Tesis Gino Bacterias

EVALUACIN DEL MTODO DILUCIN NEUTRALIZACIN APLICADO A UN
DESINFECTANTE SEGN LA NORMA TCNICA

COLOMBIANA 5473 DE 2007
JUAN CARLOS MARN DIAZ

NATALIA FERNANDA NAVARRO PEA
NATALIA SANTOS ARVALO
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar el titulo de
MICROBIOLOGO INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
BOGOT, D.C.
2008
NOTA DE ADVERTENCIA
Artculo 23 de la Resolucin N 13 de Julio de 1946

La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus
trabajos de tesis. Solo velar por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral
catlica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes
bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia.

NATHALIA FERNANDA NAVARRO PEA
APROBADO
__________________________________ _______________________________
Libardo Hernndez, Qumico Farmacutico Janeth del Carmen Arias, Bacteriloga
Director Asesor
Cindy Fernandez, Microbiloga Industrial Joel Guarn, Qumico Farmacutico

Jurado Jurado

NATHALIA FERNANDA NAVARRO PEA
APROBADO
_______________________ _______________________
Dra. Angela Umaa, MPhil. Janeth Arias, Bacteriloga.
Decano Acadmico Director de Carrera
DEDICATORIA
Dedico este trabajo a la razn de mi vida, Marianita, mi hija; a mis padres por su apoyo
incondicional y a Dios por las grandes oportunidades que me ha puesto en el camino.
Nathalia Fernanda Navarro.
A mis padres por su esfuerzo, dedicacin y por el inmenso amor que cada da estn
dispuestos a ofrecerme. A William por ensearme a amar sin condicin y por impulsarme a
ser cada vez mejor. Y sobre todo, a Dios, por permitirme crecer y lograr mis metas, por
ayudarme a ser lo que soy en este momento.
Natalia Santos Arvalo.
Dedico este trabajo al seor Lobo y a mi negra por hacer posible da a da la realizacin de
mis metas, a Karen por su apoyo, a Adriana, Martha y Marcela por su valiosa amistad y
especialmente a Dorita quien estara muy orgullosa de mi.
Juan Carlos Marn Daz

AGRADECIMIENTOS
Agradecemos al Laboratorio VICAR S.A. por hacer posible la realizacin de este proyecto,
especialmente al Profesor Libardo Hernndez por su asesora y su ayuda y a las
microbiologas Nubia Castro y Viviana Pea por su paciencia, inters y apoyo.
Agradecemos a nuestra Profesora Janeth Arias, por su compaa y constantes palabras de

aliento.
vi

TABLA DE CONTENIDO
Pag.
1. INTRODUCCION 3
2. MARCO TEORICO
2.1. El proceso de desinfeccin 5
2.2. Caractersticas de un desinfectante ideal 6
2.3. Modo de accin de los desinfectantes 7
2.4. Factores que influyen en la accin qumica de los desinfectantes 7
2.4.1. Limpieza adecuada 7
2.4.2. Carga orgnica 7
2.4.3. Tipo y porcentaje de microorganismo 7
2.4.4. Tiempo y temperatura 7
2.4.5. Ph 7
2.4.6. Nivel de dureza del agua 8
2.5. Importancia de la evaluacin de desinfectantes
2.6. Evaluaciones de neutralizacin como experimentos de
control para los test de eficacia antimicrobiana. 9
2.6.1 Mtodos De Evaluacin De Desinfectantes 9
2.6.2 Neutralizacin por inhibicin qumica 9
2.6.3. Neutralizacin por dilucin 10
2.7. Factores que afectan la neutralizacin de los antimicrobianos 10
2.7.1. Eficacia del Neutralizante 10
2.7.2. Toxicidad del Neutralizante 11
2.7.3. Diseos Para Evaluacin De Neutralizantes 11
2.7.3.1. Recuperacin en medio slido 11
2.7.3.2. Recuperacin en medio lquido 11
2.7.3.3. Recuperacin por Filtracin por Membrana 11
2.8. Normativa mundial sobre evaluacion de desinfectantes 12
2.8.1. Normas AFNOR 12
2.8.2. Normativa Europea 13
2.8.3. Normativa estadounidense 14
2.8.4. Normativa Colombiana. 15
3. JUSTIFICACIN 16
4. OBJETIVOS. 17
5. MATERIALES Y MTODOS. 18
5.1 Diseo de la investigacin 18
5.1.1 Poblacin de estudio y muestra 18
5.1.2 Variables del estudio 18
5.2. Mtodos 18
5.2.1. Materiales 18
5.2.2. Medios de cultivo 18
5.2.3. Reactivos 19
5.2.4. Equipos 19
5.3. Metodologa 19
5.3.1. Establecimiento de las condiciones experimentales para
el mtodo de ensayo dilucin-neutralizacin 19
5.3.2. Implementacin del mtodo de ensayo dilucin-neutralizacin
segn la norma tcnica colombiana 5473 del 2007 21
vii

5.3.2.3. Determinacin de las concentraciones bactericidas 21

5.3.2.4. Verificacin de la ausencia de cualquier efecto letal en las
condiciones del ensayo (parmetro A de la condicin experimental) 22
5.3.2.5. Verificacin de la ausencia de toxicidad del neutralizante
(parmetro B de control del neutralizante) 22
5.3.2.6. Parmetro de estandarizacin del mtodo 22
5.3.2.7. Incubacin y recuento de la mezcla de ensayo y de las mezclas de control y
estandarizacin 23
5.3.3. Verificacin de la metodologa 37
5.4. Recoleccin de la informacin 37
5.5. Anlisis de informacin 38
6. RESULTADOS Y DISCUSIN
6.1. Establecimiento de las condiciones experimentales para el
mtodo de ensayo dilucin-neutralizacin. 41
6.2. Implementacin y Verificacin del mtodo de ensayo
dilucin-neutralizacin segn la norma tcnica colombiana 5473 del 2007. 41
6.2.1. Preparacin de la Suspensin de Ensayo y Validacin 41
6.2.2. Evaluacin de las condiciones experimentales - Control A. 43
6.2.3. Verificacin de la ausencia de toxicidad del neutralizante Control B 44
6.2.4. Validacin del mtodo Dilucin Neutralizacin Control C 45
6.2.5. Ensayo NA Mtodo Dilucin Neutralizacin 47
7. CONCLUSIONES 51
8. RECOMENDACIONES 52
9. REFERENCIAS 53
10. ANEXOS 55
viii
RESUMEN
En el mbito mdico, la desinfeccin constituye un procedimiento esencial para enfrentar

la cadena de transmisin de infecciones. El objetivo de este estudio fue evaluar el mtodo de
dilucin neutralizacin propuesto en la Norma Tcnica Colombiana 5473 de 2007, mediante
la utilizacin de un desinfectante en gel a base de alcohol. El ensayo se efectu utilizando
Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Staphylococcus aureus ATCC 6538 y Enterococcus
hirae ATCC 10541, como microorganismos de ensayo. Las temperaturas bajo las cuales se
realiz el estudio fueron 201C como temperatura obligatoria y 361C y se emplearon
cuatro tiempos de contacto entre el desinfectante y los microorganismos evaluados (0,2,5,10
minutos). El mtodo fue realizado bajo condiciones limpias (0.3 g/l de albumina de suero
bovino) y sucias (3g/l de albumina de suero bovino y 3g/l de eritrocitos de oveja). La
implementacin del mtodo arroj resultados precisos en cada una de las seis repeticiones
realizadas en el ensayo. Los resultados obtenidos demostraron una reduccin logartmica
superior a cinco, evidenciando la actividad bactericida ejercida por el desinfectante frente a
los microorganismos control. El establecimiento de las condiciones experimentales y de la
metodologa demostr no incidir negativamente en el crecimiento de cada una de las cepas.
Igualmente, el neutralizante utilizado no inhibi el desarrollo de los organismos de ensayo.
El mtodo fue verificado mediante el cumplimiento de los lmites bsicos establecidos por la
norma. Los resultados sugieren que el mtodo evaluado mediante la implementacin del
protocolo establecido en la Norma Tcnica Colombiana 5473 de 2007, permite evaluar la
eficacia de un desinfectante bajo condiciones experimentales escogidas y controladas.
ABSTRACT
In the medical area, disinfection constitutes an essential procedure in order to face the chain
of transition of infections. The aim of this study was to evaluate the dilution-neutralization
method proposed in the Colombian Technical Norm 5473/07, by using a gel alcohol-based
disinfectant. This study was made using Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442,
Staphylococcus aureus ATCC 6538 and Enterococcus hirae ATCC 10541 taken as essay
microorganisms. The study was realized to 201C as obligatory temperature and
additionally to 361C. Four times of contact between microorganism and disinfectant were
evaluated (0, 2, 5 and 10 minutes). The essay was realized both under clean conditions (0.3
g/l of albumen of bovine serum), and dirty conditions (3 g/l of albumen of bovine serum and
3g/l of sheep erythrocytes). The implementation of this method got precise results in each of
six repetitions realized during the essay. The obtained results demonstrated a logarithmic
reduction up to five, demonstrating the bactericidal activity exercised by the disinfectant to
face the control microorganisms. The established experimental conditions and methodology
demonstrated not to affect negatively the growth of each one of microorganisms. Similarly,
the used neutralizant did not disable the development of the microorganisms of the essay.
The method was checked by means of the fulfillment of the basic limits established by the
norm. The obtained results suggest that the method evaluated by means of implementation
of the protocol established in the Colombian Technical Norm 5473/07, allows evaluating the
efficiency of a disinfectant under selected and controlled experimental conditions.
1. INTRODUCCIN
El control microbiano en el rea de la salud, constituye actualmente, uno de los pilares para
la implementacin de procesos que garanticen la seguridad a pacientes y personal que
labora en el rea. Por ello, la limpieza y la desinfeccin son el mecanismo principal al cual se
debe acudir si se quiere mantener un ambiente libre de microorganismos que pueden llegar
a alterar la salud de pacientes y personal mdico.
El proceso de desinfeccin juega un papel importante en la disminucin de la carga

microbiana presente tanto en el instrumental, como en las instalaciones de los centros
mdicos.
Los mecanismos de desinfeccin empleados, deben asegurar la reduccin de la carga

microbiana presente en equipos o ambientes hasta niveles aceptables. Si bien la
desinfeccin no garantiza una total destruccin de los microorganismos, permite ejercer un
control sobre las poblaciones microbianas presentes, impidiendo que estas puedan poner en
peligro un proceso productivo.
En el campo de la salud, as como en la industria alimenticia, cosmtica y farmacutica, la

desinfeccin permite elaborar productos inocuos, destinados al beneficio del ser humano.
Por esta razn, es necesario asegurar la ausencia de microorganismos viables tanto en el
sector salud como en cualquiera de las industrias anteriormente mencionadas. Este es por
ende el objetivo de todo proceso de desinfeccin.
Para la implementacin de un plan de desinfeccin, es necesario realizar una valoracin

preliminar acerca del tipo de desinfectante a emplear, de acuerdo con la naturaleza del
objeto que se desea poner en contacto con la sustancia desinfectante. De igual forma, es
necesario determinar el comportamiento del desinfectante ante diversas situaciones
ambientales que pueden alterar su efectividad en determinado proceso. Dentro de estas
condiciones, se puede evaluar el efecto de la temperatura, el tiempo de contacto entre el
desinfectante y la flora microbiana presente, as como la presencia de sustancias
interferentes.
Las determinaciones anteriormente nombradas, permiten conocer el espectro de accin del

desinfectante frente a cualquier tipo de carga microbiana, lo cual se puede lograr conociendo
la concentracin bactericida del desinfectante empleado.
Considerando la importancia de determinar la concentracin bactericida de un desinfectante,

este trabajo tiene como finalidad evaluar experimentalmente el protocolo descrito por la
Norma Tcnica Colombiana 5473. De esta manera, este proyecto est orientado a
establecer, implementar y verificar los procedimientos documentados en esta norma, para
servir como base a nuevos estudios realizados por entidades, que quieran evaluar la
capacidad bactericida de cualquier desinfectante que deseen emplear en sus procedimientos
de rutina.
Igualmente, este trabajo pretende suministrar informacin necesaria y contundente, que

sirva como base para asegurar, que cualquier empresa que desee implementar los mtodos
evaluados en este proyecto, sea capaz de determinar cul tipo de desinfectante utilizar para
controlar la contaminacin presente en un proceso y asegurar la obtencin de productos
seguros que beneficien a la comunidad.
As mismo, se espera que este trabajo demuestre la efectividad de los mtodos reportados
por la Norma Tcnica Colombiana 5473, y permita asegurar la aplicacin de estos
procedimientos de evaluacin en cualquier tipo de desinfectante utilizado en el sector salud,
objetivo de los ensayos reportados por la norma.
Finalmente, el deseo de esta investigacin es demostrar la importancia del proceso de

desinfeccin en el mbito mdico, y la efectividad de los mtodos empleados para la
determinacin de la concentracin bactericida de cualquier desinfectante qumico.
2. MARCO TERICO
2.1. EL PROCESO DE DESINFECCION.

