24/05/2016

HISTOKIMIA; SITOKIMIA;
MIKROKIMIA

Mikroteknik | BIP2220/BIP223
Semester Genap TA. 2015-2016 Fakultas
Biologi Unsoed

Metode Pewarnaan
Pewarnaan Umum Pewarnaan Khusus

Struktur jaringan Struktur jaringan

secara Umum tertentu

Membedakan inti Membedakan jaringan

dan sitoplasma satu dengan jaringan lain

Pewarnaan Dasar : Pewarnaan Khusus :

Haematoxylin -Eosin Histokimia
Immunohisto/sitokimia

Histo/Sitokimia
Histoteknik atau teknik histologi ilmu atau
seni mempersiapkan organ, jaringan atau
bagian jaringan untuk dapat diamati dan
ditelaah.
Sedangkan teknik histokimia teknik
untuk mendeteksi keberadaan komponen-
komponen yang terdapat dalam struktur
jaringan atu sel seperti protein, lemak,
karbohidrat, hormon ataupun enzim.

1
 24/05/2016

Histo/Sitokimia
Dasar pemikiran : masing-masing jaringan
memiliki sifat spesifik akan bereaksi dengan
pewarna tertentu
Histokimia dapat digunakan untuk membedakan :
Tipe sel : darah, sel epitel, sel pada organ/kelenjar
Jaringan : ikat, syaraf, tulang
Senyawa : lipid, karbohidrat, enzim
Mineral : kalsium

Beberapa Contoh Pewarnaan Khusus

Tipe Sel / Jaringan
Metode Pewarnaan Aplikasi
/ Senyawa
Jaringan ikat Van Gieson Trypan blue
Enzim Acid phosphatase Sumsum tulang
Alkaline phosphatase SGP
Senyawa Bests; Bauers Glikogen
Herxheimers; Sudan Black Lemak

Mineral - Alizarin Deposisi kalsium pada

jaringan tulang
Sel tertentu Giemza Sel darah
Orcein, Carmin & Feulgen Mitotik sel
Mallory-Heidenhain Azan- Sel alfa, beta dan D
Gomori pada pankreas

2
 24/05/2016

JARINGAN
Struktur Mikroskopik
Endapan Logam, Mineral (An Organik)
Senyawa Organik
Kimia Jaringan

Reaksi Kimia

Senyawa Berwarna

Diamati dengan Mikroskop

PRINSIP DASAR
Zat yg dianalisa tidak boleh berdifusi keluar
dr tempatnya semula,
Hasil reaksi tersebut harus tidak dapat larut
dan berwarna atau menghamburkan
elektron,
Metode yg dipakai harus spesifik untuk zat / golongan
kimia yg sedang diselidiki,
Prosedur tsb tidak boleh mengubah sifat atau
menghambat gugus-gugus reaktif.

3
 24/05/2016

Beberapa hal penting yang harus diperhatikan

dalam pelaksanaan histokimia
1. Pemilihan fiksatif
Sifat khusus yang akan diamati :
Supravital tidak perlu fiksatif
Apus darah metanol
Sumsum tulang Formol Zenker
General formalin (NBF 10%, Bouin)
2. Pemrosesan jaringan
Metode parafin
Metode beku OCT
3. Pengirisan
Mikrotom biasa
Cryostate
4. Mounting
Organik
Aqueous

MIKROKIMIA/SITOKIMIA
Mengetahui zat-zat penyusun bagian-bagian
sel dg pembubuhan kemikalia
Preparat segar
Dibubuhkan pelbagai larutan
kimia u/ mengetahui
ada/tdknya suatu zat tertentu
tiap kali dibuat (kalau ada : di bagian mana? yg
menyusun bagian-2 sel)
preparat baru

4
 24/05/2016

Lokasi beberapa macam Karbohidrat, Protein,

Lemak dalam Jaringan
Karbohidrat
Dlm jaringan hewan tertimbun glikogen (dlm otot &
hepar)
Timbunan glikogen dpt dilihat teknik histokimia
/teknik pewarnaan/metode :
1. Periodic Acid Schiff (PAS)
2. Best Carmine
3. Bauer
4. Lead tetra acetat
5. Iodine

