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el ADN mitocondrial solo contiene una sequencia de 17000 base nitrogenadas y posee solo 37
genes frente a los 20.000 25.000 genes del ADN cromosmico nuclear humano.
Mtodo de ultra centrifugaran con cloruro de cesio:
La separacin est basada en el tamao y la densidad, donde las partculas ms grandes y
densas son precipitadas en centrifugaciones de poca fuerza.
Las molculas de ADN sern separadas, basadas en las diferentes proporciones de AT (pares
de bases nitrogenadas de adenina y timina) respecto a GC (pares de bases nitrogenadas de
guanina y citosina). Un par AT tiene menor peso molecular que un par GC, por lo tanto, para
dos molculas de ADN de igual tamao, aquella con mayor proporcin de pares AT, tendr una
densidad menor, siendo los dems factores iguales. Diferentes tipos de cidos nucleicos
tambin sern separados en bandas, por ejemplo, el ARN es ms denso que plsmidos de
ADN superenrollado, que es ms denso que el ADN lineal cromosmico.
Entonces decimos que para la diferenciacin del ADN mitocondrial del nuclear empleamos el
mtodo de ultracentrifugacion con cloruro de cesio el cual mediante las densidades teniendo en
cuenta las pares de bases que conforman cada ADN y teniendo en cuenta que el mitocondrial
es de menor tamao que el nuclear podremos diferenciar que tipo de ADN estamos extrayendo.
Es Una proteina reactiva con la propiedad de lisar otras protenas si estas se encuentran
desnaturalizadas,ellas
Lisan enlaces peptidicos convirtiendo las proteinas en el adn en pptidos pequeos purificandolo
Caracteristicas:
*Sirve para purificar acidos nucleicos de celular animales y vegetales
*tiene baja especificidad pero La 5 prima tiene alta especificidad.
*degrada todas las proteinas presentes en cierto tiempo
* resistente a altas temperaturas
Actividad de la enzima:
Es activada por el calcio, los iones de calcio no afectan la actividad de la enzima, pero si contribuye a su
estabilidad.
Las proteinas solo se digieren por completo siempre y cuando el tiempo de incubacion es largo y la
concentracion de la enzima alta.
En el momento en el que se eliminan los iones de calcion la estabilidad de la enzima se reduce pero la
actividad proteolitica queda presente.
4) METODO CHELEX-100
El efecto de esta sustancia es prevenir la ruptura del adn a altas temperaturas catalizada por los
iones involucrados.
Consta de 4 pasos:
* Calentamiento
* Centrifugacin
100 ml de muestra.
durante 1 hora.
La lisis de los organclos se llev a cabo por adicin de dodecil sulfato de sodio a una concentracin
final del 2%. Si la solucin no clarificaba con este tratamiento se continuaba la lisis a 65C durante
45 minutos. El tubo se coloc en hielo durante 10 minutos y se centrifug a 3800g en un rotor Sorvall
ss-34 durante 10 minutos a 4C, con el fin de precipitar el material no lisado.
El sobrenadante se desproteiniz utlzando fenol saturado con tris pH 8.0. Se aadi un volumen
igual de fenol, se mezcl y se centrifug a 3000 r.p.m. en una microcentrfuga durante 10 minutos
a temperatura ambiente. Se repit la extraccin de protenas hasta que no aparecieran en la
interfase. Finalmente la fase acuosa se extrajo con fenol/cloroformo/alcohol isoamlico (24/24/1) y
una vez con cloroformo/alcohol isoamlico (24/1). El ADN se precipit con 0.1 del volumen de
acetato de sodio 0.3M y con 0.6 del volumen de isopropanol. El ADN precipitado se disolvi en buffer
TE y se tom el espectro de absorcin.
Con el fin de separar el ADN nuclear del mitocondrial se realiz una ultracentrifugacin en gradiente
de cloruro de cesio utlizando bisbenzimida para visualizar el ADN.
Los gradientes de cloruro de cesio son utilizados para separar diferentes especies de DNA de
acuerdo a su composicin de bases. Las especies de DNA que son enriquecidas en citosina y guanina
bandean denso. El grado de separacin de diferentes especies puede ser utilizado por la adicin de
drogas como la distamicina la cual se une selectivamente a regiones del DNA que son ricas en
adenina y timina y disminuye la densidad de este DNA. En suma, en la presencia de bromuro de
etidio, es posible separar DNA de diferentes conformaciones (ejemplo, superhelicoidal y lineal)
incluso teniendo la misma composicin de bases.
El ADN nuclear y el ADN mitocondrial son diferentes en muchos aspectos; de entrada, por la
ubicacin y la estructura.
El ADN nuclear se encuentra dentro del ncleo de las celulares eucariotas y tiene dos
copias por clula.
El ADN mitocondrial est ubicado en las mitocondrias y contiene 100-1000 copias por
clula.
La estructura del ADN nuclear es una molcula lineal con extremos abiertos y compuesto
de 46 cromosomas y 3 mil millones de nucletidos.
La estructura del ADN mitocondrial es de una molcula cerrada, circulas y compuesto por
16.569 nucletidos.
La herencia del ADN nuclear es diploide, es decir, que hereda el ADN de la madre y el
padre.
La herencia del ADN mitocondrial es haploide, o sea, viene nicamente de la madre.
La tasa de mutacin del ADN nuclear es menos de 0.3 por ciento.
La tasa de mutacin del ADN mitocondrial es generalmente ms alta.