La Desinfeccin pretende eliminar o reducir el nivel de microorganismo vegetativos y otros
organismos indeseables de equipos medico y superficies. El propsito es minimizar la
infeccin o la colonizacin bacteriana y convertir los instrumentos en materiales seguros
para su uso en pacientes. Esto puede se logrado gracias a la combinacin de la limpieza,
desinfeccin y la esterilizacin. Los requerimientos para una desinfeccin exitosa incluyen:
El monitoreo de los sistemas de control,

Equipos aptos para este propsito: Calibrados, monitoreados y validados.
Personal apropiadamente supervisado y entrenado. (Hoh, 2005).
El mtodo usado para la desinfeccin debe tambin tener en cuenta:
La contaminacin presente,
La tolerancia de los objetos al calor, la presin, la humedad y los qumicos,
La disponibilidad del equipo del procesamientos,
Riesgos asociados con el mtodo escogido. (Hoh, 2005).
La desinfeccin efectiva requiere control y monitoreo de todas la etapas del proceso. Los
procesos de limpieza, desinfeccin y esterilizacin tienen como propsito remover o destruir
microorganismos. La seleccin del mtodo de limpieza y desinfeccin depende del riesgo de
infeccin asociado con el uso del objeto a desinfectar. Esto tambin depende de la
disponibilidad de mtodo, del tiempo necesario para el proceso y de la naturaleza del objeto,
por ejemplo su tolerancia al calor, a la humedad y a los agente qumicos. El costo y la
seguridad tambin deben ser considerados. (Steer, 2002).
Los desinfectantes son agentes que matan microorganismos pero no necesariamente sus
esporas y no deben aplicarse sobre tejidos sino sobre objetos inanimados como mesas,
pisos, utensilios; son ejemplo de estos el cloro, hipoclorito, compuestos clorados, soda,
sulfato de cobre, compuestos de amonio cuaternario (Jaime, 2002).
Los antispticos son agentes microbicidas que pueden aplicarse sobre la piel y mucosas
pero no pueden ser utilizados internamente, son ejemplos de ellos: los agentes mercuriales,
nitrato de plata, solucin de yodo, alcoholes, detergentes (Jaime, 2002)
2.2 CARACTERSTICAS DE UN DESINFECTANTE IDEAL.
- Actividad antimicrobiana. Debe ser capaz de matar a los microorganismos. A baja

concentracin debe tener un amplio espectro de actividad antimicrobiana inactiva
bacterias (Gram positivas, Gram negativas, micobacterias), virus, hongos,
esporas,
- Solubilidad. Debe ser soluble en agua u otros solventes, en la proporcin necesaria,
para su uso efectivo.
- Estabilidad. Durante el almacenamiento los cambios en sus propiedades deben ser
mnimos y no deben causar una prdida significativa de su accin germicida.
- No debe ser txico para el hombre ni los animales.
- Homogeneidad. La preparacin debe ser uniforme en composicin, de manera que
los ingredientes activos estn presentes en cada aplicacin.
- No se debe combinar con materiales orgnicos extraos.
- Debe ser txico para los microorganismos a la temperatura ambiente, para que al
usar el agente no sea necesario elevar la temperatura ms all de la que se
encuentra normalmente en el lugar donde se va a utilizar.
- Capacidad para penetrar. Esto no es necesario si se requiere slo una accin
superficial.
- No debe ser corrosivo, ni teir el material que se trate.
- Capacidad desodorante. Desodorizar mientras desinfecta es una propiedad
deseable. Idealmente el desinfectante debe ser inodoro o tener un olor agradable.
- Capacidad detergente. Un desinfectante que sea a la vez detergente cumple 2
objetivos: limpieza y desinfeccin: la accin limpiadora mejora la efectividad del
desinfectante (www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/tema14.pdf -)
- Tensin superficial baja
- Con efecto residual
- Econmico (buena relacin coste/eficacia)
- No daino para el medio ambiente
- No inducir ni desarrollar resistencia
(www.academia.cat/societats/famcl/libre/higiene/332.pdf)
No existe en el mercado un desinfectante que cumpla todas estas caractersticas. Se escoge

uno u otro en funcin del tipo de microorganismos que queremos eliminar, del material sobre
el que se apliquen, la temperatura y el pH de trabajo, el tiempo de actuacin, la presencia de
materia orgnica sobre el material a desinfectar.
(www.academia.cat/societats/farmcl/llibre/higiene/332.pdf)
2.3 MODO DE ACCIN DE LOS DESINFECTANTES

Los desinfectantes qumicos actan sobre las clulas microbianas de diferentes maneras, de
acuerdo con el grupo qumico al cual pertenecen y a las caractersticas fisicoqumicas de
cada uno de ellos. Los principales mecanismos de accin son los siguientes:
Dao de la pared celular.
Alteracin de la permeabilidad de la membrana y la pared celular.
Alteracin de las molculas de protenas y cidos nucleicos.
Inhibicin de la sntesis de cidos nucleicos.
Inhibicin enzimtica (www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/tema14.pdf -)
2.4 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ACCIN QUMICA DE LOS DESINFECTANTES

2.4.1. Limpieza adecuada: Se debe remover la suciedad antes en cada artculo para lograr
una desinfeccin de manera eficaz. (Ninemeier, 2000).
2.4.2. Carga orgnica: La actividad desinfectante puede reducirse debido a la restriccin
que representan las fuertes cargas orgnicas en los ingredientes activos del desinfectante.
Lo recomendable es que un desinfectante haya sido probado con una carga orgnica del
5%. (Ninemeier, 2000).
2.4.3. Tipo y porcentaje de microorganismo: Algunos microorganismos son mas
resistentes a desinfectantes lquidos que otros como por ejemplo el bacilo de la tuberculosis.
(Ninemeier, 2000).
2.6.4. Tiempo y temperatura: El tiempo indicado para destruir a los microorganismos debe
especificarse en la etiqueta de los desinfectantes. Este es el tiempo durante el cual el
desinfectante debe permanecer en contacto con el microorganismo para eliminarlo.
(Ninemeier, 2000).
2.4.5. pH: Los desinfectantes se formulan dentro de un amplio rango de valores de pH para
que sean mas efectivos. Algunos desinfectantes actan mejor con un pH alcalino mayor que
7 mientras que otros lo hacen en condiciones acidas menor que 7. (Ninemeier, 2000).
2.4.6. Nivel de dureza del agua: los minerales como calcio y magnesio tambin pueden
afectar la eficacia de un desinfectante interfiriendo con los ingredientes activos de la misma.
(Ninemeier, 2000).
Son muchos los desinfectantes qumicos que se utilizan para controlar los agentes
infecciosos. Existen en el mercado una gran variedad de marcas y fabricantes, pero en
general los desinfectantes qumicos pertenecen a alguna de las siguientes categoras:
cidos o lcalis
Clorados
Glutaraldehdo
Mercuriales
Cuaternarios
Alcoholes
Formaldehdo
Yodados
Fenoles .(www.academia.cat/societats/farmcl/llibre/higiene/332.pdf)
Cuando se deba efectuar una desinfeccin utilizando desinfectantes qumicos, deber

tenerse en cuenta que la resistencia relativa de los agentes a los desinfectantes depende de
diversos factores entre los cuales se citan los siguientes:
El tiempo de contacto.
La concentracin.
La presencia de material orgnico y suciedad.
La temperatura.
La humedad.
El tipo y nmero de microorganismos.
La condicin y naturaleza de las superficies a descontaminar.
Los errores humanos.
Dependiendo de cmo se manipulen los factores mencionados, el xito logrado con los
desinfectantes qumicos variar desde una inactivacin mnima del microorganismo a tratar,
hasta una condicin de esterilidad.
(www.academia.cat/societats/farmcl/llibre/higiene/332.pdf).
2.5 IMPORTANCIA DE LA EVALUACIN DE DESINFECTANTES.
La poltica de adquisicin y uso apropiado de desinfectantes es un elemento importante en la

lucha contra las infecciones hospitalarias ya que, a causa del aumento de procedimientos de
diagnstico y teraputicos, aumentan tambin las oportunidades de introducir grmenes en
cavidades corporales de las que habitualmente estn ausentes. Existen mtodos fsicos y
fsico - qumicos capaces de lograr una esterilizacin completa pero no siempre pueden ser
utilizados en los dispositivos electrnicos u pticos actuales, de alto costo y con gran presin
de uso. Por lo tanto, la desinfeccin qumica (los desinfectantes) tiene un importante papel
en el tratamiento del medio ambiente sanitario (Tabares, 2002).
2.6. EVALUACIONES DE NEUTRALIZACIN COMO EXPERIMENTOS DE CONTROL

PARA LOS TEST DE EFICACIA ANTIMICROBIANA.
Un test biocida mide la eficacia de un agente antimicrobial a partir del crecimiento aparente
en el numero de microorganismos viable. El objetivo principal de un ensayo de eficacia
antimicrobial es la determinacin exacta de las clulas sobrevivientes en relacin con el
tiempo. Este requiere una neutralizacin efectiva del agente biocida en tiempos de muestreo
especficos. Un test biocida cuidadosamente diseado mide la eliminacin de
microorganismos a partir del numero de organismos capaces de crecer despus de la
exposicin al agente antimicrobial. Para esto es necesario demostrar la adecuada
neutralizacin del agente biocida para establecer la compatibilidad de los datos obtenidos
(Ascenzi, 1996).
2.6.1 Mtodos De Evaluacin De Desinfectantes:

Tres mtodos han sido recientemente publicados detallando protocolos de evaluacin de los
neutralizantes:
2.6.2 Neutralizacin por inhibicin qumica: Muchos biocidas pueden ser qumicamente
inactivados. Varios neutralizantes y medios de cultivo de dilucin han sido formulados para
este fin. Dentro de los ms conocidos se encuentra el caldo Letheen y Thioglicolato para
inactivar el desinfectante. La eficacia de los neutralizante fue originalmente demostrada con
Staphylococcus aureus y posteriormente con una variedad de microorganismos. El caldo
Letheen es efectivo en la recuperacin de bacterias expuestas a compuestos de amonio
cuaternario y biguanidas. El medio Thioglicolato es efectivo contra agentes mercuriales. Sin
embargo la inactivacin qumica de biocidas puede ser por si misma para algunas de las
bacterias de inters. A pesar de la toxicidad de los neutralizantes, su uso puede ser
conveniente debido a que los neutralizantes son de accin rpida (Ascenzi, 1996).
2.6.3. Neutralizacin por dilucin: La concentracin de un desinfectante ejerce un amplio

efecto en su potencia. La relacin entre la concentracin y el efecto antimicrobial difiere
entre los agentes biocidas pero es relativamente constante para un biocida particular. Esta
relacin es exponencial en la naturaleza (Ascenzi, 1996)
2.6.4 Neutralizacin por filtracin: La dilucin de un biocida por filtracin es otro medio
para neutralizar una solucin desinfectante. Este procedimiento se basa en la filtracin para
separar los microorganismos en suspensin de la solucin desinfectante. La membrana es
luego removida, y ubicada en la superficie de un agar para luego ser incubada. Los
nutrientes pasan a travs de la membrana, y se puede posteriormente apreciar el
crecimiento de colonias en la superficie de la membrana permitiendo la cuantificacin de los
microorganismos sobrevivientes. (Ascenzi, 1996).
La inhibicin del crecimiento puede ocurrir debido a la adherencia del persevante residual a
la membrana. La filtracin a travs de materiales como el difloruro de polivinilo ayuda a
disminuir esta adherencia. Adicionalmente, el preservante puede ser diluido o desprendido
del filtro mediante enjuague con fluidos como peptona al 0.1%. La filtracin por si sola no
puede ser asumida como efectiva para la neutralizacin. La recuperacin eficaz de
microorganismos sobrevivientes por este procedimiento requiere una demostracin de la
eficacia de la neutralizacin mediante uno o varios ensayos. (Ascenzi, 1996).
2.7. FACTORES QUE AFECTAN LA NEUTRALIZACIN DE LOS ANTIMICROBIANOS