DESKRIPSI HASIL
Karbohidrat pada Hewan
PAS
+ Merah Magenta/Ungu
- Tidak Merah/Tidak Ungu
Best Carmine Glikogen Granula Merah ; Inti Biru Cerah
Bauer Glikogen ; Mucin Ungu/Merah Magenta
+ Counter Stain Inti Biru - Hitam
Iodine Glikogen - Warna Spt Pohon Mahoni
Lead Tetra Acetat Seperti PAS ; + Kuat MERAH
MAGENTA/UNGU Terpulas setelah Oksidasi cukup lama 30
60 menit

5
 24/05/2016

DESKRIPSI HASIL
Karbohidrat pada Tumbuhan

PENUNJUKKAN AMYLUM
DI + JKJ (KALIUM JODIDA) terwarna BIRU HITAM ; UNGU
KECOKLATAN
LIGNIN DI + PHLOR OGLUCIN + H Cl terwarna MERAH ;
UNGU
CELLULOSE DI + JKJ + H2SO4 (75%) BENGKAK-BIRU;
DI + CHLOORZINKJOOD BIRU

Contoh pewarnaan histokimia

PENDETEKSIAN KARBOHIDRAT (MUKUS) PADA JARINGAN LUNAK
KARANG MASIF (Porites sp.) DI PERAIRAN KOTA BONTANG PROVINSI
KALIMANTAN TIMUR | Andy Dharmaputra Noor , dkk. (2015)

Fiksatif NBF 10% (24 jam) Bouin (48 jam)

Dekalsifikasi Asam lemah (Asam Asetat 10%); Asam kuat (HCl 10%) Prosedur
Pewarnaan jaringan khusus : Periodic Acid Schiff (PAS) deteksi
karbohidrat netral
1. Masukkan Larutan Schiff ke tempat penghangat
2. Deparafinasi dan Rehidrasi
3. Oksidasi dalam larutan Periodic Acid selama 10 - 30 menit
4. Cuci pada air mengalir dalam 3 menit
5. Rendam pada larutan Schiff selama 20 menit
6. Pindahkan pada air mengalir dan cuci selama 10 menit
7. Tambahkan counterstains sesuai selera (Hematoxilin-Eosin)
8. Dahidrasi, clearing dan mounting menggunakan bahan perekat (Entelen New; Canada
Balsam)

6
 24/05/2016

Contoh pewarnaan histokimia

PENDETEKSIAN KARBOHIDRAT (MUKUS) PADA JARINGAN LUNAK
KARANG MASIF (Porites sp.) DI PERAIRAN KOTA BONTANG PROVINSI
KALIMANTAN TIMUR | Andy Dharmaputra Noor , dkk. (2015)
Gambar : Fotomikrograf dinding polip
karang masif. (e) jaringan sel epitel pada
mesoglea. (a) Zooxanthellae pada lapisan
Gastroderma pada lapisan dinding polip
karang masif. (E) lapisan ektoderma, (G)
Lapisan Gastroderma, (M ) Mesoglea.

Terlihat reaksi dari pewarnaan PAS

mengandung karbohidrat netral, terlihat
reaksi dari larutan Schiff bereaksi dengan
Glikogen pada jaringan otot pada lapisan
mesoglea menghasilkan warna merah
magenta sampai keunguan.

Contoh pewarnaan histokimia

SEBARAN KARBOHIDRAT PADA KELENJAR LUDAH BIAWAK AIR
(Varanus salvator)| Idawati Nasution, dkk. (2014)

Prosedur Pewarnaan jaringan khusus : Alcian Blue (AB) pH 2,5 deteksi karbohidrat
asam
1. Jaringan dideparafinasi dan rehidrasi
2. Rendam dalam lar. Alcian blue (AB) pH 2,5 selama 25 - 30 menit
3. Amati di bawah mikroskop (Reaksi positif ditandai dg terbentuknya warna biru pada
jaringan)
4. Jaringan dicuci dg asam asetat 3% selama 5 menit (untuk menghilangkan sisa-sisa AB)
5. Cuci dg akuades selama 5 menit
6. Tambahkan counterstains dengan larutan Hematoxilin (pewarna inti)
7. Dahidrasi, clearing dan mounting menggunakan bahan perekat (Entelen
New; Canada Balsam)

