar restos de
R sustrato que pudieran alterar la
NUEVAMENT determinacin.

ELIMINAR Sobrenadante
 REDISOLVER Precipitado

SECAR Estufa: 80 C
hasta peso
constante

IV. RESULTADOS

XILOSA GRUPO A-1

XILOSA
N (2g/l) ABS 540 nm
1 2 1,135
2 1,6 0,925
3 1,2 0,743
4 0,8 0,461
5 0,4 0,201
6 0,2 0,091
7 0 0
TABLA N1- CURVA DE CALIBRADO DNS
 ABS 540 nm
f(x) = 0.59x - 0.01
R = 1

ABS 540 nm
Linear (ABS 540 nm)

GRAFICA N1 CURVA DE CALIBRADO DE DNS GRUPO A-1

x(g/L)

f(x) = 0.34x - 0
GRAFICA N02 CURVA DE CALIBRADO PARA BIOMASA CELULAR (Todos los
Grupos)

BIOMASA
SUSTRATO
GRAFICA N 03 Crecimiento cintico y consumo del sustrato en la experiencia
con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando XILOSA como fuente de carbono
GRUPO A-1

Linealidad de cinetica de crecimiento

Ln(X/Xo)

GRAFICA N 04 Curva del crecimiento celular para determinar el umax en la

experiencia con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando XILOSA como fuente de
carbono.

LN(X/Xo)

f(x) = 0.38x - 0.12

R = 1
LN(X/Xo)
Linear (LN(X/Xo))

GRAFICA N 05 Curva del crecimiento celular con los puntos lineales para
determinar el umax en la experiencia con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando
XILOSA como fuente de carbono
 TABLA N02 : Parmetros cinticos y rendimientos determinados en la
experiencia con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando XILOSA como fuente de
carbono.

Parmetro cintico y rendimientos Valor obtenido experimentalmente

Y x/s
td (h) 1,81 h
Qmx x/s (g/L*h)
Qtotal (gr/L*h)
m (h-1) 0,382 h-1

Los parmetros cinticos resumidos en la TABLA N 02, muestra aquellos

parmetros que fueron hallados experimentalmente despus de la experiencia
de cintica de crecimiento , el valor del m tericamente hallado para el
preinforme, fue de h-1, ahora experimentalmente nos sale un valor de h-1, lo
cual indica que hay una gran diferencia, luego si observamos el valor de td
hallado experimentalmente fue de h, como sabemos los intervalos de tiempo
de duplicacin para levaduras es aproximadamente entre 1 4 h, de lo cual el
valor hallado est dentro del rango, indicando que est bien nuestra cintica
de crecimiento, as mismo podemos observar que al existir un rango grande en
cuanto al tiempo de duplicacin entonces la velocidad mxima tambin habr
rangos grandes, lo cual hace que la diferencia que exista entre el valor hallado
tericamente y experimentalmente se haga insignificante.
GLUCOSA GRUPO A-2

s x
GRAFICA N 06 Crecimiento cintico y consumo del sustrato en la experiencia
con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando GLUCOSA como fuente de carbono
GRUPO A-2

GRAFICA N 07 Curva del crecimiento celular con los puntos lineales para
determinar el umax en la experiencia con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando
GLUCOSA como fuente de carbono

GLUCOSA + XILOSA GRUPO A-3

BIOMASA
SUSTRATO

GRAFICA N 08 Crecimiento cintico y consumo del sustrato en la experiencia

con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando la mezlca de GLUCOSA + XILOSA
como fuente de carbono GRUPO A-3
 LN(X/Xo)

f(x) = 0.42x + 0.1

R = 0.97
LN(X/Xo)
Linear (LN(X/Xo))

GRAFICA N 09 Curva del crecimiento celular con los puntos lineales para
determinar el umax en la experiencia con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando
la mezcla de GLUCOSA +XILOSA como fuente de carbono

V. DISCUSIONES

VI. CONCLUSIONES

VII. BIBLIOGRAFIA

VIII. ANEXOS