Recibe despus de la incubacin, se utilizan para bsqueda del MPN segn las tablas

respectivas de Mac Grady.

Un ejemplo.

Cinco tubos paralelos de cada dilucin (1:106 =10-6 del cultivo original, 1:107=19-7 del cultivo
original, 1:108=10-8 del cultivo original)

Incubados en un tiempo con 35 c muestran los resultados siguientes:

5 tubos positivos de la dilucin 10-6 5

2 tubos positivos de la dilucin 10-7 2
0 tubos positivos de la dilucin 10-8 0

El agrupamiento de los nmeros de los resultados es 5 2 0, con este nmero compuesto se

entra en la tabla correspondiente de McGrady y se encuentra el nmero ms probable:

5.0

La interpretacin:

En la dilucin 1:106 del cultivo original se encuentra como nmero ms probable 5.0 bacterias
por mililitro.

El clculo del MPN para el cultivo original s realiza por la divisin por el factor de la dilucin o
sea 10-6:

5.0/10-6 = 5x106 (bacterias / ml)

Mientras tanto existen programas para computadoras sobre la base de frmulas matemticas
de la estadstica, con los cuales se ha desarrollado tablas para el MPN con diferentes lmites de
confianza, p. ejemplo. 95% y 99%. Los resultados muestran una pequea discrepancia con
respecto a la tabla de McGrady, la que se recomienda ac para los casos de aplicacin.
Para la determinacin de la poblacin de cultivos puros de Thiobacillus Thiooxidans, se utiliza
la formacin de azufre que se produce por medio del metabolismo con tiosulfato, para
reconocer la presencia de thiooxidans en las diluciones respectivas. La solucin nutriente se
muestra turbia despus del tiempo de incubacin con 35c.

2.7.2 CONTRASTE DE FASES PARA EL MICROSCOPIO

El contraste de fases para el microscopio ( segn Zernicke) mejora mucho las observaciones de
bacterias y el conteo de poblaciones de cultivos.

La bacterias como Thiobacillus Ferrooxidans son objetos tan delgados, y sin coloracin
especial, que resulta bastante difcil la observacin por la luz transmitida de estos
microorganismos. La absorcin, la difraccin de la luz y el ndice de refraccin de las bacterias
como objetos, no son lo suficientemente fuerte para la fcil observacin.

El mtodo de contraste de fases aprovecha las diferencias en las densidades pticas (ndice de
refraccin ) del objeto ( bacteria) y la difraccin de la luz por el objeto.
Por el condensor los objetos son iluminados con luz en forma de anillos concentrados. En el
plano focal del objeto del microscopio, donde enfocado este anillo de iluminacin del
condensor se encuentra una pequea placa de fase que cambia la fase de luz paralela, la que
pasa sin contacto con objetos.

El cambio de la fase de luz paralela ( luz de fondo) por la placa de fase resulta de modo que la
diferencia de la fase de las luz del objeto alcanza 180. Por la coloracin gris de la placa fase del
objetivo se reduce la amplitud de la luz y el fondo resulta claro. El mejor contraste de fases se
recibira con luz monocromtica. En la prctica se utiliza luz verde por la adaptacin ptica del
microscopio.

2.7.3PODER RESOLUTIVO Y AUMENTO

La eficacia de un microscopio es caracterizado por los parmetros del poder resolutivo y del
aumento.

Para recibir una imagen de interferencia, que permita la observacin de objetos, es necesario
que el 1er orden de la luz disfrazado, entre en la apertura del objeto.

Dos puntos de un objeto pueden ser observado separados, cuando su distancia es ms grande
que:

/A Donde: = longitud de onda.

A= apertura numrica del objeto.

Mientras mas grande es la longitud de onda, utilizada para la observacin, ms grande tiene
que ser la distancia de dos puntos que se quiere observar separados en una imagen.

La apertura numrica resulta hasta 1.0 para objetivos secos y hasta 1.4 para objetivos de
inmersin.

El poder resolutivo se define como: /A

Resulta que no se puede separar estructuras que son notablemente ms pequeos que la
longitud de onda aplicada para la observacin. El microscopio con luz visible tiene de este
modo sus limitaciones con = 0.2 m de distancia de dos puntos.

Por la limitacin del poder resolutivo solamente es til el aumento hasta cierto lmite. Este
lmite del aumento total se encuentra entre 500 y 1000 veces la apertura numrica del
objetivo.

El objeto de inmersin tiene una apertura numrica de:

A= 1.4

El aumento mximo que es til en este caso A, llega hasta:

1400

Un aumento mayor que no sirve para el poder resolutivo y el aumento de 1400 es provechoso
slo con aceite de inmersin y el objetivo correspondiente.

2.8 TRANSFERENCIA DE ENERGIA EN SISTEMAS BIOLGICOS.

Un mayor problemas de vida es la transferencia de energa desde una fuente al organismo y la

utilizacin de parte de esa energa para su crecimiento, multiplicacin y otros procesos
biolgicos.