Contoh pewarnaan histokimia

SEBARAN KARBOHIDRAT PADA KELENJAR LUDAH BIAWAK AIR
(Varanus salvator)| Idawati Nasution, dkk. (2014)

7
 24/05/2016

Prosedur Pewarnaan jaringan khusus : Periodic Acid Schiff (PAS)deteksi karbohidrat

netral
1. Jaringan dideparafinasi dan rehidrasi
2. Oksidasi jaringan dlm lar. Periodic Acid 0,5% selama 5 menit
3. Bilas dengan akuades
4. Jaringan dimasukkan ke dlm lar. Schiff reagent selama 15 menit
5. Cuci dg air sulfit selama 5 menit (reaksi positif ditandai terbentuknya warna magenta /
merah keung-unguan pada jaringan)
6. Bilas dengan akuades selama 5 menit
7. Tambahkan counterstains dengan larutan Hematoxilin (pewarna inti)
8. Dahidrasi, clearing dan mounting menggunakan bahan perekat (Entelen New; Canada
Balsam)

Contoh pewarnaan histokimia

SEBARAN KARBOHIDRAT PADA KELENJAR LUDAH BIAWAK AIR
(Varanus salvator)| Idawati Nasution, dkk. (2014)
Pewarnaan : Alcian Blue (AB) pH 2,5

Gambar : Sebaran karbohidrat asam pada ketiga kelenjar saliva biawak air. Kelenjar
lingualis (A dan B), Kelenjar sublingualis (C dan D), dan kelenjar mandibularis (E
dan F). Reaksi Positif warna Biru pada kelenjar

8
 24/05/2016

Contoh pewarnaan histokimia

SEBARAN KARBOHIDRAT PADA KELENJAR LUDAH BIAWAK AIR
(Varanus salvator)| Idawati Nasution, dkk. (2014)
Pewarnaan : Periodic Acid Schiff (PAS)

Gambar : Sebaran karbohidrat netral pada ketiga kelenjar saliva biawak air. Kelenjar
lingualis (A dan B), Kelenjar sublingualis (C dan D), dan kelenjar mandibularis (E
dan F). Reaksi Positif warna Magenta /merah keungu-unguan pada kelenjar

PROTEIN

KH, Protein & Lemak penyusun

SITOPLASMA tdk semua reaksi + dg
histokimiawi larut lebih dahulu
(PROTEIN) waktu melalui beberapa proses
oleh karena itu hanya beberapa
lokalisasinya dapat ditunjukkan dg metode
HISTOKIMIAWI

PROTEIN

9
 24/05/2016

Tidak semua protein dapat ditunjukkan dg HISTOKIMIA

tes BIOKIMIA rusak sebelumnya hanya bbrp
jenis PROTEIN saja yg bisa
ARGININ metode SAKAGUCHI OXIN irisan metode
BEKU Fiksastif Formalin/Alkohol
Formalin JINGGA, Kolagen, Keratin & Koloid dr
Thyroid bbrp hari tahan
THYROSIN reaksi MILLON (modifikasi BENSLEY &
GRESH) metode PARAFIN Fiksatif FORMALIN
JINGGA s/d MERAH BATA

PROTEIN
Tidak semua protein dapat ditunjukkan dg HISTOKIMIA
tes BIOKIMIA rusak sebelumnya hanya bbrp
jenis PROTEIN saja yg bisa
KERATIN
a. Dilihat KORNIFIKASI Oesophagus, Ventriculus
METODE IRISAN
b. KORNIFIKASI pada sel VAGINA PAP SMEAR
Apus Vagina
Metode ASCHER, TURNER & de BOER
pewarna MICHROME MF-4 JINGGA s/d KUNING ,
KOLAGEN BIRU