Existen cuatro criterios que deben ser tenidos en cuenta en el diseo de un estudio de
neutralizacin:
1. El neutralizante debe inhibir efectivamente la accin de la solucin biocida.
2. El neutralizante no debe ser por si mismo toxico para los microorganismos de ensayo.
3. El neutralizante y el agente activo no se deben combinar para formar un compuesto
toxico.
4. Estos criterios deben ser demostrados bajo condiciones similares a las condiciones
normales para el empleo del desinfectante. (Ascenzi, 1996).
Estos criterios pueden ser considerados por los siguientes factores:
2.7.1. Eficacia del Neutralizante: La eficacia del neutralizante usado en los experimentos
de evaluacin de bactericidas puede variar tanto con el organismo de estudio como con el
biocida. Adems, la sensibilidad del organismo al biocida y la concentracin del mismo
pueden tener un efecto importante en la eficacia del tratamiento de neutralizacin. Es
10
importante comparar la recuperacin de los microorganismos del neutralizador en presencia

y ausencia del biocida. Este agente biocida. (Ascenzi, 1996).
2.7.2. Toxicidad del Neutralizante: Diversos inhibidores qumicos de antimicrobianos son
txicos por s mismos. Este factor puede ser estimado como una comparacin en la
recuperacin entre dos poblaciones una expuesta al bactericida y otra respuesta a buffer
fosfato. Los resultados finales deben mostrar microorganismos sobrevivientes en cantidades
similares. (Ascenzi, 1996).
2.7.3. Diseos Para Evaluacin De Neutralizantes
2.7.3.1. Recuperacin en medio slido: Los ensayos de suspensin para evaluar la
eficacia antimicrobial usualmente cuantifican microorganismos sobrevivientes en medio
slido. Los organismos de ensayo son fsicamente suspendidos en la solucin de ensayo, y
se toman alcuotas en intervalos de tiempo para determinar el nmero de microorganismos
sobrevivientes sobre placas de agar. El procedimiento general para estos ensayos involucra
la preparacin de una suspensin del organismo de ensayo, usualmente a una
6
concentracin de 10 UFC/ml. Las muestras son luego diluidas en un neutralizante y en un
caldo de dilucin. Estos pasos incluyen la neutralizacin del biocida, la dilucin de los
microorganismos sobrevivientes a niveles contables y la siembra en placas de agar para su
recuperacin. (Ascenzi, 1996).
2.7.3.2. Recuperacin en medio lquido: Involucra la inoculacin de un portador y el
ensayo del portador para detectar microorganismos viables despus de la desinfeccin en
medio liquido. La inferencia hecha en estos ensayos es que el medio de recuperacin
permite el crecimiento de todos los microorganismos sobrevivientes al finalizar el periodo de
desinfeccin. La determinacin final de la eficacia es basada en la ausencia de crecimiento
en el medio de cultivo lquido. Adems este caldo debe servir tanto para neutralizar el
desinfectante como para soportar el crecimiento de todos los microorganismos. (Ascenzi,
1996)
2.7.3.3. Recuperacin por Filtracin por Membrana: En este sistema se debe tener en
cuenta el tipo de membrana empleado, el equipo de filtracin, el medio, el diluyente de
neutralizacin y la solucin a ser evaluada. La filtracin puede reducir la recuperacin de
los microorganismos debido a la muerte o adherencia de las clulas a las paredes de los
embudos de filtracin. Esta prdida especfica de la tcnica puede estimarse comparando la
poblacin recuperada en el fluido diluyente con el conteo de clulas viables. La filtracin por
membrana permite incorporar un neutralizante especifico en el diluyente para superar el
efecto del agente antimicrobial. (Ascenzi, 1996).
11
2.8. NORMATIVA MUNDIAL SOBRE EVALUACION DE DESINFECTANTES

Hasta 1997 no existan normas europeas de evaluacin de desinfectantes. Los diversos
productos desinfectantes se evaluaban segn normas oficiales en algunos pases, siendo las
ms habituales las normas francesas AFNOR (Association Franaise de Normalisation), las
alemanas DGHM (Deutsche Gesellschaft fr Hygiene und Mikrobiologie) y las
estadounidenses EPA y AOAC (Association of Official Analytical Chemists) (Tabares, 2002).
2.8.1. Normas AFNOR (Association Franaise de NORmalisation)
Las normas AFNOR NFT 72 existen desde hace ms de 25 aos
NF T72-170 (noviembre 1988). Antispticos y desinfectantes utilizados en el estado lquido,
miscibles al agua y neutralizables - Determinacin de la actividad bactericida en presencia
de sustancias interferentes de referencia - Mtodo por dilucin - neutralizacin.
NF T72-171 (noviembre 1988). Antispticos y desinfectantes utilizados en el estado lquido,
miscibles al agua - Determinacin de la actividad bactericida en presencia de sustancias
interferentes de referencia - Mtodo por filtracin sobre membranas.
NF T72-190 (1988). Desinfectantes de contacto utilizados en el estado lquido, miscibles al
agua - Determinacin de la actividad bactericida y fungicida y esporicida.
NF T72-230 (1988). Antispticos y desinfectantes utilizados en el estado lquido, miscibles al
agua y neutralizables - Determinacin de la actividad esporicida - Mtodo por dilucin-
neutralizacin.
NF T72-231 (1988). Antispticos y desinfectantes utilizados en el estado lquido, miscibles al
agua - Determinacin de la actividad esporicida - Mtodo por filtracin sobre membranas.
NF T72-281 (septiembre 1986). Procedimientos de desinfeccin de las superficies por va
area - Determinacin de la actividad bactericida y fungicida y esporicida
T72-300 (noviembre 1989). Antispticos y desinfectantes utilizados en el estado lquido,
miscibles al agua - Prueba(Ensayo) de suspensin por dilucin-neutralizacin -
Determinacin de la eficacia de los productos sobre microorganismos diversos en las
condiciones prcticas de empleo.
T72-301 (noviembre 1989). Antispticos y desinfectantes utilizados en el estado lquido,
miscibles al agua - Prueba(Ensayo) de suspensin por filtracin sobre membranas -
Determinacin de la eficacia de los productos sobre microorganismos diversos en las
condiciones prcticas de empleo
2.8.2. Normativa Europea

Los proyectos europeos definidos por el Comit CEN/TC 216 se elaboran en tres fases:
12
Fase 1: normas bsicas de suspensin en agua destilada. Estas normas demuestran la

existencia de alguna actividad en condiciones favorables. Sirven para calificar el producto de
bactericida, fungicida esporicida.
Fase 2: normas de aplicacin. En cada uso, las normas reproducen condiciones similares a
los usos esperados del producto, en los campos agro-alimentario, industrial, mdico y
veterinario.
Fase 2 etapa 1: ensayos de suspensin con sustancias interferentes.
Fase 2 etapa 2: ensayos sobre superficies, como los portagrmenes de acero
(desinfectantes) o las manos (antispticos).
Fase 3: ensayos en el sitio. Por el momento, no existe ninguna norma de fase 3
(ICONTEC, 2006. NTC 5446)
UNE-EN 1040:2006. Antispticos y desinfectantes qumicos. Ensayo cuantitativo de

suspensin para la evaluacin de la actividad bactericida bsica de los antispticos y
desinfectantes qumicos. Mtodo de ensayo y requisitos (fase 1)
suspensin para la evaluacin de la actividad fungicida o levuricida bsica de los
antispticos y desinfectantes qumicos. Mtodo de ensayo y requisitos (fase 1).
suspensin para la evaluacin de la actividad bactericida de los antispticos y desinfectantes
qumicos utilizados en productos alimenticios, en la industria, en el hogar y en colectividad.
Mtodo de ensayo y requisitos (fase 2, etapa 1).
UNE-EN 13610:2003. Desinfectantes qumicos. Ensayo cuantitativo de suspensin para la
evaluacin de la actividad viricida frente a bacterifagos de los desinfectantes qumicos
utilizados en el mbito agroalimentario y en la industria. Mtodo de ensayo y requisitos (fase
2, etapa 1).
suspensin para la evaluacin de la actividad fungicida de los desinfectantes qumicos para
instrumental utilizado en medicina. Mtodo de ensayo y requisitos (fase 2, etapa 1).
superficie no porosa para la evaluacin de la actividad bactericida y/o fungicida de los
desinfectantes qumicos utilizados en productos alimenticios, en la industria, en el hogar y en
colectividad. Mtodo de ensayo sin accin mecnica y requisitos (fase 2/etapa 2).
UNE-EN 13697:2002 ERRATUM:2007. Antispticos y desinfectantes qumicos. Ensayo
cuantitativo de superficie no porosa para la evaluacin de la actividad bactericida y/o
13
fungicida de los desinfectantes qumicos utilizados en productos alimenticios, en la industria,

en el hogar y en colectividad. Mtodo de ensayo sin accin mecnica y requisitos (fase
2/etapa 2).
UNE-EN 13704:2002. Desinfectantes qumicos. Ensayo cuantitativo de suspensin para la
evaluacin de la actividad esporicida de los desinfectantes qumicos utilizados en productos
alimenticios, en la industria, en el hogar y en colectividades. Mtodo de ensayo y requisitos
(fase 2, etapa 1).
suspensin para la evaluacin de la actividad bactericida de los desinfectantes qumicos
para instrumental utilizado en medicina. Mtodo de ensayo y requisitos (fase 2, etapa 1).
suspensin para la evaluacin de la actividad micobactericida de los antispticos y
desinfectantes qumicos utilizados en veterinaria. Mtodo de ensayo y requisitos (fase 2,
etapa 1). (www.aenor.es/desarrollo/normalizacion/normas/buscadornormas.asp?pag=p -
122k -)
2.8.3. Normativa estadounidense.
ASTM: Sociedad American Section of the International Association for Testing

Materials (organismo de normalizacin de los Estados Unidos de Amrica)
ASTM E-2197-02. Standard Quantitative Disk carrier test method for determining the
bactericidal, virucidal, fungicidal, mycobactericidal and sporicidal activities of liquid chemical
germicides. ASTM International. Pa. USA. (Prueba de disco portador para actividades
bactericida, virucida, fungicida, micobactericida y esporicida de germicidas qumicos
lquidos).
ASTM E-2197-02. Standard Quantitative Disk carrier test method for determining the
bactericidal, virucidal, fungicidal, mycobactericidal and sporicidal activities of liquid chemical
germicides. ASTM International. Pa. USA. (Prueba de disco portador para actividades
bactericida, virucida, fungicida, micobactericida y esporicida de germicidas qumicos
lquidos).( www.ivami.com/ - 10k)
2.8.4. Normativa Colombiana.

NTC 4672 (primer actualizacin de 287/04 desinfectantes para uso hospitalario. Requisitos
microbiolgicos.
14
NTC 5408 2006-02-22. Mtodo cuantitativo en suspensin para determinar la actividad

tuberculicida de un desinfectante de alto nivel soluble en agua para uso hospitalario.
NTC 5473 2007-03-21 desinfectantes qumicos. Ensayo cuantitativo de suspensin para la
evaluacin de la actividad bactericida de los desinfectantes qumicos para instrumental
utilizado en el sector salud. Mtodo de ensayo y requisitos (fase 2 etapa 1)
15
3. JUSTIFICACIN.
La limpieza y la desinfeccin son aspectos primordiales que deben ser tenidos en cuenta a
la hora de evaluar si un proceso es o no satisfactorio. La presencia de microorganismos
contaminantes o ajenos al proceso es en muchos casos inevitable, pero depende de un
correcto y adecuado proceso de desinfeccin.
Es importante no solo escoger el desinfectante adecuado, sino determinar que la

concentracin a la cual se emplea es la ms eficaz y la ms rentable para quien lo utiliza.
Por ello, la importancia de este proyecto de investigacin consiste en demostrar
experimentalmente, la eficacia del mtodo dilucin neutralizacin.
Es por esto que este proyecto surge en respuesta a la necesidad de encontrar mecanismos
estandarizados que aseguren la correcta determinacin de la concentracin bactericida de
un desinfectante, til al momento de emplear una sustancia qumica que disminuya la carga
microbiana del instrumental empleado en el sector salud.
La importancia de esta investigacin radica en la posibilidad de economizar tiempo, producto

desinfectante y dinero, a la vez de obtener seguridad en el proceso de desinfeccin, a travs
de una metodologa estandarizada y normatizada por el Instituto de Normas Tcnicas y
Certificacin ICONTEC.
La precisin de esta metodologa determinada por medio de la repetibilidad de los ensayos

evaluados en esta investigacin, permite demostrar la veracidad del procedimiento
empleado y la seguridad de obtener en posteriores ensayos, resultados similares,
verificables y con seguridad, contundentes.
Finalmente, la relevancia de esta investigacin radica en que constituye una manera til de
verificar la utilidad de la tcnica dilucin neutralizacin para la evaluacin de desinfectantes
en cualquier mbito, con el fin de establecerla en caso de encontrarse un procedimiento de
desinfeccin inadecuado.
16
4. OBJETIVOS.
4.1. OBJETIVO GENERAL.

Evaluar el mtodo dilucin neutralizacin aplicado a un desinfectante en gel a base de
alcohol, segn la Norma Tcnica Colombiana 5473 de 2007.
4.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS
Establecer las condiciones experimentales para la implementacin del mtodo de

ensayo dilucin-neutralizacin.
Implementar el mtodo de ensayo dilucin-neutralizacin, utilizando un desinfectante

en gel a base de alcohol, segn la norma tcnica colombiana 5473 del 2007.
Verificar la efectividad del mtodo de ensayo dilucin-neutralizacin, para la

evaluacin de un desinfectante en gel a base de alcohol.
Reportar los resultados obtenidos por medio de la elaboracin de un informe del

ensayo y un artculo cientfico, estableciendo un protocolo de esta metodologa para
ser aplicado en VICAR FARMACUTICA S.A.
17
5. MATERIALES Y MTODOS.
5.1 Diseo de la investigacin (experimental o de investigacin): El diseo de la

investigacin es de tipo experimental ya que se busca estandarizar, implementar y verificar
el protocolo de dilucin neutralizacin de la NTC 5473. Para ello se evaluaron variables
como tiempo de contacto, temperatura de exposicin, concentracin de desinfectante,
sustancias interferentes y cepas microbianas
5.1.1 Poblacin de estudio y muestra:

El objeto de estudio fue un desinfectante a base de alcohol 70%, empleado en el sector
salud para la higiene de las manos. El producto fue sometido a las diferentes condiciones
experimentales, a su concentracin de uso.
5.1.2 Variables del estudio:

Las variables del estudio fueron el desinfectante a evaluar, las cepas de referencia
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Enterococcus hirae; el tiempo de
contacto entre el desinfectante y cada uno de los microorganismos empleados, la
temperatura y las sustancias interferentes.
5.2 Mtodos:
5.2.1. Materiales:
Tubos de ensayo.
Frascos Schott de 500ml y 1000ml.
Pipetas graduadas de 10 ml.
Micropipeta de 100 a 1000l.
Cajas de petri de tamao 90 mm a 100 mm.
Asas desechables estriles.
5.2.2. Medios de cultivo:

TSA agar tripticasa soya
5.2.3. Reactivos:
Solucin de cloruro de sodio triptona.
18
Solucin de cloruro de sodio.

Neutralizante: caldo Letheen
Agua destilada estril.
Solucin de albmina de suero bovino
Solucin de albmina de suero bovino y eritrocitos de oveja.
5.2.4. Equipos:
Autoclave.
Bao de agua.
Incubadora.
Cronmetro.
Estufa.
Horno de secado.
Vortex.
Centrfuga.
Cmara de flujo laminar.
5.3. Metodologa:
5.3.1. Establecimiento de las condiciones experimentales para el mtodo de ensayo

dilucin-neutralizacin.
Para la ejecucin de la metodologa, se tuvieron en cuenta las condiciones estipuladas por la

norma. En cuanto a la temperatura, se consider la temperatura obligatoria de 20+/-1C y
como temperatura adicional se emple 36 +/- 1C. Para determinar el tiempo de contacto
entre el desinfectante y los microorganismos de prueba, se llev a cabo un ensayo
preliminar utilizando el tiempo obligatorio de 60 minutos y cinco tiempos adicionales (0, 5,
10, 15 y 30 minutos). A partir de este ensayo se establecieron las condiciones particulares
de este ensayo. Tabla 1.
Las sustancias interferentes manejadas en el ensayo fueron solucin de albmina de suero

bovino 0.3g/L en condiciones limpias y una mezcla de eritrocitos de oveja 3ml/L con solucin
de albmina de suero bovino 3g/L para simular condiciones sucias. Para la preparacin de la
solucin de albmina de suero bovino se tomaron 48 microlitros de albmina para preparar
160ml de solucin. Para la solucin que contena eritrocitos (Condiciones sucias), se
19
tomaron 8ml de sangre de oveja desfibrinada estril y se centrifugaron cuatro veces durante
10 minutos. Luego de desechar el sobrenadante se suspendi el precipitado en 8ml de
diluyente para centrifugar de nuevo, hasta que el sobrenadante era amarillo claro o incoloro.
Finalmente se tomaron 480 microlitros de eritrocitos en 160 ml de diluyente y 480 microlitros
de albmina de suero bovino.
Los organismos de ensayo utilizados fueron los estipulados por la norma: Pseudomonas
aeruginosa ATCC 15442, Staphylococcus aureus ATCC 6538 y Enterococcus hirae ATCC
10541.
20
5.3.2. Implementacin del mtodo de ensayo dilucin-neutralizacin segn la norma

tcnica colombiana 5473 del 2007.
5.3.2.1. Preparacin de las suspensiones de los microorganismos de ensayo.

Se prepararon dos suspensiones diferentes de cada microorganismo de ensayo: la
suspensin de ensayo para efectuar el ensayo y la suspensin de validacin para efectuar la
validacin de los controles y el mtodo. Para preparar el cultivo de trabajo de los organismos
de ensayo se realizo un cultivo de primera generacin mediante siembra sobre medio TSA,
incubando 24h a 37 C. a partir de este cultivo se preparo un segundo subcultivo de la
misma forma incubando durante un tiempo de 24h. a partir de este segundo subcultivo de
preparo un tercer pase mediante el cual se realizo la suspensin de ensayo. Para esto se
transfirieron asas de clulas al diluyente, ajustando el numero de clulas a un valor
8 8
comprendido entre 1.5 x 10 ufc/ml y 5.0 x 10 ufc/ml, mediante medicin de absorbancia
-6 -7
utilizando un espectrofotmetro. Para el recuento se prepararon diluciones 10 y 10 y se
tomo una muestra de 1 ml de cada dilucin por duplicado, inoculando utilizando la tcnica de
vertido en placa en medio TSA. Las cajas se incubaron durante 24h a 37C.
5.3.2.2. Preparacin de las suspensiones del organismo de validacin.

-5
Se diluyo la suspensin de ensayo una cuarta parte de la dilucin 10 para obtener una
2 3
concentracin comprendida entre 3 x 10 ufc/ml y 1.6 x 10 ufc/ml. Para el recuento se
-1
preparo una dilucin 10 y se tomo una muestra de 1 ml por duplicado utilizando la tcnica
de vertido en cajas en agar TSA. Las cajas se incubaron durante 24 h a 37C.
5.3.2.3. Determinacin de la actividad bactericida.

Se pipete 1,0 ml de la sustancia interferente en un tubo. Se aadi 1,0 ml de la suspensin
de ensayo. Se activ inmediatamente un cronmetro, se mezcl y se coloc el tubo en un
bao de agua controlado a cada una de las temperaturas del ensayo. Transcurrido el tiempo,
se aadi 8,0 ml del producto a evaluar. Se activ de nuevo el cronmetro al comienzo de la
adicin, se mezcl y se coloc el tubo en un bao de agua controlado a cada una de las
temperaturas seleccionadas para cada uno de los tiempos de contacto seleccionados. Antes
del final de cada uno de los tiempos, se mezcl de nuevo.
Al terminar cada uno de los tiempos seleccionados, se tom una muestra de 1,0 ml de la
mezcla del ensayo Na y se transfiri a un tubo con 8,0 ml del neutralizante y 1,0 ml de agua.
Se mezcl y se coloc en un bao de agua controlado a 20C. Despus de un tiempo de
21
neutralizacin de 5 min, se tom inmediatamente una muestra de 1,0 ml de la mezcla del

ensayo neutralizada Na por duplicado y se inocul utilizando la tcnica de vertido en placa,
se incub y se realiz recuento.
5.3.2.4. Verificacin de la ausencia de cualquier efecto letal en las condiciones del ensayo
(parmetro A de la condicin experimental): Se pipete 1,0 ml de la sustancia interferente
utilizada en un tubo. Se aadi 1,0 ml de la suspensin de validacin, se activ
inmediatamente el cronometro, se mezcl y se coloc el tubo en el bao de agua controlado
a cada una de las temperaturas del ensayo durante 2 min. Transcurrido este tiempo, se
aadi 8,0 ml de agua dura. Se activ de nuevo el cronmetro al comienzo de la adicin, se
mezcl y se coloc el tubo en el bao de agua controlado a cada una de las temperaturas
del ensayo y durante cada uno de los tiempos seleccionados. Antes del final del tiempo, se
mezcl de nuevo; transcurrido el tiempo seleccionado, se tom una muestra de 1,0 ml de la
mezcla de ensayo A por duplicado e se inocul utilizando la tcnica de vertido en cajas; se
incub y se realiz recuento.
5.3.2.5. Verificacin de la ausencia de toxicidad del neutralizante (parmetro B de control del

neutralizante): Se pipetearon 8,0 ml del neutralizante y 1,0 ml de agua en un tubo. Se aadi
1,0 ml de la suspensin de validacin. Se activ el cronmetro al comienzo de la adicin, se
mezcl y se coloc el tubo en un bao de agua controlado a 20C durante 5 min. Antes de
concluir este tiempo, se mezcl transcurrido este tiempo, se tom una muestra de 1,0 ml de
esta mezcla B por duplicado y se inocul utilizando la tcnica de vertido en cajas; se incub
y se contaron las colonias.
5.3.2.6. Parmetro de estandarizacin del mtodo: Se pipete 1,0 ml de la sustancia

interferente en un tubo. Se aadi 1,0 ml de diluyente y se activ el cronmetro, se
aadieron 8,0 ml del producto. Se mezcl y se coloc el tubo en un bao de agua controlado
a cada una de las temperaturas del ensayo durante cada uno de los tiempos del ensayo;
antes de concluir este tiempo, se mezcl de nuevo; transcurrido cada uno de los tiempos del
ensayo, se transfiri 1,0 ml de la mezcla a un tubo con 8,0 ml de neutralizante. Se activ de
nuevo el cronmetro al comienzo de la adicin. Se mezcl y se coloc el tubo en un bao de
agua controlado a 20C durante 5 min.
Se aadi 1,0 ml de la suspensin de validacin. Se activ un cronmetro al comienzo de la

adicin y se mezcl. Se coloc el tubo en un bao de agua controlado durante 30 min. Antes
22
de concluir el tiempo, se mezcl de nuevo; transcurrido este tiempo, se tom una muestra de
1,0 ml de la mezcla C por duplicado y se inocul utilizando la tcnica de vertido en cajas; se
incub y se contaron las colonias.
5.3.2.7. Incubacin y recuento de la mezcla de ensayo y de las mezclas de control y

estandarizacin: Se incubaron las cajas durante 24 h. Se realiz el recuento de las cajas y
se determin el nmero de unidades formadoras de colonias (ufc) en cada caja. Se anot
para cada placa el nmero exacto de colonias, se registr mayor a 330 para cualquier
recuento mayor a 330 respectivamente, y se determinaron los valores Vc. Se calcul la
cantidad de ufc/ml en la mezcla de ensayo Na y en las mezclas de verificacin A, B y C.
Figura 2. PREPARACIN DE LAS SUSPENSIONES DEL ORGANISMO DEL ENSAYO
Cultivo de primera
generacin
Subcultivar en medio
TSA