Compuestos fosforosos estn generalmente reconocidos que juegan un rol universal en los
fenmenos de transferencia de energa. El mantenimiento de sistemas biolgicos
aproximadamente a temperatura y presin constantes requiere la transferencia de energa
desde reacciones exergnicas (exotrmicas) a reacciones endergnicas (endotrmicas). Un
mecanismo lgico para tales procesos incluye un acoplamiento de las reacciones exergnicas y
endergnicas por medio de un compuesto comn a ambas reacciones.

Es universalmente admitido que la energa metablica de la oxidacin del substrato se

trasfiere al ATP. El ATP cargado entonces transporta la energa bioqumica a todas partes de la
clula donde la energa puede ser requerida para la sntesis y mantenimiento. La energa del
ATP es utilizado en la clula para el trabajo de transporte, trabajo mecnico y de biosntesis y
en este proceso el ATP es hidrolizado a ADP ms fosfato inorgnico. La forma qumica del ADP
y APT est dado en la siguiente figura.
 2.9 ADAPTACION DE BACTERIA

La actividad bacterial se mejora efectuando repetidos cultivos sobre el mismo substrato. Este
seguimiento est ilustrado en la siguiente figura.

Mediante una adaptacin se logra:

Disminucin del tiempo muerto ( tiempo improductivo)

Aumento de grado de extraccin del metal.
Incremento en la velocidad de extraccin.
Cuando las curvas de extraccin estn muy cercanas, se puede considerar como que la
adaptacin ya finaliz. (ver curvas IV y V)
La bacteria a partir de la prueba I es usada como inculo para la prueba II y as
sucesivamente.

2.10 FASE EXPONENCIAL

Algunas veces la transicin entre fases es muy pronunciada. En otros casos hay fases
intermedias, es decir, una FASE DE ACELERACION entre las fases muerta y exponencial, y una
FASE DESACELERACION, entre la fase exponencial y la fase estacionaria.
Durante la fase exponencial el logaritmo del nmero de clulas (lnx o logx) aumenta con el
linealmente con el tiempo.

Ln X = constante + Kt (83)

Donde K es la velocidad de crecimiento especfico y la ecuacin 83 se puede escribir como:

X= X0 ekt (84)

O como

Ln X/X0 =kt (85)

Donde X0 es el valor de X extrapolado a t=0 segn se muestra en la fig. 28.

Solamente si no hay fase muerta, X0 ser el nmero actual de clulas al comienzo del
experimento.

Fig 28.- ploteo del logaritmo del nmero de clulas contra el tiempo, para la fase exponencial.

Es conveniente definir el tiempo medio de generacin, t2 , el cual es el tiempo que toma para
que cada nmero de clulas se dupliquen durante la fase exponencial.
Correspondiente a:

Ln X/X0 = ln2 (86)

De manera que a partir de la ecuacin (85) llegamos a:

T2 = ln2/k = 0.693/k (87)

Si se observa cada clula individual, se ver que aumenta en tamao y eventualmente se

divide en 2 clulas hijas, cada una delos cuales, rece y luego se divide. El tiempo entre una
divisin de la clula y el siguiente es el tiempo de generacin, y vara muy ampliamente para
un tipo de clula dada. El TIEMPO MEDIO DE GENERACION, es el tiempo medio de divisin
para todas las celulas en un cultivo dado, bajo las condiciones particulares del experimento.

2.11 FASE MUERTA

En el acpite anterior no se consider la fase muerta, y X0 podra por consiguiente tomarse

como el nmero de clulas al comienzo del experimento. Si hay una fase muerta, el tiempo
medio de generacin se debe calcular de los datos tomados dentro de la fase experimental, y
luego la duracin de la fase muerta puede ser calculada. El procedimiento se ilustra mejor con
un ejemplo.

PROBLEMA

Un medio de cultivo (FeSO4) fue inoculado con 2 x 105 clulas de T. Ferrooxidans x dm-3.
Despus de 27 horas el sistema ha entrado a la fase exponencial y haba 1.2 x 106 clulas x dm-
3
. Despus de 3 dias estuvo todava en la fase exponencial y haba 3.5 x 107 clulas x dm-3.

Calcular:

a.-velocidad de crecimiento especfico.

b.- el tiempo medio de generacin dentro de la fase exponencial.

c.- duracin de fase muerta.

SOLUCION

Podemos tratar con la fase exponencial cambiando la escala del tiempo considerando las 27
horas medidas como t= 0, y los 3 das medidos como t= (2x24-27). Luego la velocidad de
crecimiento especfico ser:

K= 2.303/45x60 log 3.5x 107/1.2 x 106 = 0.00125 min-1 (a)

T2= 0.693/0.00125= 554.4 min = 554.4/ 60 = 9.24 horas (b)

Podemos obtener la duracin de la fase muerta calculando el tiempo que tomar 5 x 10 5

clulas x dm-3 para multiplicarse a 3.5 x 107 clulas x dm-3, si no ha habido fase muerta.

Este tiempo dado por la ecuacin (85)

T=1/k ln X/X0 = 2.303/0.00125 log 3.5 x 107/5.0 x 105= 3399.4 min.