PROTEIN
Metode ASCHER, TURNER & de BOER pewarna
MICHROME MF-4 JINGGA s/d KUNING,
KOLAGEN BIRU
Metode PAPANICULAOU ceratinized cells MERAH;
non ceratinized cells BIRU HIJAU
Metode EDWARDS GURR & PAPANICULAOU u/
Apus Vagina u/ lihat keratin pada sel EPITEL
DINDING VAGINA

10
 24/05/2016

TRYPTOPHAN metode ROMIEU MERAH/

VIOLET
HYALIN metode PHLOXIN, Hematoxylin (FB. Mallory
HYALIN BIRU MERAH; HYALIN yang MATURE
ROSE / hampir tdk berwarna.
Immunohisto/Sitokimia
Imunohistokimia suatu metode kombinasi dari
anatomi, imunologi dan biokimia untuk mengidentifikasi
komponen jaringan yang memiliki ciri tertentu
dengan menggunakan interaksi antara antigen target
dan antibodi spesifik yang diberi label.

Imunohistokimia suatu cara pemeriksaan untuk

mengukur derajat imunitas atau kadar antibodi atau
antigen dalam sediaan jaringan.

Immunohisto/Sitokimia
Identifikasi antigen pada jaringan/sel tertentu menggunakan interaksi
antigen-antibodi dan menvisualisasikannya secara mikroskopis.
Membutuhkan jaringan dengan jumlah dan ketebalan yang bervariasi
tergantung dari tujuan pemeriksaan.
Bermanfaat untuk identifikasi, lokalisasi, dan karakterisasi suatu
antigen tertentu, serta menentukan diagnosis, therapi kanker.
Komponen dalam immunohisto/sitokimia
Antigen/epitop
Antibodi: primer dan sekunder
Serum
Sistem deteksi
Tracer/kromogen
Buffer

11
 24/05/2016

Antigen/epitop
Sisi spesifik pada jaringan yang dapat dikenali
oleh antibodi
Antibodi
Primer :
Antibody yang langsung berikatan dengan epitop
Memiliki konjugat/tanpa konjugat
Bila hanya mengenali epitop pada spesies tertentu
monoklonal
Bila dapat mengenali epitop pada beberapa spesies poliklonal
Sekunder
Berikatan dengan kompleks antigen-antibodi primer
Biasanya berlabel : HRP (horse redish peroxikase), biotin,
streptavidin, fluorescent

Serum
Digunakan untuk menghambat reaksi non-spesifik
Disarankan berasal dari spesies dari mana antibodi sekunder berasal
Dapat digunakan sebagai kontrol negatif
Sistem deteksi
Digunakan untuk mendeteksi ikatan kompleks antigen-antibodi
lengkap
Ada dua tipe: ABC/HRP dan ABC/AP
Tracer/kromogen
HRP: DAB (3,3-diamino benzidine)/coklat ; AEC (3 -amino-
9ethylcarbazole)/merah
AP: Fast blue/biru; NBT/BCIP (nitro blue tetrazolium/5 -bromo -4-
chloro-3-indol-phosphat)

12
 24/05/2016

Hubungan antar komponen pada

immunohisto/sitokimia

Pewarnaan Imunohistokimia

Terdapat dua metode pewarnaan imunohistokimia, yaitu

metode langsung (direct) dan metode tidak langsung (indirect).
1. Metode langsung hanya menggunakan satu antibodi, yaitu
antibodi primer yang telah dilabel.
2. Metode tidak langsung menggunakan dua antibodi, yaitu
antibodi primer tanpa dilabel dan antibodi sekunder yang telah
dilabel.
- avidin-biotin methode,
- peroxidase methode 100-1000 kali lebih sensitif dibandingkan metode
lainnya
- tyramin amplification methode

13
 24/05/2016

Pewarnaan Imunohistokimia

Prinsip pewarnaan imunohistokimia metode peroksidase, yaitu

antigen yang ada pada jaringan diikatkan dengan antibodi
primer yang spesifik. Lalu antibodi primer yang terikat
antigen kemudian diikatkan pula dengan antibodi sekunder
(antiantibodi primer) yang telah dilabel enzim peroksidase.
Penambahan substrat yang berisi kromogen dan H2O2 akan
memunculkan endapan berwarna coklat dan H2O. Endapan
coklat hasil penguraian substrat (kromogen dan H2O2)
oleh enzim peroksidase.
Warna coklat yang muncul menandakan reaksi positif (+),
artinya di dalam jaringan terdapat antigen. Apabila di
jaringan tersebut tidak terdapat antigen, maka tidak akan
muncul warna coklat.

Beberapa contoh pewarnaan immunohistokimia

AMH -immunihistokimia- AMH -immunihistokimia-

kontrol negatif positif
(Wijayanti, 2003)

14
 24/05/2016

Beberapa contoh pewarnaan immunohistokimia

Sangkot Sayuti Nasution, dkk (2015) :
DETEKSI IMUNOHISTOKIMIA ANTIGEN Coxiella burnetii SEBAGAI
PENYEBAB Q FEVER PADA SAPI
Menggunakan kit Imunohistokimia (LSAB Kit DAKO)
Pewarnaan Imunohistokimia :
1. Irisan jaringan (5 m)deparafinasi rehidrasi
2. Jaringan dipanaskan dalam bufer sitrat (menggunakan microwave) 5 menit
3. Cuci dengan phospate beffered saline tween 20 (PBST) 3 X 5 menit
4. Blocking endogenouse peroxidase menggunakan H2O2 3% selama 30 menit
5. Cuci dengan phospate beffered saline tween 20 (PBST) 3 X 5 menit
6. Blocking ikatan nonspesifik tetesi jaringan dg fetal bovine serum (FBS)
1% selama 30 menit
7. Cuci dengan phospate beffered saline tween 20 (PBST) 3 X 5 menit
8. Tetesi antibodi primer (antibodi poliklonal, rabbit anti-Coxiella burnetii
FKH-IPB) inkubasi selama 1 malam pada suhu 4 oC

Beberapa contoh pewarnaan immunohistokimia

Sangkot Sayuti Nasution, dkk (2015) :
DETEKSI IMUNOHISTOKIMIA ANTIGEN Coxiella burnetii SEBAGAI
PENYEBAB Q FEVER PADA SAPI
Menggunakan kit Imunohistokimia (LSAB Kit DAKO)
Pewarnaan Imunohistokimia :
9. Cuci dengan phospate beffered saline tween 20 (PBST) 3 X 5 menit
10. Jaringan ditetesi antibodi sekunder (biotinilated ling universal) selama 30 menit setelah
pencucian.
11. Cuci dengan phospate beffered saline tween 20 (PBST) 3 X 5 menit
12. Jaringan tetesi streptavidin HRP selama 30 menit
13. Cuci dengan phospate beffered saline tween 20 (PBST) 3 X 5 menit
14. Tetesi Chromogen 3,3-diaminobenzidine (DAB) selama 15 detik
15. Rendam pada akuades, rendam/tetesi counterstain menggunakan Mayers hematoksilin
selama 25 detik
16. Jaringan kemudian dicuci dengan akuades dehidrasi (alkohol bertingkat)
clearing (xilol) mounting
17. Pengamatan

15
 24/05/2016

Beberapa contoh pewarnaan immunohistokimia

Gambar : Hasil pewarnaan imunohistokimia. Warna coklat menunjukkan hasil

imunoreaktif pada sel-sel makrofag. A= Limpa, B= Paruparu, C= Hati. 400x .
Menggunakan kit Imunohistokimia (LSAB Kit DAKO)

Sangkot Sayuti Nasution, dkk (2015)

DETEKSI IMUNOHISTOKIMIA ANTIGEN Coxiella burnetii SEBAGAI
PENYEBAB Q FEVER PADA SAPI

Beberapa contoh pewarnaan immunohistokimia

Pengecatan preparat Imunohistokimia (IHC) p53 pada penelitian laboratorium
CCRC (Cancer Chemoprevention Research Center) Fakultas Farmasi UGM

Prosedur Kerja :
1. Lakukan deparafinasi preparat (blok parafin) dengan xylene sebanyak 3 kali masing-
masing 3 menit.
2. Rehidrasi preparat dengan menggunakan etanol 100%, etanol 95 % dan etanol 70% masing-
masing selama 2 menit, 2 menit, 1 menit dan terakhir dengan air selama 1 menit.
3. Rendam dalam peroxidase blocking solution pada suhu kamar selama 10 menit.
4. Inkubasi preparat dalam prediluted blocking serum 25C selama 10 menit.
5. Rendam preparat di dalam antibodi monoklonal anti-p53 25C selama 10 menit.
6. Cuci preparat dengan Phospate Buffer Saline (PBS) selama 5 menit.

