A ula 9 - Estrutura da molcula de DNA e replicao

Explicar os experimentos que comprovaram que o DNA o material gentico

1. Griffith realizou o primeiro experimento a fim de identificar o DNA como material

gentico, chamado O Princpio da Transformao.
Transformao bacteriana: Captao de molculas de DNA livres, liberadas de uma
bactria (doadora) para outra bactria (receptora).

Aps algum tempo, Avery, MacLeod e McCarty (1944) concluram com uma srie de
repeties de que realmente o princpio transformante o DNA atravs de
experimentos realizados com o pneumococo Streptococcus pneumoniae, podendo se
apresentar de 2 maneiras:
a) Forma virulenta que causa a morte em camundongos por pneumonia: bactrias
encapsuladas, chamadas de colnias S (do ingls, smooth, liso).
b) Forma no virulenta, que no causa pneumonia em camundongos: Variante
mutante, originada a partir da forma virulenta (S), mas que no apresentam
cpsula, chamadas de colnias R (do ingls, rough, rugoso).
 2. Alfred Hershey e Martha Chase (1952): comprovao final Bacterifagos

Os experimentos mostraram que as informaes genticas de determinado vrus bacteriano

(bacterifago T2) estavam no DNA. A composio do bacterifago T2, que infecta a Escherichia
coli, aproximadamente 50% DNA e 50% protena.
A base do experimento de Hershey e Chase a presena de fsforo no DNA, e a presena
de enxofre nas protenas. Assim, Hershey e Chase conseguiram identificar especificamente o
DNA do fago por cultura em meio que continha o fsforo radioativo, 35P; ou a cpsula proteica
do fago por cultura em meio que continha enxofre radioativo, 32S.

Protenas S (enxofre)
DNA P (fsforo)

Descrever a estrutura do DNA

O DNA uma estrutura bifilamentar (dupla hlice), altamente organizada, onde as duas
cadeias polinucleotdicas so espiraladas ao redor uma da outra e h presena de
subestruturas repetidas em intervalos ao longo do eixo da molcula.
Pentose= acar de 5 carbonos

Bases:
1. Purina (guanina e adenina)
Ligao de uma pentose em outra = ARCABOUO
Feita pelo grupo fosfato ligado no carbono 5
Ligao covalente chamada ligao fosfodister (FORTE)

2. Pirimidinas (citosina e timina)

Liga bases nitrogenadas (localizadas no centro) de uma fita com outra (FRACA)

Explicar o mecanismo de replicao de DNA

Elementos necessrios para ocorrer a sntese:

1. Enzima DNA-helicase (ABRE)
2. Protena de ligao unifilamentar (MANTM ABERTA)

3. dNTPs: trifosfato de desoxirribonucleosdeos

4. Enzima DNA polimerase: faz a incorporao de nucleotdeos, reviso e reparo de bases

mal pareadas. Precisa:
Cada nova cadeia de DNA iniciada por um filamento curto de RNA sintetizado por DNA
primase para prover um iniciador de 3' -OH para sntese de DNA. Em seguida, o iniciador de
RNA removido e substitudo por DNA pelas atividades duplas de exonuclease 5' - 3' e
polimerase 5' - 3' presentes na DNA polimerase 1. Depois, a DNA ligase une por ligao
covalente a cadeia de DNA nascente, catalisando a formao de ligaes fosfodister entre 3' -
hidroxilas e 5' -fosfatos adjacentes.

Explicar o que uma molcula recombinante

Molcula artificial de DNA de duas espcies diferentes manipulado experimentalmente.

Transgnicos.