Sin embargo, el crecimiento actualmente tom (3x24), horas= 3x24x60 = 4320 minutos, asi la
duracin de la fase muerta es: 4320.0 -

3399.4

920.6 minutos = 15.3 horas (c )

Los clculos realizado se ilustran mediante la siguiente figura.

2.12 FACTORES QUE TIENEN INFLUENCIA EN LA ACTIVIDAD BACTERIAL

La actividad metablica de los microorganismos incluidos los de lixiviacin de sulfuros est

afectada considerablemente por factores ambientales, entre las que podemos mencionar: Eh,
PH, rH2, temperatura, presin, concentracin de nutrientes, tamao de partculas o rea de
superficie del substrato y otros.

2.12.1 EFECTO DEL MEDIO AMBIENTE

Los lmites de la actividad bacterial en el ambiente natural se han estudiado en trminos del
ph y el potencial de oxidacin- reduccin. Este ltimo definido por:

Eh= E + RT/nF x logK (88)

Donde k es la constante de equilibrio de la reaccin. La escala Eh se extiende desde +850 a -

450 mV, mientras que los rangos de ph de 1.0 a 10.2.

Sin embargo estos valores no representan lo limites extremo, la vida todava existe fuera de
ellos. Una indicacin mas sensitiva del efecto del medio ambiente sobre la actividad de los
microorganismos esta dado por:

rH2= log [ aH2] (89)

donde aH2 es la actividad del hidrgeno molecular, el que puede ser definido por la siguiente
ecuacin:

H2 = 2H+ + 2e- (90)

A travs de la aplicacin de la ecuacin 88 y la ecuacin 89 una relacin entre Eh y rH2 se
puede derivar:

H2 = Eh/ 0.029 + 2 ph a 25 c (91)

Los valores de rh2 pueden estar en el rango desde 0 a 41.7 y estn directamente relacionados
al cambio de energa libre de Gibbs:

G = -nF Eh (92)

Adems, G est relacionado a la constante de equilibrio:

G= -RT log K (93)

Los valores de G corresponden a la cantidad mxima de energa que est disponible para los
microorganismos en forma ATP.

2.12.2 FUNDAMENTO TEORICO SOBRE REACCIONES REDOX

Una reaccin electroqumica consiste de una par de reacciones: oxidacin y reduccin

acompaado por prdidas o ganancia de electrones. Todas las reacciones de oxidacin y
reduccin pueden ser divididas en medias reacciones indicando el modo de transferencia del
electrn. En general, una media reaccin se puede expresar como:

Xox +mH+ + ne- = Yred + 2H2O

Y el potencial redoz de esta ecuacin referido al electrodo estndar de hidrgeno est dado
por:

En = Eh - 0.059 (m/n) ph + 0.059/n log [ Ox]X/[ Red]Y a 25 c

Los trminos Red y Ox pueden representar, respectivamente los iones reducidos y

oxidados de una par redox en solucin con potencial medido con un electrodo platino. Cuando
un electrodo se comporta reversiblemente; es decir, la reaccin es capaz de ocurrir en ambas
direcciones no hay diferencia esencial en principio entre su respuesta de electrodo.

Para la medicin de potenciales de oxidacin- reduccin se usan comnmente un par de

electrodos consistente de un electrodo inerte y un electrodo de referencia.

EL ELECTRODO INERTE

Funciona como un aceptor o donador de electrones a los iones en solucin. El platino es el que
se usa mayormente como electrodo inerte. Aunque el Au, C, Ir y otros son mencionados en la
literatura.

ELECTRODO DE REFERENCIA

Electrodo saturado de colomel (SCE) es ampliamente usado para suministrar una F.e.m
conocida.

KCl (saturado), Hg2Cl2 (solido)/ Hg (lquido)

ELECTRODO DE PRIMERA CLASE

Un metal en contacto con sus propios iones en solucin.

ELECTRODO DE SEGUNDA CLASE

Un metal est en contacto con su compuesto insoluble en un electrolito teniendo el mismo

anin que su compuesto insoluble.

En el diagrama Eh- pH, el potencial est normalmente expresado como potencial de reduccin,
segn la convencin de la International Unin of Pure and Applied Chemist :

aA + bB + mH + ne- --------- cC + dD

donde A,B,C y D son solutos inicos, moleculares o gaseosos. El cambio de la energa libre
estndar asociado con esta reaccin est dada por:

G = -RT ln K nF Eh = -RTln (aCc dDd/aAa aBb aHm) nFEh

RT= expresado en cal g-1 mol-1

F= 23060 cal vol-1

Si todas las sustancias excepto el H+ estn en su estado estndar, el potencial de electrodo se

reduce a la simple expresin:

Eh= Eh- 2.3RT/ F (m/n) pH

a) As, a temperatura ambiente la pendiente de una lnea expresando Eh como una

funcin pH es -0.0591 (m/n)
b) Si no hay iones hidrogeno en la ecuacin (m=0) la pendiente es 0.
c) Si hay iones hidrogeno, pero no electrones en la ecuacin, la lnea es vertical y tiene
valor pH fijo.