16
 24/05/2016

Beberapa contoh pewarnaan immunohistokimia

Pengecatan preparat Imunohistokimia (IHC) p53 pada penelitian laboratorium
CCRC (Cancer Chemoprevention Research Center) Fakultas Farmasi UGM

Prosedur Kerja :
7. Inkubasi preparat dengan antibodi sekunder (conjugated to horse radish peroxidase) 25C
selama 10 menit.
8. Cuci preparat dengan PBS selama 5 menit.
9. Inkubasi preparat dengan peroksidase 25C selama 10 menit.
10. Cuci preparat dengan PBS selama 5 menit.
11. Inkubasi preparat dengan kromogen DAB (Diaminobenzinidine) 25C selama 10 menit.
12. Inkubasi preparat dengan Hematoxylin-Eosin selama 3 menit.
13. Cuci preparat dengan air mengalir
14. Bersihkan preparat dan tetesi dengan mounting media, tutup preparat dengan coverslip
15. Amati ekspresi p53 (warna coklat) pada sel menggunakan mikroskop cahaya dengan
perbesaran 1000 x.

Beberapa contoh pewarnaan immunohistokimia

Pengecatan preparat Imunohistokimia (IHC) p53 pada penelitian laboratorium
CCRC (Cancer Chemoprevention Research Center) Fakultas Farmasi UGM

Gambar : Ekstrak etanolik kulit Citrus

reticulata 750 mg/kg BB menginduksi
ekspresi p53 pada sel epitel kelenjar
payudara tikus yang diinduksi DMBA.
Pengecatan dengan imunohistokimia
(indirect method ) menunjukkan sel yang
mengekspresikan protein p53. Sel yang
mengekspresikan p53 ditunjukkan
dengan sel yang berwarna coklat
(mikroskop perbesaran 1000x )
Preparat diligasikan antibodi monoklonal p53, antibodi sekunder terlabel peroksidase,
kemudian dikarakterisasi dengan double staining menggunakan DAB dan hematoxylin-
eosin.

17
 24/05/2016

Beberapa contoh pewarnaan immunohistokimia

SSEA-1 immunohistokimia pada fetus Tammar wallaby

Beberapa contoh pewarnaan immunohistokimia

Immunohistokimia pada colon carcinoma dengan antibodi

anti-cytokeratin dan p53 (Dako)

18
 24/05/2016

Beberapa hal penting yang harus diperhatikan dalam

pelaksanaan immunohistokimia
1. Pemilihan fiksatif
Paraformaldehyde 4 %
Bouin
Fiksatif khusus
2. Pemrosesan jaringan
Metode parafin
Metode beku
3. Pengirisan
Mikrotom biasa
Cryosrate fluorescent; jaringan tertentu
4. Penggunaan/pelapisan gelas objek
Gelas objek sebaiknya menggunakan pelapis: Gelatin kering
(minimal), superfrost, polylisin

Beberapa hal penting yang harus diperhatikan dalam

pelaksanaan immunohistokimia
4. Mounting
Organik HRP
Aqueous AP
5. Pada setiap kali pelaksanaan immuno-histo/ sitokimia harus selalu
tersedia kontrol positif dan kontrol negatif.
Kontrol positif digunakan untuk mengetahui apakah antibodi yang
digunakan bekerja dengan baik atau tidak
Kontrol negatif digunakan untuk mengetahui spesifisitas reaksi warna yang
muncul.
6. Pada beberapa antibodi memerlukan tahapan antigen retrieval/
antigen unmasking
Dilakukan dalam microwave atau menggunakan enzim tertentu trypsin,
pronase, proteinase K
7. Pada setiap tahap pencucian perlu dilakukan agitasi

19
24/05/2016

20