Explicar o procedimento para clonar e amplificar um gene de interesse

1. Construir uma molcula de DNA recombinante capaz de se replicar

Linearizar vetor com EcoRI;
Helicoidizar com DNA exgeno;
Ao da DNA ligase -> Formao da MOLCULA RECOMBINANTE

2. Inserir a molcula em um organismo que a replique

3. Isolar as molculas replicadas

A ula 10 - Transcrio e processamento do RNA. Controle da expresso gnica

Explicar o mecanismo de transcrio do mRNA

Sntese de RNA: sentido 5-3 de crescimento da cadeia

1. Iniciao da cadeia de RNA polimerase saber onde est o gene atravs dos promotores
(sequncias especficas no DNA que direcionam o posicionamento da RNA polimerase) e
comea a incorporar.

2. Alongamento da cadeia de RNA anda e cresce, presena de enzima e stios de

reelicoidizao e desilicoidizao.

3. Trmino mRNA se fecha

RNA polimerase encontra um sinal de trmino no DNA, ocorre a dissociao do complexo.

Identificar as diferenas entre procariontes e eucariontes no mecanismo de

transcrio do RNA

1. Iniciao:
a. Procariontes: RNA polimerase reconhece promotores e se liga ao DNA
b. Eucariontes: fatores de transcrio reconhecem promotores e se ligam ao DNA.
RNA polimerase reconhece os fatores e se liga ao DNA
2. Alongamento:
a. Eucariontes: ocorre a primeira modificao do mRNA = Revestimento (cap) de 7-
MG adicionado extremidade 5.
i. Protege a degradao por nucleases
ii. Reconhecidos por fatores proteicos na iniciao da traduo
3. Trmino:
a. Procariontes: sequncias ricas em GC formam um grampo (RNA). Polimerase
dissocia-se
 b. Eucariontes: clivagem endonucleoltica: corta o RNA nascente. Ocorre a segunda
modificao do mRNA = poliadenilao (adio de cauda poli(A) pela enzima
poli(A)-polimerase)

Explicar as modificaes que ocorrem no mRNA eucarionte aps a transcrio,

mencionando suas funes

Poliadenilao: adio de cauda poli(A).

Acentuam a estabilidade do mRNA.
Transporte do ncleo para o citoplasma.

Recomposio: genes so interrompidos, ntros (intercalares) so retirados antes da

passagem para o citoplasma.
Regulao da expresso gnica: variao em tamanho
Vantagem seletiva: recomposio alternativa dos xons. Ex: genes de -
globina: xons 1,3,4,5.

Identificar em que nveis a expresso gnica pode ser controlada

A expresso gnica pode ser controlada em qualquer um dos vrios pontos ao longo da via
molecular do DNA at a protena, incluindo:
1. estrutura do gene,
2. transcrio,
3. processamento do mRNA,
4. estabilidade do RNA,
5. traduo, e
6. modificaes ps traducionais.

Exemplificar mecanismos de expresso gnica em eucariontes

RNA de interferncia (RNAi) um importante regulador da expresso gnica em clulas

animais, vegetais e de fungos.

Interferncia: Regulaes temporais: eucariotos ligam e desligam seus genes em diferentes

estgios do desenvolvimento, de acordo com as exigncias particulares de cada estgio do
ciclo de vida. Em eucariotos h genes que:
J funcionaram, e que atualmente no funcionam mais;
Esto em funcionamento;
Ainda iro funcionar; e
Nunca funcionaro num determinado tipo celular.

Hormnios, fatores de crescimento, e outras molculas regulatrias: causam mudanas na

expresso gnica de clulas localizadas distncia. Alguns genes respondem a estmulos
externos (ambientais, olfativos, audiovisuais, etc.) alguns genes de plantas s se expressam
na presena de luz.

Ambiental: Ritmos biolgicos: determinados por regulao de genes atravs de ciclos de

expresso determinados por estmulos (ciclo circadiano).
A ula 11 Transformao gentica e Princpios de quantificao de DNA purificado - AULA
PRTICA

Conceituar transformao gentica

Insero de segmento de DNA no ncleo que ser integrado no genoma de outra planta,
excluindo a introduo por fecundao.