Incubar entre 18h 24h
Crecimiento masivo
y puro del NO
microorganismo de
ensayo
23
SI
TSA
(segundo subcultivo)
Crecimiento masivo
y puro del NO
microorganismo de
ensayo
Cultivo de SI
trabajo
TSA
(tercer subcultivo)
24
Crecimiento masivo
y puro del NO
microorganismo de
ensayo
SI
Cultivo de
trabajo
Transferir asadas
Frasco schott de 500ml

con 300 ml de solucin
salina
Agitar en vortex
25
Transferir 10 ml de esta
muestra a un tubo
Adicionar
solucin salina
Leer absorbancia en el
espectrofotmetro
Lectura mayor Lectura menor

a 0.198 a 0.198
Lectura de abs.: 0.198

correspondiente al valor NO
terico del patrn 1 de
Mac Farland
SI
-6
Preparar diluciones 10 y
-7
10 con solucin salina
Sembrar cada una de las

diluciones por duplicado en
medio TSA
Incubar entre 24h a 37C.
26
Recuento entre 1.5

8
x 10 ufc/ml y 5.0 x
8
10 ufc/ml
SI
Suspensin
de ensayo
Diluir esta suspensin con

solucin salina, aprox. Una
-5
cuarta parte la dilucin 10
-1
Preparar dilucin 10 y sembrar
en medio TSA
Incubar 24h a 37C.
Recuento entre 3.0

2
x 10 ufc/ml y 1.6x NO
3
10 ufc/ml
27
SI
Suspensin
de validacin
EnsayoNA(determinacindelaac4vidadbactericida)
Sustanciainterferente Suspensindeensayo
Pipetear1,0ml Pipetear1,0ml
Tubodeensayo
Mezclarconvortex10s
Colocartuboenbaode
aguacontroladoa
temperaturadeensayo
28
T1=20(1)C T2=36(1)C
AcNvarcronmetro Solucindeensayo
durante2min deldesinfectante
8,0ml
Colocartuboenbaode
aguacontroladoa
temperatura
T1=20(1)C T2=36(1)C
C
tA=0min tB=2min tC=5min tD=10min
Tomar1,0mldela
mezcladeensayoNa
Tubocon8,0mlde
neutralizantey1,0
mldeagua
Mezclarconvortex10s.
Colocartuboenbaode
aguacontroladoa201C
29
Dejarneutralizar
durante5min
Tomarmuestrade1,0
mldeestamezclapor
duplicado
Sembrarporlatcnica
deverNdoencajas.
Incubara37C,24h
Recuento N0
7
entre 1.5x10
SI 7 NO
ufc/ml y 5x10
ufc/ml
Ensayo valido. Ensayono

(cumple valido
especificacion
NTC)
RepeNrensayo
30
Parmetro A de control de la condicin experimental
Sustancia Suspensin de
interferente validacin
Pipetear1,0ml Tomar1,0ml
enuntubo
MezclarenVortex,
10s.
Colocartuboenbaode
aguacontrolado
temperaturaT1,T2,
Agua destilada
esteril
AcNvar
cronmetro,2min.
8,0ml
MezclarenVortex,
10s.
Colocartuboenbaodeagua
controladoalastemperaturasdel
ensayoT1,T2,durantelosNempos
delensayotA,tB,tC,tD
31
Tomarunamuestrade1,0mldela
mezcladeensayoAporduplicado
Sembrarporlatcnica
dedeverNdoencajas.
Incubara37C,24h
Recuento igual o
SI superior a NO
0.5xNvo

(Cumple valido
especificacin
NTC)
RepeNrensayo
32
Parmetro B de control del neutralizante

(Verificacin de la ausencia de toxicidad del neutralizante)
Neutralizante
Agua
Pipetear8,0ml
Suspensin de enuntubo
validacin
Pipetear1,0ml
Aadir1,0ml
AcNvar
cronmetro
Colocartuboenbaodeagua
controladoa20(1)C,5min
MezclarenVortex
10s
Tomarmuestrade1,0
mldeestamezclaB
porduplicado
InocularuNlizandolatcnica
deverNdoencajas
Incubara37C,24
h.
33
Recuento igual o
SI superior a NO
0.5xNvo

(cumple valido
especificacion
NTC)
RepeNrensayo
Parmetro C. Estandarizacin del mtodo.
Sustanciainterferente
Diluyente
Desinfectante Pipetear1,0ml
1,0ml
8,0ml
ColocartuboenbaodeaguaT1T2
durantetA.tB.tC.tD.
34
MezclarenVortex
10s
Transferir1,0mlde
lamezcla
Tubocon8,0mlde
neutralizante
AcNvarcronmetro,
5min.
Suspensinde
Colocareltuboenunbaode validacin
aguacontroladoa20(1)C
1,0ml
AcNvarcronmetro,
30min.
Mezclarenvortex
10s
Colocareltuboenunbaode
aguacontroladoa20(1)C
35
Recuento igual o
SI superior a NO
0.5xNvo

(cumple valido
especificacion
NTC)
RepeNrensayo
36
5.3.3. Verificacin de la metodologa
Se llev a cabo de acuerdo con los numerales 5.7 y 5.8 de la NTC 5473 del ICONTEC,
mediante la comparacin de la media aritmtica de las replicas de los resultados obtenidos
con los lmites bsicos (tabla 2) establecidos por la norma (Anexo 3).
Tabla 2. Lmites bsicos establecidos por la NTC 5473 del ICONTEC.
8 8
N 1.5 * 10 ufc/mL y 5 * 10 8.17 = LOG N = 8.70
ufc/mL
7 7
No 1.5 * 10 ufc/mL y 5 * 10 7.17 = LOG No =
Est comprendido entre ufc/mL 7.70
Nvo 30 ufc/mL y 160 ufc/mL
Nv 300 ufc/mL y 1600 ufc/mL
A,B,C Son iguales o superiores a 0.5 (Nvo)
Al menos una concentracin debe demostrar un LOG R 5 y al menos una concentracin

debe demostrar un LOG R < 5
En el control de los recuentos de los valores medios ponderados el cociente no es inferior a

5 ni superior a 15
5.4. Recoleccin de la informacin.
Para recolectar la informacin se emplearon los parmetros establecidos por la norma

tcnica colombiana 5473 a partir de la cual se tuvo en cuenta los procedimientos
experimentales para la determinacin de la actividad bactericida del desinfectante empleado.
Adems se obtuvo informacin partir de consulta bibliogrfica con el fin de determinar los
mecanismos de accin del proceso de desinfeccin y su aplicacin en instrumental mdico.
Para la recopilacin de los datos experimentales se emple una matriz en la cual se

registraron los resultados obtenidos en cada una de las replicas a las condiciones de
37
tiempo, temperatura, tipo de microorganismo, interferente y concentracin del desinfectante

evaluados.
Por otra parte se emplearon tablas en la cual se registraron los resultados obtenidos a partir
del conteo de clulas/ ml en cada uno de los ensayos y en los controles realizados.
5.5. Anlisis de informacin

Inicialmente se hizo una determinacin de los valores Vc, que son los valores
experimentales que se obtuvieron en el mtodo de dilucin-neutralizacin. Estos valores
incluyen los valores de ensayo y los controles.
En el mtodo de dilucin-neutralizacin se tuvo en cuenta valores Vc entre un limite entre 14

y 130 colonias. Para el calculo del numero de clulas/ ml de la suspensin de ensayo se
calcul la media aritmtica ponderada de los recuentos de dos diluciones escogidas de esta
suspensin. Para esto se utilizara la siguiente formula:
N= c
-6
(n1 + 0.1 n2 ) 10
En donde:
C es la suma de los valores Vc tenidos en cuenta;
-6
N1 es el numero de los valores Vc tenidos en cuenta en la dilucin inferior, es decir (10 );
-7
n2 es el numero de valores Vc tenidos en cuenta en la segunda dilucin, es decir (10 );
-6
10 es el factor de dilucin correspondiente a la dilucin inferior.
Para determinar el numero de clulas/ml en la mezcla de ensayo al comienzo del tiempo de

contacto (No) es decir, al tiempo cero, se obtuvo la decima parte de la media aritmtica
ponderada de N (numero de clulas/ml en la suspensin de ensayo) debido a que por la
adicin del producto y de la sustancia interferente se obtiene una dilucin a la decima parte.
Para la determinacin del nmero de microorganismos supervivientes/ml en la mezcla de

ensayo al final del tiempo de contacto y antes de la neutralizacin (Na), se emple la
siguiente formula:
Na= c x 10
n
38
en donde:
c es la suma de los valores Vc tenidos en cuenta;
n es el nmero de valores Vc tenidos en cuenta.
Para calcular el nmero de clulas/ en la suspensin de validacin Nv y el nmero de

clulas/ml en las mezclas A, B, C al comienzo del tiempo de contacto (Nvo),se emple la
siguiente formula:
Nv = c x 10
Nvo= c
en donde:
n es el nmero de valores Vc tenidos en cuenta.
Para calcular el numero de sobrevivientes en el control de las condiciones experimentales

(tiempo, temperatura, sustancia interferente), control del neutralizante y estandarizacin del
mtodo al final del tiempo de contacto, se emple las siguiente formula:
A, B, C = c
39
donde :
n es el nmero de valores Vc tenidos en cuenta
La tabulacin de los datos se hizo teniendo en cuenta la matriz de resultados relacionando lo

obtenido en cada uno de los ensayo con las condiciones experimentales trabajadas.
(Anexo3).
40
6. RESULTADOS Y DISCUSIN
6.1. Establecimiento de las condiciones experimentales para el mtodo de ensayo

dilucin-neutralizacin.
Las condiciones experimentales establecidas por la norma no presentaron modificaciones, a

excepcin del tiempo de contacto de 60 min, el cual fue omitido ya que las especificaciones
del producto sugieren un tiempo de contacto corto para ejercer su accin bactericida. Se
establecieron los tiempos de contacto 2, 5 y 10 minutos, luego de un ensayo preliminar que
demostr que el producto ejerca accin bactericida en el menor tiempo de contacto (5
minutos). Las condiciones experimentales obligatorias y adicionales aplicadas en el ensayo
se consignan en la tabla 1.
6.2. Implementacin y Verificacin del mtodo de ensayo dilucin-neutralizacin

segn la norma tcnica colombiana 5473 del 2007.
6.2.1. Preparacin de la Suspensin de Ensayo y Validacin
Para implementar el procedimiento de preparacin de las suspensiones de Ensayo y

Validacin se trabaj inicialmente con la cepa de Staphylococcus aureus ATCC 6538. Para
esto se tom como referencia el tubo N 1 del patrn de McFarland cuya concentracin
8
celular es equivalente a 3x10 UFC/ml, para cumplir con las exigencias de la norma que
8 8
determina que el recuento en esta suspensin debe ser entre 1.5x10 UFC/ml y 5.0x10
UFC/ml. La absorbancia reflejada por el patrn de McFarland fue 0.225 as que la
suspensin fue calibrada hasta alcanzar una absorbancia de 0.2. Sin embargo, al realizar el
9
recuento este fue de 4x10 por lo cual fue necesario preparar una suspensin nueva. Se
realizaron de nuevo los tres pases necesarios de la cepa y se ajust la absorbancia tanto del
patrn como de la suspensin. De forma similar el recuento no cumpla con las
especificaciones de la norma.
De acuerdo con lo anterior, se sugiri trabajar la suspensin utilizando solucin salina como
diluyente omitiendo la adicin de triptona, ya que se tena como hiptesis que esto podra
estar interfiriendo con la absorbancia propia de la suspensin. Esto debido a que la triptona,
posee una coloracin amarilla que podra estar afectando los resultados emitidos por el
colormetro. Para comprobar este planteamiento se prepararon dos suspensiones, una
empleando nicamente solucin salina como diluyente y la otra utilizando el diluyente
41
especificado en la norma, es decir, solucin salina ms triptona. La absorbancia de ambas

suspensiones fue similar al patrn de McFarland (0.199). Los resultados de los recuentos
reflejaron que efectivamente, la suspensin elaborada solo con solucin salina cumpla con
las especificaciones de la norma Tabla 3, mientras que el recuento de la suspensin
elaborada con triptona exceda los requerimientos de la norma.
A partir de la Suspensin de Ensayo, se prepar la suspensin de validacin, siguiendo las

-5
especificaciones de la norma, es decir a partir de una cuarta parte de la dilucin 10 de la
Suspensin de ensayo. Igualmente se utiliz como diluyente solucin salina y el recuento fue
adecuado para llevar a cabo el procedimiento. Tabla 3.
Para preparar la suspensin de Pseudomonas aeruginosa cepa ATCC 15442, se sigui el

procedimiento descrito para la suspensin de Staphylococcus aureus, es decir, a partir del
9
patrn de McFarland. Sin embargo al realizar el recuento este era muy alto (10 ). Se pudo
notar, que la turbidez que proporcionaba una colonia de P. aeruginosa era mayor comparada
con una colonia de S. aureus. Por esta razn, se ajust la absorbancia a un valor medio
(0.16). Esta absorbancia emiti un recuento que permiti trabajar con esta suspensin y
elaborar a partir de ella, la suspensin de validacin. Tabla 3.
Se ha reportado que Pseudomonas aeruginosa es un microorganismo formador de

biopeliculas. Este tipo de microorganismos son capaces de producir polisacridos y
glicoproteinas para formar agregados entre si (Wirtanen. G, 2001). Este factor puede influir
en la notoria turbidez generada por este microorganismo. Por esta razn no es
recomendable emplear el patrn de McFarland para ajustar suspensiones de Pseudomonas
aeruginosa. Para ello es posible elaborar una suspensin de alta concentracin a partir de la
cual se generen diluciones seriadas en base diez. Cada una de las diluciones se siembra
por duplicado en agar TSA y se mide la absorbancia. Luego se genera una curva de UFC/ml
vs. Absorbancia y por interpolacin es posible realizar una aproximacin que permita
determinar a qu absorbancia se debe ajustar la suspensin para lograr el recuento
deseado.
En otros estudios como el realizado por Espigares. E, et.al., 2003; se recomienda ajustar
espectofotomtricamente la densidad de las suspensiones bacterianas a 620 nm de longitud
de onda, para obtener una absorbancia de 0.2 a 0.3 para bacilos Gramnegativos y de 0.3 a
0.4 para cocos Grampositivos, lo cual puede ser til al momento de preparar una suspensin
8
con un recuento comprendido entre 1 y 3x10 UFC/ml.
42
Por otra parte, para preparar la suspensin de la cepa de Enterococcus hirae, se utiliz
como referencia la absorbancia emitida por la suspensin de S.aureus (0.19) al tratarse de
microorganismos Grampositivos con morfologa microscpicamente similar. La absorbancia
final de la suspensin fue 0.18. El recuento establecido fue el adecuado para trabajar con
esta suspensin. Tabla 3.
Finalmente, se consider como punto crtico de la evaluacin del mtodo, la preparacin de

las suspensiones, debido a que es la parte esencial que determina el xito de los resultados
y del procedimiento.
Tabla 3. UFC/mL en las suspensiones bacterianas de Ensayo (N) y validacin (NV)
Microorganismo N NV
LIMPIO SUCIO LIMPIO SUCIO

8 8 2 2
P aeruginosa 1,6 * 10 1,9 * 10 3,8*10 4,4*10
8 8 2 2
S. aureus 1,8*10 1,5*10 4,2*10 3,9*10
8 8 3 2
E. hirae 4.6 * 10 1.5 * 10 1.1 * 10 3 * 10
6.2.2. Evaluacin de las condiciones experimentales - Control A.
De acuerdo con la norma, los resultados de los recuentos obtenidos los parmetros de
control no deben se menores a la mitad del recuento obtenido en cada parmetro al final del
tiempo cero de contacto. Esta condicin se dio satisfactoriamente en este parmetro, tal
como se refleja en los resultados experimentales consignados en la tabla 4. Esto permiti
determinar que ni las temperaturas trabajadas (20C y 36C), ni los interferentes, ni los
tiempos de exposicin incidieron de forma negativa en el crecimiento de los
microorganismos. Anexo 3.
Cabe aclarar que el diluyente empleado para el ensayo y los controles sigui siendo el
especificado por la norma, excepto en la preparacin de las suspensiones en las cuales se
utiliz solamente solucin salina, y esto no afect de ninguna manera los resultados
obtenidos.
Los resultados fueron similares para los dos interferentes.
43
Tabla 4. Parmetro A: Control de las condiciones experimentales seleccionadas

(Promedio valores Vc UFC).
CONTROL A
Microorganismo
LIMPIO SUCIO
10 10
0min/ 0 min/ 2min/ 2 min/ 5 min/ 5 min/ 0min/ 0min/ 2min/ 2min/ 5min/ 5min/ 10min/ 10min/
min/ min/
20C 36C 20C 36C 20C 36C 20C 36C 20C 36C 20C 36C 20C 36C
20C 36C
32 36 30 28 27 19 16 16 37 39 22 28 24 25 20,5 26
34 32 28 30 28 21 19 21 35,5 36,5 25 27,5 21 22,5 26 26

P.aeruginosa
30 30 32 35 32 18 19 15 34 30 27 20,5 27 26 19 22
36 31 32 34 30 16 16 21 32 33 21 23 19 28 25 24,5
38 38 30 30 32 24 14 24 33,5 32,5 20 22,5 24 28 22 28
36 34 28 33 27 21 21 23 35 30 23,5 38,5 22,5 24,5 24,5 24,5
34,5 28,5 37 24,5 21,5 25 28,5 25 34 32 30,5 37 35,5 41,5 31,5 40,5
33 34 33 23 18 22,5 23 26 36 32,5 35 33 37,5 34 35 34

S.aureus
37 36 37 24,5 28,5 21,5 18 30 32 32 39 31,5 36,5 38 34 31,5
38,5 36 33,5 22,5 24 24,5 23 24 31 38 32 35 34,5 35,5 39 30,5
38 32,5 39 21,5 29 25,5 18 24 34,5 39 33 35 34,5 30 35 32
32 37 30 23,5 20 22,5 23 23 30,5 30 33 38 40 31 34,5 35
116 102 96 106.5 121 98 113.5 123 23 29.5 24.5 28.5 24 26 23 31
101 128 100 118 116 114 115 111.5 24 28.5 24.5 27.5 25 27 25 27.5
100 112.5 113 118 108.5 116.6 110 105 27 24 24.5 28 23 26.5 22.5 25.5
E hirae
114 106 125 109 112 127 131 96 26 25 25 27.5 26 28 22.5 25.5
110 105.5 125 121 115 120.5 111 114 27 26.5 23 30 22 28 25 30
104 110 114.5 103.5 122.5 111 106 102 26.5 29.5 25.5 31.5 24 29 24 28
6.2.3. Verificacin de la ausencia de toxicidad del neutralizante Control B.
El mtodo de dilucin neutralizacin implica el enfrentamiento de una suspensin bacteriana

y un desinfectante bajo condiciones estndar, y la terminacin de la reaccin mediante la
exposicin a un neutralizante. En este estudio se utiliz caldo Letheen que es un medio
altamente nutritivo compuesto por lecitina y tween 80, capaz de neutralizar o inhibir la accin
44
de los componentes activos de los desinfectantes. En este caso, el componente activo del
desinfectante evaluado fue alcohol.
Los datos recopilados en la Tabla 5, muestran que el neutralizante permiti ampliamente el

crecimiento de los microorganismos evaluados, y no present efectos negativos que llegaran
a ocasionar inhibicin en los mismos. Ver anexo 3.
Tabla 5. Parmetro B: Control del neutralizante (verificacin de la ausencia de

toxicidad del neutralizante Promedio valores Vc UFC).
Microorganismo CONTROL B
33
36
34,5
P. aeruginosa
32
34
37
39
38
39
S. aureus
37
36
40
111
93.5
106.5
E. hirae
117
118
120
6.2.4. Validacin del mtodo Dilucin Neutralizacin Control C
De igual manera que en los dems controles, el recuento de todas las replicas en los
diferentes tiempos y temperaturas evaluados (Tabla 6), fue superior a la mitad del recuento
obtenido en el parmetro al final del tiempo de contacto cero, para los tres microorganismos
y las dos condiciones de limpieza simuladas. Ver anexo 3.
Debido a que se trata de un procedimiento dispendioso, lo recomendable es que a la hora de

aplicar la metodologa de la norma se inicie con este control.
45
Este parmetro de control permiti determinar que el mtodo esta diseado para conocer la
accin bactericida de cualquier desinfectante sin generar por si mismo efectos negativos
sobre el microorganismo control.
Tabla 6. Parmetro C: Validacin del mtodo de dilucin neutralizacin (Promedio

valores Vc UFC).
CONTROL C
Microorganismo
LIMPIO SUCIO
10 10 0 0 2 2 5 5 10 10
0 min/ 0 min/ 2min/ 2 min/ 5 min/ 5 min/
min/ min/ min/ min/ min/ min/ min/ min/ min/ min/
20C 36C 20C 36C 20C 36C
20C 36C 20C 36C 20C 36C 20C 36C 20C 36C
38 37 36,5 28,5 32 34,5 34 37,5 31,5 33,5 30,5 31,5 34,5 35 38,5 33,5
32 36,5 32,5 31 28,5 37,5 40,5 36 33,5 38 38 37 32 39 30 36

