Cdigo:

Centro Nacional de Asistencia Tcnica a la Industria ASTIN 9230-FP-F-322

Versin: 2
TALLER TINCIONES EN EL LABORATRIO DE MICROBIOLOGA

1. IDENTIFICACIN DEL INSTRUMENTO:

Programa de Formacin: Ficha de caracterizacin:
Tecnlogo en Qumica Aplicada a la Industria 1145160
Nombre de la Gua: Cdigo de la Gua:
Determinacin de las condiciones tcnicas 9230-FP-O-314 V4
Nombre del Instructor: Marcelo Guancha
Ciudad y fecha:

2. PRESENTACIN E INSTRUCCIONES PARA EL DILIGENCIAMIENTO:

Seor/a Aprendiz:
Resuelva los problemas o casos planteados.
Al responder escriba con letra clara y sea conciso.
Entregue los productos al Instructor y solicite retroalimentacin del taller.

3. CUERPO DEL INSTRUMENTO:

3.1. INTRODUCCIN
Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color a clulas, tejidos, fibras, etctera. De
acuerdo con su origen, se pueden dividir en: colorantes naturales, los cuales son extrados de plantas o
animales, y colorantes artificiales, que son aquellos de minerales procesados y manipulados en el
laboratorio. Todo colorante, se caracteriza por presentar un grupo cromforo que tiene como funcin teir
la estructura y un grupa auxocromo, el cual participa de la reaccin, para que se d la tincin. Los
colorantes se clasifican en catinicos (bsicos), aninicos (cidos); basados en la carga presente en el
grupo cromforo.

Aunque los microorganismos vivos se pueden observar directamente en fresco al microscopio ptico, la
mayora de las veces es necesario teirlos para que por medio del uso de colorantes, sea mucho ms
fcil su identificacin; adems, la presencia de ciertas estructuras, as como su reaccin a determinadas
tcnicas, nos permite clasificar a las bacterias. As pues, los colorantes tienen las siguientes funciones:

1. Permiten hacer visibles a los objetos microscpicos y transparentes.

2. Revelan su forma y tamao.
3. Muestran la presencia de estructuras internas y externas.
4. Producen reacciones qumicas especficas.

Las tinciones se pueden clasificar como simples cuando toda la muestra se tie del mismo color y se
utiliza un slo colorante (azul de lactofenol o tinta china); tincin diferencial, cuando se visualiza ms de
un color porque se utiliza ms de un colorante (Gram o Ziehl-Neelsen); tincin especfica, cuando se
utilizan anticuerpos marcados con una molcula fluorescente para identificar una estructura celular en
particular (inmunocitoqumico) o para identificar estructuras como flagelos, cpsulas y/o esporas.

Tincin Simple. Las tinciones se basan en la utilizacin de colorantes que pueden clasificarse como
naturales o sintticos. Los naturales se utilizan principalmente con fines histolgicos. La mayor parte de
los colorantes que se utilizan para teir bacterias son sintticos, muchos de ellos son las anilinas y
derivados del benceno. Se habla de coloracin simple cuando una muestra extendida se tie con un solo
colorante. Si la preparacin se tie con safranina, las bacterias adquiriran un color rojo, si se utiliza azul
de metileno, se teirn de azul, si por el contrario se tien con cristal violeta, las bacterias aparecern
teidas de color violeta, es decir adquirirn el color del nico colorante que se utiliz. Este procedimiento
permite distinguir la morfologa y estructuras internas de la clula bacteriana, como por ejemplo, la
presencia de endospora bacteriana. Existen coloraciones especiales que permiten poner de manifiesto
estructuras bacterianas como por ejemplo: flagelo, cpsula, endosporas, etc.
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La tincin de Gram es una de las ms importantes en

microbiologa porque permite diferenciar a las bacterias en
Gram Negativas y Gram Positivas, con relacin a la
diferencia en las paredes celulares. En sta coloracin los
reactivos actan de la siguiente manera: el cristal violeta,
colorante primario, tie las bacterias y la solucin yodada
hace de mordiente o fijador de color haciendo que las
bacterias se observen teidas de un azul mas fuerte. El
solvente orgnico actuar como decolorante al eliminar de
la pared celular de las Gram Negativas la capa lipdica,
permitiendo que el colorante se libere. Las Gram Positivas
no se ven afectadas por el decolorante y en consecuencia
las Gram Negativas no se observan y las Gram Positivas
retienen el colorante. Por ltimo, un colorante secundario,
la safranina, tendr la funcin de hacer el contraste al teir
las bacterias Gram Negativas decoloradas en el paso anterior.

La morfologa de los microorganismos puede ser observada a partir de preparados frescos o fijos y
teidos. Las tinciones junto con la microscopia de luz son una herramienta bsica en microbiologa,
permitiendo estudiar las propiedades de los microorganismos y su divisin en grupos especficos para
propsitos diagnsticos. De acuerdo a la disposicin, forma y tamao, las bacterias se clasifican en:

Formas y disposiciones representativas de las clulas bacterianas

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Cuando los microorganismos crecen sobre medios de cultivo exhiben diferencias en la apariencia
macroscpica de su crecimiento, estas diferencias llamadas caractersticas culturales, son la base para la
separacin de ellas en grupos taxonmicos. La morfologa colonial, es una caracterstica indispensable a
tener en cuenta en el aislamiento primario de una bacteria y, en la cual se debe considerar el borde y la
elevacin de la misma. Adicionalmente, es importante apreciar la consistencia y la textura de la masa
celular, tambin la pigmentacin de la colonia. La descripcin se realiza sobre las colonias formadas
(agrupamiento bacteriano originado por el crecimiento y observable macroscpicamente), de forma
aislada y se evala de la siguiente manera:

Descripcin macroscpica realizada en colonias.