Explicar os procedimentos para obteno de plantas transgnicas

1. Isolar e clonar o gene de interesse

o Bibliotecas genmicas
o Triagem do gene de interesse com uso de sondas: do prprio gene; de
gene similar em outro organismo; sintetizadas a partir das protenas
codificadas pelo gene de interesse

2. Transformar clulas vegetais - introduzir o gene de interesse nas clulas

o Transformao mediada por Agrobacterium tumefaciens (Indireta)

-> Transferidos para clula vegetal, onde se integra ao cromossomo da

planta (tumor alimenta a bactria)

Uma vez inserido no DNA hospedeiro, o T-DNA permanece estvel.

Engenheiros e geneticistas retiram o agente causador do tumor

o Transformao por acelerao de partculas ou biobalstica (Direta)

Biobalstica
DNA adsorvido em micropartculas de ouro ou tungstnio
Aparelho para acelerao das micropartculas - Descarga de alta presso de gs hlio
Micropartculas so bombardeadas em tecidos vegetais - Meristemas apicais e clulas
embriognicas
Atravessam parede celular e membrana plasmtica de modo no letal
 o Transformao por eletroporao de protoplastos (Direta, porm
menos comum em espcies florestais)

3. Regenerar uma planta transgnica (parte mais difcil)

A partir de uma clula transformada

Princpio da Totipotencialidade (Haberlandt, 1902): cada clula vegetal possui o
potencial gentico para reproduzir um organismo inteiro
Cultura de tecidos: in vitro (com nutrientes e fitorreguladores)
o Duas vias possveis de regenerao:
1. Organognese: rgos partes areas
a. Via indireta
b. Via direta
2. Embriognese somtica: embrio a partir de uma clula somtica planta
completa

Compreender os princpios e procedimentos sobre quantificao de DNA

Importncia:
Estudar a regulao e funo dos genes
Expressar genes para verificar seu efeito sobre os fentipos relevantes
Obter plantas melhoradas para produo comercial (resistncia a insetos e tolerncia a
herbicidas)
A ula 12 Traduo e cdigo gentico e Mutaes gnicas e reparo do DNA

Explicar o mecanismo de traduo do RNAm, diferenciando eucariontes e procariontes

Explicar as propriedades do cdigo gentico

1. Composto por trincas de nucleotdeos: Cada sequncia de trinca de nucleotdeos (ou cdon)
refere-se sequncia de nucleotdeos no mRNA que especifica a incorporao do aminocido
indicado ou trmino de cadeia polipeptdica.

2. No-superposto : Cada nucleotdeo corresponde a um cdon.

3. No pontuado: Significa que traduzido consecutivamente, no para.

4. Redundante: pois possui cdons parecidos.

5. Ordenado: A redundncia altamente ordenada na tabela.

6. Contm cdons de incio (AUG especifica a metionina) e de trmino (UAA, UAG e UGA
no especificam aminocidos).

7. Quase universal: Tem o mesmo significado em todas as espcies com poucas excees.

Diferenciar os tipos de mutaes de ponto, mencionando as suas consequncias.

Mutaes de Ponto ou Substituio de Base - So mutaes que levam substituio de um

aminocido por outro na cadeia polipeptdica resultante da troca de uma nica base no
polmero de cido nucleico, ou seja, num nico ponto do gene.

a) Mutao de ponto sinnima Quando substituies no provocam mudanas de

aminocidos e so fenotipicamente silenciosas.

b) Mutao de ponto no-sinnima A consequncia pode ser alterao na

conformao da protena ou parada prematura da sntese, caso seja criado um
cdon de parada (UAA, UAG, UGA), ou ainda, alongamento da sntese, caso o cdon
de parada tenha sido substitudo por um cdon especificando um aminocido.

Exemplo: efeito fenotpico que provoca anemia falciforme, doena hereditria humana,
onde o cido glutmico (polar carregado) da cadeia B da hemoglobina substitudo por
valina (hidrofbico).