p. aeruginosa
35,5 40 39 29 34 32 36 38 34 33,5 40,5 38,5 34,5 39 30 35
37 33 4 32 36,5 34,5 37 33,5 30,5 32 38 36 31 37 34 30,5
31,5 31,5 33,5 39 40 33 31,5 31,5 37 38 37,5 37,5 31,5 37 30 32,5
30 34 31,5 37,5 33,5 30 33 36 33 35 35,5 34 30 38 30 33
48,5 32 42,5 35 40,5 32 47,5 35,5 40,5 34,5 33,5 36,5 33 34,5 38,5 38,5
43,5 35,5 37,5 41,5 49 39,5 39 37 35,5 33,5 33,5 36,5 37 37,5 38,5 40,5
S. aureus
40 32 43 35,5 55 34,5 42 34 36 36,5 35,5 31,5 35,5 35 38 35
37 32,5 39 41,5 42,5 30,5 54 43,5 35,5 42 32,5 40,5 36 34 38,5 38
40,5 36 38 34,5 44,5 37 46 39 37,5 34 37 38,5 33 33,5 34,5 32,5
39,5 35,5 34,5 32,5 49 34 48,5 38,5 34 39 36,5 34,5 41 37,5 36 30
93.5 115.5 95 114 111.5 95.5 95 105.5 28 28.5 32.5 24 26.5 30.5 26 27
96.5 117 95.5 114.5 107 98 95.5 109 23.5 24.5 25.5 27.5 26 25.5 25 26.5
99 108.5 128.5 100.5 108.5 109.5 128.5 95 33.5 27.5 26 25.5 23.5 24 23.5 24.5
E. hirae
119.5 101 105 94 125 98.5 105 102 25.5 28 29.5 29 27 27.5 25.5 24
122 99.5 115.5 113.5 119 102 115.5 100.5 24 24.5 29 25.5 26 25 27 27
126.5 112 127 95.5 127.5 105.5 127 97.5 25 28.5 25.5 25.5 23.5 26 24 25.5
46
6.2.5. Ensayo NA Mtodo Dilucin Neutralizacin
Para llevar a cabo el mtodo se utilizaron las suspensiones de Ensayo de cada uno de los
microorganismos control propuestos en la norma. Se utiliz un desinfectante para manos en
gel para estandarizar el procedimiento a una concentracin de 80%.
El principio activo del desinfectante es alcohol etlico y contiene adems glicerina como
emoliente y algunos conservantes. Sin embargo, adems de permitir la estandarizacin del
mtodo, los desinfectantes de este tipo tienen una amplia utilizacin en el mbito medico
quirrgico. Estudios como el realizado por Rochon-Edouard.S., et.al., 2003., establecen la
importancia de los desinfectantes de manos basados en alcohol, para la prevencin en la
transmisin de enfermedades por manos del personal hospitalario.
Igualmente, Gaonkar. T.A., et. Al., 2005, manifestaron que los productos basados en alcohol
que contienen emolientes, permiten preservar la integridad de la piel a la vez que
constituyen una alternativa viable de desinfeccin rpida. Kampf.G., et.al., 2003,
reconocieron que la desinfeccin de manos con productos que contienen alcohol es
considerada la va mas efectiva para frenar la cadena de transmisin asociada a infeccin en
el sector salud.
En el ensayo se trabajaron las seis replicas de cada tiempo y cada temperatura a la vez con
el fin de obtener bajo las mismas circunstancias de ensayo resultados precisos. Por razones
de tiempo y comodidad se trabajo un interferente con las dos temperaturas seleccionadas
(20C y 36C), con los seis tiempos iniciales (0 min, 5, 10, 15, 30 y 60 min) y las seis replicas
para cada control y para el ensayo. Sin embargo los primeros resultados demostraron que
para Staphylococcus aureus, luego de los 5 minutos de contacto no haba crecimiento, es
decir, que en los tiempos 15, 30 y 60 minutos el desinfectante eliminaba los
microorganismos presentes y que en situaciones reales no se trabajan en procesos de
desinfeccin en mbito hospitalario donde se debe asegurar una desinfeccin rpida. Por
esta razn los tiempos de contacto se cambiaron a tiempo 0, 2 minutos, 5 minutos y 10
minutos.
En cuanto a la suspensin de ensayo, la norma exige que sea empleada antes de 2 horas
luego de su preparacin. Por la duracin de cada uno de los procedimientos (ensayo y
controles) esto no fue posible ya que por da se realiz un solo interferente. Lo que se
procedi a realizar, fue conservar la suspensin en refrigeracin a 2C aproximadamente,
para ser empleada con el otro interferente. Sin embargo, se not una disminucin en el
recuento tanto de la suspensin de ensayo como en la de validacin. Por esta razn fue
47
necesario preparar una suspensin nueva para cada interferente. Los resultados de cada
recuento fueron consignados en la Tabla 3.
El comportamiento de cada cepa evaluada fue diferente. La cepa de S. aureus solo present
crecimiento en el tiempo 0, el cual fue mayor a 330 que fue el lmite mximo establecido por
la norma (Tabla7). Esto debido a que en este tiempo, el desinfectante es neutralizado
inmediatamente despus de la adicin del microorganismo, impidiendo que haya un tiempo
de contacto suficiente entre el desinfectante y la suspensin.
Tabla 7. Ensayo NA: Determinacin de la actividad bactericida del producto (Promedio

valores Vc UFC).
ENSAYO
Microorganismo
LIMPIO SUCIO
10 10 10 10
0 min/ 0 min/ 2min/ 2 min/ 5 min/ 5 min/ 0 min/ 0 min/ 2 min/ 2 min/ 5 min/ 5 min/
min/ min/ min/ min/
20C 36C 20C 36C 20C 36C 20C 36C 20C 36C 20C 36C
20C 36C 20C 36C
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
P. aeruginosa
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
S. aureus
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
E. hirae
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
48
Tabla 8. Numero de supervivientes por ml (UFC/ml), en las mezclas de ensayo al final

del tiempo de contacto t antes de la neutralizacin
NA
Microorganismo LIMPIO SUCIO
2 MIN 2 MIN 5 MIN 5 MIN 10 MIN 10 MIN 2 MIN 2 MIN 5 MIN 5 MIN 10 MIN 10 MIN
20C 36C 20C 36C 20C 36C 20C 36C 20 C 36C 20C 36 C
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
P. aeruginosa
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
S. aureus
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
E. hirae
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
<140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140 <140
En los dems tiempos evaluados no se present crecimiento del microorganismo, con lo cual
se comprueba que el desinfectante es capaz de actuar desde 2 minutos de contacto (tabla
8). Estos resultados estn de acuerdo con los resultados establecidos en estudios anteriores
como en el realizado por Chatterjee. I., et.al., 2006, en el cual concentraciones mnimas de
etanol causan ruptura celular y cambios irregulares en la apariencia de las mismas, as como
afeccin en la funcin de la membrana celular, interferencia en la divisin celular, afeccin
49
en el crecimiento, variacin en la composicin de los cidos grasos y en la sntesis de

protenas e inhibicin en el transporte de nutrientes a la clula.
Por otra parte, P. aeruginosa mostr crecimiento leve en todos los tiempos excepto en el
tiempo 0 en el que el recuento en todas la replicas fue mayor a 330 (Tabla 7). Debido a que
en las replicas de los tiempos 2, 5 y 10 los recuentos oscilaron entre10 y 15 colonias, se
tomaron como menores a catorce por especificacin de la norma, lo que permiti obtener
valores Na menores a 140 (Tabla 8 ).
La resistencia de P. aeruginosa es atribuida a varios factores que han sido consignados en

diversos estudios. Russel. A.D., 1998, estableci que las bacterias Gramnegativas poseen
reducida sensibilidad hacia los desinfectantes comparadas con los estafilococos debido a los
lipopolisacaridos de su membrana externa que impiden el flujo de los desinfectantes al
interior de la clula. Por otra parte, Gorisch. H, 2003, estableci que P. aeruginosa es capaz
de crecer en etanol e inducir enzimas capaces de oxidarlo y metabolizarlo a acetato.
En cuanto al comportamiento de E. hirae, se esperaba que fuera similar al de la cepa de S.

aureus por la similitud morfolgica y tintorial que existe entre estos dos microorganismos. Sin
embargo, E. hirae a diferencia de S. aureus present crecimiento en los tiempos 2, 5 y 10 de
ambos interferentes. Los resultados obtenidos con este microorganismo fueron similares a
los de P. aeruginosa, es decir, aunque se present crecimiento, el nmero de colonias fue
menor a 12 por lo cual se consider la especificacin de la norma y se report el resultado
como menor a 140 (Tabla 8).
Segn el estudio realizado por Sakagami. Et al., 2002, los Enterococos son importantes
patgenos nosocomiales cuyo factor de virulencia importante es su resistencia intrnseca y
adquirida a muchos agentes antimicrobianos; esto podra explicar el crecimiento de la cepa
de E. hirae, en los tiempos de contacto 2, 5 y 10min.
En sntesis, el empleo de desinfectantes en gel cuyo principio activo es alcohol, pueden

constituir un mecanismo importante de desinfeccin de manos en el mbito hospitalario, y
para que su efecto sea notorio en bacterias Gramnegativas y otros microorganismos de
difcil eliminacin se puede aumentar la concentracin de alcohol al tiempo que se manejen
emolientes que eviten el dao a la piel pero no interfieran en la accin bactericida del
desinfectante.
50
7. CONCLUSIONES
Se determin que las condiciones experimentales del ensayo deben establecerse teniendo
en cuenta las condiciones reales a las que se ver sometido el desinfectante a evaluar; para
este fin, deben tenerse en cuenta las especificaciones del fabricante, el principio activo del
desinfectante, su presentacin e incluso el lugar donde se va a utilizar.
Los resultados obtenidos en este estudio elucidan que el mtodo dilucin neutralizacin de
la NTC 5473, resulta confiable para evaluar la actividad bactericida de un desinfectante. De
este modo, la norma garantiza a quien emplee su mtodo dilucin neutralizacin, la
consecucin de resultados confiables y el control de los parmetros que pudieran tener un
efecto letal sobre los microorganismos de la prueba.
Mediante el anlisis de los resultados obtenidos en el ensayo y en los parmetros de control

se determin que no se generan inhibiciones del crecimiento bacteriano por motivos
diferentes a la accin del producto a evaluar, tal como la metodologa, las condiciones
experimentales y la sustancia neutralizante.
La elaboracin del informe del ensayo permiti reportar y verificar los resultados obtenidos,
comparndolos con los lmites exigidos por la norma en pro de determinar su validez.
51
8. RECOMENDACIONES.
Utilizar solucin salina y no el diluyente citado en la norma, para la preparacin de las

suspensiones de ensayo y validacin, ya que este puede interferir con la lectura de la
absorbancia.
Si la suspensin de ensayo cumple con la absorbancia terica del patrn nmero 1 de Mc

-5
Farland, al utilizar la cuarta parte de la dilucin 10 de la suspensin de ensayo, el recuento
de la suspensin de validacin cumple con el rango de especificacin de la norma.
Para la preparacin de la suspensin de ensayo de P. aeruginosa y E. hirae, ajustar la

suspensin a una concentracin alta (abs: 0.2) y realizar el recuento, el cual servir para
preparar las suspensiones por el mtodo de dilucin.
52
9. REFERENCIAS
Ascenzi, L. 1996. Handbook of disinfectants and antiseptics. New York. Marcel Kekker.
Chatterjee.I., Somerville.G.A., Heilmann.C., Sahl.H., Maurer.H.H., and Herrmann.M. 2006.

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53
Ninemeier, J.D. 2000.Principios de desinfeccin: esterilizacin y reprocesamiento de

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Organizacin Panamericana de la Salud. 2002. Cabinas de seguridad biolgica: uso,

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Rochon-Edouard.S., Pons.J:L., Veber.B., Larkin.M., Vassal.S., Lemeland.J.F. 2003.

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Romero Tabares, Antonio. Actualizacin 2002. Informe sobre el desinfectante New Ger....
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www.academia.cat/societats/farmcl/llibre/higiene/332.pdf
www.aenor.es/desarrollo/normalizacion/normas/buscadornormas.asp?pag=p - 122k
www.gastroenlared.com.ar/template.php?pagina=./Articulos/AsistenciaEnEndoscopia/Asisten
ciaGE.htm - 32k -
www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/tema14.pdf -
54
ANEXO 1. METODOLOGIA I
55
ANEXO 2. METODOLOGIA II
56
ANEXO 3
INFORME DEL ENSAYO
Identificacin de la muestra de desinfectante:
Nombredelproducto: CLEANHANDS
Nmerodelote: CL0G0072
Fabricante: ROPINparaVICARFARMACUTICAS.A.
Condicionesdealmacenamiento: Temperaturainferiora30C
SustanciaacNva: Alcoholeelico70%.
Periododelanlisis: NOV/24/2007hastaENE/11/2007
Resultados: VanseTablas9a20
Conclusin:
De acuerdo con la NTC 5473 del ICONTEC, el lote CL0G0072 del producto CLEAN HANDS,
cuando se utiliza como indica el productor (sin diluir), posee actividad bactericida a partir de
los dos minutos de contacto a 20 C y a 36 C tanto en condiciones limpias (0.3 g/L albmina
de suero bovino) como en condiciones sucias (3 g/L albmina de suero bovino y 3 g/L
eritrocitos de oveja); frente a las cepas mencionadas de Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus y Enterococcus hirae. La media aritmtica de la reduccin de seis
5
rplicas fue mayor a 1.0 x 10 frente a los microorganismos mencionados en todos los casos
y bajo la influencia de las variables propuestas.
Bogot Colombia, 2008-01-13
1
MARN DAZ JUAN CARLOS
2
NAVARRO PEA NATHALIA FERNANDA
3
SANTOS ARVALO NATALIA
1,2,3, Estudiantes de Microbiologa Industrial PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
57
RESULTADOSDELENSAYO,VALIDACINYCONTROLES
Explicaciones:
VC:recuentosporml
X:mediaaritmNca
R:reduccin
Tabla 9. INTERFERENTE LIMPIO 20 C Pseudomonas aeruginosa
INTERFERENTELIMPIO20CPseudomonasaeruginosa
NV0 CONTROLA
Control
controlA controlB C 2min 5min 10min
XVC 34,33 34,42 34,00 XVC 30,00 29,33 17,50
30XVCdeNVO160? SI SI SI XVCdeA0.5NVOdeA? SI SI SI
CONTROLC
2min 5min 10min
XVC 29.5 34.08 35.33
XVCdeC0.5NVOdeC? SI SI SI
CONTROLB
XVC 34,42
XVCdeB0.5NVOdeB? SI
XNA R(LOG(N0/NA))
N N0 LOGN LOGN0 7.17LOGN07.70?
2min 5min 10min 2min 5min 10min
8 7
1,6*10 1,6*10 8.2 7.2 SI <140 <140 <140 5,058 5,058 5,058
R5? SI SI SI
58
Tabla 10. INTERFERENTE LIMPIO 36 C Pseudomonas aeruginosa
INTERFERENTELIMPIO36CPseudomonasaeruginosa
NV0 CONTROLA
Control
XVC 33,5 34,42 35,33 XVC 31,66 19,83 19,83
CONTROLC
2min 5min 10min
XVC 32,83 33,58 35,41
CONTROLB
XVC 34,42
XVCdeB0.5NVOdeB? SI
XNA R(LOG(N0/NA))
8 7
1.6*10 1.6*10 8.2 7.2 SI <140 <140 <140 5,058 5,058 5,058
R5? SI SI SI
59
Tabla 11. INTERFERENTE SUCIO 20 C Pseudomonas aeruginosa
INTERFERENTESUCIO20CPseudomonasaeruginosa
NV0 CONTROLA
Control
XVC 34,5 34,42 33,25 XVC 23,08 22,91 22,83
30XVCdeNVO
160? SI SI SI XVCdeA0.5NVOdeA? SI SI SI
CONTROLC
2min 5min 10min
XVC 36,66 32,25 32,08333
CONTROLB
XVC 34,42
XVCdeB0.5NVOdeB? SI
XNA R(LOG(N0/NA))
7.17LOGN0
N N0 LOGN LOGN0
7.70?
8 7
1.9*10 1.9*10 8.27 7.27 SI <140 <140 <140 5,13 5,13 5,13
R5? SI SI SI
60
Tabla 12. INTERFERENTE SUCIO 36 C Pseudomonas aeruginosa
INTERFERENTESUCIO36CPseudomonasaeruginosa
NV0 CONTROLA
control
XVC 33,5 34,42 35 XVC 26,66 25,66 25,16
CONTROLC
2min 5min 10min
XVC 35,75 37,5 33,42
CONTROLB
XVC 34,42
XVCdeB0.5NVOdeB? SI
XNA R(LOG(N0/NA))
8 7
1.9*10 1.9*10 8.27 7.27 SI <140 <140 <140 5,13 5,13 5,13
R5? SI SI SI
61
Tabla 13. INTERFERENTE LIMPIO 20 C Staphylococcus aureus
INTERFERENTELIMPIO20CStaphylococcusaureus
NV0 CONTROLA
Control
controlA ControlB C 2min 5min 10min
XVC 35,5 38,17 41,5 XVC 34,91 23,5 22,25
CONTROLC
2min 5min 10min
XVC 39,08 46,75 46,16
CONTROLB
XVC 38,17
XVCdeB0.5NVOdeB? SI
XNA R(LOG(N0/NA))
8 7
1.8*10 1.8*10 8.25 7.25 SI <140 <140 <140 5,11 5,11 5,11
R5? SI SI SI
62
Tabla 14. INTERFERENTE LIMPIO 36 C Staphylococcus aureus
INTERFERENTELIMPIO36CStaphylococcusaureus
NV0 CONTROLA
control
controlA ControlB C 2min 5min 10min
XVC 34 38,17 33,92 XVC 23,25 23,58 25,16
CONTROLC
2min 5min 10min
XVC 36,75 34,58 37,91
CONTROLB
XVC 38,17
XVCdeB0.5NVOdeB? SI
XNA R(LOG(N0/NA))
8 7
1.8*10 1.8*10 8.25 8.25 SI <140 <140 <140 5,11 5,11 5,11
R5? SI SI SI
63
Tabla 15. INTERFERENTE SUCIO 20 C Staphylococcus aureus
INTERFERENTESUCIO20CStaphylococcusaureus
NV0 CONTROLA
Control
XVC 33 38,17 36,5 XVC 33,75 36,42 34,83
CONTROLC
2min 5min 10min
XVC 34,75 35,91 37,33
CONTROLB
XVC 38,17
XVCdeB0.5NVOdeB? SI
XNA R(LOG(N0/NA))
8 7
1.5*10 1.5*10 8.17 7.17 SI <140 <140 <140 5.03 5.03 5.03
R5? SI SI SI
64
Tabla 16. INTERFERENTE SUCIO 36 C Staphylococcus aureus
INTERFERENTESUCIO36CStaphylococcusaureus
NV0 CONTROLA
control
XVC 33,92 38,17 36,58 XVC 34,92 35 33,92
CONTROLC
2min 5min 10min
XVC 36,33 35,33 35,75
CONTROLB
XVC 38,17
XVCdeB0.5NVOdeB? SI
XNA R(LOG(N0/NA))
8 7
1.5*10 1.5*10 8.17 7.17 SI <140 <140 <140 5.03 5.03 5.03
R5? SI SI SI
65
Tabla 17. INTERFERENTE LIMPIO 20 C Enterococcus hirae
INTERFERENTELIMPIO20CEnterococcushirae
NV0 CONTROLA
Control
XVC 107,5 116,5 110,5 XVC 111,8 116 114,6
CONTROLC
2min 5min 10min
XVC 109 117 109
CONTROLB
XVC 116,5
XVCdeB0.5NVOdeB? SI
XNA R(LOG(N0/NA))
8 7
4.6*10 4.6*10 8.66 7.66 SI <140 <140 <140 5,51 5,51 5,51
R5? SI SI SI
66
Tabla 18. INTERFERENTE LIMPIO 36 C Enterococcus hirae
INTERFERENTELIMPIO36CEnterococcushirae
NV0 CONTROLA
control
XVC 111,5 116,5 110 XVC 116,5 112,5 108
CONTROLC
2min 5min 10min
XVC 104 100 102
CONTROLB
XVC 116,5
XVCdeB0.5NVOdeB? SI
XNA R(LOG(N0/NA))
8 7
4.6*10 4.6*10 8.66 7.66 SI <140 <140 <140 5,51 5,51 5,51
R5? SI SI SI
67
Tabla 19. INTERFERENTE SUCIO 20 C Enterococcus hirae
INTERFERENTESUCIO20CEnterococcushirae
NV0 CONTROLA
Control
XVC 25,4 116,5 25,67 XVC 24 24 24,25
CONTROLC
2min 5min 10min
XVC 27,5 26,33 25,5
CONTROLB
XVC 116,5
XVCdeB0.5NVOdeB? SI
XNA R(LOG(N0/NA))
8 7
1.5*10 1.5*10 8.17 7.17 SI <140 <140 <140 5,08 5,08 5,08
R5? SI SI SI
68
Tabla 20. INTERFERENTE SUCIO 36 C Enterococcus hirae
INTERFERENTESUCIO36CEnterococcushirae
NV0 CONTROLA
Control
XVC 24,5 116,5 28 XVC 29 27,6 29,67
CONTROLC
2min 5min 10min
XVC 26,5 25 26
CONTROLB
XVC 116,5
XVCdeB0.5NVOdeB? SI
XNA R(LOG(N0/NA))
8 7
1.5*10 1.5*10 8.17 7.17 SI <140 <140 <140 5,08 5,08 5,08
R5? SI SI SI
69
70
71

Tesis Gino Bacterias

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EVALUACIN DEL MTODO DILUCIN NEUTRALIZACIN APLICADO A UN

DESINFECTANTE SEGN LA NORMA TCNICA

JUAN CARLOS MARN DIAZ

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

Artculo 23 de la Resolucin N 13 de Julio de 1946

JUAN CARLOS MARN DIAZ

Cindy Fernandez, Microbiloga Industrial Joel Guarn, Qumico Farmacutico

JUAN CARLOS MARN DIAZ

Agradecemos a nuestra Profesora Janeth Arias, por su compaa y constantes palabras de

5.3.2.3. Determinacin de las concentraciones bactericidas 21

En el mbito mdico, la desinfeccin constituye un procedimiento esencial para enfrentar

El proceso de desinfeccin juega un papel importante en la disminucin de la carga

Los mecanismos de desinfeccin empleados, deben asegurar la reduccin de la carga

En el campo de la salud, as como en la industria alimenticia, cosmtica y farmacutica, la

Para la implementacin de un plan de desinfeccin, es necesario realizar una valoracin

Las determinaciones anteriormente nombradas, permiten conocer el espectro de accin del

Considerando la importancia de determinar la concentracin bactericida de un desinfectante,

Igualmente, este trabajo pretende suministrar informacin necesaria y contundente, que

Finalmente, el deseo de esta investigacin es demostrar la importancia del proceso de

2.1. EL PROCESO DE DESINFECCION.

El monitoreo de los sistemas de control,

El mtodo usado para la desinfeccin debe tambin tener en cuenta:

2.2 CARACTERSTICAS DE UN DESINFECTANTE IDEAL.

- Actividad antimicrobiana. Debe ser capaz de matar a los microorganismos. A baja

No existe en el mercado un desinfectante que cumpla todas estas caractersticas. Se escoge

2.3 MODO DE ACCIN DE LOS DESINFECTANTES

2.4 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ACCIN QUMICA DE LOS DESINFECTANTES

Cuando se deba efectuar una desinfeccin utilizando desinfectantes qumicos, deber

2.5 IMPORTANCIA DE LA EVALUACIN DE DESINFECTANTES.

La poltica de adquisicin y uso apropiado de desinfectantes es un elemento importante en la

2.6. EVALUACIONES DE NEUTRALIZACIN COMO EXPERIMENTOS DE CONTROL

2.6.1 Mtodos De Evaluacin De Desinfectantes:

2.6.3. Neutralizacin por dilucin: La concentracin de un desinfectante ejerce un amplio

2.7. FACTORES QUE AFECTAN LA NEUTRALIZACIN DE LOS ANTIMICROBIANOS

importante comparar la recuperacin de los microorganismos del neutralizador en presencia

2.8. NORMATIVA MUNDIAL SOBRE EVALUACION DE DESINFECTANTES

2.8.2. Normativa Europea

Fase 1: normas bsicas de suspensin en agua destilada. Estas normas demuestran la

UNE-EN 1040:2006. Antispticos y desinfectantes qumicos. Ensayo cuantitativo de

fungicida de los desinfectantes qumicos utilizados en productos alimenticios, en la industria,

2.8.3. Normativa estadounidense.

ASTM: Sociedad American Section of the International Association for Testing

2.8.4. Normativa Colombiana.

NTC 5408 2006-02-22. Mtodo cuantitativo en suspensin para determinar la actividad

Es importante no solo escoger el desinfectante adecuado, sino determinar que la

La importancia de esta investigacin radica en la posibilidad de economizar tiempo, producto

La precisin de esta metodologa determinada por medio de la repetibilidad de los ensayos

4.1. OBJETIVO GENERAL.

4.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS

Establecer las condiciones experimentales para la implementacin del mtodo de

Implementar el mtodo de ensayo dilucin-neutralizacin, utilizando un desinfectante

Verificar la efectividad del mtodo de ensayo dilucin-neutralizacin, para la

Reportar los resultados obtenidos por medio de la elaboracin de un informe del

5.1 Diseo de la investigacin (experimental o de investigacin): El diseo de la

5.1.1 Poblacin de estudio y muestra:

5.1.2 Variables del estudio:

5.2.2. Medios de cultivo:

Solucin de cloruro de sodio.

5.3.1. Establecimiento de las condiciones experimentales para el mtodo de ensayo

Para la ejecucin de la metodologa, se tuvieron en cuenta las condiciones estipuladas por la

Las sustancias interferentes manejadas en el ensayo fueron solucin de albmina de suero

5.3.2. Implementacin del mtodo de ensayo dilucin-neutralizacin segn la norma

5.3.2.1. Preparacin de las suspensiones de los microorganismos de ensayo.

5.3.2.2. Preparacin de las suspensiones del organismo de validacin.