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3.2. OBJETIVOS
Reconocer la morfologa celular bacteriana y otros aspectos morfolgicos.
Conocer los fundamentos, utilidades y procedimientos aplicados a las tinciones bacterianas, para
la observacin de las principales estructuras.
Desarrollar las metodologas de tincin simple y Gram aplicadas a las bacterias.

3.3. ACTIVIDADES PRELABORATORIO

Consultar sobre:
Morfologa de las bacterias
Tincin microbiolgica
Bacterias Gram positivas y Gram negativas
Estructura de las paredes celulares

3.4. MATERIALES DEL APRENDIZ

Cada Aprendiz debe contar con los siguientes implementos de trabajo y seguridad
Gua de laboratorio.
Cuaderno exclusivo para el laboratorio.
Blusa blanca de laboratorio que cubra hasta las rodillas de manga larga.
Gafas de seguridad, tapabocas, cofia y guantes,
Calculadora, regla, cinta de enmascarar, tijeras, toalla pequea.
Papel kraft, viniplast, papel aluminio, algodn y gasa

3.5. REACTIVOS
Etanol
Cultivo Agar nutritivo
Cultivo Agar PDA
Azul de metileno.
Agua destilada.
Lugol de Gram
Safranina
Cristal Violeta de gram
Alcohol acetona
Verde malaquita
KOH 3%

3.6. MATERIALES QUE SUMINISTRA EL LABORATORIO (POR GRUPO)

Lamina Portaobjetos
Lamina Cubreobjetos
Microscopio ptico
Asa microbiolgica.
Mecheros.
Goteros
Servilletas de papel

3.7. ACTIVIDAD EXPERIMENTAL

MORFOLOGA BACTERIANA
1. Con los cultivos bacterianos suministrados, realice la descripcin morfolgica de la colonia o tipo de
crecimiento observado; defina los siguientes conceptos: forma, elevacin, borde, tamao, superficie,
consistencia, aspecto y pigmentacin.
2. Tabule los datos.

TINCIONES SIMPLES Y COMPUESTAS

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Procedimiento para tinciones simples

1. Limpies las lminas con agua y jabn. Squelas y posteriormente desengrase con alcohol y deje
evaporar.
2. Identifique cada lmina con el nmero o nombre de la muestra.
3. Coloque una gota de agua destilada sobre el portaobjetos y extienda la muestra de las bacterias con
el asa bacteriolgica estril.
4. Pase la muestra dos o tres veces sobre la llama del mechero para fijar la muestra.
5. Vierta sobre el frotis el colorante azul de metileno y deje actuar por 2 minutos.
6. Pasado el tiempo, lave cuidadosamente el exceso de colorante con agua.
7. Deje secar al aire con la placa de tincin inclinada.
8. Lleve la muestra al microscopio y observe con los diferentes objetivos.

Procedimiento para tincin de Gram

1. Limpies las lminas con agua y jabn. Squelas y posteriormente desengrase con alcohol y deje
evaporar.
2. Identifique cada lmina con el nmero o nombre de la muestra.
3. Coloque una gota de agua destilada sobre el portaobjetos y extienda la muestra de las bacterias con
el asa bacteriolgica estril.
4. Dejar que la muestra seque al aire.
5. Despus de seco, pase la muestra dos o tres veces sobre la llama del mechero para fijar la muestra.
6. Vierta sobre el frotis el colorante cristal violeta y deje actuar por 1 minuto.
7. Lave con agua y escurra el exceso.
8. Seguidamente cubra el frotis con lugol y deje actuar por 1 minuto.
9. Lave con agua y escurra el exceso.
10. Ahora cubra el frotis con solucin decolorante, por 30 segundos.
11. Lave con agua y escurra el exceso.
12. Seguido, cubra la muestra con colorante de contraste (Safranina o fuschina) y deje actuar por 1
minuto.
13. Lave con agua y escurra el exceso.
14. Dejar que la preparacin se seque al aire dejando la lmina en posicin inclinada.
15. Observe en el microscopio con todos los objetivos.

BIBLIOGRAFA

Rojas-trivio, A. (2011). Conceptos y prcticas de microbiologa general. Universidad Nacional de

Colombia - Sede Palmira.

Montoya Campuzano, O. (1999). Manual de Microbiologa. Universidad Nacional de Colombia Sede

Medellin.

Lpez Jcome, L. Las tinciones bsicas en el laboratorio de microbiologa. Investigacin en discapacidad.

2014, 3, 10-18.

4. PRODUCTO (S):
1. Preinforme en la bitcora de laboratorio
2. Informe de la prctica.

Observaciones y/o recomendaciones: