Sibila Lores

Facultad de Ciencias del Mar y Ambientales
Departamento de Ingeniera Qumica, Tecnologa de Alimentos

y Tecnologas del Medio Ambiente
TESIS DOCTORAL
EVALUACIN DE LA BIODEGRADABILIDAD Y
ECOTOXICIDAD DE TENSIOACTIVOS EN EL MEDIO
ACUTICO MARINO
Miguel ngel Sibila Lores
Cdiz, Abril de 2008

EVALUACIN DE LA BIODEGRADABILIDAD Y
ECOTOXICIDAD DE TENSIOACTIVOS EN EL MEDIO
ACUTICO MARINO
Memoria presentada por el Licenciado D. Miguel ngel Sibila Lores para optar al
Grado de Doctor en Ingeniera Qumica por la Universidad de Cdiz
LA PRESENTE TESIS DOCTORAL HA SIDO DIRIGIDA POR LOS PROFESORES

DOCTORES DE LA UNIVERSIDAD DE CDIZ D. JOSE MARA QUIROGA
ALONSO, CATEDRTICO DEL REA DE TECNOLOGAS DEL MEDIO
AMBIENTE, Y D. JOSE ANTONIO PERALES-VARGAS MACHUCA, PROFESOR
TITULAR DE UNIVERSIDAD DEL REA DE TECNOLOGAS DEL MEDIO
AMBIENTE
AGRADECIMIENTOS
Es de bien nacido ser agradecido
Quisiera agradecer a todas y cada una de las personas, que no son pocas,
que, de una manera u otra, han contribuido a la elaboracin de esta Tesis. Quien me
conoce sabe que la escritura no es mi fuerte, entre otras muchas cosas. Si bien,
espero poder reflejar lo mejor posible la importancia de cada una de ellas en la
finalizacin de este doctorado.
Especial agradecimiento a mis directores de Tesis, Jose Mara Quiroga y

Jose Antonio Perales, a quienes no slo les debo gran parte de este trabajo, sino
tambin una parte importante de todo mi aprendizaje y formacin. Gracias por todo
el apoyo y esfuerzo mostrado, fruto del cual se ha llevado a cabo la elaboracin de
diversas publicaciones internacionales, una de ellas recientemente publicada.
Gracias por vuestra paciencia (en algunos momentos, infinita), por todas esas
horas extras de correcciones, planificacin de ensayos, etc., y en general, por
vuestra motivacin y afecto durante todos estos aos.
A D. Diego Sales Mrquez, director del Grupo de Investigacin de

Tecnologa del Medio Ambiente y actual Rector Magnfico de la Universidad de
Cdiz, por su confianza y apoyo, en mayor medida, en los inicios de mi doctorado.
A la Consejera de Innovacin, Educacin y Empresa de la Junta de

Andaluca, por la financiacin del presente trabajo a travs de una ayuda para la
Formacin de Doctores en Centros de Investigacin y Universidades de Andaluca.
A todos y cada uno de los profesores del rea de Tecnologas del Medio
Ambiente, y en especial a la profesora Carmen Garrido, por su dedicacin y ayuda
en los ensayos de ecotoxicidad as como en los aspectos estticos de trabajos
presentados en diferentes congresos. Sus enseanzas en todo lo relacionado con la
Toxicologa marina constituyen una pieza clave tanto en la elaboracin de este
trabajo como en las publicaciones realizadas.
A Isabel Cumbreras (Beli), secretara del Departamento de Ingeniera
Qumica, Tecnologa de Alimentos y Tecnologas del Medio Ambiente, por el
apoyo mostrado en todos los aspectos administrativos.
A mi segunda familia, Antonio Lieiro, Alberto, Abel, Txomin y

Mohammed (Mou), con quienes tuve el placer de crecer en este mundillo,
compartir tantas horas de laboratorio, lamentar ensayos fallidos, disfrutar de
momentos ldico-festivos inolvidables (y los que an quedan por venir) y con los
que siempre he podido confiar. Mis ms dulces recuerdos se los debo a ellos.
A los antiguos compaeros del grupo TMA, Natalia, Esther, Inma, Carlos,
lvaro, etc, quienes durante varios aos compartieron conmigo las penas y
alegras y quienes me ofrecieron su cario y apoyo.
A la nueva generacin de investigadores y doctorandos, Jess, Pablo, Elisa,

Santiago, Manolo, Andaluca, Cristina, Mara Jos (mi cencerrito favorito), Julia,
Juana, etc., quienes consiguen transmitirme ese entusiasmo, dedicacin y energa
que desprenden, y a los ya veteranos Dani, Youssef, Liboeiro, etc., por su amistad
y por aliviar, quizs sin saberlo, mis amargos momentos en el laboratorio (unas
lecciones de guitarra, un cigarrito o un cafelito).
A Jose Ignacio Lores, por su colaboracin en el diseo grfico del presente

trabajo.
A Beatriz Muoz, por su ayuda en las traducciones tanto de la presente

Tesis como en las publicaciones realizadas.
A los doctores Walter Giger y Hans-Peter Kohler del Instituto Federal

Suizo de Ciencias Acuticas y Tecnologa (EAWAG), por brindarme la
oportunidad de realizar una estancia bajo sus tutelas, y complementar as mi
formacin.
A mis compaeros del Instituto Federal Suizo, Simn, Daro, Patricia,

Enrique, Tobias, Holger, Andreas, Christopher, Marius, Vishaka, etc., quienes
hicieron de mi estancia una experiencia nica e inolvidable.
A mis amigos Esteban, Juanqui, Javi, Llad, Manolo, Miguelito, Ivn, etc.
por su amistad y por regalarme unas sonrisas de vez en cuando.
A mis padres y hermanos, quienes de una manera indirecta pero constante
han sufrido los dulces y amargos momentos que uno atraviesa cuando se aventura
en un trabajo de este calibre. Gracias por vuestro cario, paciencia, apoyo y
comprensin, del que he podido disfrutar en todo momento.
A Rafa, quien adems de ser de la familia considero uno de mis mejores

amigos. Gracias por esos inolvidables momentos, viajes, marchitas, etc., que me
permitieron desconectar un poco del trabajo.
Finalmente, quisiera extender mi agradecimiento a todas esas personas, que

an no estando presentes en esta lista, han aportado su granito de arena,
contribuyendo as a la finalizacin de este trabajo.
A todos, Gracias
A mi Familia
A Santiago Santiago Gonzlez,
quien mereca algo mejor
NDICE
Resumen R-1
Summary S-1
Introduccin y objetivos IO-1

Referencias IO-5
Captulo 1. Antecedentes bibliogrficos

1. Tensioactivos y Medio Ambiente I-2
2. Biodegradabilidad en el medio acutico I-6
3. Toxicidad en el medio acutico I-12
Referencias I-17
Captulo 2. Metodologa
1. Diseo experimental II-2
2. Medio de ensayo y punto de muestreo II-7
3. Metodologa para el estudio de la biodegradabilidad II-8
4. Metodologa para el estudio de la toxicidad aguda estndar II-12
5. Metodologa para el estudio de la evolucin de la toxicidad
durante la biodegradacin II-16
Referencias II-17
Captulo 3. Sales de alquil trimetil amonio

1. Introduccin III-2
2. Materiales III-7
3. Resultados y discusin
3.1. Ensayos de biodegradacin III-8
3.2. Ensayos de toxicidad aguda estndar III-14
3.3. Evolucin de la toxicidad del medio de ensayo durante la biodegradacin III-19
4. Conclusiones III-24
Referencias III-25
Captulo 4. Nonilfenoles etoxilados

1. Introduccin IV-2
2. Materiales IV-8
3.1. Ensayos de biodegradacin IV-9
3.2. Ensayos de toxicidad aguda estndar IV-15
3.3. Evolucin de la toxicidad del medio de ensayo durante la biodegradacin IV-20
i
4. Conclusiones IV-23
Referencias IV-24
Captulo 5. Alquil etoxisulfatos

1. Introduccin V-2
2. Materiales V-9
3.1. Ensayos de biodegradacin V-10
3.2. Ensayos de toxicidad aguda estndar V-15
3.3. Evolucin de la toxicidad del medio de ensayo durante la biodegradacin V-20
4. Conclusiones V-23
Referencias V-24
Captulo 6. Alcoholes etoxilados

1. Introduccin VI-2
2. Materiales VI-11
3.1. Ensayos de biodegradacin VI-12
3.2. Ensayos de toxicidad aguda estndar VI-18
3.3. Evolucin de la toxicidad del medio de ensayo durante la biodegradacin VI-23
4. Conclusiones VI-26
Referencias VI-27
Captulo 7. Estudio comparativo de la biodegradabilidad y ecotoxicidad de los

tensioactivos
1. Biodegradabilidad de los tensioactivos estudiados en el medio acutico marino VII-2
2. Toxicidad aguda de los tensioactivos estudiado sobre organismos marinos VII-5
3. Evolucin de la toxicidad del medio de ensayo durante la biodegradacin de los
diferentes tensioactivos estudiados VII-9
Conclusiones generales CG-1

General conclusions GC-1
ii
RESUMEN
El medio marino est constituido por una amplia diversidad de ecosistemas tales
como los arrefices de coral, manglares, sistemas litorales rocosos y arenosos, etc. Cada uno
de estos sistemas contiene una biota caracterstica representada por miles de especies que
con excesiva frecuencia estn expuestas a gran variedad de contaminantes derivados,
generalmente, de la actividad humana. Ms all de los detergentes, cuya aplicacin es la
ms comn, los tensioactivos poseen numerosas aplicaciones dada sus propiedades
emulsionantes, humectantes, dispersantes, as como de solubilidad y resistencia a la dureza
del agua. Su elevado y creciente consumo ha hecho de estas sustancias uno de los
contaminantes ms frecuentes en el medio acutico. Al objeto de evaluar los posibles
riesgos ambientales de estos compuestos, resulta imprescindible el conocimiento de su
distribucin, comportamiento, destino y efectos txicos en el medio natural.
La presente Tesis Doctoral tiene como objetivo fundamental el estudio de la

biodegradabilidad y ecotoxicidad de diferentes familias de tensioactivos (catinicos, no-
inicos y aninicos) en el medio acutico marino.
En el captulo 1 se lleva a cabo una revisin general de los aspectos fundamentales

tratados en este trabajo. En primer lugar se resumen las caractersticas fsico-qumicas ms
importantes de los tensioactivos as como sus principales efectos adversos en el medio
ambiente y la normativa vigente al respecto. Los principales modelos cinticos de
biodegradacin y los aspectos ms relevantes relacionados con el estudio de la toxicidad en
el medio acutico marino son tambin presentados en este captulo.
El captulo 2 describe la metodologa utilizada durante el desarrollo del trabajo

experimental. Se han realizado tres tipos de ensayos: ensayos de biodegradacin, ensayos
de toxicidad aguda estndar sobre organismos marinos y ensayos combinados de toxicidad
y biodegradacin. Todos los ensayos de biodegradacin y toxicidad se realizaron en agua
de mar natural procedente de la zona litoral de Sancti Petri (Cdiz, Espaa). Las principales
caractersticas fsico-qumicas de cada tensioactivo y medio de ensayo aparecen descritas
en los captulos correspondientes.
Los captulos 3, 4, 5 y 6 exponen los resultados obtenidos en los ensayos de

biodegradacin y ecotoxicidad de los diferentes tensioactivos estudiados as como en los
ensayos combinados de biodegradacin y toxicidad de los medios de ensayo.
As, en el captulo 3 se lleva a cabo el estudio de la biodegradabilidad y

ecotoxicidad de una sal de alquil trimetil amonio, en particular del cloruro de dodecil
trimetil amonio (DTMAC), perteneciente a la familia de los tensioactivos catinicos. El
R-1
porcentaje de eliminacin de carbono orgnico disuelto (COD) fue elevado, con un valor
promedio del 91%. Los valores de tiempo de latencia y vida media fueron de 15,17 y 26,95
das, respectivamente. La toxicidad del tensioactivo dependi significativamente del
organismo ensayado, siendo el crustceo marino A. franciscana el menos sensible al
mismo. En el caso de las microalgas, los valores de IC50 estuvieron comprendidos entre
0,69 y 6,34 mg L-1 DTMAC. El tensioactivo presenta una biodegradabilidad
ambientalmente aceptable, ya que durante su biodegradacin no se aprecia un aumento de
la toxicidad del medio.
En el captulo 4 se muestran los resultados obtenidos para el tensioactivo no-inico

TergitolNP9, perteneciente al grupo de los nonilfenol etoxilados. stos indican la
existencia de un potencial para la degradacin del tensioactivo en el medio marino
(porcentaje de biodegradacin final superior al 80%). El modelo cintico que mejor
describi la biodegradacin final de TergitolNP9 bajo las condiciones ensayadas fue el
modelo cintico de primer orden. Las microalgas presentaron una mayor toxicidad que el
crustceo A. franciscana, siendo las especies I. galbana y C. gracilis las ms sensibles al
tensioactivo. Los resultados parecen indicar que el tensioactivo no presenta una
biodegradacin ambientalmente aceptable dado que durante el proceso degradativo tuvo
lugar la formacin de metabolitos ms txicos que el compuesto original.
El captulo 5 est dedicado a la biodegradabilidad y ecotoxicidad del tensioactivo

aninico EmpicolESB 70/SP, perteneciente al grupo de los alquil etoxisulfatos. El
porcentaje de eliminacin de COD fue alto, aunque a una baja velocidad de degradacin
(>96,5% biodegradacin al cabo de 124 das). Durante el proceso degradativo se
distinguieron dos etapas, una primera que podra corresponder con la ruptura hidroltica de
la molcula, y otra en la que la degradacin ocurre principalmente va - y -oxidaciones.
En relacin a la toxicidad, la microalga D. salina se mostr como la ms sensible al
tensioactivo. No se detectaron metabolitos ms txicos durante la biodegradacin del
tensioactivo, lo cual indica que el tensioactivo presenta una biodegradabilidad
ambientalmente aceptable.
En el captulo 6 se exponen los resultados obtenidos con un tensioactivo no-inico

alcohol etoxilado, conocido comercialmente como Findet1214N/23. Los ensayos de
biodegradacin mostraron un elevado porcentaje de biodegradacin final en agua de mar
(>95%), aunque a una baja velocidad de biodegradacin (tiempo de vida media= 56,8 das).
El modelo de orden cero fue seleccionado para el clculo del tiempo de latencia y vida
media. Los valores de toxicidad para las microalgas (EC50) estuvieron comprendidos entre
5,0 mg L-1 para C. gracilis y 35,03 mg L-1 para el alga verde T. chuii, mientras que el
crustceo A. franciscana present un valor de LC50 (72-h) de 23,33 mg L-1. Los resultados
obtenidos del experimento combinado de toxicidad y biodegradacin indicaron una
biodegradabilidad del tensioactivo ambientalmente aceptable.
R-2
El captulo 7 proporciona una sntesis y comparacin de los resultados obtenidos
en los estudios de esta investigacin. Finalmente, se enumeran las principales conclusiones
generales y se apunta por dnde deberan dirigirse las futuras investigaciones en este
campo.
R-3
SUMMARY
The marine environment is made up of complex and diverse ecosystems such as

coral reefs, mangrove forests, rocky and sandy shores, etc. These systems are composed of
a specific biota represented by thousands of species which are often exposed to different
pollutants generally derived from the human activities. Despite the fact that surfactants are
mainly used in household detergent, they also have a large number of applications due to
their physicochemical properties such as good foaming, high water solubility, low hardness
sensitivity and dispersant properties. Since their high and increasing worldwide
consumption, they have been identified as one of the major pollutants of the aquatic
environment. In order to assess their environmental risks, the distribution, behaviour, fate
and biological effects of these surfactants in the environment should be considered.
The aim of the present Doctoral Thesis is to study the biodegradability and
ecotoxicity of different families of surfactants (cationic, non-ionic and anionic) in the
marine aquatic environment.
Chapter 1 shows a revision of the fundamental concepts related to this work.

Firstly, the main physico-chemical characteristics of the surfactants are summarised as well
as their adverse effects in the environment and the recent legislation. The major
biodegradation kinetic models, as well as the most relevant aspects related to the study of
the toxicity in marine environments, are also presented in this chapter.
Chapter 2 describes the methodology used in the present work. Three different
types of studies have been carried out: biodegradation tests using commercial surfactants,
toxicity tests of surfactants on marine organisms and studies concerning the evolution of
testing medium toxicity during the biodegradative process of the surfactants. Pristine
natural sea water samples collected from the coastal area of Sancti Petri (Cadiz, Spain)
were used as test medium in the biodegradation and toxicity tests. Main physico-chemical
characteristics of each surfactant and tested medium are shown in the corresponding
chapters.
Chapters 3, 4, 5 and 6 show the results obtained from the biodegradability and
ecotoxicity tests of the different commercial surfactants as well as the combined toxicity
and biodegradation tests of the test media.
Chapter 3 studies the biodegradability and ecotoxicity of an alkyl trimethyl

ammonium salt (DTMAC), a cationic surfactant. A high dissolved organic carbon (DOC)
removal percentage was observed, showing a mean value of 91%. Lag and half-life times
were 15.17 and 26.95 days, respectively. Toxicity of the cationic surfactant depended
S-1
significantly on the tested organism, being the marine invertebrate A. franciscana the least
sensitive species. In the case of microalgae, IC50 values ranged between 0.69 and 6.34 mg
L-1 DTMAC. During the surfactant biodegradation process no increase of toxicity of the
test medium with respect to the initial medium toxicity was observed, indicating that the
surfactant shows an environmental acceptable biodegradability.
Chapter 4 shows the results obtained for the non-ionic surfactant TergitolNP9,
which belongs to the well known group of nonylphenol ethoxylates. The results indicated
that there is a potential for the biodegradation of TergitolNP9 in sea water (ultimate
biodegradation percentage >80%). The kinetic model which best described the ultimate
biodegradation of the surfactant under the tested conditions was the first-order model.
Microalgae showed a higher toxicity than the marine invertebrate A. franciscana, being the
species I. galbana and C. gracilis the most sensitive. Biodegradation intermediates showed
a higher toxicity than the parent compound, which means that the surfactant does not seem
to show an environmental acceptable biodegradability.
Chapter 5 studies the biodegradability and ecotoxicity of the commercial anionic

Empicol ESB 70/SP, an alkyl ethoxysulphate surfactant. DOC removal percentage was
relatively high, although at a slow biodegradation rate (biodegradation percentage >96.5%
in 124 days). Two different stages were observed during the biodegradation process; the
first stage would correspond with the breakdown of the molecule by means of hydrolytic
reactions meanwhile the second stage may be characterized by the final degradation via -
and -oxidations of the intermediates resulting from the first stage. Regarding the toxicity,
the microalga D. salina was the most sensitive species. No toxic metabolites were detected
during the biodegradation process, indicating that the surfactant shows an environmental
acceptable biodegradability.
Chapter 6 provides the biodegradability and ecotoxicity of the alcohol ethoxylate

Findet1214N/23, a non-ionic surfactant. The results obtained from the biodegradation tests
indicated a high ultimate biodegradation percentage in sea water (>95%) although at a very
slow rate (half-life time = 56.8 days). Zero-order kinetic model was the most appropriate
model describing the surfactant kinetic under the conditions tested. Lag and half-life times
were calculated from the selected kinetic model. EC50 values for microalgae ranged from
5.0 mg L-1 for C. gracilis to 35.03 mg L-1 for T. chuii meanwhile the marine invertebrate A.
franciscana showed a 72-h LC50 value of 23.33 mg L-1. The results obtained from the study
of the evolution of the test medium toxicity indicate that the surfactant shows an
environmental acceptable biodegradability.
Chapter 7 provides a synthesis and comparison of the results obtained from all the
experiments and studies conducted during this investigation. Finally, the main general
conclusions are listed and suggestions for future researches are provided.
S-2
INTRODUCCIN
OBJETIVOS
Introduccin y objetivos
El medio marino constituye uno de los ecosistemas ms importante del planeta,

cubriendo un 71% de la superficie de la Tierra (361 x 106 km2) (Millero, 2006). Adems,
representa un 99% del espacio vital disponible y contiene un 90% de la biosfera, es decir,
posee una mayor diversidad biolgica que los ecosistemas terrestres y de agua dulce (CE,
2005). Incluye ocanos, estuarios, salinas, lagunas saladas, y ecosistemas submareales,
costeros y tropicales tales como arrecifes de coral y manglares.
El medio ambiente marino desempea un papel determinante en las condiciones

climticas y meteorolgicas y resulta un elemento imprescindible para nuestra vida. As,
constituye nuestra principal fuente de oxgeno, albergando al mayor productor de oxgeno
atmosfrico, el fitoplancton marino, cuya produccin supone alrededor del 90% de la
produccin mundial de oxgeno. Desde un punto de vista socio-econmico, el medio
acutico marino representa, sin lugar a dudas, un factor importante para la prosperidad
econmica, el bienestar social y la calidad de vida.
A lo largo de la Historia, la distribucin de los asentamientos del hombre no ha

sido uniforme por toda la superficie terrestre, sino que ha tendido a concentrarse en las
regiones ms ricas, las cuales ofrecen un mayor nmero de posibilidades econmicas y
sociales. Se estima que, en la actualidad, la poblacin litoral alberga de forma directa o
indirecta el 50,3% de la poblacin mundial, con una densidad de poblacin media de 80
personas por km2, es decir, 2,5 veces superior al promedio total de la que habita en el
interior de los continentes. Estas cifras indican la clara tendencia del hombre a desplazarse
a estas zonas dada la ventaja que representa la riqueza de sus recursos, posicionndolas
como reas estratgicas y de gran relevancia para su estudio. Asimismo, entre los aos
2000 y 2030, se prev un aumento de la poblacin urbana mundial del 72%, mientras que
en el caso de la superficie del territorio ocupado por las ciudades de ms de 100.000
habitantes se estima un aumento del 175%, lo que supone un importante incremento en la
ocupacin de las zonas costeras (Melndez, 2007).
Como consecuencia del aumento demogrfico y de la industrializacin,

urbanizacin y turismo en las zonas costeras, el medio ambiente marino se encuentra
sometido a un progresivo deterioro. Las aguas residuales constituyen, por volumen, la
principal fuente de contaminacin del medio marino y costero. Las descargas de aguas
residuales costeras han aumentado de manera considerable en los tres ltimos decenios.
Estas aguas, adems de nutrientes (nitrgeno y fsforo, principalmente) y materia orgnica
fcilmente biodegradable, tambin contienen cantidades significativas de compuestos
xenobiticos, es decir, compuestos orgnicos cuya nica fuente en el medio ambiente es de
origen antropognica.
Los tensioactivos constituyen, por volumen, uno de los principales compuestos

xenobiticos presentes en las aguas residuales urbanas. Su produccin anual mundial
IO-2
alcanza los 12,5 millones de toneladas por ao, con un incremento anual estimado de
500.000 toneladas (Edser, 2006). Sin embargo, desde un punto de vista ambiental, existe
una incertidumbre generalizada sobre el comportamiento de estos compuestos en el medio
acutico y terrestre.
La preocupacin por la conservacin del medio ambiente marino ha aumentado

considerablemente en los ltimos aos. Una de las consecuencias ms directas consiste en
la implantacin de nuevas restricciones para el uso de determinados compuestos as como
reglamentaciones que limiten sus vertidos. La Comisin Europea (2003), basndose en el
Reglamento N 1488/94 y las Directivas 93/67/EEC y 98/8/EC, elabor una gua tcnica
para la evaluacin de los posibles riesgos generados por la presencia de compuestos
qumicos en los diferentes compartimentos ambientales, entre ellos, el medio acutico
marino.
La evaluacin de riesgo ambiental comprende el estudio del destino final de un

determinado compuesto tras ser vertido al medio as como de los posibles efectos adversos
sobre los organismos pertenecientes a los diferentes compartimentos ambientales
receptores. El riesgo ambiental se calcula mediante la comparacin de la concentracin
ambiental estimada (PEC) y la concentracin estimada de no efecto (PNEC) para cada
compartimento.
Al objeto de evaluar el destino final de un determinado compuesto resulta

sumamente necesario el conocimiento de los mltiples procesos y transformaciones fsico-
qumicas y biolgicas a los que se puede ver sometido. La biodegradacin constituye uno
de los procesos degradativos ms importantes, desempeando un papel fundamental en la
eliminacin de compuestos en el medio receptor. Debido a que se ve influenciada por un
gran nmero de factores ambientales, el estudio de la biodegradabilidad de un compuesto
en un determinado compartimento ambiental supone una ardua tarea que no es posible
abordar en un solo trabajo experimental. Se requiere el anlisis de los resultados de
mltiples trabajos realizados bajo diferentes condiciones que se puedan dar en el medio de
estudio (naturaleza del medio, concentracin del compuesto, temperatura, etc.)
El estudio de la toxicidad constituye otro de los factores clave en la evaluacin del

riesgo ambiental pues nos permite establecer la concentracin umbral de un determinado
compuesto por encima de la cual se pueden producir efectos adversos en la biota y, en
consecuencia, garantizar la integridad del ecosistema. A partir de las concentraciones de
efectos calculadas para diferentes organismos (NOEC, LOEC, E(L)C50, etc.) se puede
establecer un valor pronstico de concentracin ambiental que no producira ningn efecto
sobre la comunidad biolgica (PNEC).
IO-3
Objetivos
Objetivo general
La presente Tesis Doctoral tiene como objetivo fundamental el estudio de la

biodegradabilidad y ecotoxicidad de tensioactivos correspondientes a diferentes familias
(sales de alquil trimetil amonio, nonilfenol etoxilados, alquil etoxisulfatos y alcoholes
etoxilados) en el medio acutico marino.
Objetivos especficos
Para alcanzar este objetivo general, se han formulado diferentes objetivos especficos:
Estudiar la biodegradacin final o mineralizacin de diferentes familias de

tensioactivos mediante el mtodo estandarizado de frasco agitado (OPPTS 835.3160
Biodegradabilidad en agua de mar), propuesto por la Agencia de Proteccin
Ambiental de los Estados Unidos (USEPA).
Modelizar la cintica de biodegradacin de los diferentes tensioactivos en agua de mar

natural bajo condiciones ambientales controladas.
Estudiar la toxicidad aguda de los tensioactivos sobre diferentes organismos marinos:

microalgas (Nannochloropsis gaditana, Isochrysis aff. galbana, Chaetoceros gracilis,
Dunaliella salina y Tetraselmis chuii) y crustceos marinos (Artemia franciscana).
Estudiar la evolucin de la toxicidad de los diferentes medios de ensayos durante el

proceso de biodegradacin, al objeto de detectar la presencia de intermediatos de
biodegradacin que pueden resultar ms txicos que el tensioactivo original.
Comparar los resultados obtenidos en los ensayos de biodegradacin y ecotoxicidad

para los diferentes tensioactivos ensayados.
Estos objetivos proporcionan la base para el desarrollo del trabajo experimental, cuyos
resultados son discutidos en los sucesivos captulos. En el ltimo apartado se resumen las
conclusiones ms relevantes de la presente Tesis Doctoral.
IO-4
Referencias
CE, Comisin Europea, 1993. Directiva 93/67/EC de la Comisin, de 20 de julio de 1993,por la que se fijan los
principios de evaluacin del riesgo, para el ser humano y el medio ambiente, de las sustancias notificadas
de acuerdo con la Directiva 67/548/CEE del Consejo. Official J. L., 227: 9-18.
CE, Comisin Europea, 1994. Reglamento (CE) n 1488/94 de la Comisin, de 28 de junio de 1994, por el que se
establecen los principios de evaluacin del riesgo para el ser humano y el medio ambiente de las
sustancias existentes de acuerdo con el Reglamento (CEE) n 793/93 del Consejo.Official J. L., 161: 3-11
CE, Comisin Europea, 1998. Directiva 98/8/CE del Parlamento Europeo y del Consejo de 16 de febrero de 1998
relativa a la comercializacin de biocidas. Official J. L., 123: 1-63.
CE, Comisin Europea, 2003. Gua Tcnica Europea para la evaluacin de riesgos basada en la Directiva
93/67/EC de la Comisin, de 20 de julio de 1993, el Reglamento (CE) n 1488/94 de la Comisin, de 28
de junio de 1994, y la Directiva 98/8/CE del Parlamento Europeo y del Consejo de 16 de febrero de
1998. Agencia Europea de Sustancias Qumicas, Italia.
CE, Comisin Europea, 2005. Comunicacin de la Comisin al Consejo y al Parlamento Europeo: Estrategia
temtica sobre la proteccin y la conservacin del medio ambiente marino SEC(2005)1290.
COM(2005)504 final. Bruselas, Blgica.
Edser, C., 2006. Latest market analysis. Focus on surfactants. An international newsletter monitoring technical and
commercial developments for all surface active agents, Ed. Elsevier, Mayo, 2006.
Melndez, G., 2007. Liberar el potencial del crecimiento urbano. Informe sobre el Estado de la Poblacin Mundial
2007. Fondo de Poblacin de las Naciones Unidas (UNFPA). Repblica Dominicana.
Millero, F. J., 2006. Chemical Oceanography. (Eds) Kennish, M. J. Marine Science Series. CRC Press. Miami,
Florida, USA.
IO-5
Captulo 1
ANTECEDENTES BIBLIOGRFICOS
Resumen
En el presente captulo se lleva a cabo una breve revisin bibliografa de los

aspectos ms relevantes de la Tesis Doctoral. En primer lugar se resumen las caractersticas
ms importantes de los tensioactivos as como los posibles problemas que stos pueden
generar sobre el medio ambiente y la legislacin vigente al respecto. Posteriormente, se
describen los principales modelos cinticos de biodegradacin descritos en la bibliografa.
Finalmente, se abordan aspectos relacionados con la toxicidad de compuestos en el medio
acutico, en particular en el medio acutico marino.
Captulo 1
1. Tensioactivos y Medio Ambiente
Los tensioactivos, tambin conocidos como agentes de superficie, constituyen un

amplio grupo de compuestos qumicos con un gran nmero de aplicaciones debido a sus
propiedades de solubilidad, detergencia, resistencia a la dureza del agua, as como
emulsionantes, dispersantes y humectantes. Estos compuestos, de naturaleza anfiflica,
constan de dos partes estructurales o grupos bien diferenciados, uno hidrfilo y otro
hidrfobo. La presencia de ambos grupos en su molcula le confieren diversas propiedades
tales como la capacidad para disminuir la tensin superficial del agua, la formacin de
monocapas de esparcimiento de absorcin en la interfase agua/aire, la formacin de
emulsiones y/ microemulsiones, la formacin de micelas, etc.
En funcin del carcter inico del grupo hidrfilo, los tensioactivos se dividen en
cuatro grandes familias: aninicos, cuando presentan una carga elctrica negativa,
catinicos, cuando es positiva, anfteros, cuando presentan propiedades aninicas o
catinicas segn el pH del medio y no-inicos cuando an presentando una ionicidad sta
no est definida netamente como negativa o positiva. En la Tabla I.1 se muestran los
principales tipos de tensioactivos utilizados as como sus acrnimos.
Tabla I.1. Acrnimos de los principales tipos de tensioactivos (Ying, 2006).
Clase Nombre comn Acrnimo

Lineal alquilbenceno sulfonatos LAS
Tensioactivos Alcanos sulfonatos secundarios SAS
aninicos Alcoholes ter sulfatos (alquil etoxisulfatos) AES
Alcoholes sulfatos (alquil sulfatos) AS
Alquilfenoles etoxilados APE APEO
Tensioactivos Nonilfenoles etoxilados NPE NPEO
No-inicos Octilfenoles etoxilados OPE OPEO
Alcoholes etoxilados AE AEO
Sales de amonio cuaternario QAC
Haluros de alquil trimetil amonio TMAC
Haluros de alquil dimetil amonio DMAC
Tensioactivos Haluros de alquil bencil dimetil amonio BDMAC

catinicos Haluros de dialquil dimetil amonio DADMAC
Cloruro de bi(alquil grasa hidrogenada) dimetil amonio DTDMAC
Cloruro de bi(alquil grasa hidrogenada) trimetil amonio DTTMAC
Cloruro de dietil ster dimetil amonio DEEDMAC
I-2
Antecedentes bibliogrficos
Desde un punto de vista comercial, los tensioactivos ms utilizados han sido los
lineal alquilbenceno sulfonatos (LAS), alquil etoxisulfatos (AES), alquil sulfatos (AS),
alquilfenoles etoxilados (APE), alcoholes etoxilados (AE), y las sales de amonio
cuaternario (QAC). Desde un punto de vista cientfico, los lineal alquilbenceno sulfonatos
(LAS), alquil etoxisulfatos (AES) y las sales de amonio cuaternario (QAC) constituyen los
tensioactivos ms estudiados (Ying, 2006).
Dada la gran versatilidad de tensioactivos, estos compuestos encuentran aplicacin

en numerosos campos tecnolgicos. Entre stas destacan: formulaciones de detergentes,
productos de higiene corporal, cosmticos, aplicaciones alimentarias, pinturas y barnices,
aplicaciones agrcolas, farmacuticas, emulsiones de asfalto, tratamiento de cueros y/
flotacin de minerales.
Produccin y consumo de tensioactivos
La produccin mundial de tensioactivos alcanza unos 12,5 millones de toneladas

por ao, con un incremento anual estimado de 500.000 toneladas (Edser, 2006).
Considerando la produccin total de tensioactivos, alrededor del 60% corresponde a
tensioactivos utilizados en detergentes domsticos, mientras que un 30% es empleado en
aplicaciones tcnicas e industriales, un 7% en limpieza industrial y 6% en productos de
higiene corporal (Edser, 2006). En la Figura I.1 se representa el consumo total de
tensioactivos para el ao 2006 en las principales regiones del mundo.
frica
Estados Unidos/Canad
6,9% 4,2% 2,8%
8,6% 26,7% Europa Occidental
China
Centro Europa/Europa Oriental
11,4% Latino Amrica
Japn
15,6% 23,9%
Oriente Medio
Figura I.1. Consumo mundial de tensioactivos durante el ao 2006 (Janshekar y col.,

2006).
En Europa, los datos ms recientes encontrados estimaban una produccin total de

tensioactivos de 2,48 millones de toneladas para el ao 2000, de los cuales un 49,6%
corresponde a no inicos, un 40,2% a tensioactivos aninicos, un 8,3% a catinicos y un
1,8 % a la produccin de anfteros (UMSICHT, 2003).
I-3
Captulo 1
En las Figuras I.2A y I.2B se representan la evolucin del consumo de

tensioactivos (excluidos los jabones) en Espaa, durante los aos 1996-2006. Existe un
claro un aumento del consumo total de tensioactivos durante los ltimos aos, pasando de
un valor de 240 a 388 millones de Kg, lo que supone un aumento total del 61% (INE,
2006). Asimismo, se observa un consumo fluctuante para los tensioactivos aninicos, sin
apenas incremento en valores absolutos durante la ltima dcada (Fig. I.2B). Para el resto
de tensioactivos el consumo aumenta claramente, siendo ms acusado en el caso de los
tensioactivos catinicos, superando ligeramente el consumo de aninicos a partir del ao
2002 (INE, 2006).
500 200
No-ionicos Cationicos Anionicos Otros
400 160
Consumo (10 Kg)
Consumo (106 Kg)
300 120
200 80
100 40
A B
0 0
1994 1996 1998 2000 2002 2004 2006 2008 1994 1996 1998 2000 2002 2004 2006 2008
Ao Ao
Figura I.2. Evolucin del consumo de tensioactivos en Espaa durante los aos 1996-
2006. (A) consumo total de tensioactivo, (B) consumo de tensioactivos por
tipo (INE, 2006).
Implicaciones ambientales
A pesar del gran nmero de aplicaciones y de las numerosas ventajas que

presentan los tensioactivos tanto en el mbito industrial como econmico y sanitario, desde
un punto de vista ambiental, stos son considerados como un importante contaminante del
medio acutico. Una vez utilizados, estos compuestos llegan a las estaciones depuradoras a
travs de las aguas residuales urbanas e industriales y en determinados casos son vertidos
directamente a las aguas superficiales. Durante el tratamiento de las aguas residuales, un
elevado porcentaje de estos compuestos es eliminado mediante procesos de biodegradacin
y adsorcin en el material particulado, mientras que los metabolitos generados son
dispersados en los diferentes compartimentos ambientales (Ying, 2006).
Los principales efectos atribuibles a los tensioactivos como consecuencia de su

presencia en el medio acutico son: (1) produccin de efectos txicos adversos sobre los
organismos que habitan en el medio receptor, (2) produccin de espumas tanto en ros
I-4
como en estaciones depuradoras de aguas residuales, (3) efectos sobre la aireacin,

coagulacin y sedimentacin en estaciones depuradoras de aguas residuales, y (4)
contaminacin de acuferos (no es muy frecuente y suele ser consecuencia de otro tipo de
contaminacin mas importante).
Normativa sobre tensioactivos y medio ambiente
El creciente consumo de tensioactivos as como sus posibles repercusiones

ambientales constituyen las principales razones por las que diferentes instituciones y
organismos pblicos hayan promulgado normas para el control y uso de estas sustancias.
En el mbito europeo, se han establecido diversas directivas relativas a la biodegrabilidad,
control y uso de sustancias tensioactivas. As, por ejemplo, la Directiva del Consejo
82/243/CEE regula la aspectos relacionados con la biodegradacin de tensioactivos
utilizados en formulaciones detergentes. Tambin cabe destacar la incorporacin legislativa
en materia de calidad de agua de la Directiva Marco de Aguas (Directiva 60/2000/CE), la
cual incluye a los compuestos 4-p-nonilfenol y p-ter-octifenol, derivados de los
tensioactivos nonilfenoles etoxilados y octilfenoles etoxilados, respectivamente, en la lista
de sustancias prioritarias en el mbito de la poltica de aguas. En el mbito estatal, la
reglamentacin tcnico-sanitaria para la elaboracin, circulacin y comercio de detergentes
y limpiadores es regulada mediante el Real Decreto 770/1999, de 7 de Mayo mientras que
en el mbito autonmico andaluz la Consejera de Medio Ambiente en 1997 public la
Orden de de 14 de Febrero, por la que se clasifican las aguas litorales andaluzas y se
establecen los objetivos de calidad de las aguas afectadas directamente por los vertidos.
I-5
Captulo 1
2. Biodegradabilidad en el medio acutico
La biodegradacin constituye uno de los principales procesos de transformacin de

los compuestos xenobiticos en el medio acutico. Durante dicho proceso, los
microorganismos utilizan los tensioactivos como fuente de energa (procesos catablicos)
y/ sustrato (procesos anablicos) (Ying, 2006).
En el proceso de biodegradacin de compuestos orgnicos intervienen numerosas

variables tales como las caractersticas fsico-qumicas del medio (oxgeno disuelto,
temperatura, pH, luz, concentracin de nutrientes, etc.), las caractersticas fsico-qumicas
del compuesto (solubilidad, concentracin, etc.) y/ los microorganismos presentes (tipos,
concentracin, etc.).
Modelos cinticos de biodegradacin
El conocimiento de la cintica de biodegradacin de un determinado contaminante

orgnico resulta esencial a la hora de evaluar su persistencia en el medio y valorar los
posibles riesgos que pueden suponer para la biota. Asimismo, nos permite conocer la
concentracin de tensioactivo en cualquier instante, predecir los niveles ms probables, y
evaluar si el compuesto ser eliminado antes de ser transportado a un comportamiento
ambiental determinado (Alexander, 1994).
Modelo cintico de Monod
La mayora de los modelos cinticos para el crecimiento celular y el consumo de

sustrato se encuentran basados en el modelo cintico Monod (1949), cuya ecuacin viene
dada por la siguiente expresin:
max S (1)
=
Ks + S
donde es la velocidad especfica de crecimiento, max es la mxima velocidad especfica

de crecimiento, S es la concentracin de sustrato limitante del crecimiento celular, y Ks es
una constante que representa la concentracin de sustrato a la cual la velocidad de
crecimiento es la mitad de la velocidad mxima. En la Figura I.3 se representa grficamente
la expresin correspondiente al modelo cintico de Monod.
I-6
(T-1)
max
max/2
Ks
Concentracin de Sustrato (M V-1)
Figura I.3. Evolucin de la velocidad especfica de crecimiento en funcin de la

concentracin de sustrato.
Existen determinadas limitaciones a la hora de aplicar el modelo cintico de

Monod a la biodegradacin de compuestos en el medio acutico. En primer lugar, el
modelo esta concebido para un cultivo bacteriano puro, el cual utiliza el sustrato como
fuente de carbono y energa. En segundo lugar, el modelo considera el sustrato en cuestin
como la nica fuente de carbono. Finalmente, asume que el compuesto orgnico es
totalmente soluble en agua y no presenta ningn efecto txico sobre los microorganismos,
que los organismos se encuentran en un medio lquido bien aireado y que los nutrientes
inorgnicos y factores de crecimiento necesarios estn presentes en exceso.
A pesar de que el modelo de Monod no es aplicable a determinados procesos

degradativos, existen muchas otras situaciones en las que este modelo proporciona una
buena aproximacin para modelizar el crecimiento de cultivos mixtos y consumo de
sustrato limitante del crecimiento (Simkins y Alexander, 1984).
Simplificaciones del modelo cintico de Monod
Simkins y Alexander (1984), a partir de simplificaciones del modelo cintico de

Monod, obtuvieron seis modelos cinticos de mineralizacin, incluyendo exclusivamente
las variables concentracin de sustrato y densidad celular. En la Tabla I.2 se recogen los
diferentes modelos cinticos propuestos por Simkins y Alexander, as como las
condiciones necesarias para su aplicacin.
I-7
Captulo 1
Tabla I.2. Modelos cinticos de biodegradacin usando solamente las variables

concentracin de sustrato y biomasa (Simkins y Alexander, 1984).
Modelo Condiciones Ecuacin Constantes Unidades de las

necesarias -dS/dt = constantes
B0 >> S0 max B0
A) Primer Orden K1 S K1 = h-1
S0 << KS KS
max
B) Logstico S0 << KS K3 S (S0 + B0 - S) K3 = mg L-1 h-1
KS
C) Monod K0 S
B0 >> S0
( KS + S )
K0 = max B0 mg L-1 h-1
(sin crecimiento)
D) Monod max S ( S0 + B0 S )
Ninguna max h-1
(con crecimiento) ( KS + S )
B0 >> S0
E) Orden Cero K0 K0 = max B0 mg L-1 h-1
S0 >> KS
F) Logartmico S0 >> KS max (S0 + B0 - S) max h-1
S0= concentracin inicial de sustrato; S= concentracin de sustrato; Ks= constante que representa la
concentracin de sustrato a la cual la velocidad de crecimiento es la mitad de la velocidad mxima; B0=
cantidad de sustrato requerido para producir una concentracin inicial de microorganismos X0; max=
mxima velocidad especfica de crecimiento, S es la concentracin de sustrato limitante del crecimiento
celular
En la Figura I.4 se resume grficamente las diferentes condiciones (columna 2 de

la Tabla I.2) bajo las cuales son aplicables los modelos cinticos propuestos por Simkins y
Alexander (1984).
Log10 X0 E
ORDEN
C CERO
MONOD
(sin crecimiento)
A
PRIMER
ORDEN
F
D LOGARTMICA
MONOD
(con crecimiento)
B
LOGSTICA
Concentracin de Sustrato
Figura I.4. Modelos cinticos en funcin de la concentracin de sustrato y biomasa

(Simkins y Alexander, 1984).
I-8
Las curvas de biodegradacin correspondientes a los diferentes modelos cinticos

de Simkins y Alexander se representan en la Figura I.5. Al igual que ocurre con la cintica
de Monod, estos modelos presentan una serie de limitaciones que deberan tenerse en
cuenta a la hora de su aplicacin. En primer lugar, estos modelos cinticos asumen una
produccin constante de clulas en el tiempo as como un rendimiento constante biomasa-
sustrato. Por otro lado, estos modelos no son aplicables cuando influye de manera decisiva
determinados factores ambientales tales como la presencia de otros sustratos, depredacin
por protozoos, presencia de compuestos inhibidores, etc.
100
90
80
Sustrato remanente (%)
70
C
F
60 B E
50
40 A D
30
20
10
Tiempo
Figura I.5. Curvas de biodegradacin de compuestos de acuerdo con los modelos

cinticos mostrados en la Tabla I.2. (Alexander, 1985).
Modelo cintico de Quiroga-Sales y Romero
Para salvar estos inconvenientes, Quiroga y Sales (1988) desarrollaron un modelo

cintico en el que la velocidad de degradacin viene dada por un polinomio de segundo
grado, el cual es slo funcin de la concentracin de sustrato, y cuya ecuacin viene dada
por la siguiente expresin:
dS (7)
- = K2 ST2 + K1 ST + K0
dt
donde K0, K1 y K2 corresponden a los coeficientes del polinomio de segundo grado y ST es

la concentracin de sustrato en un tiempo T.
Separando variables e integrando la ecuacin 7 obtenemos la expresin para la

concentracin de tensioactivo, la cual viene dada por la siguiente ecuacin:
I-9
Captulo 1
h ( S0 q ) q ( S0 h) e p t (8)
S=
( S0 q ) ( S0 h) e p t
siendo:
p= K12 4 K2 K0
( K1 + p)
q=
2 K2
( K1 p)
h=
2 K2
S0 = concentracin inicial de sustrato.
De la ecuacin 8 se sigue que la velocidad de consumo de sustrato se anula cuando

la concentracin de sustrato presente en el medio es igual a "q" o "h", ya que stas seran
las soluciones de dicha ecuacin. El hecho de que la velocidad de consumo de sustrato se
anule para el valor de concentracin de materia orgnica S = q, implica que q es el valor
mnimo alcanzable de concentracin de materia orgnica y, por tanto, representa el nivel de
materia orgnica no biodegradable para este tipo de microorganismos.
Romero (1991), estudiando el comportamiento de procesos de degradacin en

discontinuo, obtuvo una ecuacin basada en un polinomio de segundo grado respecto a la
concentracin de sustrato presente en el medio, similar a la ecuacin emprica propuesta
por Quiroga y Sales (1988). La ecuacin viene dada por la siguiente expresin:
S 0 ( S t 0 S nb ) + S nb ( S t 0 S 0) e max t (9)
St = max t
( S t 0 S nb ) + ( S t 0 S 0) e
donde St es la concentracin total de sustrato en un instante t, Sto es la concentracin inicial

total de sustrato, S0 es la mxima concentracin de sustrato invertible en formacin de
biomasa, Snb es la concentracin de sustrato no biodegradable, y max es la mxima
velocidad especfica de crecimiento de los microorganismos.
Romero (1991) da una interpretacin fsica a los parmetros cinticos p, h y q

obtenidos por Quiroga y Sales (1988) a partir de las expresiones matemticas utilizadas.
As, p tendra el significado de una velocidad mxima ya que es el producto de la constante
de velocidad observada por la concentracin mxima de microorganismos alcanzable en el
medio. Es decir, supondra aquella velocidad mxima alcanzable cuando el trmino K2 = 0.
El trmino h tiene dimensiones de sustrato y corresponde a la mxima cantidad disponible
I-10
en el medio para formar biomasa e incluye el trmino relativo a la concentracin inicial de

microorganismos. Finalmente, el trmino q representa la concentracin de sustrato no
metabolizable por los microorganismos. Lgicamente, la velocidad de degradacin en
procesos discontinuos se anula para los valores de h y q (cuando an no han comenzado a
degradar al sustrato, S=S0=h, y cuando no existe sustrato biodegradable en el medio,
S=Snb=q, respectivamente).
Este modelo ha sido aplicado con xito tanto a la degradacin de tensioactivos en

aguas naturales (Perales y col., 1999; Quiroga y col., 1999; Manzano y col., 1998, 1999)
como a otros sustratos orgnicos (vinazas y FORSU) (Romero, 1991; Fernndez, 2008).
I-11
Captulo 1
3. Toxicidad en el medio acutico
El incremento de la produccin y uso de sustancias potencialmente txicas, y el

papel del medio acutico como sumidero de muchas de ellas ha hecho que cada vez sea ms
necesario poder valorar los efectos de tales compuestos, no slo sobre el hombre, sino
tambin sobre los organismos y ecosistemas. La experiencia muestra que es menos costoso,
econmica y ambientalmente, prevenir la posible contaminacin de un ecosistema que su
posterior recuperacin (Van Leewen, 1990).
La presencia de compuestos xenobiticos en el medio natural puede generar

efectos considerables sobre otros compuestos que existen de manera natural en el medio,
sobre componentes fsicos y biolgicos y/ sobre determinados procesos claves para la
supervivencia del ecosistema. La magnitud de tales efectos depende de las propiedades
fsico-qumicas del contaminante y sus metabolitos, la concentracin de compuesto en el
medio, la frecuencia de descarga y las propiedades de los propios ecosistemas
(Ramamoorthy y Baddaloo, 1995). Adems, dada la singularidad de cada medio, un
ecosistema nunca resulta representativo de otro (Koyman, 1987; Van Leewen, 1990). As,
ecosistemas aparentemente similares pueden ser afectados de manera diferente por una
misma concentracin de un determinado compuesto. Por lo tanto, a la hora de evaluar los
posibles efectos de un determinado compuesto en el medio natural resulta imprescindible
considerar todas y cada una de las condiciones que caracterizan al ecosistema en cuestin.
Un factor determinante en el efecto de un contaminante es el periodo de

exposicin. As, en funcin del tipo de exposicin, se distinguen dos tipos de efectos:
efectos agudos, aquellos debidos a exposiciones de una elevada concentracin de
compuesto durante un periodo de tiempo relativamente corto, y efectos crnicos, aquellos
generados por la exposicin prolongada a una baja concentracin de un determinado
compuesto (Ramamoorthy y Baddaloo, 1995).
Evaluacin de la toxicidad acutica. Tipos de ensayos de toxicidad
La toxicologa acutica estudia los posibles efectos adversos de compuestos

qumicos y sus mezclas sobre organismos acuticos en diferentes niveles de organizacin,
desde el subcelular y organismos individuales hasta comunidades y ecosistemas (Rand,
1995). La toxicologa acutica se centra, bsicamente, en aquellos efectos agudos y
crnicos considerados como adversos tales como mortalidad, efectos sobre el crecimiento,
reproduccin, etc., as como de los procesos de recuperacin de la biota cuando la
exposicin cesa. Una relativamente reciente rama de la toxicologa consiste en el estudio de
la relacin entre los efectos txicos y la estructura molecular, y es conocida por las siglas en
ingls QSAR (Quantitative Structure Activity Relationship), y tiene como objetivo final
I-12
tener una cierta capacidad de prediccin de efecto de los compuestos sobre los organismos
en funcin de sus propiedades estructurales (Rand, 1995).
La evaluacin de los efectos potenciales toxicolgicos de compuestos en

organismos acuticos, es decir, la concentracin de un compuesto y el tiempo de exposicin
necesario para producir un determinado efecto, se lleva a cabo mediante ensayos de
toxicidad acutica. En funcin del tipo de exposicin al que el organismo es sometida,
distinguimos tres tipos de ensayos de toxicidad: aguda, subcrnica, y crnica.
Los ensayos de toxicidad aguda estn diseados para determinar la concentracin

de compuesto que produce efectos adversos en los organismos expuestos durante un corto
periodo de tiempo en un medio controlado (Ramamoorthy y Baddaloo, 1995). Los criterios
de efecto ms utilizados en este tipo de ensayos son la mortalidad, inmovilidad, prdida de
equilibrio, e inhibicin del crecimiento. Generalmente, su duracin suele estar comprendida
entre las 24 y 96 horas, aunque en algunos casos este periodo no est predeterminado
(Rand, 1995).
Los ensayos de toxicidad crnica permiten evaluar los posibles efectos adversos de
compuestos bajo unas condiciones de exposicin a largo plazo y empleando
concentraciones subletales (Rand, 1995). En este tipo de ensayos, la respuesta txica
observada puede ser el resultado de los efectos directos del compuesto en cuestin, de una
forma alterada del compuesto, de una redistribucin de los metabolitos en el organismo, y/
efectos en rganos diana, y en sistemas enzimticos y hormonales. Su duracin suele ser
variable; en un ensayo crnico completo el organismo es expuesto al compuesto durante un
ciclo de vida reproductivo completo.
Los procedimientos de toxicidad subcrnica estn diseados generalmente para

evaluar los efectos adversos de compuestos administrados a organismos durante repetidas
exposiciones en una dosis diaria desde un periodo de varios das hasta 3 o 4 meses. Son
considerados ensayos de exposicin prolongada y sus dosis de efecto son inferiores a las
empleadas en los ensayos de toxicidad aguda. El periodo de estudio suele variar entre los
21 y 30 das, con un incremento en el nivel de dosis al final del periodo y una prolongacin
del tratamiento por un periodo adicional si los efectos son cuestionables.
En general, los ensayos de toxicidad deben de cumplir una serie de requerimientos

mnimos. As, por ejemplo, la respuesta de un determinado ensayo debe ser repetible; no
sera vlido un ensayo que cada vez que se realizase los resultados difirieran entre s,
aunque siempre existe una variabilidad en la respuesta debido al factor de manipulacin que
deber minimizarse lo mximo posible. Adems, dada la gran variabilidad que introducen
los propios organismos, se deben buscar aquellos cuyo tamao permita que cada ensayo se
lleve a cabo con un gran nmero de especies. Por otro lado, la Directiva 2000/60/CE,
I-13
Captulo 1
Marco de Aguas, recomienda la obtencin de datos de toxicidad, tanto puntuales (agudos)

como correspondientes a un periodo prolongado en el tiempo (crnicos), a partir de
diferentes taxones acuticos (algas y /o macrfitos, invertebrados, peces, etc.).
Un factor a tener en cuenta en los ensayos de toxicidad es la homogeneidad de los

ensayos con respecto a la heterogeneidad de los ecosistemas. Esto se puede reflejar en la
intervencin de variables que no son tenidas en cuenta en estudios puntuales (Van Leewen,
1990). Como ejemplo no deben olvidarse los posibles efectos de una desviacin de la
temperatura media para determinada una poca pudiendo acentuar la toxicidad del
compuesto en cuestin. El ciclo de vida del organismo ensayado constituye otro de los
factores a tener en cuenta, ya que la toxicidad puede verse acentuada o mitigada en funcin
de la edad del organismo. Asimismo, tambin resulta importante realizar estudios
exhaustivos que nos permitan comprobar la representatividad de las especies seleccionadas
con respecto al compartimento que estamos estudiados.
Parmetros ambientales
Al objeto de establecer las concentraciones admisibles para un determinado

organismo expuesto y comparar los efectos producidos en individuos procedentes de
diferentes niveles de organizacin, resulta necesario medir y expresar la toxicidad de forma
cuantitativa. Los valores generados en los ensayos de toxicidad nos permite determinar la
concentracin ms alta del compuesto ensayado que no produce ningn efecto
estadsticamente significativo en organismos de ensayos en comparacin con los
organismos control (NOEC, no-observed-effect concentration) as como la concentracin
ms baja a la que se observa un efecto estadsticamente significativo (LOEC, lowest-
observed-effect concentration). Sin embargo, el concepto de no efecto se encuentra poco
definido y es especfico para cada especie, ya que considera cualquier efecto subletal que
difcilmente ser generalizable para toda la comunidad biolgica. Por ello y al objeto de
facilitar la comparacin entre los resultados obtenidos en ensayos de toxicidad bien de un
mismo compuesto sobre diferentes organismos, o bien la de diferentes compuestos sobre el
mismo organismo, se emplea preferentemente los valores de LC50, concentracin en la cual
se observa un 50% de mortalidad de los organismos ensayados, o EC50, concentracin en la
que se observa un efecto determinado (por ejemplo, inhibicin de crecimiento) en el 50%
de los organismos despus de un cierto tiempo de exposicin (Rand, 1995).
La mayora de los estudios de toxicidad van dirigidos a la obtencin de

informacin para calcular el riesgo ambiental. La evaluacin del riesgo ambiental se basa
en el clculo de la concentracin ambiental que no producira efecto alguno sobre la
comunidad ecolgica (PNEC, predicted no effect concentration), la cual es obtenida a
partir de las parmetros ambientales de los correspondientes ensayos de toxicidad (NOEC,
LC50, EC50, etc.).
I-14
Ensayos de toxicidad en agua de mar
Son numerosos los ensayos de toxicidad que se han llevado a cabo con diferentes
organismos acuticos marinos correspondientes a diferentes grupos taxonmicos. Sin
embargo, tan slo un reducido nmero de estos ensayos han sido desarrollados
formalmente y considerados como ensayos normalizados para incorporarlos a los
procedimientos regulativos de las normativas o textos legislativos. La gran mayora de los
procedimientos de los ensayos de toxicidad en agua de mar se limitan a una respuesta aguda
o un ensayo a corto plazo no superior a 4 das, y generalmente utilizando como especies de
ensayo a peces e invertebrados para determinar la concentracin letal media (LC50) o la
concentracin efectiva media (EC50) del compuesto en cuestin. De hecho, basndose en la
limitada informacin que existe actualmente acerca del cultivo en laboratorio, sobre los
ciclos de vida, la dieta y las posibles enfermedades de un gran nmero de las especies
estudiadas en agua de mar, tan slo un pequeo nmero de estos ensayos podran
considerarse como estndares (Garrido, 2002).
En la Tabla I.3 se muestran los principales ensayos toxicidad en agua de mar

encontrados en la bibliografa (Rand, 1995). En la actualidad, tambin es posible encontrar
una extensa bibliografa acerca de protocolos de ensayos de toxicidad estandarizados en las
paginas web de organismos oficiales gubernamentales y ambientales tales como USEPA
(Agencia de Proteccin Ambiental de los Estados Unidos), ECETOC (Centro Europeo de
Ecotoxicologa y Toxicologa de Compuestos Qumicos), OCDE (Organizacin para la
Cooperacin y el Desarrollo Econmico), etc.
I-15
Captulo 1
Tabla I.3. Ensayos de toxicidad de agua de mar (Rand, 1995, modificado por Garrido,
2002).
CDIGO TTULO
Mtodos Normalizados, Parte 8000 (APHA y col., 1992)
8111 Bioestimulacin (Productividad algal)
8112 Procedimiento de ensayo de toxicidad para fitoplancton
8310 Procedimiento de ensayo de toxicidad para protozoos ciliados
8410 Procedimiento de ensayo de toxicidad de corales escleroactnidos
8510 Procedimiento de ensayo de toxicidad de anlidos
8610 Procedimiento de ensayo de toxicidad de moluscos
8710 Procedimiento de ensayo de toxicidad de microcrustceos
8712 Procedimiento de ensayo de toxicidad de acartia
8720 Procedimiento de ensayo de toxicidad de macrocrustceos
8910 Procedimiento de ensayo de toxicidad de peces
ASTM (ASTM, 1993)
E-1191-90 Gua para realizar ensayos de toxicidad durante el ciclo de vida en msidios
E-729-88a Gua para realizar ensayos de toxicidad aguda con peces, macroinvertebrados, y anfibios
E-1241-92 Gua para realizar ensayos de toxicidad durante estadios tempranos de vida de Peces
E-1440-91 Gua para realizar ensayos de toxicidad aguda con el rotfero del gnero Brachionus
Gua para realizar ensayos de toxicidad agudos de tipo estticos y de flujo continuo con embriones de cuatro especies de moluscos
E-724-89
bivalvos de agua de mar
E-1463-92 Gua para realizar ensayos de toxicidad agudos estticos y de flujo continuo con msidios de la Costa Oeste de EEUU
E-1367-92 Gua para realizar ensayos de toxicidad en sedimentos de 10 das de duracin con anfpodos marinos y esturicos
E-1192-88 Gua para realizar ensayos de toxicidad aguda en efluentes acuosos con peces, macroinvertebrados y anfibios
E-1218-90 Gua para realizar ensayos de toxicidad esttica de 96-horas con microalgas
Test Agudos en Efluentes de la EPA (USEPA, 1991)
Ensayos de toxicidad aguda en efluentes con Mysidopsis baha
Ensayos de toxicidad aguda en efluentes con Cyprinodon variegatus
Ensayos de toxicidad aguda en efluentes con Menidia sp.
Test Crnicos en Efluentes de la EPA (USEPA, 1991)
1004 Mtodo de supervivientes larvarios y ensayos de crecimiento de Cyprinodon variegatus
1005 Mtodo de supervivientes embrio-larvales y ensayo de teratogeneicidad de Cyprinodon variegatus
1006 Mtodo de supervivientes larvarios y crecimiento de Menidia Beryllina
1007 Mtodo de supervivencia, crecimiento y ensayo de fecundidad de Mysidopsis bahia
1008 Mtodo del ensayo de fertilizacin del erizo de mar Arbacia punctulata
1009 Mtodo del ensayo de reproduccin sexual algal de Champia parvulata
EPA TSCA Procedimientos de toxicidad del Cdigo de regulacin Federal (TSCA, 1990)
797.1050 Ensayo de toxicidad aguda en algas
797.1075 Ensayo de toxicidad aguda en algas de agua dulce y marina
797.1400 y 40 Ensayo de toxicidad aguda en peces
797.1520 y 60 Ensayo de bioconcentracin en peces
797.1600 Ensayo de toxicidad con estadios tempranos de peces
797.1800 Ensayo de toxicidad aguda en ostras
797.1930 y 50 Ensayo de toxicidad aguda con msidios (camarones)
797.1970 Ensayo de toxicidad aguda con pendidos
EPA-FIFRA Procedimientos de toxicidad (USEPA, 1985, 1986)
Procedimiento de Evaluacin Estndar: Ensayos de toxicidad aguda para organismos marinos y esturicos:
- Ensayo de toxicidad de 96-horas para peces esturicos (EPA-540/9-85-009, 1985)
- Test de Toxicidad de 96 horas para camarones (EPA-540/9-85-010, 1985)
- Procedimiento de Evaluacin Estndar: Test de Toxicidad Aguda para organismos marinos y esturicos (Estudio de deposicin de
concha en moluscos de 96 horas y flujo abierto) (EPA- 540/1-85-011, 1985)
- Procedimiento de Evaluacin Estndar: Test de Toxicidad Aguda para organismos marinos y esturicos (Estudio de embriones y
larvas en moluscos de 48 horas) (EPA-540/9-86-012, 1986)
- Procedimiento de Evaluacin Estndar: Estadios tempranos de vida en peces (EPA-540/9-86-138, 1986)
- Procedimiento de Evaluacin Estndar: Test de Toxicidad durante el ciclo de vida en peces (EPA-540/9-86-137, 1986)
- Procedimiento de Evaluacin Estndar: Plantas no-vasculares: Crecimiento y Reproduccin en Plantas Acuticas -Nivel 1 y 2 (EPA
540/9-86-134, 1986)
OECD Test Guidelines
No especifica procedimientos de ensayos de toxicidad en agua salada
Medioambiente Canad (Environment Canada, 1992)
Test de toxicidad aguda en sedimentos usando anfpodos marinos y de estuario
Ensayo de fertilizacin con equinoideos
I-16
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I-17
Captulo 1
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I-18
Captulo 2
METODOLOGA
Resumen
El captulo que a continuacin se presenta recoge la metodologa empleada

durante la realizacin del trabajo experimental. En primer lugar se detalla el diseo
experimental seguido para el estudio de la biodegradabilidad y toxicidad de los diversos
tensioactivos as como las condiciones de cada ensayo realizado. A continuacin se
describen los mtodos de ensayo de biodegradacin en agua de mar, de toxicidad aguda
estndar con microalgas y crustceos marinos, y finalmente, la metodologa seguida en los
ensayos de toxicidad durante la biodegradacin de los tensioactivos.
Captulo 2
1. Diseo experimental
En el siguiente apartado se describen las condiciones de los ensayos de

biodegradacin, toxicidad aguda estndar y los ensayos combinados de toxicidad y
biodegradacin.
Ensayos de biodegradacin
Al objeto de estudiar la biodegradabilidad final mineralizacin de los diferentes

tensioactivos en el medio acutico marino, se han llevado a cabo diversos ensayos de
biodegradacin. El mtodo empleado fue el de frasco agitado, propuesto por la USEPA
(1998a). En las Tablas II.1, II.2, II.3 y II.4 aparecen recogidas las condiciones de cada uno
de estos ensayos para los diferentes tensioactivos: tipo de ensayo, identificacin,
concentracin inicial de tensioactivo, concentracin de benzoato sdico (sustancia de
referencia) y concentracin de HgCl2. Todos los medios de ensayos estuvieron basados en
una matriz de agua de mar natural. La localizacin del punto de toma de muestra as como
las condiciones de ensayo aparecen recogidas en los apartados 2 y 3 del presente captulo,
respectivamente. Las principales caractersticas fsico-qumicas de los medios de ensayo as
como de los tensioactivos empleados se detallan en los correspondientes captulos
(captulos 3, 4, 5 y 6).
Tabla II.1. Diseo de experimentos para el estudio de la biodegradabilidad del

tensioactivo catinico cloruro de dodecil trimetil amonio (DTMAC).
DTMAC Benzoato sdico HgCl2

Ensayo Cdigo
(mg L-1 COD) (mg L-1 COD) (mg L-1)
Control CO1 - - -
Referencia REF1 - 15 -
Abitico AB1 18 - 100
Tensioactivo C1 18 - -

tensioactivo no-inico nonilfenol etoxilado (NPEO).
NPEO Benzoato sdico HgCl2

Ensayo Cdigo
Control CO2 - - -
Tensioactivo N1 12 - -
II-2
Metodologa

tensioactivo aninico alquil etoxisulfato (AES).
AES Benzoato sdico HgCl2

Ensayo Cdigo
Control CO3 - - -
Tensioactivo AES1 18 - -

tensioactivo no-inico alcohol etoxilado (AE).
AE Benzoato sdico HgCl2

Ensayo Cdigo
Control CO4 - - -
Tensioactivo AE1 16 - -
Ensayos de toxicidad aguda estndar
En las Tablas II.5, II.6, II.7 y II.8 se indican los ensayos realizados para el estudio
de la toxicidad aguda estndar (TE) de los diferentes tensioactivos. En ellas se recogen el
grupo taxonmico del organismo usado, la especie, su identificacin y la respuesta
estudiada. Todos los ensayos se llevaron a cabo en agua de mar natural (vase apartado 2).
Las principales caractersticas fsico-qumicas y biolgicas del medio de ensayo

empleado para cada tensioactivo se recogen en los correspondientes apartados de
posteriores captulos (captulos 3, 4, 5 y 6). La metodologa empleada para la realizacin de
los ensayos de inhibicin de crecimiento y mortalidad aparece detallada en el apartado 3 del
presente captulo.
II-3
Captulo 2
Tabla II.5. Diseo de experimentos para el estudio de la toxicidad estndar (TE) del
tensioactivo catinico cloruro de dodecil trimetil amonio (DTMAC).
Grupo Organismo Cdigo Efecto

Algas N. gaditana TE1 Inhibicin crecimiento(IC), 96-h
Algas I. galbana TE2 Inhibicin crecimiento (IC), 96-h
Algas C. gracilis TE3 Inhibicin crecimiento (IC), 96-h
Algas D. salina TE4 Inhibicin crecimiento (IC), 96-h
Algas T. chuii TE5 Inhibicin crecimiento (IC), 96-h
Crustceos A. franciscana TE6 Mortalidad, 48 y 72-h
tensioactivo no-inico nonilfenol etoxilado (NPEO).

Algas N. gaditana TE7 Inhibicin crecimiento (IC), 96-h
tensioactivo aninico alquil etoxisulfato (AES).

tensioactivo no-inico alcohol etoxilado (AE).

II-4
Metodologa
Ensayos de evolucin de la toxicidad del medio de ensayo durante el proceso de

biodegradacin
Los siguientes ensayos tuvieron como objetivo comprobar si a lo largo del proceso
de biodegradacin no tienen lugar transformaciones en la molcula de tensioactivo que
conlleven la formacin de subproductos ms txicos, esto es, que presenta una
biodegradabilidad ambientalmente aceptable. Para ello, se llevaron a cabo ensayos de
toxicidad sobre microalgas y crustceos marinos de muestras procedentes de los ensayos de
biodegradacin tomadas en diferentes estados del proceso. En las Tablas II.9, II.10, II.11 y
II.12 se recogen los diferentes ensayos realizados as como las condiciones empleadas en
cada uno de ellos. Se indican el grupo taxonmico del organismo usado, la especie, su
identificacin, los porcentajes de biodegradacin a las que se tomaron las, y finalmente, el
efecto estudiado.
Tabla II.9. Diseo de experimentos para el estudio de la toxicidad durante el proceso de

biodegradacin (TB) del tensioactivo catinico cloruro de dodecil trimetil
amonio (DTMAC).
Grupo Organismo Cdigo Biodegradacin (%) Efecto

Algas N. gaditana TB1 0, 17, 40, 55, 70, 81, 95 IC, 72 y 96-h
Algas I. galbana TB2 0, 17, 40, 55, 70, 81, 95 IC, 72 y 96-h
Algas C. gracilis TB3 0, 17, 40, 55, 70, 81, 95 IC, 72 y 96-h
Algas D. salina TB4 0, 17, 40, 55, 70, 81, 95 IC, 72 y 96-h
Algas T. chuii TB5 0, 17, 40, 55, 70, 81, 95 IC, 72 y 96-h
Crustceos A. franciscana TB6 0, 17, 40, 55, 70, 81, 95 Mortalidad, 48 y 72-h

biodegradacin (TB) del tensioactivo no-inico nonilfenol etoxilado (NPEO).

Algas N. gaditana TB7 0, 16, 28, 36, 45, 50, 64, 80, 93 IC, 72 y 96-h
Algas I. galbana TB8 0, 16, 28, 36, 45, 50, 64, 80, 93 IC, 72 y 96-h
Algas C. gracilis TB9 0, 16, 28, 36, 45, 50, 64, 80, 93 IC, 72 y 96-h
Algas D. salina TB10 0, 16, 28, 36, 45, 50, 64, 80, 93 IC, 72 y 96-h
Algas T. chuii TB11 0, 16, 28, 36, 45, 50, 64, 80, 93 IC, 72 y 96-h
Crustceos A. franciscana TB12 0, 16, 28, 36, 45, 50, 64, 80, 93 Mortalidad, 48 y 72-h

biodegradacin (TB) del tensioactivo aninico alquil etoxisulfato (AES).

Algas N. gaditana TB13 0, 18, 36, 55, 78, 91 IC, 72 y 96-h
Algas I. galbana TB14 0, 18, 36, 55, 78, 91 IC, 72 y 96-h
Algas C. gracilis TB15 0, 18, 36, 55, 78, 91 IC, 72 y 96-h
Algas D. salina TB16 0, 18, 36, 55, 78, 91 IC, 72 y 96-h
Algas T. chuii TB17 0, 18, 36, 55, 78, 91 IC, 72 y 96-h
Crustceos A. franciscana TB18 0, 18, 36, 55, 78, 91 Mortalidad, 48 y 72-h
II-5
Captulo 2

biodegradacin (TB) del tensioactivo no-inico alcohol etoxilado (AE).

Algas N. gaditana TB19 0, 20, 37, 53, 63, 77, 94 IC, 72 y 96-h
Algas I. galbana TB20 0, 20, 37, 53, 63, 77, 94 IC, 72 y 96-h
Algas C. gracilis TB21 0, 20, 37, 53, 63, 77, 94 IC, 72 y 96-h
Algas D. salina TB22 0, 20, 37, 53, 63, 77, 94 IC, 72 y 96-h
Algas T. chuii TB23 0, 20, 37, 53, 63, 77, 94 IC, 72 y 96-h
Crustceos A. franciscana TB24 0, 20, 37, 53, 63, 77, 94 Mortalidad, 48 y 72-h
II-6
Metodologa
2. Medio de ensayo y punto de muestro
El medio de ensayo empleado tanto en los ensayos de biodegradacin como de

toxicidad contena como matriz principal agua de mar natural procedente de la zona externa
de la desembocadura del Cao de Sancti Petri (rea litoral de Sancti Petri, Cdiz). Se trata
de un canal de 17 km de longitud de flujo-reflujo de mareas que comunica la Baha interior
de Cdiz con el ocano Atlntico (Figura II.1).
El canal presenta una gran importancia desde el punto de vista econmica debido a
las actividades que soporta (con los puertos deportivos de Gallineras y Sancti Petri y el
astillero militar de la Carraca), a las que se le suman la presencia de ncleos urbanos (San
Fernando y Chiclana de la Frontera) y un alto valor ecolgico (Vidal y Tejedor, 2005). El
punto de toma de muestra est localizado en la parte ms externa de la desembocadura del
cao, una zona con fuerte influencia mareal y muy poco antropizada, como muestran los
resultados de los anlisis realizados al agua tomada en esta zona (captulos 3, 4, 5 y 6).
N
Punto de
muestro
Figura II.1. Situacin geogrfica del Cao de Sancti Petri y fotografas de la zona de
muestreo.
II-7
Captulo 2
3. Metodologa para el estudio de la biodegradabilidad
En este apartado se expone la metodologa seguida para el estudio de la

biodegradabilidad de los diversos tensioactivos, as como una breve descripcin del
material comn empleado en los ensayos.
Mtodo de ensayo
Los ensayos de biodegradacin realizados en el presente trabajo siguieron la

directriz OPPTS 835.3160 Biodegradabilidad en agua de mar, propuesta por la Agencia
de Proteccin Ambiental de los Estados Unidos (USEPA, 1998a). Esta directriz contempla
dos posibles mtodos de ensayo: el mtodo de frasco cerrado y el mtodo de frasco agitado.
En este trabajo, se opt por emplear el mtodo de frasco agitado dado que este mtodo
permite, entre otras, tomar muestras peridicas para realizar el anlisis cuantitativo de los
tensioactivos y de parmetros analizados (oxgeno disuelto, temperatura y pH) as como
para los ensayos de toxicidad.
El mtodo de frasco agitado consiste en una variante en agua de mar del ensayo
homlogo de la Organizacin para la Cooperacin y Desarrollo Econmico (OECD, 1992),
desarrollado por el Instituto Dans de Calidad del Agua (Nyholm y Kristensen, 1987). Los
resultados de este ensayo no deben tomarse como indicadores de fcil biodegradabilidad,
pero pueden usarse especficamente para obtener informacin acerca de la
biodegradabilidad de compuestos en ambientes marinos. As, un resultado positivo en el
ensayo (eliminacin del carbono orgnico disuelto (COD) >70% en menos de 60 das)
indicara la existencia de un potencial para su degradacin en el medio marino estudiado.
Por el contrario, un resultado negativo no descartara tal potencial aunque sera necesario
llevar a cabo nuevos estudios, por ejemplo, empleando concentraciones inferiores, para
corroborar esta hiptesis.
Descripcin del mtodo
Las muestras de agua de mar fueron tomadas con ayuda de una botella
oceanogrfica tipo Ruttner a 0,5 m de profundidad y posteriormente, filtradas mediante
filtros de fibra de vidrio de 1 m de tamao de poro nominal, para eliminar partculas
gruesas. A continuacin las muestras fueron enriquecidas con 1 mL L-1 de diferentes
soluciones stock de nutrientes (Tabla II.13) y finalmente, aclimatadas durante 24 horas en
oscuridad a 20 1C, al objeto de permitir el pre-acondicionamiento de los
microorganismos a las condiciones de ensayo.
Los reactores empleados en los ensayos de biodegradacin eran de borosilicato de

color mbar con una capacidad de 2,5 L, con objeto de que el proceso tuviese lugar bajo luz
II-8
Metodologa
difusa. A cada reactor se le adicion un volumen de 1,5 L de agua de mar aclimatada,

dejando as un espacio vaco suficiente para permitir la correcta re-oxigenacin del medio.
Los experimentos se llevaron a cabo en una cmara termostatizada en oscuridad y a 19
2C. La agitacin del medio de ensayo se llev a cabo de forma peridica mediante la
inyeccin de un pequeo flujo de aire, el cual adems de agitar la disolucin, permiti la
aireacin de la misma (Figura II.2). En el caso del tensioactivo no-inico NPEO la
agitacin se llev a cabo mediante un agitador magntico para evitar a la formacin de
espuma, y por tanto, la disminucin de su biodisponibilidad.
Tabla II.13. Composicin qumica de las soluciones stock de nutrientes empleadas en los
ensayos de biodegradacin (USEPA, 1998).
Solucin stock de nutrientes Compuesto Concentracin (g L-1)

KH2PO4 8,5
K2HPO4 21,75
Solucin stock I
Na2HPO4 2H2O 33,3
NH4Cl 0,5
Solucin stock II CaCl2 27,5
Solucin stock III MgSO4 22,5
Solucin stock IV FeCl3 6H2O 0,25
Figura II.2. Cmara termostatizada empleada para los ensayos de biodegradacin.
Los experimentos de biodegradacin estaban constituidos por: (a) un ensayo

control, el cual contena exclusivamente agua de mar aclimatada, (b) un ensayo referencia,
formado por agua de mar aclimatada y una concentracin de 15-20 mg L-1 de COD de
II-9
Captulo 2
benzoato sdico, (c) un ensayo abitico, el cual contena una concentracin aproximada de
tensioactivo de 15 mg L-1 COD y 100 mg L-1 de HgCl2, y finalmente (d) un triplicado,
formado por agua de mar aclimatada y una concentracin aproximada de tensioactivo de 15
mg L-1 COD. El objetivo del ensayo abitico fue comprobar si durante el experimento tuvo
lugar algn proceso de prdida de concentracin por mecanismos no biolgicos tales como
hidrlisis, adsorcin, volatilizacin, etc., mientras que el ensayo de referencia tuvo como
fin comprobar la actividad de la flora microbiana natural contenida en el agua de mar
empleada. As, un resultado negativo en los ensayos de biodegradacin, incluido el ensayo
de referencia, indicara que stos son debidos a una baja actividad microbiana del agua de
mar empleada y no a razones estructurales del compuesto ensayado, y, por lo tanto, habra
que repetir el experimento con agua procedente de otra zona.
La concentracin de sustrato en los ensayos de biodegradacin fue determinada

mediante medidas de carbono orgnico disuelto (COD). Estas medidas se realizaron de
acuerdo con el mtodo estndar de combustin infrarroja 5310B (APHA y col., 1992) con
la ayuda de un analizador Shimadzu TOC-5050A. Previo a su anlisis, las muestras fueron
filtradas a travs de filtros de fluoruro de polivinilideno de 0,22 m de tamao de poro
nominal (Millipore, S.A.). La determinacin de los parmetros de control (pH, oxgeno
disuelto y temperatura) se llev a cabo peridicamente, al objeto de garantizar que el
proceso degradativo estuviera transcurriendo bajo condiciones no limitantes. La
determinacin del oxgeno disuelto se realiz mediante un oxmetro porttil con electrodo
selectivo de membrana, corrector de salinidad y compensador de temperatura (WTW Gmb,
Prod. n Oxi 330). La determinacin del pH fue potenciomtrica, emplendose un pHmetro
porttil (Crison Instruments, S.A., Prod. n 507) dotado de un electrodo combinado de
vidrio Ag/AgCl y un compensador automtico de temperatura con una resolucin de 0,01
unidades de pH.
Modelizacin cintica
Los valores de concentracin de sustrato obtenidos a lo largo de los ensayos de

biodegradacin fueron ajustados a diferentes modelos cinticos propuestos por diversos
autores (Simkins y Alexander, 1984; Quiroga y col., 1999) mediante tcnicas de regresin
no lineal, con la ayuda del programa estadstico Sigma Plot 8.0. La seleccin del modelo
cintico ms apropiado se llev a cabo en funcin de la simplicidad de los modelos que
presentan un mejor ajuste. Para determinar la bondad del ajuste del modelo cintico a los
datos experimentales se han considerado: (a) el coeficiente de determinacin (R2), (b) el
significado fsico de los parmetros cinticos calculados, y (c) los resultados obtenidos en
el anlisis estadstico de la Chi-cuadrado (2).
II-10
Metodologa
El anlisis de la 2 nos permite evaluar de una manera fcil y rpida la bondad del
ajuste de los datos experimentales a un determinado modelo matemtico (Press y col.,
1986). Bsicamente, consiste en el clculo del parmetro estadstico Q, probabilidad de que
la Chi-cuadrado exceda al azar un determinado valor 2 terico, y el cual nos da una medida
cuantitativa de la bondad de ajuste del modelo. As, valores Q muy prximos a cero
indicaran que las diferencias aparentes entre los datos experimentales y los datos
correspondientes al modelo terico no son debidas a fluctuaciones experimentales y por
tanto, el modelo podra ser estadsticamente rechazado. Por el contrario, valores Q
prximos a la unidad indicaran que tales diferencias pueden ser debidas a variaciones
casuales, indicando as un buen ajuste del modelo. Sin embargo, valores muy prximos a la
unidad indicaran un excelente ajuste entre los datos experimentales y tericos, demasiado
bueno literalmente para ser cierto, y suele ser debido, normalmente, a una sobreestimacin
de los errores de medidas. En general, un valor aceptable de 2 para un ajuste relativamente
bueno es aquel en el que 2 , siendo el nmero de grados de libertad ( = N - M, N es el
nmero de datos y M el nmero de parmetros del modelo ajustado).
A partir de las ecuaciones y parmetros cinticos se calcularon los valores del

tiempo de latencia (tL t10), t50 y el de vida media (t1/2), considerando tL el tiempo
transcurrido hasta alcanzar un 10% de biodegradacin, t50 el tiempo transcurrido en
alcanzar un 50% de biodegradacin, a partir del tiempo de latencia y t1/2 el transcurrido
hasta alcanzar el 50% de biodegradacin, considerando el tiempo de latencia (Figura II.3).
100
Biodegradacin (%)
t50
50
10
tL t1/2
Tiempo (T-1)
Figura II.3. Tpica curva de biodegradacin empleando el mtodo de frasco agitado

(USEPA, 1998).
II-11
Captulo 2
4. Metodologa para el estudio de la toxicidad aguda estndar
A continuacin se describe la metodologa empleada para el estudio de toxicidad

aguda estndar con microalgas y crustceos marinos.
Ensayos de toxicidad con microalgas marinas
Se han empleado un total de cinco especies de microalgas marinas:

Nannochloropsis gaditana (clase Eustigmatophyceae), Isochrysis aff. galbana (clase
Primnesiophyceae), Chaetoceros gracilis (clase Bacillariophyceae), Dunaliella salina
(clase Chlorophyceae) y Tetraselmis chuii (clase Prasinophyceae) (Figura II.4). Todas las
especies procedan de la coleccin de cepas de microalgas del Instituto de Ciencias Marinas
de Andaluca (ICMAN-CSIC) (Lubian y Yufera, 1989).
A B C D E
Figura II.4. Algas usadas: (A) N. gaditana, (B) I. galbana, (C) C. gracilis, (D) D. salina
y (E) T. chuii.
Para el estudio de la toxicidad aguda sobre las microalgas marinas se llevaron a

cabo ensayos de inhibicin del crecimiento. El procedimiento seguido estuvo basado en
diversos mtodos estndares propuestos por la Agencia de Proteccin Ambiental de los
Estados Unidos (USEPA, 1996, 1998b, 2002a, 2002b), la Asociacin de la Salud Pblica
Americana (APHA y col., 1992), la Organizacin para la Cooperacin y el Desarrollo
Econmico (OECD, 1998) y otros autores (Rand, 1995; Kooijman y col., 1996; Garrido,
2002).
La preparacin de los inculos se realiz en dos etapas. En una primera etapa, los
inculos fueron cultivados en agua de mar sinttica esterilizada, al objeto de sanear los
cultivos y evitar cualquier fuente de contaminacin. Una vez alcanzada una determinada
concentracin, estos inculos fueron cultivados en agua de mar natural esterilizada. Todos
los inculos de microalgas fueron cultivados en frascos Erlenmeyer de borosilicato de 500
mL a 20 1C e iluminacin continua (220 mol m-2 sec-1), conteniendo 100 mL de agua
de mar sinttica (USEPA, 2002a) o natural esterilizada, y un suplemento de nutrientes y
vitaminas, de acuerdo con el medio f/2 (Guillard y Ryther, 1962), el cual fue modificado
empleando una concentracin doble de nitrato y fosfato (Huertas y col., 2000) y silicatos
(Garrido, 2002) (Tabla II.14). La concentracin de biomasa fue estimada a partir de la
II-12
Metodologa
densidad ptica del cultivo (DO) medida mediante un colormetro (Nannocolor PT-3
MACHEREY-NAGEL) a una longitud de onda de 690 nm (DO, 690 nm).
Tabla II.14. Composicin del medio nutritivo, modificado del f/2, empleado en los
ensayos de toxicidad con microalgas (Garrido, 2002).
f/2 Medio nutritivo Medio nutritivo

Compuesto Elemento
(g L-1) (mg L-1) (mg L-1)
Macronutrientes
NaNO3 150,0 150,0 N 24,724
NaPO4H22H2O 10,0 10,0 P 1,985
FeCl3 6H2O 3,15 3,15 Fe 0,651
Na2O3Si 0,5 0,5 Si (*) 0,121
Metales traza
CuSO4 5H2O 0,010 0,010 Cu 0,003
ZnSO4 7H2O 0,022 0,022 Zn 0,005
CoCl2 6H2O 0,010 0,010 Co 0,002
MnCl2 4H2O 0,180 0,180 Mn 0,050
Na2MoO4 2H2O 0,006 0,006 Mo 0,002
Vitaminas
Vitamina B1 0,100 0,100
Vitamina B12 0,005 0,005
Otros componentes
EDTA-Na2 2H2O 4,36 4,36 (**)
(*) No incluido en la composicin inicial de f/2. Slo necesario para diatomeas.
(**) Suprimir este compuesto en ensayos con metales.
Los ensayos de inhibicin de crecimiento fueron realizados en tubos de vidrio de

borosilicato de 10 mL, conteniendo 2 mL de inculo y 2 mL de una solucin conocida de
tensioactivo, ambos preparados en agua de mar natural y enriquecidos con medio de
nutrientes f/2 modificado. La densidad de biomasa inicial ptima en los cultivos de
microalgas fue de 0,200-0,300 unidades de absorbancia, concentracin a la cual el cultivo
se encuentra en fase de crecimiento exponencial (Perales, 2001). Los cultivos fueron
incubados a 20 1C, con un foto-perodo de 24 horas y una intensidad de luz de 220 mol
m2 sec, utilizando una incubadora de precisin modelo Hot-Cold GL 4000700 (J. P.
Selecta, S.A.) (Figura II.5).
Todas las concentraciones empleadas, as como los controles, fueron ensayadas

por triplicado. La concentracin de biomasa fue medida inicialmente y a las 24, 48, 72 y 96
horas de incubacin. Las velocidades de crecimiento de las microalgas fueron analizadas
estadsticamente mediante interpolacin lineal para determinar los valores 96-h IC50
(concentracin que produce un 50% de inhibicin de crecimiento en los cultivos de
microalgas al cabo de 96 horas de exposicin), utilizando para ello el programa informtico
ICp (Norberg-King, 1988, 1993). Los parmetros LOEC (concentracin ms baja ensayada
II-13
Captulo 2
que produce efecto) y NOEC (concentracin ms elevada ensayada que no produce efecto)
fueron calculados mediante el test de Dunnet o Steel, dependiendo de los resultados
obtenidos previamente en los test Shapiro-Wilk de normalidad y test de Bartlett de
homogeneidad de la varianza (USEPA, 2002a). Para el clculo de dichos parmetros se
empleo el programa estadstico ToxStat (West y Gulley, 1996).
Figura II.5. Incubadora modelo Hot-Cold GL 4000700 utilizada en los ensayos de

toxicidad estndar con microalgas marinas.
Ensayos de toxicidad con Artemia franciscana
Para la realizacin de los ensayos de toxicidad con crustceos marinos se emple

la especie Artemia franciscana (cdigo 1301), cuyos quistes fueron proporcionados por el
Instituto de la Artemia en Blgica (Artemia Reference Center, State University of Ghent
and Laboratory of Biological Research in Aquatic Pollution, Blgica) (Figura II.6A). La
medida de toxicidad se ha basado en la mortalidad del crustceo marino despus de un
determinado tiempo de exposicin al tensioactivo en comparacin con un control no txico.
A B
Figura II.6. Ensayo de toxicidad estndar con crustceos marinos. (A) Fotografa del
crustceo Artemia sp. (B) Preparacin de las placas Petri empleadas en los
ensayos.
II-14
Metodologa
La metodologa empleada en los ensayos de toxicidad con crustceos ha seguido

las directrices propuestas por la Agencia de Proteccin Ambiental de los Estados Unidos
(USEPA, 1992, 1996, 1998b, 2002a, 2002b), la Organizacin para la Cooperacin y el
Desarrollo Econmico (OECD, 1998), la Sociedad Americana para el Ensayos de
Materiales (ASTM, 2004) y diversos autores (Rand, 1995; Garrido, 2002).
Para la eclosin de los quistes de A. franciscana se emplearon frascos Erlenmeyer

de borosilicato de 250 mL, conteniendo 100 mL de agua de mar sinttica esterilizada
(USEPA, 2002a). Los quistes fueron incubados a 20 1C, iluminacin constante y
aireacin suave. Bajo estas condiciones, el tiempo de eclosin requerido fue de
aproximadamente 24 horas. Los nauplios eclosionados fueron transferidos con la ayuda de
una pipeta Pasteur a agua de mar sinttica fresca.
Los experimentos fueron realizados en placas Petri de borosilicato (55mm de

dimetro) (Figura II.5), conteniendo un nmero total de 10 individuos por placa. Estos
individuos eran transferidos en un volumen inferior a 50 L con la ayuda de una pipeta
Pasteur. Posteriormente se aadieron 8 mL de la concentracin del txico a ensayar y se
incubaron a 20 1C y en oscuridad.
Todas las concentraciones de tensioactivos as como el control fueron ensayados

por quintuplicado. Al cabo de 24, 48 y 72 horas se cont, con ayuda de una lupa, el nmero
de individuos muertos (inmovilidad durante 10 segundos y color blanquecino) y vivos.
La determinacin de los valores LC50 (concentracin que provoca la mortalidad de

un 50% de la poblacin de individuos) a las 48 y 72 horas de exposicin al tensioactivo se
llevo a cabo siguiendo el procedimiento propuesto por la Agencia de Proteccin Ambiental
de los Estados Unidos (USEPA, 2002b). En aquellos casos en los que los datos no reunan
las condiciones necesarias para aplicar el mtodo Probit (Finney, 1962), se emple el
mtodo Trimmed Spearman-Karber Spearman-Karber, dependiendo de los porcentajes de
mortalidad observados a las concentraciones mximas y mnimas ensayadas (USEPA,
2002b). La determinacin de los parmetros LOEC (concentracin ms baja ensayada que
produce efecto) y NOEC (concentracin ms elevada ensayada que no produce efecto) se
llev a cabo siguiendo el mismo procedimiento que en el caso de las microalgas.
II-15
Captulo 2
5. Metodologa para el estudio de la evolucin de la toxicidad durante la

biodegradacin.
Durante el proceso de biodegradacin de los tensioactivos se analiz la evolucin

de la toxicidad del medio de ensayo. Los porcentajes de biodegradacin a los que fueron
tomadas las muestras de toxicidad se recogen en el apartado 1 del presente capitulo (Tablas
II.9, II.10, II.11 y II.12).
La metodologa empleada para los ensayos de toxicidad con aguas procedentes de

diferentes estados del ensayo de biodegradacin ha sido anloga a la metodologa descrita
para los ensayos de toxicidad aguda estndar con microalgas y crustceos marinos
(apartado 4). En el caso de las microalgas, se realiz una modificacin de la metodologa de
los ensayos estndares de toxicidad al objeto de evitar la dilucin de las concentraciones de
tensioactivo. En este caso, los inculos de microalgas fueron centrifugados, una vez
alcanzada la densidad ptima. Posteriormente, se procedi a la eliminacin del
sobrenadante y, finalmente, a la re-suspensin de las microalgas en 4 mL de muestra
procedente de los diferentes estados de biodegradacin (enriquecidas con medio nutritivo
f/2 modificado) hasta alcanzar una concentracin de biomasa optima (0,200-0,300 unidades
de absorbancia).
II-16
Metodologa
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II-17
Captulo 2
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II-18
Captulo 3
SALES DE ALQUIL TRIMETIL AMONIO
Resumen
Dentro de la gran familia de los tensioactivos catinicos, las sales de alquil trimetil
amonio destacan por sus numerosas aplicaciones tanto domsticas como industriales. Sin
embargo, la bibliografa existente acerca del comportamiento ambiental de estos
tensioactivos en el medio marino es, hasta la fecha, muy escasa. El siguiente captulo
presenta los resultados del estudio de la biodegradabilidad y ecotoxicidad del tensioactivo
catinico cloruro de dodecil trimetil amonio (DTMAC) en agua de mar natural procedente
de la zona costera de Sancti Petri (Cdiz). El mtodo de ensayo para el estudio de la
biodegradacin final del tensioactivo se ha basado en la directriz OPPTS 835.3160
Biodegradabilidad en agua de mar, propuesta por la Agencia de Proteccin Ambiental de
los Estados Unidos (USEPA). El estudio de la toxicidad se ha llevado a cabo mediante
ensayos de inhibicin del crecimiento de diversas especies de microalgas as como ensayos
de mortalidad del crustceo marino Artemia sp. Finalmente, se ha estudiado la evolucin de
la toxicidad del medio de ensayo a lo largo del proceso degradativo sobre estos organismos
marinos. Los resultados indican un elevado porcentaje de biodegradacin final del
tensioactivo (>90%). Asimismo, la microalga C. gracilis constituye la especie ms sensible
al tensioactivo. Dado que no se observa un incremento de la toxicidad del medio se puede
concluir que el tensioactivo presenta una biodegradabilidad ambientalmente aceptable.
Captulo 3
1. Introduccin
Sales de alquil trimetil amonio. Caractersticas y usos
Las sales de alquil trimetil amonio constituyen un importante grupo dentro de la

amplia gama de tensioactivos catinicos con numerosas aplicaciones industriales y
domsticas (Huber, 1984; Garca y col., 1999; Nalecz-Jawecki y col., 2003). As, cabe
destacar su utilizacin en productos cosmticos, tales como acondicionadores colorantes
para el cabello, as como en otros productos de cuidado personal (Madsen y col., 2001).
Su estructura qumica se compone de una parte hidrfoba constituida por una

cadena alqulica, generalmente lineal, con un nmero de tomos de carbono comprendido,
normalmente, entre 12 y 18, y una parte hidrfila, formada por un tomo de nitrgeno
cuaternario con tres radicales metilo. En funcin del tipo de contrain presente en la
molcula (anin Cl- Br-) se diferencian dos tipos de sales: cloruros de alquil trimetil
amonio (ATMAC) y bromuros de alquil trimetil amonio (ATMAB) (Figura III.1).
CH3
R N+ CH3 X-
CH3
Figura III.1. Estructura qumica del tensioactivo catinico sal de alquil trimetil amonio
(R= CxH2x+1, x= 12-18; X- = Cl- Br-).
Niveles de alquil trimetil amonio en el medio acutico
La determinacin de sales de alquil trimetil amonio y, en general de tensioactivos

catinicos, en diferentes compartimentos acuticos ha sido objeto, sorprendentemente, de
muy pocos estudios. Tan slo se han encontrado datos referentes a la presencia del
tensioactivo cloruro de bi(alquil grasa hidrogenada) dimetil amonio (DTDMAC) en
efluentes de estaciones depuradoras de aguas residuales (Versteeg y col., 1992) y en agua
de ro (Leuwen y col., 1992), con concentraciones de 62 y 2-34 g L-1 DTDMAC,
respectivamente.
Debido a su naturaleza anfiflica, durante el tratamiento de las aguas residuales los

tensioactivos catinicos son adsorbidos con gran facilidad en la superficie del material
particulado. Esto hace que las concentraciones esperadas de estos compuestos en la fase
acuosa sean, en principio, relativamente bajas. Kupfer (1982) y Topping y Waters (1982)
III-2
Sales de alquil trimetil amonio
observaron una reduccin del 95% de la concentracin total de tensioactivos catinicos en

un sistema de lodos activos, siendo gran parte de esta eliminacin debida a procesos de
adsorcin sobre los flculos biolgicos. Adems, Huber (1987) encontr una eliminacin
de entre el 20 y 40% de tensioactivos catinicos en el decantador primario de una estacin
depuradora de aguas residuales debido a procesos de adsorcin en los slidos
sedimentables.
Biodegradabilidad de las sales de alquil trimetil amonio
Hasta la fecha, pocos son los estudios que se han llevado a cabo sobre la
biodegradacin de sales de alquil trimetil amonio en ambientes aerobios anaerobios.
Mackrell y Walter (1978) propusieron tres posibles rutas metablicas para la degradacin
de estos tensioactivos bajo condiciones aerobias (Figura III.2). Una primera ruta consiste en
la ruptura del enlace C-N de la cadena alqulica (N-desalquilacin) dando lugar a un
aldehdo y a una amina terciaria, la cual a su vez se degradara mediante sucesivas rupturas
del enlace C-N de los grupos metilos (N-desmetilacin). Otra posible ruta de degradacin
sera la ruptura del enlace C-N de uno de los grupos metilo, dando lugar a formaldehdo y
una amina terciaria, la cual se degradara mediante N-desalquilacin y/ N-desmetilaciones.
El ataque microbiano sobre la cadena alqulica de la molcula mediante - oxidaciones
constituye la tercera posible ruta de biodegradacin de estos compuestos. Para condiciones
anaerobias, no se ha encontrado bibliografa en la que se describa las posibles rutas de
biodegradacin de estos compuestos.
El acortamiento de la cadena alqulica mediante - oxidaciones ha sido

demostrado por Dean-Raymond y Alexander (1977) en estudios de degradacin del
tensioactivo C10TMAC con Xanthomonas sp. Sin embargo, estudios llevados a cabo con
lodos activos procedentes de una estacin depuradora de aguas residuales urbanas sugieren
que el mecanismo de biodegradacin de las sales de alquil trimetil amonio consiste en una
N-desalquilacin, seguida de N-desmetilaciones (Nishiyama y col., 1995). En esta ruta, la
sal de alquil trimetil amonio sera inicialmente degradada a trimetil-amina mediante una N-
desalquilacin y posteriormente transformada en dimetil-amina, y a su vez, en metil-amina.
Sin embargo, este ltimo compuesto raramente ha sido detectado (Nishiyama y col., 1995).
En general, las sales de amonio cuaternaria son consideradas biolgicamente

degradables bajo condiciones aerobias (Ying, 2006). Games y col. (1982) demostraron que
durante el proceso degradativo no se generan metabolitos recalcitrantes y describieron un
tiempo de vida media de 2,5 horas para la biodegradacin primaria del tensioactivo cloruro
de octadecil trimetil amonio (C18TMAC) en un sistema de lodos activos. Asimismo,
estudios llevados a cabo sobre diferentes homlogos de sales de alquil trimetil amonio
(bromuros de dodecil, tetradecil y hexadecil trimetil amonio) y empleando agua de mar
III-3
Captulo 3
inoculada indicaron una completa biodegradacin primaria bajo condiciones aerobias

(Garca y col., 2001).
Sal de amonio cuaternario
CH3
R N+ CH3 X-
CH3
N-desalquilacin -oxidacin
N-desmetilacin
CH3
O H3C CH3 H R CH3 O
R C
+ N O C + N C R1 N+ CH3
H CH3 H CH3 HO CH3

Aldehdo Trimetil amina Formaldehdo Amina terciaria Amina cuaternaria
- oxidacin
N-desalquilacin N-desmetilacin
CH3
O
N-desmetilacin
C R2 N+ CH3
CO2, H2O, NH3 /NH4+
N-desalquilacin HO CH3
Amina cuaternaria
+
O
H3 C C
OH
cido actico
Figura III.2. Rutas de biodegradacin de las sales de aquil trimetil amonio (Mackrell y
Walter, 1978) (R=C12-C18; R1=R-1, R2=R-2).
La elevada mineralizacin que presentan estos tensioactivos tambin ha sido

puesta de manifiesto en diversas experiencias. As, por ejemplo, Games y col (1982)
observaron un alto grado y velocidad de mineralizacin para el tensioactivo C18TMAC a
concentraciones iniciales de ensayo comprendidas entre 0,1 y 1 mg L-1. Larson y Vashon
(1983) estimaron un tiempo de vida media de 2,2 das para dicho tensioactivo empleando
agua de ro previamente aclimatada. En estudios de mineralizacin en agua de ro y
mediante14C del tensioactivo C18TMAC (10 g/l) tambin se ha observado una elevada
biodegradacin final, obtenindose porcentajes de 14CO2 superiores al 60% y 75% al cabo
III-4
de 7 y 21 das, respectivamente (Boethling, 1984). En un medio de ensayo constituido por

agua de mar inoculada, Garca y col. (2001) observaron una completa mineralizacin para
diferentes homlogos de sales de alquil trimetil amonio (bromuros de dodecil, tetradecil y
hexadecil trimetil amonio) en un periodo comprendido entre 7 y 11 das de ensayo. Por otro
lado, diversos estudios han demostrado un aumento del grado de mineralizacin del
tensioactivo catinico cloruro de alquil trimetilamonio (ATMAC) cuando se combina con
el tensioactivo aninico lineal alquil benceno sulfonato (LAS). Games y col. (1982)
encontraron que una concentracin de 20 mg L-1 de C18TMAC inhiba la produccin
endgena de CO2 en un sistema de lodos activos, descartando por tanto su biodegradacin,
mientras que para una mezcla de C18TMAC y LAS (ambos en una concentracin de 20 mg
L-1) se alcanz un porcentaje de mineralizacin del 81% al cabo de 25 das de ensayo.
Aunque pocos son los estudios que se han llevado a cabo sobre la
biodegradabilidad de tensioactivos catinicos en condiciones anaerobias, se considera que
las sales de alquil trimetil amonio, y en general, los tensioactivos catinicos no son
anaerbicamente biodegradables. Garca y col. (1999) describieron una pobre
biodegradacin primaria y la ausencia de mineralizacin de diversos compuestos de alquil
trimetil amonio bajo condiciones anaerobias. Por otro lado, Janicke y Hilge (1979)
encontraron una mnima y/ inexistente disminucin de la concentracin de sales de
amonio cuaternario en digestores anaerobios.
Los estudios de biodegradacin de las sales de alquil trimetil amonio llevados a

cabo por diversos autores muestran que la biodegradabilidad de los diferentes homlogos
disminuye, en general, a medida que aumenta la longitud de cadena alqulica. En estudios
realizados por Masuda y col. (1976) los porcentajes de biodegradacin para diferentes
homlogos de ATMAC al cabo de 10 das de ensayos fueron del 73% para C8, 63% para
C10, 59% para C12, 35% para C14 y 0% para C16 y C18. Por otro lado, Garca y col. (2001)
encontraron una completa biodegradacin primaria del C12TMAB y C14TMAB al cabo de 3
das mientras que para C16TMAB sta no se alcanz hasta los 6 das de ensayo. Asimismo,
se observ una mineralizacin total de estos tensioactivos al cabo de 6 das para C12 y C14 y
11 das para C16.
Toxicidad de las sales de alquil trimetil amonio en el medio acutico
La bibliografa existente en relacin a la toxicidad acutica de las sales de alquil

trimetil amonio (ATMAC y ATMAB) sobre diferentes grupos taxonmicos (algas,
invertebrados, peces, etc.) es abundante, aunque cabe destacar que generalmente se tratan
de organismos acuticos no marinos.
Para el caso especfico de las algas, los datos de toxicidad aportados en la

bibliografa parecen indicar que se tratan de un grupo de organismos muy sensible a los
III-5
Captulo 3
tensioactivos catinicos, encontrndose valores de EC50 generalmente inferiores a 1 mg L-1.

As, Utsunomiya y col. (1997a) para una sal de alquil trimetil amonio con una cadena
alqulica comprendida entre 16 y 18 tomos de carbono (C16-18TMAC) encontraron valores
de EC50 (24-h, formacin de 13C-Glicerol) de 0,79 mg L-1 para la microalga marina
Dunaliella sp., mientras que para la especie de agua dulce Chlorella pyrenidosa el valor de
IC50 (96-h) fue de 0,28 mg L-1 (Utsunomiya y col., 1997b). Lewis y Hamm (1986)
investigaron los efectos de diversos tensioactivos ATMAC sobre el crecimiento de diversas
especies de algas. Para las microalgas Selenastrum capricornutum y Microcystis
aeruginosa, los valores de IC50 (96-h) hallados para el tensioactivo C16TMAB fueron de
0,09 mg L-1 y 0,03 mg L-1, respectivamente. Para el caso de C12TMAC, los valores de IC50
(96-h) estuvieron comprendidos entre 0,12 mg L-1 para Microcystis aeruginosa y 0,20 mg
L-1 para Navicula pelliculosa.
Los valores encontrados en la bibliografa de toxicidad aguda de las sales de alquil

trimetil amonio sobre invertebrados acuticos son, en todos los casos, inferiores a 1 mg L-1,
al igual que ocurre con las microalgas. Estudios de toxicidad aguda con bromuros de
dodecil, tetradecil y hexadecil trimetil amonio mostraron, concentraciones de efecto (EC50,
24-h, movilidad) comprendidas entre 0,13 y 0,18 mg L-1 sobre el crustceo D. magna
(Garca y col., 2001). Lewis y Suprenant (1983) encontraron efectos txicos (LC50, 48-h)
sobre el crustceo Gammarus sp. a una concentracin media de 0,1 mg L-1 de C16TMAC.
La toxicidad de las sales de alquil trimetil amonio sobre peces ha sido objeto de
estudio de pocos autores. En un estudio realizado por Boethling y Lynch (1992) para una
serie de sales de alquil trimetil amonio, mostraban valores de EC50 comprendidos entre 0,86
y 8,6 mg L-1 para la carpa Idus melanotus. Asimismo, Singh y col. (2002), para el
C16TMAC, determinaron los valores de EC50 (movilidad, 48-h) para tres especies de peces
de agua dulce, siendo sta de 1,21 mg L-1 para la trucha arco iris (Salmo gairdneri), 8,24
mg L-1 para el pez mosquito (Gammbusia affinis) y 3,58 mg L-1 para la carpa dorada
(Carassius auratus).
De forma general, la toxicidad de los tensioactivos catinicos aumenta con la

longitud de la cadena alqulica como consecuencia del aumento de la hidrofobicidad de la
molcula (Garca y col., 2001). Sin embargo, en ensayos de toxicidad realizados sobre el
crustceo D. magna y la fotobacteria P. phosphoreum, Garca y col. (2001) no observaron
diferencias significativas en la toxicidad de diferentes homlogos. Esto puede ser atribuido
a la baja biodisponibilidad de los homlogos de cadena alqulica ms largas como
consecuencia de su menor solubilidad.
III-6
2. Materiales
En el siguiente apartado se describen las principales caractersticas fsico-qumicas

del tensioactivo catinico, objeto del presente estudio, as como del medio de ensayo
empleado tanto en los ensayos de biodegradacin como de toxicidad sobre organismos
marinos.
Tensioactivo ensayado
El tensioactivo catinico empleado en el presente estudio fue el cloruro de dodecil

trimetil amonio (DTMAC), CAS 112-00-5 y suministrado por Sigma Aldrich, S.A.
(Barcelona). Se trata de un homlogo puro constituido por una cadena alqulica de 12
tomos de carbono y frmula emprica C15H34ClN. Posee un peso molecular de 263,89 g
mol-1, una solubilidad en agua de 50 g L-1 y una pureza superior al 99% de materia activa.
Medio de ensayo
En la Tabla III.1 se recogen las principales caractersticas fsico-qumicas y

biolgicas del agua de mar empleada en los ensayos de biodegradacin y toxicidad. Como
puede observarse las concentraciones de nitrito, nitrato, amonio y fosfato se encuentran por
debajo del lmite de deteccin del mtodo. Por otro lado, el anlisis microbiolgico desvela
la ausencia de microorganismos indicadores de influencia de aguas residuales urbanas.
Adems, se aprecia una baja concentracin de carbono orgnico disuelto, similar a las
descritas en aguas ocenicas (USEPA, 1998). Estos resultados indican que se trata de un
agua de excelente calidad y con muy bajo nivel nulo de contaminacin.
Tabla III.1. Caractersticas del agua de mar empleada en los ensayos de biodegradacin y
toxicidad del tensioactivo catinico (valor medio desviacin estndar, n=3).
Parmetro Unidades Valor Parmetro Unidades Valor

-1 -
Oxgeno disuelto % saturacin 89,9 1,8 Nitrato mg L NO3 < 0,020
Temperatura C 21,0 0,3 Amonio mg L-1 NH4+ < 0,007
Conductividad mS cm-1 51,1 0,2 Fosfato mg L-1 PO43- < 0,015
pH - 8,25 0,04 Silicato mg L-1 Si 0,046 710-4
-1 2+
Salinidad - 38,7 0,2 Dureza total mg L Ca 316 45
-1 -3
Carbono Total mg L C 26,5 0,5 Clorofila a mg m Cl a 0,85 0,10
Carbono inorgnico mg L-1 C 25,6 0,5 Estreptococos fecales UFC 100mL-1 No detectado
Carbono orgnico mg L-1 C 0,97 0,01 Coliformes fecales UFC 100mL-1 No detectado
-1 -
Nitrito mg L NO2 < 0,015 Enterococos UFC 100mL-1 No detectado
III-7
Captulo 3
Los resultados de los distintos ensayos realizados con DTMAC durante el trabajo
experimental se discuten en este apartado. En primer lugar, se resume el anlisis de los
parmetros de control medidos en el proceso de biodegradacin. Posteriormente, se
exponen los resultados correspondientes al estudio cintico del proceso de mineralizacin
del tensioactivo estudiado. A continuacin, se discuten los valores de toxicidad aguda
obtenidos a partir de los ensayos de inhibicin de crecimiento y mortalidad sobre
microalgas y crustceos marinos. Finalmente, se comentan los resultados obtenidos en los
ensayos de toxicidad con muestras procedentes de diferentes estados del ensayo de
biodegradacin.
3.1. Ensayos de biodegradacin
Parmetros de control
En la Figura III.3 se recogen la evolucin del pH y oxgeno disuelto en los ensayos

de biodegradacin (C1, C2 y C3) y en el control (CO1).
8,4 100
80
8,3
O2 (%saturacin)
60
pH
8,2
40
CO1 CO1
8,1 C1
20 C1
C2 C2
C3 C3
8,0 0
0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50
Tiempo (d) Tiempo (d)
Figura III.3. Evolucin del pH y oxgeno disuelto en el ensayo control (CO1) y los ensayos
de biodegradacin con DTMAC (C1, C2 y C3).
Como puede observarse en la Figura III.3, los valores de pH permanecen

prcticamente constantes a lo largo del experimento de biodegradacin, sin diferencias
significativas entre los ensayos de biodegradacin y el ensayo control, mostrando valores
medios de pH (valor medio DE) de 8,2 0,1.
III-8
Respecto a la concentracin de oxgeno disuelto, se aprecia en general un descenso

inicial de los niveles de oxgeno, los cuales se mantienen durante el resto del experimento.
No obstante, la concentracin de oxgeno disuelto en los ensayos de biodegradacin y
ensayo control permanece dentro de un intervalo que garantiza el desarrollo apropiado de
los microorganismos aerobios, mostrando valores medios de 73,7 3,1 y 78,3 3,7 % de
saturacin para los ensayos de biodegradacin y control, respectivamente.
En el caso del ensayo de referencia los valores de pH y oxgeno disuelto

estuvieron comprendidos entre 8,3 0,1 y 76,9 13,7 % de saturacin, respectivamente.
Los valores medios de temperatura en los ensayos control, referencia y biodegradacin con
tensioactivos fueron de 20,0 0,1C, 19,9 0,2C y 20,0 0,1C, respectivamente.
A la vista de estos resultados se puede concluir que las condiciones experimentales

durante el proceso de biodegradacin del tensioactivo fueron no limitantes para un
desarrollo ptimo de la microbiota responsable de la actividad degradativa.
Evolucin del carbono orgnico disuelto en los ensayos control, referencia y abitico
En la Figura III.4 se muestra la evolucin del carbono orgnico disuelto (COD) en

los ensayos control, referencia (benzoato sdico) y abitico (HgCl2).
Concentracin (mg COD L-1)
20
15
10 REF1
AB1
CO1
5
0
0 10 20 30 40 50
Tiempo (d)
Figura III.4. Evolucin del carbono orgnico disuelto en los ensayos control (CO1),
referencia (REF1) y abiticos (AB1) a lo largo del proceso de biodegradacin.
Se puede observar como la concentracin de COD en el ensayo control permanece

constante a lo largo del experimento, alcanzando valores medios de 0,9 0,7 mg L-1 COD.
III-9
Captulo 3
Asimismo, los valores de COD en el medio abitico, en presencia de HgCl2,

permanecen en torno al valor inicial a lo largo del ensayo, mostrando un porcentaje medio
de mineralizacin del 1,1 0,8 %. Este resultado viene a descartar la contribucin de
procesos abiticos tales como adsorcin, precipitacin, etc. en la eliminacin del
tensioactivo DTMAC en los ensayos de biodegradacin realizados.
En cuanto al ensayo de referencia, puede observarse como el benzoato sdico es

degradado en una extensin superior al 50% al cabo de 5 das de ensayo, mientras que al
cabo de 9 das el porcentaje de degradacin es superior al 90%. Estos valores son acordes a
los hallados por otros autores (Nyholm y Kristensen, 1992; Staples y col., 2001; Perales y
col., 2007) para el mismo sustrato y medio de ensayo (tiempo de vida media comprendido
entre 1 y 7 das), indicando la adecuada actividad de la poblacin microbiana presente en el
medio.
Evolucin del carbono orgnico disuelto en los ensayos con tensioactivo
En la Figura III.5 se representan los valores de concentracin residual de DTMAC

(mg L-1 COD) a lo largo del experimento para los tres ensayos realizados. Los puntos
indican los valores medios experimentales, mientras que las barras de error denotan la
desviacin estndar (n=3).
Concentracin (mg COD L )
20
-1
15
10
0
0 10 20 30 40 50
Tiempo (d)
Figura III.5. Evolucin de la concentracin residual de DTMAC (mg COD L-1) en los
ensayos de biodegradacin. La lnea continua corresponde a la curva obtenida
del ajuste de los valores experimentales a un modelo cintico logstico.
III-10
Se puede observar como la concentracin de COD se mantiene prcticamente

constante durante los primeros das de ensayo (fase de latencia) para posteriormente
comenzar el proceso metablico, alcanzndose porcentajes de mineralizacin superiores al
55% (8,3 mg L-1 COD) y 91% (1,6 mg L-1 COD) al cabo de unos 28 y 40 das de ensayo,
respectivamente. De acuerdo con la directiva OPPTS 835.3160 Biodegradabilidad en agua
de mar (USEPA, 1998), los resultados obtenidos en los ensayos de biodegradabilidad con
DTMAC (ms de un 90% de biodegradacin al cabo de 40 das de ensayo) manifiestan la
existencia de un potencial para la biodegradacin del tensioactivo en el medio acutico
marino.
La presencia de una fase de adaptacin de los microorganismos responsables de la

degradacin del tensioactivo (fase de latencia, aclimatacin o induccin) ha sido tambin
puesta de manifiesto por diversos autores para otros tensioactivos y medios de ensayo
(Shimp, 1989; Manzano y col., 1998; Perales y col., 1999; Staples y col., 2001; Perales y
col., 2007). As, Manzano y col. (1998) establecieron que la presencia de esta fase puede
ser debida bien a una baja concentracin de microorganismos con capacidad para degradar
el tensioactivo en el medio bien a que la microbiota presente en el medio empleado no ha
estado expuesta anteriormente al tensioactivo en cuestin, y por tanto, ha de aclimatar su
sistema enzimtico a la nueva fuente de sustrato (induccin enzimtica). Otros autores
defienden que este comportamiento puede ser consecuencia del efecto txico o
bacteriosttico generado por la presencia de altas concentraciones de sustrato sobre las
poblaciones bacterianas presentes en el medio (Garca y col., 1999). Por otro lado,
Wiggings y Alexander (1988a, 1988b) establecieron como posibles causas, adems de las
ya mencionadas, la falta de nutrientes, predacin por protozoos la mutacin de especies.
En nuestro caso, podemos descartar estas ltimas como posibles causas del periodo de
aclimatacin dado que el medio de ensayo fue previamente enriquecido con un medio de
nutrientes y filtrado (eliminacin de protozoos). Adems, dado que no se observa una fuerte
variabilidad en el tiempo de latencia entre los diferentes ensayos replicados de
biodegradacin podemos considerar que la mutacin de especies no tuvo lugar. En
conclusin, la presencia de esta fase de aclimatacin puede ser debida a una baja
concentracin de microorganismos en el medio, a que la microbiota presente en el medio
empleado no haya estado expuesta anteriormente al tensioactivo DTMAC y/ al efecto
bacteriosttico generado por la presencia del tensioactivo.
Modelizacin cintica
Los ensayos de biodegradacin actuales propuestos por la Organizacin para la

Cooperacin y el Desarrollo Econmico (OCDE), as como otros organismos, por ejemplo,
la Agencia de Proteccin Ambiental de los Estados Unidos (USEPA), no recogen un
tratamiento cintico preciso de los datos experimentales; tan slo se limitan al clculo,
mediante mtodos grficos, de los parmetros cinticos tiempo de latencia (tL), t50 (tiempo
III-11
Captulo 3
transcurrido hasta alcanzar un 50% de biodegradacin, sin considerar la fase de latencia) y

tiempo de vida media (t1/2).
Con el fin de conocer la cintica de biodegradacin del tensioactivo en el medio

marino, bajo las condiciones ensayadas, y calcular de una manera rigurosa los parmetros
cinticos tL, t50 y t1/2, se han ajustado los valores experimentales obtenidos a diferentes
modelos cinticos de consumo de sustrato propuestos por Simkins y Alexander (1984) y
Quiroga y col. (1999).
En la Tabla III.2 se recogen los valores de los parmetros cinticos y estadsticos

estimados para cada uno de los modelos aplicados. Se puede observar como slo los
modelos logstico y de Quiroga, Sales y Romero (Q-S-R) muestran un buen ajuste a los
datos experimentales, con coeficientes de determinacin (R2) muy prximos a la unidad en
ambos casos (R2 > 0,98). Adems, en ambos casos se obtienen parmetros cinticos con un
coherente significado fsico. Sin embargo, el anlisis de la chi-cuadrada (2) desvela que
slo en el caso de aplicar un modelo logstico a los resultados experimentales, se obtiene un
valor del parmetro estadstico Q prximo a la unidad (2 ~ ), lo que viene a indicar que
las diferencias aparentes entre los datos experimentales y los datos generados por el modelo
se deben principalmente a fluctuaciones experimentales y no a una falta de ajuste de los
datos experimentales al modelo. Estos resultados indican que el modelo cintico logstico
es el que mejor describe la cintica de mineralizacin del tensioactivo DTMAC en agua de
mar y bajo las condiciones ensayadas. En la Figura III.5 se representa mediante una lnea
continua los valores obtenidos al ajustar los valores experimentales a un modelo cintico
logstico.
Tabla III.2. Parmetros cinticos y estadsticos correspondientes a los resultados de

biodegradacin de DTMAC en agua de mar.
Parmetros estadsticos
Modelo Parmetro cintico Valora
R2 2 Q
Primer-orden S0 (mg COD L )-1
24,09 9,82
(Simkins y 0,80 8642,5 49 0
Alexander, 1984) K1 (d-1) 0,039 0,022
Logstico S0 (mg COD L-1) 19,16 2,39

(Simkins y B0 (mg COD L-1) 0,146 0,032 0,98 55,96 48 0,200
Alexander, 1984)
KLg (mg COD L-1 d-1) 0,0094 0,044
S0 (mg COD L-1) 19,03 2,23
Q-S-R Sto (mg COD L-1) 19,10 2,33
(Quiroga y col., 0,98 100,05 47 1,05E-05
1999) Snb (mg COD L-1) 0,957 2,62
max (d-1) 0,209 0,087
a
Datos presentados como valor medio DE (n=3)
III-12
A partir de los parmetros cinticos obtenidos del ajuste del modelo logstico a los
datos experimentales, y al objeto de poder comparar los resultados con los obtenidos por
otros autores, se ha calculado el tiempo de latencia (tL), t50 y el tiempo de vida media (t1/2).
Para ello se emplearon las siguientes ecuaciones cinticas obtenidas a partir de un modelo
logstico por Perales y col. (2007):
1 S (1)
Ln 0 + 10
9 B
0
tL =
K Lg (S 0 + B0 )
9 (S 0 + 2 B 0 ) (2)
Ln
(S 0 + 10 B 0 )
t 50 =
K Lg (S 0 + B 0 )
t1 / 2 = t 50 + t L (3)
Sustituyendo los valores de los parmetros cinticos por los obtenidos

anteriormente para el modelo logstico (Tabla III.2), se obtiene un valor medio de tiempo
de latencia (tL) de 15,17 das, un valor de t50 de 11,78 das y un tiempo de vida media (t1/2)
de 26,95 das.
Diversos son los estudios que han abordado la mineralizacin de las sales de alquil
trimetil amonio en diferentes medios; si bien la mayora de ellos emplean condiciones
experimentales muy dispares. Como consecuencia, resulta difcil realizar comparaciones
con los resultados mostrados en el presente trabajo. As, por ejemplo, Madsen (2001) para
el tensioactivo C16TMAC y empleando una concentracin inicial de 10 mg L-1 obtuvo un
porcentaje de mineralizacin del 40% al cabo de 28 das en un medio mineral inoculado.
Por el contrario, Boethling (1984) usando una concentracin 1000 veces menor (10 g L-1)
y otro medio de ensayo (agua de ro) obtuvo valores comparables (75% mineralizacin al
cabo de 21 das). Sin embargo, Larson y Vishon (1983) empleando un medio pre-expuesto
al tensioactivo, hallaron velocidades de degradacin 10 veces ms bajas (50%
mineralizacin al cabo de 2,2 das). En el caso de agua de mar, tan slo se ha encontrado un
estudio llevado a cabo por Garca y col. (2001), los cuales obtuvieron tiempos de vida
media comprendidos entre 6 y 11 das, usando una concentracin de 5 mg L-1 de
tensioactivo y un inculo de microorganismos. Como conclusin no podemos afirmar que
la velocidad de degradacin en el medio marino de estos compuestos sea mayor o menor
que en otros ambientes. Si bien, se puede establecer que los datos obtenidos son anlogos a
los encontrados por Boethling (1984) y Madsen (2001), comparables a los obtenidos por
Garca y col. (2001) en agua de mar inoculada, y muy diferentes a los descritos por Larson
y Vishon (1983) en agua de ro aclimatada.
III-13
Captulo 3
3.2. Ensayos de toxicidad aguda estndar
En la Figura III.6 se muestra la evolucin temporal de la concentracin neta de

biomasa (densidad ptica neta, DOn = DOt=t DOt=0) para diferentes concentraciones de
exposicin de DTMAC (mg L-1) en los ensayos estndar de toxicidad con microalgas. Se
pueden observar diferentes efectos txicos dependiendo de la especie de microalga
ensayada. As, para las microalgas I. galbana y C. gracilis se observan porcentajes de
inhibicin del crecimiento superiores al 15%, incluso para la mnima concentracin
ensayada (1 mg DTMAC L-1). Por el contrario, el crecimiento de las microalgas N.
gaditana y T. chuii es inhibido a concentraciones iguales o superiores a 4 y 5 mg DTMAC
L-1, respectivamente. Un caso intermedio es el de la microalga D. salina, la cual presenta
efectos txicos a concentraciones iguales o superiores a 2 mg DTMAC L-1. Por otro lado,
podemos observar que el tensioactivo DTMAC muestra efectos letales para todas las
microalgas. En el caso de I. galbana y C. gracilis, se aprecia una mortalidad de los cultivos
(valores negativos de densidad ptica neta) al cabo de 24 horas de ensayo a concentraciones
superiores a 3 mg DTMAC L-1, mientras que la mortalidad de los cultivos N. gaditana, D.
salina y T. chuii tiene lugar a concentraciones superiores de 6 y 8 mg DTMAC L-1,
respectivamente.
III-14
0,8 0,6
0 N. gaditana 0 I. galbana
2 0,5 1
0,6 4 2
6 0,4 3
DOn (690 nm)
DOn (690 nm)

8 4
0,4 0,3
10 mg L-1 5 mg L-1
0,2
0,2 0,1
0,0
0,0
-0,1
-0,2 -0,2
0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100
Tiempo (h) Tiempo (h)
0,5
0 C. gracilis
1
0,4
2
3
DOn (690 nm)
0,3 4
5 mg L-1
0,2
0,1
0,0
-0,1
0 20 40 60 80 100
Tiempo (h)
1,0 0,6
0 D. salina 0 T. chuii
0,8 2 0,5 5
4 10
6 0,4 20
DOn (690 nm)
DOn (690 nm)
0,6 8 30
10 mg L-1 0,3 40 mg L-1
0,4
0,2
0,2
0,1
0,0 0,0
-0,2 -0,1
0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100
Figura III.6. Evolucin de la concentracin neta de biomasa (DOn, 690 nm) en el ensayo
de toxicidad estndar con microalgas. Las barras de error denotan las
desviaciones estndares (n=3).
III-15
Captulo 3
Los valores medios de las concentraciones de inhibicin del crecimiento (IC50),

NOEC (concentracin ms elevada a la que no se observan efectos adversos) y LOEC
(concentracin ms baja a la que se observan efectos adversos) calculadas para cada una de
las microalgas ensayadas y un periodo de exposicin de 96 horas se recogen en la Tabla
III.3. Se puede observar como los valores de IC50 (inhibicin del crecimiento) estn
comprendidos entre 0,69 y 6,34 mg DTMAC L-1, dependiendo de la especie. Por otro lado,
los resultados mostrados en la tabla muestran que los valores de NOEC son inferiores a la
mnima concentracin ensayada en todos los casos, a excepcin de la microalga T. chuii.
De acuerdo con los valores IC50 obtenidos, podemos establecer el siguiente orden de
sensibilidad de las diferentes microalgas al tensioactivo: C. gracilis > I. galbana D.
salina > N. gaditana > T. chuii, siendo esta ltima la ms tolerante al tensioactivo
catinico.
Tabla III.3. Valores de IC50, NOEC y LOEC obtenidos en el ensayo de toxicidad estndar
con microalgas marinas y el tensioactivo DTMAC.
Organismo Efecto txico Concentracin (mg L-1)

N. gaditana 96-h IC50 4,01 (3,36-4,55)a
96-h NOEC 3,04b
96-h LOEC 4,06b
I. galbana 96-h IC50 1,45 (1,23-1,61)a
96-h NOEC < 1,02b
96-h LOEC 1,02b
C. gracilis 96-h IC50 0,69 (0,59-0,73)a
96-h NOEC < 1,02b
96-h LOEC 1,02b
D. salina 96-h IC50 1,24 (1,16-1,38)a
96-h NOEC < 2,08b
96-h LOEC 2,08b
T. chuii 96-h IC50 6,34 (5,36-7,33)a
96-h NOEC < 5,07b
96-h LOEC 5,07b
a
Concentracin, valor medio (Intervalo de confianza, 95%)
b
Concentracin de efecto basado en concentraciones experimentales
Como ya se ha comentado en el apartado de introduccin, la bibliografa existente

en torno a la toxicidad de estos compuestos sobre microalgas marinas es muy limitada. Esto
hace que la comparacin de los resultados obtenidos en el presente estudio con los
resultados descritos en la bibliografa no resulte sencilla. Tan slo se han encontrado datos
de toxicidad del tensioactivo C16-18TMAC sobre la especie Dunaliella sp., obtenindose un
III-16
valor de EC50 (24-h, formacin de 13C-Glicerol) de 0.79 mg L-1 (Utsunomiya y col., 1997a).
Como puede apreciarse en la Tabla III.3 los valores obtenidos en los ensayos de toxicidad
con microalgas para DTMAC resultan del mismo orden de magnitud que el obtenido por
Utsunomiya y col. (1997a). Sin embargo, si se comparan los valores obtenidos en el
presente trabajo con los valores de toxicidad descritos para diferentes sales de alquil trimetil
amonio en microalgas de agua dulce, se observan que stos difieren significativamente en
uno o varios rdenes de magnitud, dependiendo de la especie ensayada. As, por ejemplo,
Lewis y Hamm (1986) encontraron valores de IC50 (96-h) comprendidos entre 0,03 y 0,2
para las especies S. capricornutum y M. aeruginosa, lo que supone una toxicidad de 10-100
rdenes de magnitud mayor que las encontradas en especies marinas. En un estudio de
toxicidad realizado por Utsunomiya y col. (1997b) sobre la microalga Chlorella
pyrenoidosa se muestran valores de toxicidad ligeramente inferiores (EC50= 0,28 mg L-1)
que los observados en el presente trabajo para las microalgas marinas. Estos resultados
parecen indicar que los efectos txicos agudos generados por la presencia de sales de alquil
trimetil amonio son ms acusados en especies de microalgas de agua dulce que en especies
marinas. Si bien sera deseable contar con un mayor nmero de datos para poder afirmar
esta observacin.
En este apartado se muestran los resultados de toxicidad obtenidos para el

crustceo A. franciscana expuesto a concentraciones crecientes de DTMAC. La siguiente
grfica muestra el porcentaje de supervivientes obtenidos para periodos de exposicin de 48
y 72 horas.
100 A. franciscana
Supervivientes (%)
80
60
40
20
48h
72h
0
0 20 40 60 80 100
Concentracin (mg L-1)
Figura III.7.Efecto de DTMAC sobre A. franciscana a las 48 y 72 horas de exposicin.

Los datos se representan como valor medio DE (n=5).
III-17
Captulo 3
Se puede observar un aumento de la mortalidad de la poblacin de artemias como

consecuencia del efecto txico del tensioactivo, alcanzando el valor mximo (100%
mortalidad) a una concentracin de DTMAC de 75 mg L-1 tanto a las 48 como a las 72
horas de exposicin. Asimismo, se aprecia un aumento de la toxicidad del tensioactivo al
aumentar el periodo de exposicin, disminuyendo as el porcentaje de supervivencia. Por
otro lado, cabe destacar que para un periodo de exposicin de 48 horas prcticamente no se
observan efectos letales sobre la poblacin de crustceos a concentraciones inferiores de
30,5 mg DTMAC L-1, mientras que al cabo de 72 horas de exposicin el porcentaje de
mortalidad fue inferior al 20% a concentraciones inferiores de 22,5 mg DTMAC L-1. Los
valores de los parmetros de toxicidad LC50 (concentracin que produce la mortalidad del
50% de la poblacin), NOEC y LOEC calculados para un periodo de exposicin de 48 y 72
horas se recogen en la Tabla III.4.
Tabla III.4. Valores de LC50, NOEC y LOEC obtenidos en el ensayo de toxicidad estndar
con crustceos y el tensioactivo DTMAC.

A. franciscana 48-h LC50 46,74 (44,62-48,87)a
72-h LC50 34,19 (31,89-36,66)a
48-h NOEC 31,5b
48-h LOEC 50,0b
72-h NOEC 22,5b
72-h LOEC 27,0b
a
b
De manera similar a lo que ocurre con las microalgas marinas, no se han

encontrado en la bibliografa valores de toxicidad de las sales de alquil trimetil amonio
sobre artemias ni otros crustceos marinos, limitndose los datos de toxicidad hallados en la
bibliografa a especies agua dulce. Sin embargo, si comparamos los valores obtenidos
anteriormente (Tabla III.4) con los aportados por otros autores para diferentes sales de
alquil trimetil amonio y especies de agua dulce se aprecian diferencias significativas entre
ambos. En un estudio llevado a cabo por Lewis y Suprenant (1983) sobre el crustceo
Gammarus sp. se mostraba un valor de LC50 (48-h) de 0,1 mg L-1. Por otro lado, Garca y
col. (2001) obtuvieron valores de EC50 (24-h) comprendidos entre 0,13 y 0,38 mg L-1 para
el crustceo D. magna. Estos resultados parecen indicar que, al igual que ocurre con las
microalgas marinas, los efectos adversos de estos tensioactivos sobre crustceos marinos
son menos acusados que en especies de agua dulce. No obstante, sera necesario realizar
ms ensayos de toxicidad con estos tensioactivos utilizando un mayor nmero de especies
III-18
tanto de agua dulce como marinas al objeto de obtener un conjunto de datos ms

homogneos y corroborar as esta hiptesis.
3.3. Evolucin de la toxicidad del medio de ensayo durante la biodegradacin
El presente apartado tiene como objetivo el estudio de la evolucin de la toxicidad

del medio de ensayo a lo largo del proceso degradativo, con el fin de determinar si durante
la biodegradacin del tensioactivo se generan metabolitos ms txicos (en cantidad y/
naturaleza) que el tensioactivo original o si por el contrario, el tensioactivo presenta una
biodegradacin ambientalmente aceptable, disminuyendo as la toxicidad del medio de
ensayo a medida que es degradado.
En la Figura III.8 se representa la evolucin temporal de la toxicidad del medio de

ensayo (% inhibicin del crecimiento/mortalidad) y grado de mineralizacin (%) durante el
ensayo de biodegradacin del tensioactivo catinico DTMAC.
III-19
Captulo 3
100
N. gaditana 100 100
I. galbana 100
Inh. crecimiento, 96-h (%)

Biodegradacin (%)
Biodegradacin (%)
80 80 80 80
60 60 60 60
IC, 96-h (%) IC, 96-h (%)
Biodegradacin (%) Biodegradacin (%)
40 40 40 40
20 20 20 20
0 0 0 0
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Tiempo (das) Tiempo (das)
100 C. gracilis 100 100 D. salina 100


Biodegradacin (%)
Biodegradacin (%)
80 80 80 80
60 60 60 60
IC, 96-h (%) IC, 96-h (%)
40 40 40 40
20 20 20 20
0 0 0 0
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
100 T. chuii 100 100 A. franciscana 100

Mortalidad, 72-h (%)
Biodegradacin (%)
Biodegradacin (%)
80 80 80 80
60 60 60 60
IC, 96-h (%)
Biodegradacin (%)
40 40 40 40
LC,72-h (%)
Biodegradacin (%)
20 20 20 20
0 0 0 0
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Figura III.8. Evolucin del efecto txico del medio de ensayo (%) y porcentaje de
mineralizacin (%) durante el experimento de biodegradacin de DTMAC.
III-20
Desde un punto de vista terico, la evolucin de la toxicidad del medio durante el

proceso degradativo puede seguir cuatro patrones de comportamiento:
(a) La toxicidad del medio de ensayo disminuye a medida que se degrada el compuesto,
esto es, se produce una detoxificacin del medio, lo que viene a indicar que el sustrato
inicial no slo constituye la nica fuente de toxicidad del medio sino que durante su
biodegradacin no se estn generando metabolitos ms txicos (en cantidad y/
naturaleza) que el compuesto original. En este caso la representacin tendra una forma
anloga a la que se muestra en la Figura III.9A.
A B
Biodegradacin (%)
Biodegradacin (%)
Efecto txico (%)
Efecto txico (%)

Efecto txico (%)
Efecto txico (%) Biodegradacin (%)
Biodegradacin (%)
C D
100 100
Biodegradacin (%)
Biodegradacin (%)
80 80
Efecto txico (%)
Efecto txico (%)
Efecto txico (%)

60
Efecto txico (%) Biodegradacin (%)
60
Biodegradacin (%)
40 40
20 20
0 0
Figura III.9. Curvas modelo de evolucin del efecto txico del medio de ensayo (%) y
porcentaje de biodegradacin final (%) durante el experimento de
biodegradacin de un sustrato.
(b) La toxicidad del medio de ensayo aumenta durante la biodegradacin del tensioactivo
como consecuencia de la generacin de metabolitos ms txicos que el compuesto
original (Figura III.9B)
III-21
Captulo 3
(c) La toxicidad inicial del medio de ensayo es inferior al 100% y dicho valor se mantiene
constante durante los primeros estados del proceso de biodegradacin, lo que vendra
a indicar que se est generando metabolitos de toxicidad similar (en cantidad y
naturaleza) a la del tensioactivo original (Figura III.9C)
(d) La toxicidad inicial del medio de ensayo es del 100% y dicho valor se mantiene
constante, incluso una vez superada la fase de latencia del proceso de biodegradacin.
En este caso no podemos garantizar que durante la biodegradacin del tensioactivo se
ha producido metabolitos ms o menos txicos (en cantidad y naturaleza) que el
compuesto original, puesto que partimos del valor mximo de efecto al inicio del
ensayo (Figura III.9D).
Observando los resultados mostrados en la Figura III.8 se puede apreciar que en el caso
de las microalgas N. gaditana, I. galbana, C. gracilis y D. salina la toxicidad inicial del
medio de ensayo (0% biodegradacin del DTMAC) fue del 100%, permaneciendo
constante durante los primeros 25-30 das de ensayo (40-70% biodegradacin del
DTMAC). Este hecho se debe a la alta sensibilidad que presentan estas especies de
microalgas en comparacin con la elevada concentracin inicial de tensioactivo empleado
en el ensayo de biodegradacin y no nos permite evaluar si durante la biodegradacin del
tensioactivo se estn generando metabolitos ms menos txicos que el tensioactivo
original (caso D). En el caso de T. chuii y A. franciscana se puede observar una
detoxificacin del medio a medida que transcurre la biodegradacin del tensioactivo
alcanzando niveles de detoxificacin del medio del 90% al cabo de 44 y 36 das,
respectivamente (caso A).
Si consideramos los valores de efectos txicos obtenidos cuando se alcanza

aproximadamente un 50% de mineralizacin del tensioactivo (da 28, 55% de
mineralizacin) podemos apreciar que stos varan significativamente dependiendo de la
especie. As, en el caso de las microalgas I. galbana y C. gracilis el porcentaje de efecto
observado es del 100% mientras que para D. salina resulta ligeramente inferior (90%). Por
el contrario N. gaditana y T. chuii presentan los menores valores de efectos, mostrando
porcentajes de inhibicin del crecimiento del 38 y 11%, respectivamente. En el caso del
crustceo A. franciscana, se puede observar un efecto toxico del 20% al cabo de 28 das de
ensayo (55% biodegradacin). A la vista de estos resultados podemos establecer el
siguiente orden de sensibilidad al medio de ensayo: C. gracilis I. galbana D. salina >
N. gaditana > T. chuii A. franciscana, siendo las microalgas C. gracilis, I. galbana y D.
salina las ms sensibles. Si comparamos estos resultados con los obtenidos anteriormente
en los ensayos de toxicidad estndar con DTMAC podemos observar que el grado de
sensibilidad de las especies al tensioactivo catinico es bastante similar a la que presentan
al medio de ensayo, a excepcin del crustceo el cual muestra una sensibilidad ligeramente
III-22
mayor al medio de ensayo. No obstante, estos resultados parecen indicar que el tensioactivo
(y no los metabolitos) constituyen la principal fuente de toxicidad del medio de ensayo.
Atendiendo a los resultados obtenidos por T. chuii y A. franciscana podemos concluir que
durante la biodegradacin del tensioactivo se produce una clara detoxificacin del medio
sin formacin de metabolitos ms txicos (en cantidad y/ naturaleza) que el tensioactivo
original y por lo tanto, que el tensioactivo DTMAC presenta una biodegradacin
III-23
Captulo 3
4. Conclusiones
Las principales conclusiones obtenidas en el presente captulo son las siguientes:
El tensioactivo catinico DTMAC presenta una elevada biodegrabilidad en el medio

acutico marino bajo las condiciones ensayadas, alcanzando porcentajes de
mineralizacin superiores al 91% al cabo de 40 das de ensayo, lo que viene a indicar
la existencia de un potencial para la biodegradacin de estos tensioactivos en el medio
acutico marino.
La cintica de biodegradacin final o mineralizacin del tensioactivo catinico

DTMAC puede ser explicada mediante un modelo cintico logstico, en el que la
concentracin residual de sustrato depende exclusivamente de la concentracin inicial
de tensioactivo y microorganismos.
La toxicidad del tensioactivo catinico estudiado depende significativamente del

organismo ensayado. As, de las diferentes especies de microalgas estudiadas, C.
gracilis representa la especie ms sensible al tensioactivo. Respecto al crustceo
marino A. franciscana, a pesar de que los efectos estudiados han sido diferentes a los
de las microalgas, se obtienen valores de toxicidad muy superiores, lo que parece
indicar una mayor resistencia del crustceo al tensioactivo estudiado.
El estudio de la evolucin de la toxicidad del medio de ensayo indica que durante el

proceso de biodegradacin tiene lugar la detoxificacin del medio sin produccin de
intermediatos ms txicos (en cantidad y naturaleza) que el tensioactivo original. Estos
resultados permiten clasificar al DTMAC como un compuesto de biodegradabilidad
III-24
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III-27
Captulo 4
NONILFENOLES ETOXILADOS
Resumen
El presente captulo muestra los resultados obtenidos en los ensayos de

biodegradacin, ecotoxicidad y ensayos combinados de toxicidad y biodegradacin del
tensioactivo comercial no-inico TergitolNP9, perteneciente a la familia de los
nonilfenoles etoxilados. Los resultados obtenidos indican la existencia de un potencial para
la degradacin del tensioactivo en el medio marino, siguiendo la mineralizacin del
tensioactivo TergitolNP9 una cintica de primer orden. En relacin a la toxicidad, las
microalgas son ms sensibles a la presencia del tensioactivo que el crustceo A.
franciscana, y dentro de stas las especies I. galbana y C. gracilis. Los resultados
obtenidos en los ensayos combinados de toxicidad y biodegradacin demuestran que el
tensioactivo TergitolNP9 no presenta una biodegradacin ambientalmente aceptable,
puesto que durante el proceso degradativo la toxicidad del medio de ensayo aumenta debido
a la formacin de metabolitos ms txicos (en cantidad y/ naturaleza) que el tensioactivo
original.
Captulo 4
1. Introduccin
Nonilfenoles etoxilados. Caractersticas y usos
Dentro de la amplia gama de tensioactivos no-inicos empleados actualmente, los

alquilfenoles etoxilados (APEOs), y en particular los nonilfenoles etoxilados (NPEOs)
constituyen uno de los agentes de superficie ms consumidos en el mundo. Los datos ms
recientes de produccin apuntaron un consumo total de 77.000 toneladas de NPEOs en
Europa occidental para el ao 2001 (OSPAR, 2001).
Su estructura qumica est formada por una cadena alqulica con 9 tomos de
carbono, un grupo aromtico y una cadena etoxilada con un nmero variable de unidades
etoxiladas (Figura IV.1). Convencionalmente, cada NPEO se describe mediante el nmero
medio de unidades etoxiladas, el cual puede variar entre 1 y 100, aunque generalmente
suele estar comprendida entre 1 y 20 unidades en funcin de la formulacin. En general, a
medida que incrementa la longitud de la cadena etoxilada, su peso especfico, viscosidad y
solubilidad en agua tambin lo hacen, siendo los NPEOs con un nmero medio de unidades
etoxiladas superior a seis fcilmente solubles en agua.
O OH
O
n
Figura IV.1. Estructura qumica del tensioactivos no-inico nonilfenol etoxilado (R=
CxH2x+1, x= 9; n= 0-19).
Los NPEOs han sido utilizados ampliamente desde hace ms de 40 aos en

diferentes aplicaciones tanto domsticas como industriales. Tradicionalmente, estos
tensioactivos se han empleado en formulaciones de detergentes domsticos. No obstante,
los NPEOs tambin desempean un papel fundamental en la formulacin de determinados
productos utilizados en diversos procesos industriales tales como: procesos de fabricacin
de papel, pinturas, resinas y revestimientos de proteccin, aceros y/ plaguicidas as como
en proceso de recuperacin de aceites y gas, etc.
Niveles de nonilfenoles etoxilados en el medio acutico
Son numerosos los autores que han centrado sus esfuerzos en la monitorizacin de
los nonilfenoles etoxilados en el medio acutico, incluido el medio marino. Como
consecuencia existe una amplia bibliografa en relacin a la presencia de estos tensioactivos
en el medio acutico.
IV-2
Nonilfenoles etoxilados
En aguas continentales, Ahel y col. (1994b) describieron concentraciones mximas

de 45 g L-1 para NP1EC (cido nonilfenoxiactico), 71 g L-1 para NP2EC (cido
nonilfenoxietoxiactico), 69 g L-1 para NP1EO (nonilfenol monoetoxilado), 30 g L-1 para
NP2EO (nonilfenol dietoxilado) y 45 g L-1 para NP (nonilfenol) en muestras de aguas
procedentes del ro Glatt (Suiza), siendo la concentracin de ambos grupos (NPEC y
NPEO) generalmente superior a 10 g L-1. Adems, encontraron la presencia de NPEOs
con un nmero de unidades etoxiladas comprendido entre 3 y 5, aunque a bajas
concentraciones. Por otro lado, estudios realizados en agua de ro por el Centro de
Investigacin del Agua (Water Research Center, WRc, 1991) describieron concentraciones
de diferentes homlogos de APEOs comprendidas entre 1 y 80 g L-1. Asimismo, estudios
de monitorizacin llevados a cabo en diversos ros en los Estados Unidos observaron
concentraciones del metabolito NP de 2 g L-1 en el ro Delaware (Philadelphia), 10 g L-1
en el ro Rin y 1000 g L-1 en un afluente del ro Savannah (BUA, 1991).
Los estuarios y ocanos tambin se encuentran expuestos a los nonilfenoles

etoxilados y sus metabolitos bien por el aporte de ros contaminados bien debido a
descargas directas de aguas residuales. As, por ejemplo, Marcomini y col. (1990, 2000)
encontraron diversos nonilfenoles etoxilados en la laguna de Venecia, la cual ha sido
sometida a numerosas descargas de vertidos urbanos e industriales. Los resultados
obtenidos mostraban niveles de NPEOs de 4,5 g L-1, siendo los oligmeros de entre 5 y 10
unidades etoxiladas los ms frecuentes. Por otro lado, Kvestak y col. (1994) examinaron la
distribucin de NPEOs en el efluente de una estacin depuradora de aguas residuales y en
el estuario del ro Krka, un estuario fuertemente estratificado en la regin adritica. Los
niveles encontrados en las aguas residuales variaron entre 70 y 2960 g NPEO L-1, mientras
que en el estuario estuvieron comprendidos entre 1,1 y 6 g L-1 en el agua salobre y 0,1-0,7
g L-1 en la capa salina.
Biodegradabilidad de los nonilfenoles etoxilados
La biodegradabilidad de los alquilfenoles etoxilados (APEOs), y en particular de

los nonilfenoles etoxilados (NPEOs), tanto en ensayos en laboratorios con aguas
continentales como en estaciones depuradoras de aguas residuales ha sido objeto de estudio
de diversos autores (Yoshimura, 1986; Maki y col., 1994; Manzano y col., 1998, 1999;
Mann y Boddy, 2000).
La ruta de biodegradacin de los NPEOs ms aceptada es la propuesta por

Yoshimura (1986), la cual aparece recogida en la Figura IV.2.
IV-3
Captulo 4
Nonilfenol etoxilado
(NPnEO)
O OH
O
n
R
Hidrlisis
(mecanismo a)
O OH
O
n-1
Oxidacin R Hidrlisis
(mecanismo b) Nonilfenol etoxilado (mecanismo a)
NP(n-1)EO
O OH O OH
O O
O
-oxidacin
R (mecanismo c) R
cido nonilfenoxietoxiactico Nonilfenol dietoxilado
NP2EC NP2EO
Hidrlisis
(mecanismo a)
O
O -oxidacin O
OH (mecasnismo c) OH
R R
cido nonilfenoxiactico Nonilfenol monoetoxilado
NP1EC NP1EO
Reduccin OH Hidrlisis
(mecanismo b) (mecanismo a)
R
Nonilfenol
NP
Figura IV.2. Rutas de biodegradacin de los nonilfenoles etoxilados (Yoshimura, 1986)

(R=C9H19).
La biodegradacin primaria consiste, primeramente, en un ataque hidroltico sobre

los grupos etoxilados de la cadena polietoxilada dando lugar a NPEOs de cadena ms corta
(mecanismo a; Swisher, 1987), que puede conllevar a la produccin de metabolitos tales
IV-4
como nonilfenol dietoxilado (NP2EO) y monoetoxilado (NP1EO) y/ nonilfenol (NP); si

bien este ltimo slo ha sido observado en condiciones anaerobias (Ahel y Giger, 1994a).
Por otro lado, Swisher (1987) propuso la carboxilacin del grupo alcohol terminal
de la cadena polietoxilada como otra de las posibles rutas de biodegradacin (mecanismo
b). Sin embargo, otros autores establecen que esta carboxilacin slo es dominante despus
del acortamiento de la cadena etoxilada a una o dos unidades etoxiladas (mecanismo c;
Ahel y col., 1987; Ball y col., 1989).
Rudling y Solyom (1974) y Maki y col (1994) propusieron la formacin de

NP2EC y NP1EC a partir de NPEO de cadena etoxilada corta (mecanismo b) bajo
condiciones aerobias, mientras que la formacin de NP2EO y NP1EO tendran lugar bajo
condiciones anaerobias (mecanismo a). Por otro lado, no contemplan la transformacin de
NP2EO y NP1EO a NP2EC y NP1EO, respectivamente, tal y como propone Yoshimura
(1986).
Otra posible reaccin consiste en la oxidacin de la cadena alqulica, cuya

existencia ha sido puesta de manifiesto por diversos autores (Osburn y Benedict, 1966).
Schobert y col. (1981) encontraron alquilfenol dietoxilado con grupos carboxlicos en la
parte hidrfoba en mayor proporcin que el compuesto sin oxidar. Pese a este resultado, no
parece ser un mecanismo principal de degradacin debido al grado de ramificacin que
suele presentar la cadena alqulica.
La degradacin total implica la completa mineralizacin de la estructura aromtica

de los NP/ NPEC (Swisher, 1987), aunque la mayora de los estudios indican que mientras
que la biodegradacin primaria parece ser particularmente rpida (prdida de las unidades
etoxiladas), la metabolizacin de los biointermediatos NP, NP1EO, NP2EO, NP3EO y
carboxilados NP1EC y NP2EC resulta extremadamente lenta (Talmage, 1994; Field y
Reed, 1996; Potter y col., 1999; Staples y col., 1999).
La biodegradabilidad de los NPEOs viene determinada principalmente por la

estructura de la cadena alqulica, obtenindose porcentajes de biodegradacin y velocidades
de degradacin menores en el caso de cadenas alqulicas ramificadas (Kravetz, 1990). La
posicin del anillo bencnico en la cadena alqulica tambin influye en la velocidad de
degradacin. As, los NPEOs en los que la unin del grupo aromtico a la cadena alqulica
tiene lugar en el carbono primario, presentan velocidades de biodegradacin mayores
(Little, 1977). Otro factor determinante en la velocidad de degradacin de los NPEOs
consiste en el nmero de unidades etoxiladas, obtenindose velocidades de degradacin
menores a medida que aumenta el nmero de unidades etoxiladas (Little, 1977; Sivak y
col., 1982).
IV-5
Captulo 4
Toxicidad de los nonilfenoles etoxilados en el medio acutico
Como se ha podido apreciar en el apartado anterior, la ruta metablica de los

NPEOs conduce a la formacin de biointermediatos, muchos de los cuales resultan ser
persistentes, y ms txicos que el compuesto original (Naylor y col., 1992; Jobling y
Sumpter, 1993; Ahel y col., 1994a; White y col., 1994; Ahel y col., 1996). Estos
metabolitos pueden ser hidrfobos, como es el caso de NP, NP1EO y NP2EO (Giger y col.,
1984; Ahel y Giger, 1985; Brown, 1988) o hidrfilos, NP1EC y NP2EC (Giger y col.,
1984; Ahel y col., 1987). Estudios realizados sobre diversas especies de peces encontraron
una mayor toxicidad de estos metabolitos (NP1EO, NP2EO, NP1EC, NP2EC y NP) sobre
peces de agua dulce (Yoshimura, 1986) y esturicos (Hall y col., 1989) que el tensioactivo
original. Por otro lado, Kravetz y col. (1991) y Maguire (1999) demostraron que la
persistencia de estos compuestos es mayor que la de otros tensioactivos tales como lineal
alquilbenceno sulfonatos (LAS) y alcoholes etoxilados (AE). Adems, estudios llevados a
cabo por diversos autores han demostrado que algunos de estos metabolitos tales como los
NP exhiben efectos estrognicos (Jobling y Sumpter, 1993; White y col., 1994).
Debido a la elevada capacidad de bioacumulacin en organismos (Ekelund y col.,

1990), persistencia en el medio, y toxicidad, se han llevado a cabo, en diversos pases,
diferentes medidas para limitar el uso de estos tensioactivos. As, por ejemplo, en la
Directiva 60/2000/CE, Marco de Aguas, de la Comunidad Europea se han incorporado los
metabolitos 4-para-nonilfenol y para-ter-octilfenol a la lista de sustancias prioritarias (UE,
2001). Adems, existen otros acuerdos nacionales e internacionales que restringen la
utilizacin de los nonilfenoles y nonilfenoles etoxilados tales como: Recomendacin
PARCOM 92/8 (resultado de la Convencin OSPAR para la Proteccin del Medio Marino
del Nordeste atlntico) sobre Nonilfenoles Etoxilados (PARCOM, 2002), el Reglamento
793/93/CE sobre la evaluacin y control de sustancias existentes (CE, 1993), el programa
Existing Chemicals Programme de la OCDE (Organizacin para la Cooperacin y el
Desarrollo Econmico) (OECD, 1987), etc.
De manera general, la toxicidad de los nonilfenoles etoxilados incrementa a

medida que lo hace la longitud de la cadena alqulica (McLeese y col., 1981). Este hecho
tambin ha sido observado por Hall y col. (1989) en ensayos de toxicidad sobre el camarn
(Mysidopsis bahia) mostrando valores de LC50 (48-h) de 0,9-2 mg L-1 para el tensioactivo
NP9EO, 2,5 mg L-1 para NP15EO y >100 mg L-1 para NP40EO y NP50EO. Por otro lado,
estudios llevados a cabo por Yoshimura (1986) han puesto de manifiesto la disminucin de
la toxicidad de estos tensioactivos a medida que aumenta el nmero de unidades etoxiladas.
En la actualidad, la bibliografa existente en torno a la toxicidad de NPEOs en

organismos marinos es relativamente escasa, en comparacin con los estudios realizados
con organismos de agua dulce. En el caso de microalgas marinas, tan slo se han
IV-6
encontrado dos referencias bibliogrficas, siendo los valores obtenidos muy dispares.
Ukeles (1965) estudi el efecto de estos tensioactivos sobre doce especies de microalgas
marinas, mostrando una inhibicin total del crecimiento a concentraciones superiores a 100
mg L-1 para una serie de NPEOs comerciales ramificados (Igepal). Por otro lado, Moreno y
col. (2001) encontraron un valor de IC50 de 1,0 mg L-1 para el tensioactivo NP10EO y la
microalga C. gracilis. Respecto a la toxicidad en crustceos marinos, Hall y col. (1989) y
Patoczka y Pulliam (1990) encontraron valores similares de efectos txicos sobre el
camarn (Mysidopsis bahia) y el tensioactivo NP9EO, con valores de LC50 (48-h) de 0,9-2
y 1,23 mg L-1, mientras que estudios posteriores llevados a cabo por Dorn y col. (1993)
mostraron valores muy superiores (LC50= 12-50 mg L-1 NP9EO) para un periodo de
exposicin de 96-h y el mismo organismo.
En el caso de microalgas de agua dulce, los valores de toxicidad encontrados en la

bibliografa para el tensioactivo NP9EO suelen oscilar entre 12 y 50 mg L-1 (Lewis, 1986;
Dorn y col., 1993). Respecto a la toxicidad en invertebrados en agua dulce, la bibliografa
descrita en relacin a la toxicidad de estos tensioactivos es muy extensa, encontrndose una
gran variabilidad de los valores de toxicidad en funcin del tensioactivo y especie
ensayada. As, se han descrito valores de EC50 comprendidos entre 19,3 y >100 mg L-1 para
el tensioactivo NP12EO (Portmann y Wilson, 1971; van Emden y col., 1974; Waldock y
Thain, 1991) y superiores a 10 mg L-1 para NP10EO (Swedmark y col., 1971, 1976) sobre
diferentes especies de crustceos y moluscos. Para el tensioactivo NP9EO, se han
observado diferencias significativas en el grado de sensibilidad de los crustceos Daphnia
sp. Mientras que para la especie Daphnia magna los valores de LC50 (48-h) descritos en la
bibliografa son de 14 mg L-1 para NP9EO (Kravetz y col., 1991; Naylor, 1995), para la
especie Daphnia pulex estos valores resultan ligeramente inferiores, mostrando una LC50
(48-h) de 2,9 mg L-1 (Salanitro y col., 1988). Asimismo, se ha observado una elevada
toxicidad de los metabolitos NP1EO y NP2EO con valores de LC50 (24-h) de 0,39 y 0,56
mg L-1, respectivamente (Sun y col., 2005). Por otro lado, un estudio realizado por Isidoro
y col. (2006) mostraba valores de EC50 (48-h, movilidad) comprendidos entre 0,07 y 10 mg
L-1 sobre el crustceo Ceriodaphnia dubia.
Respecto a la toxicidad de estos tensioactivos sobre peces de agua dulce, se han

encontrado efectos txicos letales (LC50, 96-h) sobre el pez carpa (Pimephales promelas) a
concentraciones comprendidas entre 1,6 y 46 mg L-1 NP9EO (OECD, 1997; Dorn y col.,
1993; Talmage, 1994) mientras que para las carpas Carassius auratus y Leuciscus idus los
valores de toxicidad descritos (LC50, 48-h) son de 18 y 7 mg L-1 NP9EO, respectivamente
(OECD, 1997).
IV-7
Captulo 4
2. Materiales
A continuacin se detallan las principales caractersticas fsico-qumicas del

tensioactivo ensayado as como del medio empleado en los ensayos de biodegradacin y
toxicidad.
El tensioactivo no-inico estudiado consisti en un nonilfenol etoxilado

comercialmente conocido como TergitolNP9 IGEPAL CO-630, CAS 127087-87-0, y
fue suministrado por Fluka Chemie A.G. (Barcelona). Concretamente se trata de un
poli(oxi-1,2-etanodiol),-(4-nonilfenil)-hidroxi, con frmula emprica C33H60O10. El
tensioactivo posee una cadena alqulica ramificada de 9 tomos de carbono y est formado
por una mezcla de homlogos de diferente longitud de cadena etoxilada, con un grado
medio de etoxilacin de 9,3. Es soluble en agua, posee un peso molecular de 616 g mol-1 y
una pureza del 99,7% de materia activa.
Medio de ensayo
En la Tabla IV.1 se recogen las principales caractersticas fsico-qumicas y

biolgicas del agua de mar empleada en los ensayos de biodegradacin y toxicidad. Dado
que las muestras de agua de mar fueron tomadas en el mismo punto que en el estudio
anterior (captulo 3, apartado 2), los valores obtenidos para los distintos parmetros son
muy similares a los obtenidos con el tensioactivo DTMAC. De manera anloga al estudio
anterior, podemos concluir que se trata de un agua de excelente calidad correspondiente a
una zona costera muy poco antropizada.
Tabla IV.1. Caractersticas del agua de mar empleada en los ensayos de biodegradacin y
toxicidad del tensioactivo no-inico TergitolNP9 (valor medio desviacin
estndar, n=3).

Oxgeno disuelto % saturacin 91,4 1,2 Nitrato mg L-1 NO3- < 0,020
pH - 8,10 0,04 Silicato mg L-1 Si 0,018 0,002
Salinidad - 36,8 0,4 Dureza total mg L-1 Ca2+ 320 20
Carbono Total mg L-1 C 27,4 0,5 Clorofila a mg m-3 Cl a 0,85 0,10
-1
Carbono inorgnico mg L C 26,2 0,5 Estreptococos fecales UFC 100mL-1 1,0 1,5
Carbono orgnico mg L-1 C 1,17 0,02 Coliformes fecales UFC 100mL-1 No detectado
-1 - -1
Nitrito mg L NO2 < 0,015 Enterococos UFC 100mL No detectado
IV-8
En la Figura IV.3 se representa la evolucin de los parmetros de control pH y

oxgeno disuelto en los ensayos de biodegradacin (N1, N2 y N3) y en el control (CO2).
Como puede observarse en dicha figura los valores de pH sin presencia de substrato
(ensayo control) oscilan entre 8 y 8,3 presentando un valor medio de 8,2 0,1 (valor medio
DE). Para todos los dems ensayos de biodegradacin se obtiene un comportamiento
similar al ensayo control, con un valor medio de 8,25 0,1.
100
8,4
80
O2 (%saturacin)
8,2
60
pH
8,0
40
7,8 CO2
CO2
N1
N2
20 N1
N2
7,6 N3
N3
0
0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50
Figura IV.3. Evolucin del pH y oxgeno disuelto en el ensayo control (CO2) y los
ensayos de biodegradacin con NPEO (N1, N2 y N3).
Respecto a la concentracin de oxgeno disuelto, se puede apreciar en la Figura

IV.3 como los valores de oxigeno disuelto, tanto en el ensayo control como en los ensayos
de biodegradacin, fueron prcticamente constantes a lo largo del experimento, mostrando
porcentajes medios de saturacin del 76,1 2,6 y 77,2 0,5 %, respectivamente
En el caso del ensayo de referencia, los valores de pH y oxgeno disuelto se

encuentran comprendidos entre 8,1 0,1 y 77,8 9.51 % de saturacin, respectivamente.
Los valores medios de temperatura en los ensayos de biodegradacin, ensayo referencia y
control fueron de 18,1 0,1C, 18,5 0,9 C, y 18,46 0,2C, respectivamente.
IV-9
Captulo 4
A la vista de estos resultados podemos afirmar que durante el experimento de

biodegradacin las condiciones de pH, oxgeno y temperatura fueron no limitantes para el
desarrollo de la microbiota responsable de la actividad degradativa y, por tanto, de la
mineralizacin del substrato ensayado.
En la Figura IV.4 se muestran la evolucin del carbono orgnico disuelto (COD) en

los ensayos control, referencia (benzoato sdico) y abitico (HgCl2).
20 REF2
AB2
CO2
15
10
0
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (d)
Figura IV.4. Evolucin del carbono orgnico disuelto en los ensayos control (CO2),
referencia (REF2) y abitico (AB2) a lo largo del proceso de
biodegradacin.
Tal y como se muestra en la Figura IV.4 el contenido de carbono orgnico disuelto

(mg L-1) en los ensayos control y abitico permaneci prcticamente constante a lo largo
del experimento, con valores medios de COD de 1,6 0,6 mg L-1 y 12,5 0,6 mg L-1,
respectivamente. En el caso del ensayo abitico (con presencia de HgCl2), se alcanz un
porcentaje medio de mineralizacin del tensioactivo del 1,7 2,7 %, por lo que parece que
los procesos abiticos tales como adsorcin, precipitacin, etc. no contribuyen en la
eliminacin del tensioactivo.
En el caso del ensayo referencia, la Figura IV.4 muestra como la concentracin de

carbono orgnico disuelto disminuye drsticamente durante los primeros 9 das de ensayo,
siendo degradado en una extensin superior al 50% al cabo de 5 das de ensayo; si bien el
IV-10
benzoato sdico fue degradado en un porcentaje superior al 85% al cabo de 9 das. Estos
valores estn en consonancia con los descritos por diversos autores para el mismo sustrato
(Nyholm y Kristensen, 1992; Staples y col., 2001; Perales y col., 2007), lo que viene a
indicar la adecuada actividad de la poblacin microbiana presente en el medio de ensayo.
En la Figura IV.5 se recoge la evolucin de la concentracin de carbono orgnico

disuelto (mg COD L-1) a lo largo del experimento de biodegradacin del tensioactivo no-
inico TergitolNP9.
14
-1
12
10
0
0 10 20 30 40 50
Tiempo (d)
Figura IV.5. Evolucin del carbono orgnico disuelto (mg COD L-1) durante la
biodegradacin del tensioactivo TergitolNP9 para los tres ensayos de
biodegradacin con tensioactivos. Los datos experimentales se expresan como
el valor medio DE (n=3). La lnea continua corresponde a la curva obtenida
del ajuste de los valores experimentales a un modelo cintico de primer orden.
La Figura IV.5 muestra una disminucin de la concentracin de COD a lo largo

del experimento, alcanzando valores de 5,2 mg L-1 COD (55% de mineralizacin) y 2,4 mg
L-1 COD (80% de mineralizacin) al cabo de 29 y 53 das de ensayo, respectivamente.
Atendiendo al criterio establecido por la directriz OPPTS 835.3160 Biodegradabilidad en
agua de mar (USEPA, 1998), estos resultados (porcentaje de biodegradacin superior al
70% en un tiempo inferior a 60 das) ponen de manifiesto la existencia de un potencial para
la biodegradacin del tensioactivo en el medio acutico marino.
Cabe destacar la ausencia de una fase de aclimatacin o adaptacin de la poblacin

microbiana a la nueva fuente de sustrato. Ensayos de biodegradacin del nonilfenol
IV-11
Captulo 4
etoxilado NP15EO en agua de ro prstina tambin han mostrado una fase de adaptacin
muy corta o casi inexistente (tiempo de latencia entre 1 y 3 das), sugiriendo como posibles
causas la presencia en el medio de una significativa concentracin de microorganismos
capaces de degradar primariamente (hidrlisis) el tensioactivo (Manzano y col., 1998). Por
el contrario, estudios llevados a cabo por Perales y col. (2007) en el que empleaba como
medio de ensayo agua de mar de la misma procedencia que la empleada en el presente
trabajo, obtuvieron una importante fase de aclimatacin (tiempo de latencia entre 6,06 y
7,27 das) para la biodegradacin primaria del tensioactivo aninico lineal alquil benceno
sulfonato (LAS). Si comparamos los resultados obtenidos por Perales y col. (2007) con los
resultados hallados en el presente trabajo, ambos con la misma matriz, observamos
diferencias significativas en la fase de aclimatacin del proceso de degradacin. Estas
diferencias pueden ser atribuidas a las caractersticas de las enzimas responsables de la
biodegradacin del tensioactivo. En el caso del tensioactivo aninico LAS, el mecanismo
inicial de biodegradacin consiste en el acortamiento de la cadena alqulica mediante - y
-oxidaciones llevadas a cabo por enzimas oxidativas tales como alcano monooxigenasa y
dehidrogenasa (Scott y Jones, 2000). Por el contrario, durante la etapa inicial de
biodegradacin de los NPEOs tiene lugar la ruptura hidroltica de la cadena etoxilada dando
lugar a NPEOs de cadena ms corta. Esta ruptura tiene lugar gracias a enzimas hidrolticas,
las cuales podran ser ms frecuentes en el sistema enzimtico de la microbiota natural o
bien ser sintetizadas ms rpidamente que las correspondientes enzimas oxidativas.
Modelizacin cintica
Al objeto de conocer la cintica de mineralizacin del TergitolNP9 en agua de

mar, los valores experimentales de concentracin en el tiempo se ajustaron a diferentes
modelos cinticos. En la Tabla IV.2 se recogen los valores de los parmetros cinticos y
estadsticos calculados para los diferentes modelos cinticos aplicados.
Se puede apreciar, en un primer anlisis, que todos los modelos cinticos presentan
un buen ajuste a los datos experimentales (R2 = 0,97). Sin embargo, un anlisis ms
detallado demuestra que slo en el caso de aplicar un modelo cintico de primer orden se
obtienen parmetros cinticos con un significado fsico coherente. As, por ejemplo, en el
caso del modelo logstico se obtiene un valor de B0 (cantidad de sustrato necesaria para
producir la concentracin inicial de microorganismos) injustificablemente alto en
comparacin con los obtenidos por otros autores. A modo de ejemplo, Perales y col. (2007),
para el tensioactivo LAS y empleando el mismo medio de ensayo que el presente estudio,
estimaron valores de B0 comprendidos 0,267 y 0,565 mg LAS L-1. Por otro lado, para el
tensioactivo DTMAC el valor de B0 obtenido en el presente estudio ha sido de 0,146 mg
COD L-1 (ver captulo 3, apartado 3). En el caso del modelo cintico de Quiroga, Sales y
Romero se puede apreciar que el valor calculado para el parmetro Sto (concentracin
inicial de tensioactivo) es muy superior a la concentracin real empleada en los ensayos.
IV-12
Por otro lado, el anlisis de la chi-cuadrada (2) muestra que solamente en el caso del
modelo de primer orden, los valores del parmetro Q (probabilidad de que la chi-cuadrado
exceda al azar un determinado valor 2 terico) alcanza el valor ms prximo a la unidad (Q
= 0,338), indicando que las diferencias aparentes entre los datos experimentales y tericos
se deben probablemente a fluctuaciones casuales y no a una falta de ajuste de los datos
experimentales al modelo (vase captulo 2, apartado 3). A la vista de los resultados
obtenidos, podemos concluir que el modelo que mejor describe la cintica de
mineralizacin del tensioactivo TergitolNP9 en agua de mar bajo las condiciones
estudiadas es el modelo de primer orden, descrito por Simkins y Alexander (1984). Los
valores tericos de concentracin de COD en el tiempo obtenidos a partir del modelo
cintico de primer orden se representan mediante lnea continua en la Figura IV.5.
Tabla IV.2. Parmetros cinticos y estadsticos correspondientes a los resultados de

biodegradacin del TergitolNP9 en agua de mar.
Modelo Parmetro cintico Valor a
R2 2 Q
Primer-orden -1
S0 (mg COD L ) 11,91 1,28
(Simkins y 0,97 21,07 10 0,338
Alexander, 1984) K1 (d-1) 0,03 0,006

(Simkins y B0 (mg COD L-1) 131,6 605,1 0,97 179,5 9 6,40E-34
Alexander, 1984) KLg (mg COD L-1 d-1) 0,0002 0,001
S0 (mg COD L-1) 21,74 92,35
Q-S-R -1
Sto (mg COD L ) 15200 20E+06
(Quiroga y col., 0,97 105,02 8 3,98E-19
1999) Snb (mg COD L-1) 1,23 8,13
max (d-1) 0,050 0,147
a
Una vez seleccionado el modelo cintico que mejor describe la mineralizacin del
tensioactivo en el medio marino, se procede a calcular el tiempo de latencia (tL), t50 (el
tiempo necesario para alcanzar un 50% de biodegradacin, sin considerar el tiempo de
latencia), y el tiempo de vida media (t1/2). Sustituyendo los valores obtenidos anteriormente
para el modelo cintico de primer orden en las ecuaciones (1), (2) y (3), obtenidas a partir
del modelo de primer orden por Perales y col. (2007), obtenemos un valor medio de tiempo
de latencia (tL), t50 y tiempo de vida media (t1/2) de 3,51, 19,59 y 23,10 das,
respectivamente.
Ln(0.9) (1)
tL =
K1
IV-13
Captulo 4
Ln(0.9 / 0.5) (2)

t 50 =
K1
t1 / 2 = t 50 + t L (3)
La bibliografa encontrada acerca de la biodegradacin de los nonilfenoles etoxilados

en diferentes medios de ensayos (agua de ro, agua esturicas, lodos activos y sedimento)
muestra un amplio intervalo de velocidades de biodegradacin. As, por ejemplo, Staples y
col. (2001), estudiando la mineralizacin del tensioactivo NP9EO en un sistema de lodos
activos, mostraron valores de tiempo de vida media comprendidos entre 7 y 13,6 das,
empleando una concentracin inicial de 10 mg L-1, mientras que en sedimento y agua de
ro, los tiempos de vida media fueron de 18,2 y 18,6 das, respectivamente. En el caso de
agua de ro, Manzano y col. (1998) encontraron porcentajes de mineralizacin
comprendidos entre el 30 y 70% al cabo de 30 das para el tensioactivo NP15EO y una
concentracin inicial de 5 mg L-1. Similares porcentajes de mineralizacin han sido
obtenidos por Potter y col. (1999) en aguas esturicas al cabo de 183 das de ensayos; si
bien el proceso de biodegradacin primaria se complet al cabo de 24 das. Por el contrario,
estudios llevados a cabo por Jonker y col. (2001) en agua de ro mostraron valores de
velocidad de degradacin primaria ms rpida, con porcentajes del 99% al cabo de 4 das
de ensayos. Estos valores estn en consonancia con los obtenidos por Yoshimura (1986), el
cual describi un tiempo de vida media para la degradacin primaria de un NPEO de 4 das
en agua de ro y 10 das en sedimentos.
Si comparamos los valores obtenidos en el presente apartado con los valores

descritos anteriormente, observamos que difieren significativamente. Estas diferencias
pueden ser debidas a la concentracin inicial de tensioactivo empleada, al tipo de
biodegradacin medida (primaria o final) y/o a la estructura qumica del NPEO (longitud y
ramificacin de cadena alqulica y nmero de unidades etoxiladas). No obstante, a pesar de
estas diferencias, los valores obtenidos en el presente estudio, son comparables a los
obtenidos por Staples y col. (2001) y Manzano y col. (1998) en agua de ro.
IV-14
En la Figura IV.6 se muestra la evolucin temporal de la concentracin neta de

exposicin de TergitolNP9 (mg L-1).
En todas las microalgas ensayadas se observan efectos txicos sobre el crecimiento

de los cultivos, aunque a diferentes concentraciones de ensayo. En el caso de las microalgas
I. galbana y C. gracilis se aprecian efectos inhibitorios a concentraciones superiores a 3 mg
L-1 TergitolNP9 al cabo de 24 horas de exposicin. Por otro lado, para concentraciones
iguales o superiores a 4 mg L-1 las microalgas N. gaditana y T. chuii muestran una drstica
disminucin del crecimiento al cabo de 24 y 48 horas, respectivamente. Asimismo, se
puede observar como en algunos casos no slo ha tenido lugar una inhibicin del
crecimiento sino un descenso de la concentracin inicial de biomasa (mortalidad). En el
caso de las microalgas N. gaditana, I. galbana y C. gracilis esta mortalidad tiene lugar a
concentraciones superiores a 8 mg L-1 tras 24 horas de exposicin. Por el contrario, las
microalgas D. salina y T. chuii mostraron efectos letales slo durante la primera etapa de
exposicin (24 horas) y a concentraciones superiores a 14 y 20 mg L-1, respectivamente.
Transcurrido este periodo, se observa una recuperacin de los cultivos, incluso a la
concentracin ms alta de tensioactivo estudiada.
IV-15
Captulo 4
0,8 0,6
2 0,5 3
0,6 4 4
6 0,4 6
DOn (690 nm)
DOn (690 nm)

8 8
0,4 0,3
10 mg L-1 10 mg L-1
0,2
0,2 0,1
0,0
0,0
-0,1
-0,2 -0,2
0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100
0,6
0 C. gracilis
0,5 1
3
0,4 5
DOn (690 nm)
7
0,3
9 mg L-1
0,2
0,1
0,0
-0,1
-0,2
0 20 40 60 80 100
Tiempo (h)
1,0 0,8
0 D. salina 0 T. chuii
0,8 4 4
8 0,6 20
10 40
DOn (690 nm)
DOn (690 nm)
0,6 14 60
16 mg L-1
0,4
90 mg L-1
0,4
0,2
0,2
0,0
0,0
-0,2 -0,2
0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100
Figura IV.6. Evolucin de la concentracin neta de biomasa (DOn, 690 nm) en el ensayo de
toxicidad estndar con microalgas. Las barras de error denotan las
IV-16
Los valores de las concentraciones de inhibicin del crecimiento (IC50), NOEC y LOEC
calculadas para cada una de las microalgas ensayadas y un periodo de exposicin de 96
horas se reflejan en la Tabla IV.3.
Tabla IV.3. Valores de IC50, NOEC y LOEC obtenidos en el ensayo de toxicidad estndar
con microalgas marinas y el tensioactivo TergitolNP9.
Organismo Efecto Concentracin (mg L-1)

N. gaditana 96-h IC50 5,41 (4,99-5,73)a
96-h NOEC 2,92b
96-h LOEC 3,99b
I. galbana 96-h IC50 4,57 (4,32-4,84)a
96-h NOEC 2,12b
96-h LOEC 2,92b
C. gracilis 96-h IC50 3,45 (2,79-4,87)a
96-h NOEC 2,12b
96-h LOEC 2,92b
D. salina 96-h IC50 13,95 (11,25-15,06)a
96-h NOEC 7,98b
96-h LOEC 10,1b
T. chuii 96-h IC50 25,82 (22,76-29,84)a
96-h NOEC < 4,72b
96-h LOEC 4,72b
a
b
Tal y como se muestra en la Tabla IV.3, los valores de IC50 se encuentran

comprendidos entre 3,45 mg L-1 para el caso de C. gracilis y 13,95 mg L-1 para la
microalga T. chuii. Por otro lado, se puede observar como los valores NOEC varan entre
2,12 mg L-1 para I. galbana y C. gracilis y 7,98 mg L-1 para la microalga D. salina. De
acuerdo con los valores IC50 obtenidos, podemos establecer el siguiente orden de
sensibilidad de las diferentes microalgas al TergitolNP9: C. gracilis I. galbana > N.
gaditana > D. salina > T. chuii, siendo esta ltima la ms tolerante.
Estos resultados son comparables a los encontrados por otros autores (Moreno y col.,
2001) para NP10EO y la microalga marina C. gracilis (IC50= 1 mg L-1); si bien la menor
toxicidad puede ser debida a la mayor longitud de cadena etoxilada que presenta el
tensioactivo. En relacin con especies de agua dulce, se obtienen rdenes de magnitud
similares a los obtenidos con otras especies. As, por ejemplo, para el homlogo de NPEO
IV-17
Captulo 4
de longitud de cadena etoxilada de 9 unidades etoxiladas (NP9EO), los valores de EC50 (96-
h) oscilan entre 12 y 50 mg L-1 para la microalga Selenastrum capricornutum (Lewis, 1986;
Dorn y col., 1993).
En el presente apartado se muestran los resultados de toxicidad obtenidos para el

crustceo A. franciscana expuesto a crecientes concentraciones de TergitolNP9. La Figura
IV.7 recoge el porcentaje de supervivientes obtenidos para periodos de exposicin de 48 y
72 horas.
100 A. franciscana
Supervivientes (%)
80
60
40
20
48h
72h
0
0 20 40 60 80 100
Figura IV.7. Efecto del TergitolNP9 sobre A. franciscana a las 48 y 72 horas de

exposicin. Los datos se representan como valor medio DE (n=5).
Se puede observar un aumento del efecto txico a medida que aumenta la

concentracin de tensioactivo, alcanzando valores mximos de efecto del 78 y 92% al cabo
de 48 y 72 horas, respectivamente. Por otro lado, se aprecia una disminucin del porcentaje
de supervivientes al aumentar el periodo de exposicin, como consecuencia de un aumento
del efecto txico del tensioactivo. A concentraciones inferiores a 15 mg L-1 no se observan
efectos txicos significativos para ambos periodos de exposicin.
Los valores de los parmetros de toxicidad LC50, NOEC y LOEC calculados para
un periodo de exposicin de 48 y 72 horas se recogen en la Tabla IV.4.
IV-18
Tabla IV.4. Valores de LC50, NOEC y LOEC obtenidos en el ensayo de toxicidad estndar
con crustceos y el tensioactivo TergitolNP9.

72-h LC50 30,34 (26,06-33,84)a
48-h NOEC 15,18b
48-h LOEC 30,36b
72-h NOEC 15,18b
72-h LOEC 30,36b
a
b
Si se comparan los resultados obtenidos en la Tabla IV.4 con los recogidos en la

bibliografa (vase captulo de introduccin) para los NPEOs con otras especies de
invertebrados, nos encontramos con una amplia variabilidad de efectos adversos
dependiendo del tensioactivo y organismo en cuestin. Para el caso del tensioactivo
NP9EO, los valores obtenidos en el presente estudio resultan muy superiores a los descritos
para el camarn marino Mysidopsis bahia (LC50, 48-h= 0,9-2 mg L-1), mientras que para el
crustceo D. magna estas diferencias no son tan acusadas (LC50 = 14 mg L-1).
Otros parmetros importantes a considerar a la hora de estudiar la toxicidad son los

valores de la mnima concentracin que provoca un efecto observable (LOEC) y la mxima
concentracin que no presenta efecto observable (NOEC). Si comparamos las
concentraciones de NPEOs en el medio acutico natural (excluyendo las aguas residuales)
descritas en la bibliografa (vase captulo de introduccin), en todos los casos inferiores a
80 g NPEO L-1, con los valores del parmetro NOEC obtenidos, tanto para las microalgas
como invertebrados marinos (Tabla IV.3), estos ltimos resultan ser 3 4 rdenes de
magnitud mayores (dependiendo de la especie) que las concentraciones ambientales. Estos
resultados parecen indicar, en un principio, que el tensioactivo estudiado NP9EO no supone
un riesgo ambiental para el medio acutico marino. No obstante, cabe indicar que existe
una diferencia importante entre la naturaleza del tensioactivo utilizado en los ensayos de
toxicidad (TergitolNP9) y los NPEOs hallados en aguas naturales. En el caso de stos
ltimos estamos hablando de homlogos de cadena alqulica corta, y por lo tanto ms
txicos (Yoshimura, 1986; Hall y col., 1989) que los NP9EO. Por todo esto, hay que
considerar que a la hora de evaluar el riesgo ambiental de un compuesto no slo hay que
referirse al sustrato original sino tambin a los subproductos de la transformacin del
mismo en el compartimento estudiado, pues de lo contrario se corre el peligro de
subestimar su riesgo ambiental.
IV-19
Captulo 4
En el presente apartado se lleva a cabo el estudio de la evolucin del medio de

ensayo durante la biodegradacin del tensioactivo no-inico TergitolNP9 sobre diversas
especies de microalgas marinas y un crustceo marino.
En la Figura IV.8 se representa la evolucin temporal de la toxicidad del medio de

ensayo (% de inhibicin del crecimiento/mortalidad) y grado de mineralizacin (%) durante
el ensayo de biodegradacin del tensioactivo no-inico TergitolNP9.
Se puede observar como en el caso de las microalgas N. gaditana, I. galbana y C.

gracilis el porcentaje inicial de efecto (0% de biodegradacin del tensioactivo) es del
100%, permaneciendo constante durante los primeros 34 das de ensayos, momento en el
que el tensioactivo se ha mineralizado un 64%. Esto puede ser debido a la elevada
sensibilidad de estas tres microalgas al tensioactivo junto a la elevada concentracin inicial
empleada en los ensayos de biodegradacin. Como consecuencia de ello, no podemos
determinar si durante la biodegradacin del tensioactivo TergitolNP9 tiene lugar la
formacin de metabolitos ms o menos txicos (en cantidad y/ naturaleza) que el
tensioactivo original para estas tres especies de microalgas. Estaramos pues ante un caso
tipo D (vase captulo 3, apartado 3.3).
En el caso de las microalgas D. salina y T. chuii observamos un porcentaje inicial

de efecto (0% biodegradacin) inferior al 80%. Asimismo, se aprecia un incremento de la
toxicidad del medio durante la fase inicial de biodegradacin, alcanzando valores mximos
(100% inhibicin del crecimiento) al cabo de 6 das de ensayo, momento en el cual el
tensioactivo TergitolNP9 alcanza un porcentaje de biodegradacin del 16%,
aproximadamente. Al cabo de 34 das de ensayo (64% biodegradacin), y tal como se
observa para el resto de las microalgas se produce una disminucin de la toxicidad del
medio como consecuencia del proceso de mineralizacin. En el caso del crustceo A.
franciscana, se puede observar un comportamiento anlogo, esto es, un aumento inicial de
la toxicidad del medio al biodegradarse el tensioactivo. En la Figura IV.8 vemos como el
porcentaje inicial de efecto txico (10% mortalidad) es relativamente bajo, en comparacin
con el observado para las microalgas (80-100% inhibicin del crecimiento), pero a
continuacin la toxicidad del medio aumenta drsticamente, alcanzando valores mximos
de efecto (100%) al cabo de 11 das de ensayos (alrededor del 40% de mineralizacin). Una
vez alcanzado este mximo efecto adverso del medio de ensayo (entre el da 15 y 23 de
ensayo), la toxicidad disminuye paulatinamente a medida que avanza el proceso de
mineralizacin.
IV-20
N. gaditana 100
I. galbana 100
100 100

Biodegradacin (%)
Biodegradacin (%)
80 80 80 80
60 60 60 60
IC, 96-h (%)
Biodegradacin (%)
40 40 40 40
20 20 20 20
IC, 96-h (%)
Biodegradacin (%)
0 0 0 0
0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100

Biodegradacin (%)
Biodegradacin (%)
80 80 80 80
60 60 60 60
40 40 40 40
20 20 20 20
IC, 96-h (%) IC, 96-h (%)
0 Biodegradacin (%) 0 0 Biodegradacin (%) 0
0 20 40 60 80 0 20 40 60 80 100

Biodegradacin (%)
Biodegradacin (%)
80 80 80 80
60 60 60 60
40 40 40 40
20 20 20 20
LC, 72-h (%)
IC, 96-h (%) Biodegradacin (%)
0 Biodegradacin (%) 0 0 0
0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100
Figura IV.8. Evolucin del efecto txico del medio de ensayo (%) y porcentaje de
mineralizacin (%) durante el experimento de biodegradacin de
TergitolNP9.
Los resultados obtenidos para las microalgas D. salina y T. chuii y el crustceo A.

franciscana parecen confirmar que durante la mineralizacin del tensioactivo no-inico
TergitolNP9 en agua de mar tiene lugar un aumento de la toxicidad del medio como
IV-21
Captulo 4
consecuencia de la formacin de metabolitos ms txicos (en cantidad y/ naturaleza) que

el tensioactivo original y por tanto, el tensioactivo no presenta una biodegradacin
Si tenemos en cuenta la ruta de biodegradacin aerobia de los NPEOs podemos

apreciar que este aumento de la toxicidad probablemente sea debido a la presencia de
biointermediatos hidrfobos, tales como NP1EO, NP2EO y NP3EO, e, hidrfilos,
principalmente NP1EC y NP2EC, los cuales han sido identificados como ms txicos que
los NPEOs (Yoshimura, 1986; Hall y col., 1989; Kravetz y col., 1991; Jobling y Sumpter,
1993; White y col., 1994; Maguire, 1999).
Los resultados obtenidos en el presente apartado estn en consonancia con los

descritos por otros autores (Naylor y col., 1992; Jobling y Sumpter, 1993; Ahel y col.,
1994a; White y col., 1994; Ahel y col., 1996), quienes muestran que durante el proceso de
degradacin de los alquilfenoles etoxilados tiene lugar la formacin de biointermediatos,
muchos de los cuales resultan ser ms txicos y persistentes que el compuesto original.
IV-22
4. Conclusiones
El tensioactivo no-inico TergitolNP9 presenta una elevada biodegrabilidad en el

medio acutico marino bajo las condiciones ensayadas, alcanzando porcentajes de
mineralizacin superiores al 80% al cabo de 53 das de ensayo, lo que indica la
existencia de un potencial para la biodegradacin de estos tensioactivos en el medio
acutico marino.
La biodegradacin final o mineralizacin del tensioactivo no-inico en agua de mar

bajo las condiciones ensayadas sigue una cintica de primer orden, caracterizada por la
ausencia de una fase inicial de aclimatacin de los microorganismos responsables de la
degradacin del TergitolNP9.
La toxicidad del tensioactivo TergitolNP9 experimenta una gran variabilidad

dependiendo del organismo ensayado. As, de las diferentes especies de microalgas
estudiadas, las microalgas marinas I. galbana y C. gracilis se muestran como las ms
sensibles. Respecto al crustceo marino A. franciscana, a pesar de que los efectos
estudiados han sido diferentes a los de las microalgas, se obtienen valores de toxicidad
superiores, lo que parece indicar una mayor resistencia del crustceo al tensioactivo
estudiado.
Los resultados obtenidos en los ensayos de toxicidad aguda con microalgas y

crustceos marinos junto con los datos disponibles de niveles ambientales de esta
familia de tensioactivos parecen indicar que las concentraciones de NP9EO presentes
en el medio acutico marino, como tal, no suponen un riesgo ambiental. No obstante,
dada la elevada toxicidad que presentan los intermediatos generados durante su
degradacin (principalmente NPE1EO, NPE2EO, NPE1EC y NPE2EC), sera preciso
disponer de los valores de concentracin de no efecto (NOEC) de estos metabolitos y
no del compuesto original para evaluar el riesgo ambiental del NP9EO en su conjunto,
esto es incluyendo sus subproductos.
El estudio de la evolucin de la toxicidad del medio de ensayo indica que durante el

proceso de biodegradacin del TergitolNP9 tiene lugar un aumento de la toxicidad del
medio como consecuencia de la formacin de intermediatos ms txicos (en cantidad
y/ naturaleza) que el tensioactivo original. Estos resultados permiten clasificar al
tensioactivo TergitolNP9 como un compuesto de biodegradabilidad ambientalmente
no aceptable.
IV-23
Captulo 4
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IV-28
Captulo 5
ALQUIL ETOXISULFATOS
Resumen
En los ltimos aos, el consumo de los tensioactivos aninicos alquil etoxisulfatos

(AES) se ha visto fuertemente incrementado debido a sus propiedades, las cuales los hacen
ideales en mltiples aplicaciones. En el presente captulo se exponen los resultados
obtenidos en los experimentos de biodegradacin y ecotoxicidad del alquil etoxisulfato
EmpicolESB 70/SP en agua de mar natural procedente de la zona costera de Sancti Petri
(Cdiz). Los valores obtenidos indican la existencia de un potencial para la degradacin del
tensioactivo EmpicolESB 70/SP en el medio marino, aunque a baja velocidad de
biodegradacin. Durante la mineralizacin del tensioactivo se distinguen dos etapas, las
cuales siguen una cintica de primer orden y logstico, respectivamente. En relacin a la
toxicidad del tensioactivo aninico, los resultados obtenidos sealan a la microalga D.
salina como la ms sensible, mientras que el tensioactivo experimenta menores efectos
adversos sobre el crustceo marino A. franciscana. Los resultados obtenidos en los ensayos
combinados de toxicidad y biodegradacin no indican la presencia de metabolitos ms
txicos (en cantidad y/ naturaleza) que el tensioactivo original, por lo que parece que el
tensioactivo presenta una biodegradabilidad ambientalmente aceptable.
Captulo 5
1. Introduccin
Alquil etoxisulfatos. Caractersticas y usos
Los alquil etoxisulfatos (AES), tambin conocidos como alcoholes ter sulfato
alcoholes etoxilados sulfato, son tensioactivos aninicos utilizados en muy diversos
sectores industriales y domsticos. Aunque histricamente los lineal alquilbenceno
sulfonatos (LAS) han sido los tensioactivo sintticos aninicos por excelencia, en cuanto a
su produccin y uso as como probablemente el agente de superficie cuyo comportamiento
ambiental (ecotoxicidad y biodegradabilidad) ha sido ms estudiado (Perales, 2001), la
importancia y el consumo de los AES se ha visto incrementado en los ltimos aos. As,
por ejemplo, para el ao 2003 el consumo de AES estimado en Amrica del Norte fue de
491.238 toneladas, mientras que en el caso del LAS se estim un consumo de 317.513
toneladas para ese mismo ao (Modler y col., 2004). Por otro lado, se ha estimado un
consumo anual de AES en Europa de 276.000 toneladas, de las cuales 108.000 toneladas
son empleadas en detergentes domsticos y productos de limpieza (HERA, 2002).
Los AES son obtenidos mediante reacciones de sulfatacin de alcoholes etoxilados

de longitud de cadena alqulica y nmero de unidades etoxiladas variable, utilizando para
ello trixido de azufre cido clorosulfnico seguida de una inmediata neutralizacin con
una base, producindose generalmente sal de sodio y menos comnmente sal de amonio. La
mayora de los AES comerciales estn constituidos por complejas mezclas de homlogos
(Feijtel y van de Plassche, 1995) con un nmero de tomos de carbono en la cadena
alqulica comprendido entre 12 y 18 y de 1 a 5 unidades etoxiladas (Fendinger y col., 1994)
y suelen constituir disoluciones acuosas con una pureza aproximada del 25-30% 68-70%
de materia activa. Los AES de sodio se caracterizan por contener, generalmente,
aproximadamente un 2-4% de alcohol etoxilado desulfatado, 1-2% alcohol sin reaccionar y
1-45% de alcohol sulfato y opcionalmente cantidades traza de compuestos inorgnicos
tampones de pH, dependiendo del contenido de materia activa y del grado de etoxilacin.
La Figura V.1 recoge la estructura qumica de los alquil etoxisulfatos.
O
R O
O S O-
n O
Figura V.1. Estructura molecular del tensioactivo aninico aquil etoxisulfato (R= CxH2x+1,
x= 12-18; n = 1-5).
V-2
Alquil etoxisulfatos
Niveles de alquil etoxisulfatos en el medio acutico
Hasta el momento, pocos son los autores que han enfocado sus esfuerzos en la
determinacin de las concentraciones de AES en el medio acutico, y ninguno en el medio
marino. Tan slo se han encontrado datos referentes a las concentraciones de estos
compuestos en efluentes de estaciones depuradoras de aguas residuales urbanas y ros. As,
por ejemplo, Matthijs y col. (1999) describieron concentraciones medias de 6,5 g L-1 de
alquil etoxisulfatos de cadena alqulica comprendida entre 12 y 15 tomos (C12-15AES) en
efluentes de diversas estaciones depuradoras de aguas residuales (EDAR) de los Pases
Bajos. Por otro lado, en un estudio reciente llevado cabo en Estados Unidos por Sanderson
y col., (2006) se hallaron concentraciones totales de alcohol sulfato (AS) y alquil
etoxisulfatos (AES) de 10 y 172 ng L-1, correspondientes a aguas arriba y abajo de un punto
de vertido a un ro, respectivamente, mientras que en el influente y efluente de la EDAR se
determinaron concentraciones de 162,3-200,2 mg L-1 y 0,24-2,85 mg L-1, respectivamente.
Biodegradabilidad de los alquil etoxisulfatos (AES)
Steber y Berger (1995) establecieron tres posibles rutas/mecanismos de

biodegradacin de los alquil etoxisulfatos en condiciones aerobias, las cuales parecen tener
lugar simultneamente. En la Figura V.2 se representan los posibles mecanismos aerobios
de biodegradacin de los alquil etoxisulfatos (Steber y Berger, 1995).
La primera de estas posible rutas de biodegradacin consiste en una -oxidacin

de la cadena alqulica del AES seguida de -oxidaciones que provocan un sucesivo
acortamiento de la cadena alqulica, dando lugar a AES carboxilados (mecanismo a).
Un segundo mecanismo de biodegradacin consiste en la ruptura enzimtica del

grupo sulfato (desulfatacin) dando lugar a la formacin de un alcohol graso etoxilado
(mecanismo b). Posteriormente, el alcohol etoxilado generado es degradado mediante la
ruptura del enlace central bien mediante - y -oxidacin de cualquiera de los extremos
de la molcula (vase captulo 6, apartado 1).
Otro posible mecanismo de biodegradacin consiste en la hidrlisis del enlace

central ter (enlace entre la cadena alqulica y etoxilada) dando lugar a un alcohol y un
polietilenetilenglicol sulfato (mecanismo c). El alcohol generado es oxidado danto lugar a
un cido graso, mientras que el polietilenglicol sulfato es transformado a etilenglicol
mediante desulfatacin y sucesivas hidrlisis.
Finalmente, un cuarto posible mecanismo consiste la hidrlisis de un enlace ter

no central dando lugar a la formacin de un alcohol etoxilado y etilenglicol sulfato
(mecanismo d). Posteriormente, el alcohol etoxilado es degradado bien mediante la
V-3
Captulo 5
hidrlisis del enlace central ter bien - y -oxidacin de cualquiera de los extremos de la
molcula (vase captulo 6, apartado 1), mientras que el polietilenglicol es eliminado
mediante desulfatacin y sucesivas hidrlisis dando lugar a etilenglicol.
Alquil etoxisulfato (AES)
O
R1 O O S O-
O
-oxidacin n O Desulfatacin
(mecanismo a) (mecanismo b)
O
HO R2 O O S O- R1 O OH
O O
n O n
O
Alquil etoxisulfato carboxilado Alcohol etoxilado
(captulo 6, apartado 1)
-oxidacin
Hidrlisis no central
O (mecanismo d)
HO R3 O O S O-
O O
n O O
O HO O S O-
R1 OH + O
Alquil etoxisulfato carboxilado n-1 O
Alcohol etoxilado Polietilnglicol

Hidrlisis central (captulo 6, apartado 1) sulfato
(mecanismo c)
Desulfatacin
Hidrlisis
O
HO O S O- HO OH
R 1 OH + O
O
O
n
Alcohol Polietilenglicol sulfato Etilnglicol
Oxidacin Desulfatacin
Hidrlisis
R1 OH
HO OH
O
O
cido Etilnglicol
graso
Figura V.2. Rutas de biodegradacin aerobia propuesta para los tensioactivos aninicos
AES (R1=CxH2x+1, R2= Cx-1H2x, R3= Cx-2H2x-1, x= 12-18; n=1-5) (Steber y
Berger, 1995).
V-4
En general, los AES son considerados fcilmente biodegradables en condiciones

aerobias, independientemente de la longitud de cadena etoxilada (Painter, 1992; BKH,
1994; Madsen y col., 2001), alcanzando velocidades de degradacin primaria y final
similares a la de los alcoholes sulfatos (AS) (Scott y Jones, 2000). As, por ejemplo, Fischer
(1982), empleando el mtodo de frasco cerrado, obtuvo porcentajes de biodegradacin
primaria del 96% al cabo de 30 das de ensayo para diferentes AES. Asimismo, Painter
(1992) encontr porcentajes de biodegradacin primaria para el tensioactivo alquil
etoxisulfato de cadena alqulica entre 12 y 14 tomos de carbono y 3 unidades etoxiladas
(C12-14 AE3S) comprendidos entre el 90 y 100% al cabo de 1-5 das de ensayo. Por otro
lado, estudios realizados por Schrder (1995) en agua de ro describieron un tiempo de vida
media de aproximadamente 1 hora para diferentes AES.
La biodegradacin final o mineralizacin de los AES tambin ha sido estudiada

por diversos autores (Swisher, 1987; Holt y col., 1992); si bien la mayora de estos estudios
han sido realizados en aguas continentales De manera general, los AES se caracterizan por
presentar una elevada biodegradabilidad final. As, por ejemplo, estudios llevados a cabo
sobre diversos AES mostraron la completa degradacin de los metabolitos generados
durante el proceso degradativo, tales como los etilenglicoles sulfatos, conduciendo a la
formacin de sulfato inorgnicos y dixido de carbono (Griffith y col., 1986; White y
Russell, 1988). Por otro lado, en ensayos de simulacin de lodos activos con C12-14AE2S y
C12-15oxo-AE3S se han observado porcentajes de eliminacin de COD del 58-100% y 96-
100%, respectivamente, al cabo de 28 das de ensayo (Schberl y col., 1988). Asimismo,
Steber y Berger (1995) encontraron una completa mineralizacin (100% de eliminacin de
la demanda terica de oxgeno) del tensioactivo C12-18AE8,5S en ensayos de biodegradacin
de frasco cerrado.
La biodegradacin de AES bajo condiciones anaerobias tambin ha sido objeto de

estudio de diversos autores, observndose altos porcentajes de biodegradacin (Itoh y col.,
1987; Nuck y Federle, 1996; Painter, 1992; Steber, 1991; Steber y Berger, 1995). En un
estudio de biodegradabilidad anaerobia del tensioactivo C12-14AEO2S (ensayos ECETOC),
Steber (1991) encontr una produccin de biogs del 75% al cabo de un perodo de
incubacin de 41 das. Asimismo, Painter (1992), operando en condiciones anaerobias,
encontr una eliminacin del 64% de sustancia activa al azul de metileno (MBAS) para el
tensioactivo C12-14AE3S al cabo de 28 das de ensayo y del 70% MBAS para el tensioactivo
C16AE1S en 17das. Por otro lado, estudios llevados a cabo en un digestor a escala de
laboratorio mostraron una mineralizacin anaerobia (basado en la formacin de 14C-gas) del
tensioactivo C14AE3S comprendida entre 88,4% y 87,6% al cabo de 17 das de incubacin,
dependiendo de la concentracin de inculo utilizado (Nuck y Federle, 1996).
A diferencia de otros tensioactivos, estudios realizados por Painter (1992) parecen

indicar que el porcentaje de biodegradabilidad de estos compuestos no se ve afectado por
V-5
Captulo 5
la longitud de la cadena alqulica; si bien su grado de ramificacin puede dificultar la

biodegradacin primaria de estos tensioactivos, encontrando porcentajes de eliminacin
para un AES lineal del 97% al cabo de 3 das, un 90% para un oxo-AES lineal, y 50% para
un AES de cadena ramificada.
Toxicidad de los alquil etoxisulfatos en el medio acutico
Se han encontrado numerosos datos de toxicidad aguda de los AES sobre un total
de 17 especies marinas y de agua dulce correspondientes a diferentes grupos taxonmicos
(algas, invertebrados y peces), aunque la mayora de estos estudios corresponden a especies
de agua dulce, y en ocasiones no se especifican bien las condiciones de ensayo. En la Tabla
V.1 se resumen algunos de los valores de toxicidad aguda de diversos AES sobre diferentes
organismos acuticos marinos y de agua dulce recogidos en la bibliografa.
De manera general, los valores de toxicidad (EC50) de los AES se encuentran

comprendidos entre 0,37 y 450 mg L-1, lo que demuestra una gran variabilidad de la
toxicidad en funcin del taxn, la especie, condiciones de ensayo y tipo de alcohol
etoxilado ensayado. Con respecto al taxn se observan diferencias significativas entre ellos,
estando los valores de EC50 comprendidos entre 0,37 y 65 mg L-1 en el caso de las algas,
0,78 y 167,3 mg L-1 en el caso de los invertebrados y, 0,8 y 450 mg L-1 en el caso de los
peces (Tabla V.1). Asimismo, en un estudio realizado por la consultora BKH (1994), en el
que se recopilan datos de toxicidad de diversos AES sobre organismos acuticos, se
mostraban valores de EC50 comprendidos entre 3,5 y 10, 4,2 y 350 y, 0,39 y 94,4 mg L-1 en
el caso de algas, crustceos y peces, respectivamente.
Otra de las fuentes de variabilidad de la toxicidad de los AES consiste en la

especie ensayada. As, por ejemplo, en el caso de algas marinas, Pavlic y col. (2005)
obtuvieron valores similares de toxicidad (EC50, 72-h) para dos especies de diatomeas,
mientras que para especies de algas de agua dulce estas diferencias fueron algo ms
acusadas (Tabla V.1). Respecto a la variabilidad en peces de agua dulce, Reiff y col. (1979)
encontraron una toxicidad similar del tensioactivo C12-15AE3S sobre dos especies diferentes.
Sin embargo, estudios realizados por Singh y col. (2002) encontraron diferencias
significativas entre los peces R. heteromorpha e I. idus melanotus, con valores de IC50 (48-
h) comprendidos entre 7, 20 y 13,64 mg L-1 de lauril etersulfato sdico (C12AES).
En relacin a las condiciones de ensayos (tipo de respuesta, periodo de exposicin,

etc.) no se ha encontrado ningn trabajo en el que se compare la toxicidad de los AES a
diferentes condiciones experimentales, aunque en general se asume que cambios en las
condiciones de ensayo (tiempo de exposicin, temperatura, etc.) puede influir de manera
significativa en los resultados de los ensayos de toxicidad aguda (Rand, 1995).
V-6
Tabla V.1. Resumen de algunos valores de toxicidad aguda de AES sobre organismos
acuticos recogidos en la bibliografa.
Toxicidad
Grupo Especie AES Efecto Referencia
(mg L-1)
Algas marinas Phaeodactylum tricornutum C12AES 72-h EC50 0,50 Pavlic y col., 2005
Skeletonema costatum C12AES 0,37
Algas de Selenastrum capricornutum C10-15AE3S 48-h EC50 65 Yamane y col., 1984
agua dulce C12-14AES 72-h EC50 32 Verge y col., 1996
Pseudokirchneriella subcapitata C12AES 3,5 Pavlic y col., 2005
Scenedesmus subspicatus C12AES 0,50
Invertebrados marinos Artemia salina C12-14AE3S 24-h LC50 11,97 Liwarska y col., 2005
Invertebrados de Daphnia magna C13,67AE2,25S 96-h EC50 1,17 Maki, 1979
agua dulce Ceriodaphnia dubia C12AE1S 48-h LC50 9,55 Dyer y col., 2000
C12AE2S 55,98
C12AE4S 118,26
C12AE8S 43,46
C13AE2S 7,18
C14AE1S 4,08
C14AE2S 4,24
C14AE4S 43,97
C15AE1S 0,78
C15AE2S 18,96
C15AE4S 66,4
C15AE8S 167,31
Peces de Salmo gairdneri C12AES 48-h IC50 10,84 Singh y col., 2002
agua dulce Gammbusia affinis C12AES 13,64
Carassius auratus C12AES 12,35
Cirrhina mrigala C12AES 7,20
Pimephales promelas C12AE2S 24-h LC50 1,5 Painter, 1992
C14AE2S 1,8
C16AE2S 1,0
C18AE2S 8,0
C11AE4S 17,0
C14AE4S 4,0
C16AE4S 0,9
C18AE4S 15
C14AE6S 9,3
C16AE6S 0,8
C18AE6S 2,1
Oncorhynchus mykiss C9-10AE2,5S 96-h LC50 400-450
C12-13AE2S 28
C12-15AE3S 8,9
Salmo trutta C12-15AE3S 1,0-2,5 Reiff y col., 1979
Rasbora heteromorpha C12-15AE3S 48-h LC50 3,9
Idus idus melanotus C12-15AE3S 3,95
V-7
Captulo 5
Respecto a la estructura qumica del alquil etoxisulfato, estudios llevados a cabo

por diversos autores (Little, 1981; Painter, 1992; Dyer y col., 2000; Madsen, 2001)
mostraron que la toxicidad de los AES depende principalmente de la longitud de cadena
alqulica y en menor medida del nmero de unidades etoxiladas. As, Little (1981) encontr
que la toxicidad aguda de varios AES (C8-C19.6 y 1-3 EO) sobre el pez Lepomis
macrochirus aumentaba a medida que lo hacia la longitud de la cadena alqulica, con
valores de LC50 superiores a 250 mg L-1 para C8, 375 mg L-1 para C10, 24 mg L-1 para C13,
4-7 mg L-1 para C14, 2 mg L-1 para C15 y 0,3 mg L-1 para C16. Asimismo, Painter (1992)
encontr para una serie de AES que la toxicidad sobre la carpa Pimephales promelas
aumentaba a medida que lo haca la longitud de la cadena alqulica, hasta un mximo de 16
tomos de carbono, a partir del cual la toxicidad experimentaba un descenso debido a su
baja solubilidad, y por tanto, biodisponibilidad. Posteriormente, Dyer y col. (2000)
observaron dos tendencias; en aquellos AES con idntica cadena alqulica los efectos
txicos disminuan a medida que aumentaba el nmero de unidades etoxiladas, mientras
que para aquellos con igual nmero de unidades etoxiladas la toxicidad incrementaba a
medida que aumentaba la longitud de la cadena hidrocarbonada (Tabla V.1).
A pesar de la alta toxicidad que presentan algunos AES sobre determinadas

especies acuticas (Painter, 1992; Pavlic y col., 2005), no se ha descrito en la bibliografa la
formacin de metabolitos txicos persistentes durante el proceso de biodegradacin de los
AES.
V-8
2. Materiales
A continuacin se detallan las principales caractersticas del tensioactivo as como

del medio de ensayo empleado para los estudios de biodegradacin y ecotoxicidad.
El tensioactivo aninico utilizado fue un alquil etoxisulfato conocido

comercialmente como Empicol ESB 70/SP, CAS 68585-34-2 y suministrado por
Huntsman Surface Science Iberica S.L. (Barcelona). Est constituido por una mezcla de
homlogos de cadena alqulica entre 10 y 16 tomos de carbono (predominando C12 y C14)
y dos unidades etoxiladas. Presenta una pureza del 70,0 1,0 % de materia activa, una
densidad (20C) de 1,10 g cm-3 y una elevada solubilidad en agua.
Medio de ensayo
Las principales caractersticas fsico-qumicas y biolgicas del agua de mar

empleada en los ensayos de biodegradacin y ecotoxicidad se reflejan en la Tabla V.2. De
manera anloga a los anteriores captulos (captulo 3 y 4), los resultados obtenidos en el
anlisis del agua de mar demuestran su bajo grado nulo de contaminacin.
Tabla V.2. Caractersticas del agua de mar empleada en los ensayos de biodegradacin y
toxicidad del tensioactivo aninico Empicol ESB 70/SP (valor medio
desviacin estndar, n=3).

Oxgeno disuelto % saturacin 92,7 1,8 Nitrato mg L-1 NO3- 0,033 0,009
-1
pH - 8,14 0,04 Silicato mg L Si 0,021 0,003
Carbono total mg L-1 C 26,9 0,5 Clorofila a mg m-3 Cl a 0,73 0,12
-1
Carbono inorgnico mg L C 26,4 0,5 Estreptococos fecales UFC100mL-1 No Detectado
Carbono orgnico mg L-1 C 0,50 0,01 Coliformes fecales UFC100mL-1 No Detectado
-1 - -1
Nitrito mg L NO2 < 0,015 Enterococos UFC100mL No detectado
V-9
Captulo 5
En el siguiente apartado se presentan y discuten los resultados obtenidos en los

diferentes ensayos de biodegradacin y ecotoxicidad realizados con el tensioactivo aninico
Empicol ESB 70/SP.
La Figura V.3 muestra la evolucin de los parmetros de control pH y oxgeno

disuelto en los ensayos de biodegradacin (AES1, AES2 y AES3), abitico (AB3) y control
(CO3) a lo largo del experimento de biodegradacin.
8,5 100
80
8,0
O2 (%saturacin)
60
pH
7,5
40
CO3 CO3
7,0 AES1 AES1
AES2 20 AES2
AES3 AES3
AB3 AB3
6,5 0
0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120
Figura V.3. Evolucin del pH y oxgeno disuelto en el ensayo control (CO3), abitico
(AB3) y los ensayos de biodegradacin con AES (AES1, AES2 y AES3).
Como puede observar en dicha figura el parmetro pH muestra valores similares

en los ensayos control, abitico y de biodegradacin, alcanzando valores medios (valor
medio DE) de 7,90 0,15, 8,05 0,15 y 7,95 0,1, respectivamente.
Respecto a la concentracin de oxigeno disuelto, se observa una disminucin

inicial de los niveles de oxgeno disuelto en los ensayos de biodegradacin que
posteriormente se recupera, alcanzndose valores similares a los ensayos control y
abiticos. A pesar de este descenso inicial, los valores de oxgeno disuelto en todos los
ensayos realizados permanecen dentro de un rango que garantizan que ste no ha sido un
factor limitante del proceso degradativo. Los porcentajes de saturacin medios obtenidos en
V-10
los ensayos control, abitico y de biodegradacin fueron del 87,4 2,8%, 87,8 2,9%, y
81,8 6,96%, respectivamente.
Respecto al ensayo de referencia (benzoato sdico), los valores medios de pH y

oxgeno disuelto estuvieron comprendidos entre 7,96 0,14 y 75,6 7,58% de saturacin,
respectivamente. Los valores medios de temperatura encontrados en los ensayos control,
abitico, referencia y de biodegradacin fueron de 19,4 0,5C, 20,2 0,19C, 19,7 0,2
C, y 19,83 0,11C, respectivamente.
Los resultados obtenidos en el presente apartado indican que durante el

experimento de biodegradacin las condiciones experimentales de pH, oxgeno y
temperatura no fueron limitantes para el desarrollo de la poblacin microbiana responsable
del proceso biodegradativo.
En la Figura V.4 se muestran la evolucin seguida por el sustrato residual,

concentracin de carbono orgnico disuelto, en los ensayos control, referencia (benzoato
sdico) y abitico (HgCl2) a lo largo del ensayo de biodegradacin.
20
15
10 REF3
AB3
CO3
5
0 20 40 60 80 100 120
Tiempo (d)
Figura V.4. Evolucin del carbono orgnico disuelto en los ensayos control (CO3),
referencia (REF3) y abitico (AB3) a lo largo del proceso de biodegradacin.
Se puede observar como en el caso del ensayo control y abitico la concentracin

de carbono orgnico permanece prcticamente constante a lo largo del experimento de
biodegradacin, con valores medios de 1,09 0,80 y 18,59 0,56 mg DOC L-1,
respectivamente. El porcentaje de mineralizacin alcanzado en el ensayo abitico fue del
V-11
Captulo 5
1,82 3,32 %, descartando, por lo tanto, la contribucin de procesos abiticos (tales como
precipitacin, absorcin, etc.) en la eliminacin del tensioactivo.
Por el contrario, se puede apreciar como el benzoato sdico (sustancia de

referencia) fue rpidamente degradado, con porcentajes medios de degradacin superiores
al 50 y 90 % al cabo de 6 y 9 das, respectivamente. Estos resultados estn en consonancia
con los obtenidos por diversos autores (Nyholm y Kristensen, 1992; Staples y col., 2001;
Perales y col., 2007) para el mismo substrato (tiempo de vida media comprendido entre 1 y
7 das), indicando as una apropiada actividad microbiolgica del agua de mar usada.
En la Figura V.5 se recoge la evolucin temporal de la concentracin residual de

Empicol ESB 70/SP (mg L-1 COD) presente en el medio de ensayo para los tres ensayos de
biodegradacin realizados. Los puntos indican los valores medios experimentales, mientras
que las barras de error denotan la desviacin estndar (n=3).
20
Etapa A Etapa B
-1
15
10
0
0 20 40 60 80 100 120
Tiempo (d)
Figura V.5. Evolucin de la concentracin residual de EmpicolESB 70/SP (mg COD L-1)
en los ensayos de biodegradacin. La lnea continua roja corresponde a la
curva obtenida del ajuste de los valores experimentales a un modelo cintico
de primer orden, mientras que la lnea continua azul representa el ajuste
correspondiente a un modelo logstico.
En primer lugar, se observa como al cabo de 120 das de ensayo el tensioactivo

EmpicolESB 70/SP es mineralizado casi en su totalidad, alcanzando porcentajes de
degradacin del 25, 60 y 97% al cabo de 9, 60 y 124 das de ensayo, respectivamente. Cabe
V-12
destacar un descenso de la concentracin inicial de carbono orgnico disuelto en el primer

da de ensayo, la cual se corresponde con una acusada disminucin de la concentracin de
oxgeno disuelto, tal y como observamos en la Figura V.3. Atendiendo al criterio
establecido por la directriz OPPTS, estos resultados (eliminacin de COD inferior al 70% al
cabo de 60 das de ensayo) no descartan la capacidad del medio acutico marino para
degradar el tensioactivo aninico estudiado, aunque sera necesario realizar ensayos
adicionales de biodegradacin, por ejemplo, empleando concentraciones iniciales de
tensioactivo inferiores (USEPA, 1998). Sin embargo, los resultados obtenidos tras un
periodo de experimentacin de 124 das indican un alto grado de mineralizacin del
tensioactivo estudiado (97% al cabo de 124 das). Este elevado porcentaje de
biodegradacin parece indicar que, efectivamente, existe un potencial para la
mineralizacin de estos tensioactivos en el medio marino, si bien a una baja velocidad de
degradacin si la comparamos con otros tensioactivos o el sustrato de referencia.
Por otro lado, se puede apreciar la existencia de dos etapas durante el proceso de
mineralizacin del tensioactivo aninico (Figura V.5). La primera etapa (etapa A) se
encuentra comprendida entre el momento inicial de ensayo hasta el da 45,
aproximadamente, y se caracteriza por una rpida velocidad de degradacin y la ausencia
de una fase de adaptacin de los microorganismos responsables de la biodegradacin. La
segunda etapa (etapa B) abarca aproximadamente desde el da 46 hasta el final del ensayo
y, a diferencia de la primera etapa (etapa A), se puede observar una acusada fase de
adaptacin de la poblacin bacteriana y una velocidad de degradacin ms lenta.
La presencia de estas dos etapas durante la mineralizacin del EmpicolESB

70/SP puede justificarse atendiendo al mecanismo de biodegradacin de estos tensioactivos
propuestos por Steber y Berger (1995) (Figura V.2) y a los resultados obtenidos por
Manzano y col. (1998) y Perales y col. (2007). As, Steber y Berger (1995) establecieron
varias posibles rutas de biodegradacin que incluyen procesos de hidrlisis y -
oxidaciones, entre otras. Por otro lado, en un estudio llevado a cabo por Manzano y col.
(1998) se mostraba que la degradacin del tensioactivo no-inico NPEO, cuyo principal
mecanismo inicial de ruptura consiste en la hidrlisis de la cadena etoxilada, presentaba una
fase de aclimatacin relativamente corta (tiempo de latencia = 1-3 das). Por el contrario,
Perales y col. (2007) mostraron la presencia de una larga fase de adaptacin (tiempo de
latencia = 6,67 0,6 das) durante la degradacin del tensioactivo aninico LAS, cuyo
mecanismo inicial de degradacin consiste en - oxidaciones (Schberl, 1989; Scott y
Jones, 2000). Teniendo en cuenta estas consideraciones, los resultados obtenidos en el
presente experimento parecen indicar que durante la primera etapa (etapa A) predomina la
ruptura hidroltica de los enlaces ter (corto periodo de aclimatacin) mientras que en una
segunda etapa (etapa B), estos metabolitos son degradados va - oxidaciones (largo
periodo de aclimatacin).
V-13
Captulo 5
Con el fin de conocer la cintica de mineralizacin del tensioactivo en el medio de

ensayo, y al igual que se ha realizado en los anteriores captulos, se ajustaron los valores
experimentales obtenidos para ambas etapas (etapas A y B) a diferentes modelos cinticos
de consumo de sustrato propuestos por Simkins y Alexander (1984) y Quiroga y col.
(1999). Los resultados obtenidos a partir del anlisis estadstico demuestran que el
tensioactivo EmpicolESB 70/SP muestra una cintica de primer orden durante la primera
etapa del proceso (etapa A) mientras que durante la segunda etapa (etapa B) el modelo
cintico logstico es el que mejor se ajusta a los datos experimentales. En las Tablas V.3 y
V.4 se recogen los valores de los parmetros cinticos y estadsticos correspondientes al
modelo cintico de mejor ajuste para cada una de las etapas.
Tabla V.3. Parmetros cinticos correspondientes a los resultados de biodegradacin de

EmpicolESB 70/SP en agua de mar.
Parmetros cinticos a
Modelo S0 K1 B0 KLg
(mg COD L-1) (d-1) (mg COD L-1) (mg COD L-1 d-1)
Primer orden b
16,05 1,48 0,016 0,005 -- --
(etapa A)
b
Logstico
8,23 1,46 -- 0,001 0,004 0,012 0,009
(etapa B)
a
b
Simkins y Alexander (1984)
Tabla V.4. Parmetros estadsticos correspondientes a los resultados de biodegradacin

de EmpicolESB 70/SP en agua de mar.
Modelo
R2 2 Q
b
Primer orden
0,93 36,65 21 0,050
(etapa A)
b
Logstico
0,95 24,03 26 0,574
(etapa B)
b
Simkins y Alexander (1984)
Al objeto de determinar la velocidad de mineralizacin del tensioactivo

EmpicolESB 70/SP bajo las condiciones ensayadas, esto es, los valores del periodo de
latencia y de vida media, se han sustituido los valores de los parmetros cinticos obtenidos
en la Tabla V.3 en las expresiones propuestas por Perales y col. (2007) para el modelo de
primer orden y logstico (vase captulos 3 y 4). As, los valores de tiempo de latencia (tL),
t50 (el tiempo necesario para alcanzar un 50% de biodegradacin, sin considerar el tiempo
V-14
de latencia) y tiempo de vida media (t1/2), calculados para la etapa A fueron de 3,3, 15,3 y
18,6 das, respectivamente. En el caso de la etapa B, los valores de tL, t50 y t1/2 obtenidos
fueron 26,5, 23,3 y 49,8 das, respectivamente.
La velocidad de degradacin obtenida en el presente trabajo para el tensioactivo

EmpicolESB 70/SP (C12-14AE2S) resulta inferior a las mostrados por otros autores para
diversos AES y empleando un medio mineral inoculado (50% mineralizacin al cabo de 35
das de ensayos). As, por ejemplo, Schberl y col. (1988), en un ensayo de fcil
biodegradabilidad (OECD 301), mostraron porcentajes de mineralizacin del 58-100% y
96-100% al cabo de 28 das de ensayo para los tensioactivos C1214AE2S y C1215oxo-AE3S,
respectivamente. Por otro lado, Painter (1992) para un alquil etoxilado de similar estructura
qumica (C1214AE3S) encontr porcentajes de biodegradacin primaria del tensioactivo C12-
14AE3S comprendidos entre el 90 y 100% al cabo de 1-5 das de ensayo. Steber y Berger
(1995), empleando el mtodo de frasco cerrado, tambin observaron una completa
mineralizacin del tensioactivo C1218AE8.5S en un periodo inferior a 28 das.
En la Figura V.6 se muestra la evolucin temporal de la concentracin neta de

exposicin de EmpicolESB 70/SP (mg L-1) en los ensayos estndar de toxicidad con
microalgas. Se puede apreciar como la toxicidad del tensioactivo aninico vara
considerablemente dependiendo de la especie ensayada. En general, se observa una
inhibicin del crecimiento con respecto al control para todas las microalgas y
concentraciones ensayadas al cabo de 24 horas de exposicin. Asimismo, se aprecia como
al cabo de las 96 horas de exposicin estos efectos son ms acusados, especialmente en las
microalgas N. gaditana, C. gracilis y D. salina. Por otro lado, se pueden observar valores
negativos de DOn al cabo de las 24 horas en todas las microalgas menos N. gaditana,
indicando efectos txicos letales sobre las microalgas. Sin embargo, al cabo 48 horas de
ensayo se produce una recuperacin de los cultivos para casi todas las concentraciones
ensayadas. Se aprecia como en el caso de I. galbana y T.chuii esta recuperacin del
crecimiento tiene lugar para todas las concentraciones ensayadas, mientras que en las
especies C. gracilis y D. salina sta slo tuvo lugar a concentraciones iguales o inferiores a
22,4 y 7 mg L-1 EmpicolESB 70/SP, respectivamente.
V-15
Captulo 5
1,2 1,2
1,0 6 1,0 17
11 20
0,8 17 0,8 22
DOn (690 nm)
DOn (690 nm)

22 25
0,6 28 mg L-1 0,6 28 mg L-1
0,4 0,4
0,2 0,2
0,0 0,0
-0,2 -0,2
0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100
0,6
0 C. gracilis
0,5 11
14
0,4 17
DOn (690 nm)
20
0,3
22 mg L-1
0,2
0,1
0,0
-0,1
-0,2
0 20 40 60 80 100
Tiempo (h)
1,4 1,4
D. salina 0 T. chuii
0
1,2 1
1,2 7
14
3
1,0 1,0 28
4
DOn (690 nm)
DOn (690 nm)
35
6 0,8 42 mg L-1
0,8
7 mg L-1
0,6 0,6
0,4 0,4
0,2 0,2
0,0 0,0
-0,2 -0,2
0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100
Figura V.6. Evolucin de la concentracin neta de biomasa (DOn, 690 nm) en el ensayo
de toxicidad estndar con microalgas. Las barras de error denotan las
V-16
En la Tabla V.5 se recogen los valores de las concentraciones de inhibicin del

crecimiento (IC50), NOEC y LOEC calculadas para cada una de las microalgas ensayadas y
un periodo de exposicin de 96 horas.
Tabla V.5. Valores de IC50, NOEC y LOEC obtenidos en el ensayo de toxicidad estndar
con microalgas marinas y el tensioactivo EmpicolESB 70/SP.

N. gaditana 96-h IC50 22,05 (21,10-28,66)a
96-h NOEC 8,40b
96-h LOEC 11,20b
I. galbana 96-h IC50 24,02 (21,39-27,73)a
96-h NOEC 16,80 b
96-h LOEC 19,60 b
C. gracilis 96-h IC50 20,83 (20,56-21,07)a
96-h NOEC 16,80 b
96-h LOEC 19,40 b
D. salina 96-h IC50 4,68 (4,09-4,93)a
96-h NOEC 2,80 b
96-h LOEC 4,20 b
T. chuii 96-h IC50 23,10 (20,46-24,55)a
96-h NOEC 7,00 b
96-h LOEC 14,00 b
a
b
Como puede observarse en la Tabla V.5 los valores 96-h IC50 calculados para la
microalga D. salina son notablemente ms bajos que los calculados para el resto de
microalgas. Asimismo, no se aprecian diferencias significativas entre el resto de las
microalgas (N. gaditana, I. galbana, C. gracilis y T. chuii). Tambin puede verse como los
valores medio NOEC (96-h) estn comprendidos entre 4,20 mg L-1 para D. salina y 19,60
mg L-1 para I. galbana y C. gracilis. De acuerdo con los valores IC50 obtenidos, podemos
establecer el siguiente orden de sensibilidad de las diferentes microalgas al tensioactivo: D.
salina > N. gaditana I. galbana C. gracilis T. chuii. Cabe resaltar la variabilidad de
los valores de IC50 obtenidos en el caso de las microalgas N. gaditana e I. gracilis, para las
cuales se obtuvieron coeficientes de variacin del 24,24 y 20,33%, respectivamente.
En el caso de algas marinas, tan slo se han encontrado datos de toxicidad del
tensioactivo aninico C12AES sobre las diatomeas Phaeodactylum tricornutum (EC50= 0,50
V-17
Captulo 5
mg L-1) y Skeletonema costatum (EC50= 0,37 mg L-1) (Pavlic y col., 2005; Tabla V.1)
aunque resultan muy inferiores a los valores de toxicidad hallados en el presente trabajo
(Tabla V.5). La principales diferencias entre el ensayo llevado a cabo por Pavlic y col.
(2005) y el realizado en el presente trabajo radica en la estructura qumica del AES (si bien
el EmpicolESB 70/SP presenta una mayor longitud de cadena alqulica (12-14 tomos de
carbono)) y el periodo de exposicin empleado (Pavlic y col. emplearon un periodo de 72
horas frente al periodo de 96 horas empleada en el presente trabajo). Atendiendo a estas
diferencias cabra esperar una mayor toxicidad del EmpicolESB 70/SP, sin embargo,
precisamente ocurre lo contrario, por lo que la causa slo puede deberse al diferente grado
de sensibilidad de las especies ensayadas.
Respecto a las especies de agua dulce, los valores obtenidos son comparables a los
encontrados por Verge y col. (1996) para la especie S. capricornutum y el alcohol
etoxisulfato C12-14AES (EC50= 32 mg L-1, 72-h). Sin embargo, se observan diferencias
significativas con respecto a las microalgas P. subcapitata y S. subspicatus, las cuales
presentan una sensibilidad muy superior (EC50= 0,50-3,5 mg L-1, 72-h). Estos resultados
ponen de manifiesto, una vez ms, la elevada variabilidad que presenta la toxicidad de estos
tensioactivos, dependiendo de la especie ensayada.
A continuacin se muestran los resultados de toxicidad obtenidos para el crustceo

A. franciscana expuesto a crecientes concentraciones de EmpicolESB 70/SP. La siguiente
grfica muestra los porcentajes de artemias supervivientes obtenidos para periodos de
exposicin de 48 y 72 horas.
A. franciscana
100
Supervivientes (%)
80
60
40
20
48h
72h
0
0 10 20 30 40 50 60 70
Figura V.7. Efecto del tensioactivo AES sobre A. franciscana a las 48 y 72 horas de
exposicin. Los datos se representan como valor medio DE (n=5).
V-18
A la vista de la Figura V.7 se puede observar que a medida que aumenta la

concentracin de ensayo el porcentaje de supervivientes decrece como consecuencia del
efecto txico del agente de superficie, siendo este efecto ms acusado para un periodo de
exposicin de 72 horas. Por otro lado, cabe destacar una elevada variabilidad de los valores
de mortalidad correspondientes a las cinco rplicas.
En la Tabla V.6 se recogen los valores de los parmetros de toxicidad LC50

(concentracin que produce la mortalidad del 50% de la poblacin), NOEC y LOEC
calculados para un periodo de exposicin de 48 y 72 horas.
Tabla V.6. Valores de LC50, NOEC y LOEC obtenidos en el ensayo de toxicidad estndar
con crustceos y el tensioactivo AES.

72-h LC50 23,92 (19,59-28,26)a
48-h NOEC 4,90 b
48-h LOEC 9,80 b
72-h NOEC 4,90 b
72-h LOEC 9,80 b
a
b
Se puede apreciar como, a pesar de que el efecto txico fue ms acusado tras 72
horas de exposicin, las concentraciones mximas de efectos observables (NOEC) y
concentraciones mnimas de efectos observables (LOEC) mostraron los mismos valores
para ambos periodos (NOEC = 4.90 mg L-1; LOEC = 9.80 mg L-1). Estos resultados son
comparables con lo obtenidos por Liwarska-Bizukojc y col. (2005) para el crustceo marino
A. salina y el tensioactivo C12-14EO3S (LC50= 11,97 mg L-1). Dentro del conjunto de datos
hallados en la bibliografa para invertebrados de agua dulce (Tabla V.1), encontramos que
los valores hallados en el presente trabajo resultan inferiores a los obtenidos por Dyer y col.
(2000) para la crustceo C. dubia y el tensioactivo C12AE2S (LC50= 55,98, 48-h) mientras
que por el contrario presentan menores efectos txicos que los observados por Maki y col.
(1979) para la especie D. magna y el tensioactivo de similar estructura qumica
C13,67AE2,25S (LC50= 1,17, 96-h). En el primer caso, estas diferencias pueden ser debidas a
la menor longitud de cadena de cadena alqulica del tensioactivo C12AE2S con respecto al
tensioactivo ensayado en este trabajo (C12-14AE2S) as como el menor tiempo de exposicin
empleado. Por el contrario, en el segundo caso, dado que la estructura qumica de ambos
tensioactivos y el tiempo de exposicin son similares, estas diferencias podran ser debidas
a los diferentes grados de sensibilidad que presentan los organismos ensayados.
V-19
Captulo 5
Dado que no se han encontrado datos de concentracin de alquil etoxisulfatos en el

medio acutico marino, no es posible evaluar el riesgo que supone la presencia de estos
tensioactivos en este medio. Sin embargo, si tenemos en cuenta los niveles de alquil
etoxisulfatos encontrados en agua de ro por Sanderson y col. (2006) (10-172 ng L-1)
podemos apreciar como los valores de concentracin de no efecto (NOEC) calculados para
las microalgas y el crustceo marino (NOEC= 2,8-16,8 mg L-1) son muy superiores a las
concentraciones ambientales encontradas. Partiendo de que las concentraciones de estas
sustancias en el medio marino seran incluso inferiores que en agua de ro dado la gran
capacidad de dilucin del medio, podemos afirmar que la presencia de estos compuestos no
supone, en principio, un riesgo ambiental para las poblaciones de estas microalgas y
crustceo marino. No obstante, para corroborar esta hiptesis sera necesario llevar a cabo
un mayor nmero de estudios de toxicidad aguda y crnica incluyendo un mayor nmero de
especies as como un programa de monitoreo ambiental de estas sustancias en zonas
costeras.
En el siguiente apartado se presenta y discuten los resultados del estudio de la

evolucin de la toxicidad del medio de ensayo a lo largo del proceso biodegradativo del
EmpicolESB 70/SP. La evolucin temporal de la toxicidad del medio de ensayo (%) y
grado de mineralizacin (% inhibicin del crecimiento y mortalidad) durante el ensayo de
biodegradacin del tensioactivo se recogen en la Figura V.8.
V-20
100 N. gaditana 100 100

I. galbana 100

Biodegradacin (%)
Biodegradacin (%)
80 80 80 80
60 60 60 60
40 40 40 40
IC, 96-h (%)
Biodegradacin (%)
20 20 20 20
IC, 96-h (%)
0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120

100 C. gracilis 100 100

D. salina 100

Biodegradacin (%)
Biodegradacin (%)
80 80 80 80
60 60 60 60
IC, 96-h (%)
20 20 20 20
IC, 96-h (%)
0 0 0 Biodegradacin (%) 0
0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120


Biodegradacin (%)
Biodegradacin (%)
80 80 80 80
60 60 60 60
IC, 96-h (%)

LC,72-h (%)
Biodegradacin (%)
20 20 20 20
0 0 0 0
0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120
Figura V.8. Evolucin del efecto txico del medio de ensayo y porcentaje de
mineralizacin durante el experimento de biodegradacin del tensioactivo.
De manera general, se observa una disminucin del efecto toxico del medio a lo
largo del proceso de mineralizacin del EmpicolESB 70/SP, esto es, una detoxificacin
del medio de ensayo. En el caso de D. salina se puede apreciar un efecto txico mximo
(100% inhibicin del crecimiento) durante los primeros estados de biodegradacin (40
das, aprox.). Este hecho se debe a la alta sensibilidad que presenta esta especie de
V-21
Captulo 5
microalga (como se pudo comprobar en el apartado 3.2) en comparacin con la elevada

concentracin inicial de tensioactivo usado en el experimento de biodegradacin. Por el
contrario, para el resto de organismos ensayados se puede observar niveles de
detoxificacin del 100% al cabo de 96 das (77% biodegradacin) en el caso de I. galbana,
C. gracilis, T. chuii y A. franciscana y de 124 das (100% biodegradacin) en el caso de N.
gaditana y D.salina (caso A, vase captulo 3, apartado 3.3).
Si consideramos los valores de efectos txicos obtenidos cuando se alcanza

aproximadamente un 50% de mineralizacin del tensioactivo (da 41 de ensayo), podemos
observar que stos varan notablemente dependiendo de la especie ensayada. As, por
ejemplo, en el caso de D. salina se observa un porcentaje de efecto del 100%, mientras que
las microalgas N. gaditana, I. galbana, C. gracilis, y T. chuii muestran porcentajes de
efectos similares, estando comprendidos entre el 10 y 36%. En el caso del crustceo marino
A. franciscana el efecto txico inicial (100% mortalidad) se ve reducido un 90% al cabo de
41 das de ensayos (50% biodegradacin, aprox.).
Teniendo en cuenta los valores de toxicidad alcanzados al inicio del experimento

de biodegradacin (0% mineralizacin) as como los efectos txicos observados al alcanzar
aproximadamente un 50% de mineralizacin (da 41 de ensayo), podemos establecer el
siguiente orden de sensibilidad al medio de ensayo: D. salina > N. gaditana I. galbana
C. gracilis T. chuii > A. franciscana, siendo la microalga D. salina la ms sensible. Si
comparamos estos resultados con los obtenidos anteriormente en los ensayos de toxicidad
estndar con EmpicolESB 70/SP podemos observar que la sensibilidad de las especies al
tensioactivo aninico es similar a la que presentan al medio de ensayo, a excepcin del
crustceo, el cual se mostr ligeramente ms resistente al medio de ensayo que la microalga
T. chuii. Esta similitud entre los resultados obtenidos en ambos experimentos parece indicar
que el tensioactivo (y no los metabolitos) constituyen la principal fuente de toxicidad del
medio de ensayo.
Atendiendo a los resultados obtenidos para la mayora de las especies de

microalgas y el crustceo marino, podemos concluir que durante la biodegradacin del
tensioactivo se produce una clara detoxificacin del medio sin formacin de metabolitos
ms txicos (en cantidad y/ naturaleza) que el tensioactivo original y por lo tanto, que el
tensioactivo aninico EmpicolESB 70/SP presenta una biodegradacin ambientalmente
aceptable.
V-22
4. Conclusiones
El tensioactivo aninico EmpicolESB 70/SP presenta una elevada biodegrabilidad

(porcentaje de mineralizacin superior al 97%) en el medio acutico marino bajo las
condiciones ensayadas, aunque a una baja velocidad de biodegradacin.
La biodegradacin final o mineralizacin del tensioactivo en agua de mar presenta dos

etapas bien diferenciadas. Los resultados parecen indicar que la primera etapa
corresponde a la ruptura hidroltica del tensioactivo, mientras que en la segunda etapa
tiene lugar la eliminacin de los metabolitos generados durante la etapa anterior
mediante - y -oxidaciones. La cintica de biodegradacin del tensioactivo aninico
durante la primera etapa sigue un modelo cintico de primer orden, mientras que
durante la segunda etapa, el modelo cintico que mejor describe la biodegradacin
final del xenobitico es el logstico.
La toxicidad del tensioactivo EmpicolESB 70/SP depende significativamente del tipo

de organismo ensayado. As, de las diferentes especies de microalgas estudiadas, la
microalga D. salina constituye, con una amplia diferencia entre las otras cuatro
especies, la ms sensible al tensioactivo. Respecto al crustceo marino A. franciscana,
a pesar de que los efectos txicos estudiados han sido diferentes a los de las
microalgas, se obtienen un grado similar de sensibilidad que para el resto de las
microalgas estudiadas.
Los resultados obtenidos en los ensayos de toxicidad con organismos acuticos junto
con los datos disponibles de niveles ambientales de AES parecen indicar que las
concentraciones de AES presentes en el medio acutico marino no suponen un riesgo
ambiental.
Las medidas de toxicidad obtenidas en los ensayos combinados de toxicidad con el

experimento de biodegradacin indican una clara detoxificacin del medio durante el
proceso de mineralizacin del tensioactivo aninico EmpicolESB 70/SP sin
produccin de intermediatos ms txicos (en cantidad y/ naturaleza) que el
tensioactivo original. Estos resultados permiten clasificar al tensioactivo ensayado
como un compuesto de biodegradabilidad ambientalmente aceptable.
V-23
Captulo 5
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V-26
Captulo 6
ALCOHOLES ETOXILADOS
Resumen
Los alcoholes etoxilados (AE) constituyen una de las principales familias de

tensioactivos no-inicos y destacan por su baja-moderada capacidad de formacin de
espumas, resistencia a la dureza del agua y biodegradabilidad. El siguiente captulo est
dedicado al estudio de la biodegradabilidad y ecotoxicidad del alcohol etoxilado comercial
Findet1214N/23 en agua de mar. Los resultados obtenidos muestran un elevado grado de
mineralizacin bajo las condiciones ensayadas, aunque a baja velocidad (>90% al cabo de
108 das de ensayo). El modelo cintico que mejor describe la cintica de mineralizacin
del tensioactivo en el medio de ensayo consiste en un modelo de orden cero, obtenindose
valores de tiempo de latencia (tL) y tiempo de vida media (t1/2) de 11,5 y 56,8 das,
respectivamente. En lo que respecta a la toxicidad, los valores de IC50 (96-h) para las
microalgas se encuentran comprendidos entre 5 mg L-1 para C. gracilis y 35,03 mg L-1 para
T. chuii, mientras que en el caso del crustceo marino el valor de LC50 (72-h) calculado es
de 23,33 mg L-1. Los ensayos de toxicidad combinados con el experimento de
biodegradacin muestran una clara detoxificacin del medio del ensayo a lo largo del
proceso de mineralizacin del tensioactivo, lo que viene a indicar que el tensioactivo
presenta una biodegradacin ambientalmente aceptable.
Captulo 6
1. Introduccin
Alcoholes etoxilados. Caractersticas y usos
Los alcoholes etoxilados (AE) constituyen una de las familias de tensioactivos no-
inicos ms utilizadas en productos de limpieza domsticos e industriales, as como en
diversos sectores tales como la agricultura, industria textil, industria del papel, etc. Estos
tensioactivos fueron desarrollados como una alternativa ambientalmente ms lbil que los
tensioactivos no inicos alquilfenoles etoxilados (Scott y Jones, 2000), dada la elevada
toxicidad que presentan los metabolitos de degradacin de estos ltimos (Naylor y col.,
1992; Jobling y Sumpter, 1993; Ahel y col., 1994; White y col., 1994; Ahel y col., 1996).
Entre sus principales caractersticas destacan la baja-moderada capacidad de formacin de
espumas, resistencia a la dureza del agua y biodegradabilidad. Estas propiedades, tan
deseables desde un punto de vista industrial, han provocado el incremento de su produccin
y consumo en los ltimos aos. Para el ao 2002, el volumen de consumo de AE estimado
(empleados exclusivamente en productos domsticos de limpieza) ha sido de 275.000
toneladas (HERA, 2007), mientras que otras estimaciones establecen una produccin
mundial anual de 1,1 millones de toneladas (Hauthal, 2004).
Los alcoholes etoxilados son obtenidos a partir de alcoholes de cadena lineal

derivados principalmente de aceite de coco, de grasa animal o sintticos, a los que se une
un nmero variable de moles de oxido de etileno. En la Figura VI.1 se recoge la estructura
qumica general de los AE (n = nmero de unidades etoxiladas).
R O OH
O
n
Figura VI.1. Estructura molecular del tensioactivo no-inico alcohol etoxilado (R =

CxH2x+1, x= 8-18, n = 0-19).
De manera general, las formulaciones de alcoholes etoxilados de uso comercial

estn compuestas por una mezcla compleja de oligmeros, con una longitud media de
cadena etoxilada comprendida entre 1 y 20 unidades, mientras que la cadena
hidrocarbonada suele contener entre 8 y 18 tomos de carbono (Mezzanotte y col., 2002).
En funcin del tipo de cadena alqulica presente en la molcula se puede distinguir entre:
los alcoholes etoxilados de cadena alqulica lineal y los alcoholes etoxilados de cadena
alqulica ramificada. La proporcin de oligmeros (nmero de unidades etoxiladas)
generalmente adopta una distribucin de Poisson (Swisher, 1987) y afecta a las propiedades
VI-2
Alcoholes etoxilados
fsico-qumicas, biodegradabilidad en el medio y uso final (Wang y Fingas, 1993; Ahel y

col., 2000; Mezzanotte y col., 2002; Wind y Belanger, 2006).
Niveles de alcoholes etoxilados en el medio acutico
Tradicionalmente, la determinacin de alcoholes etoxilados en influentes y

efluentes de estaciones depuradoras de aguas residuales (EDARs) se ha llevado a cabo
mediante mtodos analticos cualitativos juntos con otros mtodos empleados para el
anlisis del contenido global en tensioactivos no-inicos, como por ejemplo el mtodo
BiAs (mtodo de la sustancia activa al bismuto). En la actualidad, los esfuerzos estn
directamente dirigidos hacia el desarrollo de nuevos mtodos para la determinacin
especfica de AE a bajas concentraciones en muestras ambientales.
Diversos son los estudios que analizan el comportamiento de estos compuestos

durante el tratamiento de aguas residuales. As, por ejemplo, Holt y col. (1992), para una
concentracin de 3,4 mg L-1 AE en el influente de una EDAR, encontraron concentraciones
en el efluente de 40 g L-1, lo que supone una eliminacin del 99%, aproximadamente. Por
otro lado, Madsen y col. (2001), encontraron porcentajes de eliminacin de los alcoholes
etoxilados durante el tratamiento de aguas residuales del 97,5%, con valores de 6-20 g L-1
AE en el efluente. En un estudio de monitorizacin llevado a cabo en diferentes EDARs de
los Pases Bajos se mostraban altos porcentajes de eliminacin de los alcoholes etoxilados,
siendo la concentracin media de AE en los efluentes de 6,2 g L-1 (Matthijs y col., 1999).
La presencia de AE en el medio acutico natural tambin ha sido objeto de estudio

por parte de diversos autores, aunque solamente se han encontrado valores de
concentraciones ambientales en agua de ro. No obstante, los estudios realizados en agua de
ro indican una baja presencia de estos compuestos en el medio acutico natural. As, por
ejemplo, Holt y col. (1992) encontraron concentraciones medias de 4 g L-1 del alcohol
etoxilado C14-15 en el ro Ohio (EEUU). Por otro lado, estudios llevados a cabo en un ro en
Japn no encontraron presencia alguna de AE en el compartimento acutico (lmite de
deteccin del mtodo 5 g L-1), mientras que en muestras de sedimentos las
concentraciones variaron entre 0 y 1 mg kg-1 (HERA, 2007).
Biodegradabilidad de los alcoholes etoxilados
La ruta de biodegradacin aerobia de los alcoholes etoxilados (AE) ha sido

seguida en numerosos estudios (Osburn, 1966; Patterson, 1970; Swisher, 1987), siendo la
ms aceptada la propuesta por Marcomini y col. (2000a, 2000b). En la Figura VI.2 se
representan los posibles mecanismos aerobios de biodegradacin de los alcoholes
etoxilados (Marcomini y col., 2000a, 2000b).
VI-3
Captulo 6
Alcohol etoxilado
R1
O OH
R2 O
n
Hidrlisis central Hidrlisis oxidativa
(mecanismo a) (mecanismo c)
-oxidacin
(mecanismo b)
R1 O R1 R1
HO OH O OH
R2
OH + O
n HO R3 O R2
O
O
OH
n
O
Alcohol Polietilenglicol Alcohol etoxilado carboxilado Alcohol etoxilado carboxilado
-oxidacin
Oxidacin
Hidrlisis Hidrlisis oxidativa -oxidacin
R1 O R1
OH HO OH O OH
R2 O HO R3 O
Hidrlisis n
O O n-m O
oxidativa
cido graso PEG monocarboxilado Alcohol etoxilado dicarboxilado
Acortamiento no +
oxidativo -oxidacin
O Hidrlisis
HO OH HO O
O O OH
n-m
O n-m
PEG PEG dicarboxilado
Figura VI.2. Rutas de biodegradacin aerobia propuesta para los tensioactivos no-inicos
alcoholes etoxilados (AE) (R1= -H para alcoholes lineales, cadena alqulica
lineal o ramificada de 1-6 tomos de carbono para alcoholes ramificados;
R2= cadena alqulica lineal de 10 tomos de carbono; R3= cadena alqulica
lineal de 9 tomos de carbono; m= nmero par) (Marcomini y col., 2000a,
2000b).
Un posible mecanismo consiste en la ruptura central de la molcula (mecanismo

a), dando lugar a la formacin de polietilenglicol con la misma longitud que la cadena
etoxilada, y los correspondientes alcoholes. Posteriormente, las molculas de
polietilenglicol son degradadas mediante un mecanismo hidroltico y/ hidroltico oxidativo
con la consiguiente formacin de polietilenglicol mono y/ dicarboxlico. Por otro lado, los
alcoholes son transformados en los correspondientes cidos grasos y posteriormente
incorporados a las rutas metablicas comunes de los cidos grasos.
VI-4
Otro posible mecanismo consiste en una oxidacin del carbono terminal de la

cadena alqulica (-oxidacin) originando la formacin de alcoholes etoxilados
carboxilados y en ltima instancia (va -oxidaciones) una serie de polietilenglicoles
carboxilados (mecanismo b).
Finalmente, una tercera posibilidad consiste en un ataque primario al carbono

terminal de la cadena polietoxilada mediante un proceso hidroltico similar al que muestran
los tensioactivos no inicos del tipo alquilfenol polietoxilado (mecanismo c), dando lugar a
alcoholes etoxilados carboxilados de cadenas ms cortas y finalmente, tras un proceso de
- y -oxidaciones e hidrlisis, polietilenglicol dicarboxilado.
A pesar de las diferentes posibles vas de degradacin, estudios realizados sobre

diversos AE parecen indicar que, en el caso de AE lineales y la mayora de los
monoramificados, el principal mecanismo de biodegradacin consiste en la ruptura del
enlace central (mecanismo a), mientras para el resto de alcoholes etoxilados ramificados el
mecanismo principal propuesto consiste en la biodegradacin primaria a travs de una -
oxidacin a la cadena polietoxilada (mecanismo b) (Marcomini y col., 2000a, 2000b). Por
el contrario, en condiciones anaerobias, la ruptura del grupo terminal etoxi parece ser la
fase inicial del ataque microbiano (mecanismo c; Huber et al., 2000).
Numerosos son los estudios que se han encontrado en la bibliografa en relacin a

la biodegradabilidad primaria y final de los AE en el medio acutico. No obstante, la
mayora de estos estudios emplean como medio de ensayo agua continental o bien un
medio mineral. De manera general, los alcoholes etoxilados son considerados fcilmente
biodegradables bajo condiciones aerobias y anaerobias (Ying, 2006), alcanzando altos
porcentajes de biodegradacin primaria en unidades de lodos activos y otros ambientes
acuticos, aunque su mineralizacin presenta valores significativamente ms bajos
(Reynolds y col., 1997). En las Tablas VI.1 y VI.2 se recogen algunos de los resultados de
mineralizacin de los alcoholes etoxilados, tanto lineales como ramificados, encontrados en
la bibliografa.
VI-5
Captulo 6
Tabla VI.1. Resumen de los datos de biodegradacin final o mineralizacin de alcoholes

etoxilados lineales (Madsen y col., 2001).
Compuesto Tipo de ensayo Resultado Referencia

C9-11 EO8 Frasco cerrado, 28 d 80% DTO Madsen y col., 1994
C16-18 EO5 Frasco cerrado, 28 d 65-75% DTO Schberl y col., 1988
C16-18 EO30 Frasco cerrado, 28 d 27% DTO
C12-18 EO10-14 Frasco cerrado, 28 d 69-86% DTO
C12-15 EO7 BOD, 30 d 92% DTO Kravetz y col., 1991
C14-15 EO7 BOD, 30 d 83% DTO
C12-15 EO7 Evolucin CO2, 28 d 82% DTCO2 Madsen y col., 1996
C12-15 EO9 Evolucin CO2, 28 d 64-79% DTCO2 Kravetz y col., 1991
C12-14 EO7-8 Ensayo de agua de ro, 28 d 100% COD Kaluza y Taeger, 1996
C13 EO7-8 Ensayo de agua de ro, 28 d 100% COD
C13-15 EO7-8 Ensayo de agua de ro, 28 d 100% COD
C15 EO7-8 Ensayo de agua de ro, 28 d 100% COD
*DTO= demanda terica de oxgeno; DTCO2=demanda terica de dixido de carbono; COD= carbono orgnico
disuelto
Tabla VI.2. Resumen de los datos de biodegradacin final o mineralizacin de alcoholes

etoxilados ramificados (Madsen y col., 2001).
Compuesto Tipo de ensayo Resultado Referencia

Oxo-C13-15 EO3-12 Ensayo OECD, 28 d 75% COD Schberl y col., 1988
C10-14 EO7 (tomo de C cuaternario) BOD, 30 d 40% DTO Kravetz y col., 1991
Oxo-C12 EO5 Evolucin CO2, 28 d > 60% DTCO2 Marcomini y col., 2000a
C11-15 EO7 (tomo de C cuaternario) Evolucin CO2, 28 d 40-50% DTO Kravetz y col., 1991
Iso-C10 EO7-8 Ensayo de agua de ro, 28 d 90% COD Kaluza y Taeger, 1996
Oxo-C11 EO7-8 Ensayo de agua de ro, 28 d 100% COD
Iso-C13 EO7-8 (3 grupos CH3) Ensayo de agua de ro, 28 d 100% COD
Iso-C13 EO7-8 (4 grupos CH3) Ensayo de agua de ro, 28 d 62% COD
C13 EO7-8 (10% ramificacin) Ensayo de agua de ro, 28 d 95% COD
C13 EO7-8 (25% ramificacin) Ensayo de agua de ro, 28 d 95% COD
C13 EO7-8(46% ramificacin) Ensayo de agua de ro, 28 d 50% COD
Oxo-C13-15 EO7-8 Ensayo de agua de ro, 28 d 100% COD
Oxo-C14-15 EO9-20 Ensayo de agua de ro, 28 d 65-75% COD Schberl y col., 1988
C15 EO7-8 Ensayo de agua de ro, 28 d 100% COD Kaluza y Taeger, 1996
DTO= demanda terica de oxgeno, DTCO2=demanda terica de dixido de carbono; COD= carbono orgnico
disuelto
VI-6
La biodegradabilidad de los AE depende principalmente de la estructura de la

cadena alqulica y, en menor medida, de su longitud as como del nmero de unidades
etoxiladas presentes en la molcula (Dorn y col., 1993). De manera general, los alcoholes
grasos lineales presentan un mayor grado de biodegradabilidad que los alcoholes
ramificados (Tabla VI.1, Tabla VI.2).
En el caso de alcoholes etoxilados ramificados, uno de los principales factores que

afectan a la biodegradabilidad de estos compuestos es el nmero de ramificaciones
presentes en la cadena alqulica. Kaluza y Taegar (1996), usando alcoholes etoxilados
ramificados de similar nmero de tomos de carbono en la cadena alqulica pero con
diferente grado de ramificacin (C13 EO7-8), encontraron porcentajes de mineralizacin
menores para aquellos que presentaban mayor grado de ramificacin (Tabla VI.2). Tambin
observaron una disminucin de la biodegradabilidad de los AE ramificados (Iso-C13 EO7-8)
a medida que aumentaba el nmero de grupos metilos en la cadena alqulica. Por otro lado,
la ramificacin de la cadena alqulica no slo se ha demostrado afectar a la extensin de la
biodegradacin sino tambin a su velocidad, siendo ms lenta cuanto mayor es el grado de
ramificacin (Holt y col., 1992; Balson y Felix, 1995).
Tambin se ha demostrado que la presencia de tomos de carbono cuaternarios en

la molcula afecta negativamente a la biodegradabilidad de estos tensioactivos. As, por
ejemplo, estudios realizados por Kravetz y col. (1991) encontraron porcentajes de
mineralizacin muy bajos (40-50%) para los alcoholes etoxilados que presentan tomos de
carbono cuaternarios en la cadena alqulica en comparacin con otros alcoholes etoxilados
ramificados (Tabla VI.2).
En lo que respecta a la longitud de la cadena etoxilada, sta influye en la

hidrofobicidad del AE influyendo as en la biodegradabilidad en trminos de
biodisponibilidad. As, a medida que aumenta la longitud de la cadena etoxilada disminuye
la biodisponibilidad del tensioactivo como consecuencia de un descenso de la
hidrofobicidad y un aumento del tamao molecular, limitando el transporte de la molcula a
travs de la pared celular (Balson y Felix, 1995). En aquellos alcoholes etoxilados
compuestos por ms de 20 unidades etoxiladas, se ha observado una disminucin de su
velocidad de degradacin (Scharer y col., 1979; Holt y col., 1992), mientras que en aquellos
con ms de 50 unidades etoxiladas se ha encontrado un aumento del porcentaje de
biodegradacin primaria (Birch, 1984).
Toxicidad de los alcoholes etoxilados en el medio acutico
La evaluacin de la toxicidad, tanto aguda como crnica, de los alcoholes

etoxilados ha sido objeto de estudio de diversos autores. Existe una amplia bibliografa
acerca de la toxicidad de estos compuestos sobre diferentes grupos taxonmicos: bacterias,
VI-7
Captulo 6
algas, insectos, moluscos, crustceos, peces y plantas acuticas. No obstante, cabe destacar
que la mayora de estos estudios se han llevado a cabo sobre especies de agua dulce, siendo,
por lo tanto, bastante limitada la bibliografa existente en relacin a la toxicidad de estos
tensioactivos sobre especies marinas.
El mecanismo de toxicidad de los AE consiste en una narcosis de tipo no polar,

caracterizado por la interaccin entre el tensioactivo y las membranas biolgicas de los
organismos (Roberts, 1991; Boeije y col., 2006). Sin embargo, el efecto txico de estos
contaminantes est claramente relacionado con su hidrofobicidad. En general, los
homlogos de AE de mayor cadena alqulica y, por tanto ms hidrfobos, pueden penetrar
en la pared celular con mayor eficiencia, siendo, por lo tanto, ms txicos (Boeije y col.,
2006). Sin embargo, estos homlogos deben de ser, a su vez, lo suficientemente solubles
para permitir entrar en contacto con el organismo (biodisponibilidad). As, por ejemplo, en
el caso de alcoholes etoxilados con cadena alqulica igual o superior a 15 tomos de
carbono, para los cuales cabe esperar una toxicidad elevada, sta disminuye como
consecuencia de su baja solubilidad (SIAR, 2006).
Los datos recogidos en la bibliografa en torno a la toxicidad de los AE, tanto

lineales como ramificados, sobre organismos acuticos, en general, presentan una elevada
variabilidad inter- e intra-especifica (Tablas VI.3 y VI.4). Van de Plassche y col. (1999)
establecieron que esta elevada variabilidad puede ser debido a la heterogeneidad que
presentan la mayora de las formulaciones de los AE de uso comercial, las cuales suelen
estar constituidos por mezclas de varias longitudes de cadena alqulica y nmero de
unidades etoxiladas. Otra posible fuente de variabilidad en los datos de toxicidad radica en
la presencia de un 2-5 % de alcohol no etoxilado y entre un 0,5 y 2 % de polietilenglicol en
muchas de las formulaciones comerciales (Van de Plassche y col., 1999). Otros autores
defienden que estas diferencias tambin pueden deberse a las diferentes condiciones usadas
en los ensayos (HERA, 2007).
En general, los valores de toxicidad (EC50) de los AE sobre microalgas varan

entre 0,05 y 50 mg L-1, mientras que para el caso de invertebrados los valores de efectos
txicos agudos (EC50) suelen estar comprendidos entre 0,1 y >100 mg L-1, para AE lineales
y, entre 0,5 y 50 mg L-1, para el caso de AE ramificados (D. EPA, 2001). Asimismo, Lewis
y Suprenant (1983), para el caso de invertebrados, obtuvieron para un mismo alcohol
etoxilado valores de toxicidad (LC50, 48-h) comprendidos entre 0,29 y 270 mg L-1,
dependiendo de la especie ensayada.
VI-8
Tabla VI.3. Resumen de datos de toxicidad aguda (EC50) de alcoholes etoxilados lineales
y ramificados sobre microalgas.
EC50
Especie AE Periodo Referencia
(mg L-1)
Selenastrum capricornutum C12-14 EO4 2-4 48 h Yamane y col., 1984
C12-14 EO9 4-8 48 h
C12-14 EO13 10 48 h
C12-15 EO9 0,7 96 h Dorn y col., 1993
C13 EO7 7,5 96 h
C11-15 EO7 10,0 96 h
C12-15 EO7 0,85 72 h Madsen y col., 1996
Scenedesmus subspicatus C14-15 EO6 0,09 96 h Lewis y Hamm, 1986
C13 EO7-8 0,5 72 h Kaluza y Taeger, 1996
C15 EO7-8 0,05 72 h
C12-14 EO7 0,5 72 h
Iso-C10 EO7-8 50 72 h
Iso-C13 EO7-8 5 72 h
C13-15 EO7-8 0,5 72 h
Oxo-C13-15 EO7-8 0,5 72 h
Microcystis aeruginosa C12-14 EO9 10-50 72 h Yamane y col., 1984
C14-15 EO6 0,60 96 h Lewis y Hamm, 1986
Nitzschia fonticola C12-14 EO9 5-10 48 h Yamane y col., 1984
Navicula pelliculosa C14-15 EO6 0,28 96 h Lewis y Hamm, 1986
Estudios realizados por Yamane y col. (1984) sobre la microalga S. capricornutum

y AE lineales de igual longitud de cadena alqulica (C12-14) mostraron que la toxicidad de
los alcoholes etoxilados lineales disminuye a medida que aumenta el numero de unidades
etoxiladas (Tabla VI.3). En el caso de crustceos, este hecho ha sido puesto de manifiesto
en los ensayos realizados por Maki y Bishop (1979) y posteriormente Wong y col. (1997)
sobre la especie D. magna (Tabla VI.4).
Por otro lado, Kaluza y Taeger (1996), en ensayo de toxicidad con S. subspicatus
obtuvieron valores de EC50 de 0,5 y 0,05 mg L-1 para los tensioactivos C13 EO7-8 y C15 EO7-
8, lo cual supone un aumento de la toxicidad a medida que aumenta la longitud de la cadena
hidrocarbonada (Tabla VI.3). Sin embargo, para el crustceo D. magna estos autores
(Kaluza y Taeger, 1996) no observaron diferencias significativas en los efectos adversos
producidos por ambos tensioactivos (Tabla VI.4). En el caso de alcoholes etoxilados
ramificados tambin se ha observado un incremento de la toxicidad sobre microalgas al
aumentar el nmero de tomos de carbono de la cadena hidrocarbonada (Kaluza y Taeger,
VI-9
Captulo 6
1996). Estudios llevado a cabo por la Agencia de Proteccin Ambiental de Dinamarca (D.
EPA, 2001) mostraron que un aumento en el grado de ramificacin de la cadena alqulica
de los AE provoca una disminucin de la toxicidad de estos tensioactivos tanto en
microalgas como en invertebrados acuticos.
Tabla VI.4. Resumen de datos de toxicidad aguda (LC50/EC50 a las 48 horas) de alcoholes
etoxilados lineales y ramificados sobre invertebrados.
EC50 (48-h)
Especie AE Referencia
(mg L-1)
Mysidopsis bahia C10 EO4 5,6 Hall y col., 1989
C13 EO10 2,2
Daphnia magna C12-13 EO5 0,46 Wong y col., 1997
C12-13 EO4.5-6 0,59
C12-13 EO6.5 0,74
C14-15 EO13 1,2
C15 EO7-8 0,5 Kaluza y Taeger, 1996
C12-14 EO7-8 0,5
C13 EO7-8 0,5
C13-15 EO7-8 0,5
C12-15 EO7 1,0-2,0 Madsen y col., 1996
C12-15 EO9 1,3 Dorn y col., 1993
C14-15 EO7 0,29-0,4 Lewis y Perry, 1981
C14 EO1 0,83 Maki y Bishop, 1979
C14 EO2 1,53
C14 EO3 0,73
C14 EO4 1,76
C14 EO6 4,17
C14 EO9 10,07
C16-18 EO18 20 Talmage, 1994
C16-18 EO30 18
Daphnia pulex C12-15 EO7 0,76 Salanitro y col., 1988
C14 EO1 0,10 Maki y Bishop, 1979
C14 EO4 0,21
Paratanytarus
C14-15 EO7 23 Lewis y Suprenant, 1983
parthenogenica
Gammarus sp. C14-15 EO7 3,3
Asellus sp. C14-15 EO7 270
VI-10
2. Materiales
A continuacin se detallan las principales caractersticas del tensioactivo as como

del medio de ensayo empleado en los estudios de biodegradacin y ecotoxicidad.
El tensioactivo no-inico ensayado fue un alcohol etoxilado conocido

comercialmente como Findet1214N/23 y suministrado por Kao Corporation, S. A.
(Barcelona). El tensioactivo consiste en una mezcla de homlogos de cadena alqulica
lineal de entre 12 y 14 tomos de carbono, en una proporcin aproximada de 70% y 30%,
respectivamente, y un valor medio de 11 unidades etoxiladas. Posee una pureza aproximada
del 100 %, una densidad de 1,007 g cm-3 y una elevada solubilidad en agua. El peso
molecular medio estimado es de 630 g mol-1 (Sabahi, 2004).
Medio de ensayo
El medio de ensayo empleado en los ensayos de biodegradacin y toxicidad del

alcohol etoxilado fue el mismo que el utilizado en los ensayos con el tensioactivo alquil
etoxisulfato (captulo 5). No obstante, al objeto de facilitar la lectura del presente trabajo se
resumen las principales caractersticas fsico-qumicas y biolgicas del agua de mar
empleada en los ensayos de biodegradacin y toxicidad (Tabla VI.5).
Tabla VI.5. Caractersticas del agua de mar empleada en los ensayos de biodegradacin y
toxicidad del tensioactivo no-inico Findet1214N/23.

-1 -
Oxgeno disuelto % saturacin 92,7 1,8 Nitrato mg L NO3 0,033 0,009
pH - 8,14 0,04 Silicato mg L-1 Si 0,021 0,003
Carbono total mg L-1 C 26,9 0,5 Clorofila a mg m-3 Cl a 0,73 0,12
Carbono inorgnico mg L-1 C 26,4 0,5 Estreptococos fecales UFC100mL-1 No detectado
-1
Carbono orgnico mg L C 0,50 0,01 Coliformes fecales UFC100mL-1 No detectado
Nitrito mg L-1 NO2- < 0,015 Enterococos UFC100mL-1 No detectado
VI-11
Captulo 6
En el siguiente apartado se exponen los resultados obtenidos en los ensayos de

biodegradacin, de toxicidad con microalgas y crustceos marinos y en los ensayos
combinados de toxicidad durante el experimento de biodegradacin.
Al objeto de comprobar que durante el ensayo se daban unas condiciones no

limitantes para la proliferacin y desarrollo de las poblaciones bacterianas originarias, se
llev a cabo un control de los parmetros fsico-qumicos pH, oxgeno disuelto y
temperatura en los ensayos de biodegradacin, referencia, abitico y control.
En la Figura VI.3 se recogen la evolucin del pH y oxgeno disuelto en los

ensayos de biodegradacin y en el control.
8,4 100
8,2 80
O2 (%saturacin)
8,0 60
pH
7,8 40
CO4 CO4
7,6 AE1 20 AE1
AE2 AE2
AE3 AE3
7,4 0
0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120
Figura VI.3. Evolucin del pH y oxgeno disuelto en el ensayo control (CO4) y los ensayos
de biodegradacin con AE (AE1, AE2 y AE3).
Se puede apreciar como los valores de pH se mantienen prcticamente constantes a

lo largo del experimento tanto en los ensayos de biodegradacin como en el ensayo control,
alcanzando valores medios similares (valor medio DE) de 8,03 0,1 y 8,05 0,1,
respectivamente. Por otro lado, se observa que los valores de oxgeno disuelto en los
ensayos de biodegradacin y el control se encuentran, de manera general, por encima de un
80% de saturacin, mostrando porcentajes medios de 87,76 0,26% y 87,9 3,2%,
respectivamente.
VI-12
En el caso de la temperatura, los valores medios registrados durante el

experimento fueron de 19,9 0,15 C y 19,8 0,4 C, para los ensayos de biodegradacin
y control, respectivamente. Respecto al ensayo de referencia (benzoato sdico), los valores
de pH, temperatura y oxgeno disuelto estuvieron comprendidos entre 8,00 0,1; 20,5
0,05 C y 85,5 13,97 % de saturacin, respectivamente.
Los resultados obtenidos en este apartado indican claramente que el experimento

de biodegradacin del tensioactivo no-inico Findet1214N/23 se llev a cabo bajo
condiciones experimentales no limitantes para el desarrollo ptimo de la microbiota
responsable de la actividad degradativa.
La evolucin del carbono orgnico disuelto (COD) en los ensayos control, referencia
(benzoato sdico) y abitico (Findet1214N/23 + HgCl2) se representa grficamente en la
Figura VI.4.
20
15
10
REF4
AB4
CO4
5
0
0 20 40 60 80 100 120
Tiempo (d)
Figura VI.4. Evolucin del carbono orgnico disuelto en los ensayos control (CO4),
referencia (REF4) y abitico (AB4) a lo largo del proceso de
biodegradacin.
Se puede apreciar como en el caso del ensayo control y abitico, la concentracin

de COD permanece prcticamente constante a lo largo del experimento, alcanzando valores
medios de 0,72 0,3 y 16,27 0,6 mg L-1 COD (valor medio DE), respectivamente. En
el caso del ensayo abitico, estos valores suponen una mineralizacin del tensioactivo del
VI-13
Captulo 6
2,3 2,5%, lo que viene a indicar que la aportacin de procesos no biolgicos en la

eliminacin del tensioactivo no inico Findet1214N/23 es prcticamente despreciable.
En el caso del ensayo de referencia, cabe destacar que se emplearon los resultados
obtenidos para el tensioactivo alquil etoxisulfato (captulo 5), dado que las muestras de
agua de mar fueron tomadas al mismo tiempo y en el mismo lugar. Al objeto de facilitar la
lectura del presente captulo se han representado los datos en la Figura VI.4, observndose
porcentajes de biodegradacin superiores al 50% y 90% al cabo de 6 y 9 das de ensayo,
respectivamente. Tal y como se coment en el captulo anterior, estos valores indican que la
poblacin microbiana presente en el medio de ensayo presenta una actividad dentro de la
normalidad.
En la Figura VI.5 se representan los valores de concentracin de Findet1214N/23

-1
(mg L COD) a lo largo del proceso de mineralizacin para los tres ensayos de
biodegradacin realizados. Los puntos indican los valores medios experimentales, mientras
que las barras de error denotan la desviacin estndar (n=3).
-1
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0 20 40 60 80 100 120
Tiempo (d)
Figura VI.5. Evolucin de la concentracin residual de Findet1214N/23 (mg COD L-1) en

los ensayos de biodegradacin. La lnea continua corresponde al ajuste de los
valores experimentales a un modelo cintico de orden cero.
En la Figura VI.5, se observa una disminucin de la concentracin de carbono

orgnico disuelto (COD) a lo largo del experimento, alcanzando valores medios de COD de
11,5, 7,5 y 0,81 mg L-1 al cabo de 22, 60 y 108 das de ensayo, respectivamente, esto es,
porcentajes de mineralizacin del 25, 55 y 90%. Atendiendo a los criterios establecido en la
VI-14
directriz OPPTS 835.3160 Biodegradabilidad en agua de mar (USEPA, 1998), los valores
obtenidos en el presente experimento (eliminacin de COD inferior al 70 % al cabo de 60
das de ensayo) no descartan la existencia de un potencial para la mineralizacin de estos
compuestos en el medio ambiente marino, aunque sugieren la realizacin de nuevos
experimentos de biodegradacin (por ejemplo, empleando concentraciones ms prximas a
las ambientales) para corroborar esta hiptesis. Sin embargo, los altos niveles de
biodegradacin alcanzados en el medio, hacen pensar que realmente existe un potencial
para la degradacin de estos tensioactivos, aunque a una baja velocidad de degradacin.
Otro de los aspectos importantes que se desprende de la Figura VI.5 es la ausencia

de una fase de adaptacin o induccin por parte de los microorganismos responsables del
proceso biodegradativo a la nueva fuente de carbono. Esto puede ser debido a que, dado
que se trata de un alcohol etoxilado de cadena alqulica lineal, las enzimas que intervienen
en el mecanismo de degradacin son fundamentalmente de tipo hidrolticas (mecanismo a,
Figura VI.2), las cuales podran ser ms frecuentes en el sistema enzimtico de la
microbiota natural o bien ser sintetizadas rpidamente (Manzano y col., 1998).
Modelizacin cintica
Siguiendo el planteamiento seguido en los anteriores captulos, se ha modelizado

la cintica de mineralizacin del tensioactivo Findet1214N/23 en los tres ensayos de
biodegradacin, empleando diversos modelos cinticos de consumo de sustrato recogidos
en la bibliografa (Simkins y Alexander, 1984; Quiroga y col., 1999). Los parmetros
cinticos y estadsticos calculados para cada uno de los modelos estudiados se recogen en la
Tabla VI.6.
En primer lugar se comprueba que todos los modelos estudiados presentan un buen
ajuste, si bien en el caso del modelo de primer orden se obtiene un valor del coeficiente de
determinacin ligeramente inferior (R2= 0,9186). Sin embargo, un estudio ms detallado de
los valores de los parmetros cinticos obtenidos demuestra que slo en el caso de los
modelos cinticos de orden cero, primer orden y logstico, se obtiene parmetros con
valores coherentes de S0 (concentracin inicial de substrato). As, por ejemplo, en el caso
del modelo de Quiroga, Sales y Romero (Q-S-R), se obtiene un valor negativo de
concentracin de substrato no biodegradable (Snb), mientras que el valor de la
concentracin inicial estimada (S0) es muy superior a la concentracin real ensayada. En el
caso del modelo logstico, a pesar de obtener una buena correlacin con los datos
experimentales y un valor coherente de S0, el valor calculado de B0 (cantidad de sustrato
necesaria para producir la concentracin inicial de sustrato) resulta injustificablemente alto
en comparacin con los obtenidos por otros autores (Perales y col., 2001). Estos resultados
parecen razonables ya que dichos modelos contemplan una fase de latencia o aclimatacin,
la cual no ha sido observada en nuestro estudio.
VI-15
Captulo 6
Al objeto de seleccionar cual de los dos modelos restantes (orden cero o primer
orden) es el ms apropiado para describir la cintica de mineralizacin del tensioactivo se
recurre al anlisis de la chi-cuadrada (2). Si atendemos a los valores obtenidos para el
parmetro estadstico Q (probabilidad de que la chi-cuadrado exceda al azar un
determinado valor 2 terico) se observa que en el caso del modelo de orden cero el valor
de Q se encuentra ms prximo a la unidad, lo que viene a indicar que las posibles
variaciones entre los valores experimentales y los obtenidos por el modelo pueden estar
debidos a fluctuaciones experimentales y no a una falta de ajuste de los datos
experimentales al modelo. Se puede concluir, por tanto, que el modelo cintico que mejor
describe la mineralizacin del tensioactivo no-inico AE en el medio marino y bajo las
condiciones ensayadas es el modelo de orden cero. En la Figura VI.5 se representa
mediante una lnea continua los valores obtenidos al ajustar los valores experimentales al
modelo cintico de orden cero.
Tabla VI.6. Parmetros cinticos y estadsticos correspondientes a los resultados de

biodegradacin de AE en agua de mar.
Modelo Parmetro cintico Valor a
R2 2 Q
Orden cero S0 (mg COD L )-1
14,48 1,92
(Simkins y 0,94 55,37 50 0,279
Alexander, 1984) K0 (mg COD L-1 d-1) 0,12 0,03
Primer-orden S0 (mg COD L-1) 15,76 2,95
(Simkins y -1
0,92 152,81 50 2,4E-12
Alexander, 1984) K1 (d ) 0,016 0,06

(Simkins y B0 (mg COD L-1) 3,66 0,94 0,94 67,16 49 0,043
Alexander, 1984) -1 -1
KLg (mg COD L d ) 0,002 0,002
S0 (mg COD L-1) 46,33 415
Q-S-R Sto (mg COD L-1) 23,03 72,06
(Quiroga y col., 0,94 860,85 48 1,8E-149
1999) Snb (mg COD L-1) -3,23 37,41
max (d-1) 0,022 0,101
a
El tiempo de latencia (tL), t50 (el tiempo necesario para alcanzar un 50% de
biodegradacin, sin considerar el tiempo de latencia), y el tiempo de vida media (t1/2) se
calcularon a partir de la ecuacin integrada del modelo cintico de orden cero (vase
captulo 1). Los valores obtenidos fueron 11,5, 43,5 y 56,8 das, respectivamente. Cabe
destacar que aunque desde un punto de vista cualitativo en la Figura VI.5 no se observa una
fase inicial de aclimatacin o latencia, con fines comparativos frente a otros tensioactivos,
VI-16
se ha tomado como valor del tiempo de latencia, el periodo transcurrido hasta lanzar una
degradacin del 10%, si bien este valor es tan elevado (11,5 das) debido a la lentitud del
proceso.
Lechuga (2005), empleando un medio mineralizado inoculado con

microorganismos procedente de una EDAR, encontr un elevado grado de biodegradacin
primaria (>80%) y velocidad de degradacin (t1/2 entre 19,7 y 30,7 horas) para el mismo
tensioactivo que en el presente estudio (Findet1214N/23, C12EO11) y utilizando
concentraciones iniciales comprendida entre 5 y 50 mg L-1. Por el contrario, estudios
llevados a cabo por Kravetz y col. (2001) mostraron velocidades de mineralizacin muy
inferiores para el tensioactivo C12EO9 y el mismo medio de ensayo (inculo procedente de
una unidad de lodos activos). Dependiendo de si el inoculo estaba previamente aclimatado
o no al tensioactivo, estos autores, empleando una concentracin inicial de 10-20 mg C L-1,
obtuvieron valores de mineralizacin superiores al 80% al cabo de 30 das de ensayo
(inculo aclimatado) y comprendidos entre un 64 y 79% al cabo de 28 das (inculo sin
aclimatar). Estos valores resultan similares a los obtenidos por Madsen (1996) en una
unidad de lodos activos y en el efluente secundario de una EDAR. As, para el tensioactivo
C12-15EO7 y en la unidad de lodos activos, obtuvo una mineralizacin del 82% al cabo de 28
das mientras en el efluente el porcentaje de mineralizacin alcanzado para el mismo
tensioactivo fue del 60% al cabo de 28 das. En el caso de agua de ro, tambin se ha puesto
de manifiesto una elevada biodegradabilidad de estos compuestos, con velocidades de
biodegradacin comparables a los obtenidos en medios minerales inoculados. As, por
ejemplo, Kaluza y Taeger (1996), en ensayos de biodegradacin realizados en agua de ro y
empleando una concentracin inicial superior a 10 mg L-1, obtuvo una completa
mineralizacin del tensioactivo C12-14EO7-8 al cabo de 28 das de ensayos.
La comparacin de estos datos con los obtenidos en el presente captulo (90%

mineralizacin en 108 das, tiempo de vida media= 56,8 das) parecen indicar que el medio
de ensayo juega un papel fundamental en la velocidad de degradacin de los AE, siendo
sta muy inferior en el medio marino. Diversos estudios tambin han puesto de manifiesto
la menor velocidad de degradacin de diferentes compuestos en el medio acutico marino
en comparacin con medios de agua dulce. As, por ejemplo, Perales y col. (2007),
obtuvieron una menor biodegradacin primaria del tensioactivo aninico lineal alquil
benceno sulfonatos (LAS) en agua de mar que en agua de ro bajo las mismas condiciones
experimentales. Jeong-Hun y Fusao (2005) mostraron tambin diferencias significativas en
la velocidad de degradacin del compuesto fenlico bisfenol A, siendo menor en agua de
mar. Resultados similares se han obtenido para otras sustancias qumicas tales como la
benzo(a)pirina (Kot-Wasik y col., 2004) y el homopolmero (poli-3-hidroxibutirato)
(Kasuya y col., 1998).
VI-17
Captulo 6
En la Figura VI.6 se muestra la evolucin temporal de la concentracin neta de

exposicin de Findet1214N/23 en los ensayos estndar de toxicidad con microalgas.
Como puede observarse en dicha figura, los cultivos de microalgas respondieron

de manera diferente a la presencia del tensioactivo Findet1214N/23. De manera general,
se aprecia una disminucin de la biomasa de microalgas con respecto al ensayo control a
medida que aumenta la concentracin de tensioactivo. As, la microalga D. salina
experimenta efectos sobre el crecimiento a concentraciones superiores a 12 mg L-1,
mientras que T. chuii e I. galbana muestran diferencias significativas con respecto al
ensayo control a concentraciones superiores de 8 mg L-1. Por el contrario, se puede
observar como el tensioactivo tiene un mayor efecto txico sobre las microalgas N.
gaditana y C. gracilis, para las cuales se observan efectos inhibitorios sobre el crecimiento
a concentraciones iguales o superiores a 4 y 6 mg L-1, respectivamente. Por otro lado, se
puede observar que en el caso de las microalgas I. galbana, C. gracilis y D. salina se
obtienen valores de DOn (690 nm) negativos a concentraciones superiores a 10 y 14 mg L-1,
respectivamente, lo indica no slo efectos inhibitorios sino letales sobre estos cultivos de
microalgas. Sin embargo, podemos apreciar como I. galbana y C. gracilis despus de un
periodo de 48-h experimentan una recuperacin del cultivo para los ensayos realizados con
10 y 6 mg L-1 de tensioactivo, respectivamente.
VI-18
1,0 1,2
0,8 2 1,0 2
4 4
6 0,8 6
DOn (690 nm)
DOn (690 nm)

0,6 8 8
10 mg L-1 0,6 10 mg L-1
0,4
0,4
0,2
0,2
0,0 0,0
-0,2 -0,2
0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100
0,4
0 C. gracilis
0,3 2
4
6
DOn (690 nm)
0,2 8
10 mg L-1
0,1
0,0
-0,1
-0,2
0 20 40 60 80 100
Tiempo (h)
2,5 1,4
0 D. salina T. chuii
0
4 1,2 4
2,0
8 8
10 1,0 16
DOn (690 nm)
DOn (690 nm)
1,5 12 28
0,8
14 mg L-1 36 mg L-1
1,0 0,6
0,4
0,5
0,2
0,0
0,0
-0,5 -0,2
0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100
Figura VI.6. Evolucin de la concentracin de biomasa normalizada en el ensayo estndar.

Las barras de error denotan las desviaciones estndares (n=3)
VI-19
Captulo 6
En la Tabla VI.7 se recogen los valores de las concentraciones de inhibicin del

crecimiento (IC50), NOEC y LOEC para cada una de las microalgas ensayadas y un periodo
de exposicin de 96 horas.
Tabla VI.7. Valores de IC50, NOEC y LOEC obtenidos en el ensayo de toxicidad estndar
con microalgas marinas y el tensioactivo Findet1214N/23.

N. gaditana 96-h IC50 5,84 (5,52-6,19)a
96-h NOEC 2,0b
96-h LOEC 4,0b
I. galbana 96-h IC50 9,08 (8,69-9,42)a
96-h NOEC 6,0b
96-h LOEC 8,0b
C. gracilis 96-h IC50 5,00 (4,70-5,42)a
96-h NOEC 4,0b
96-h LOEC 6,0b
D. salina 96-h IC50 11,58 (8,84-13,42)a
96-h NOEC 10,0b
96-h LOEC 12,0b
T. chuii 96-h IC50 35,03 (33,16-36,44)a
96-h NOEC 4,0b
96-h LOEC 8,0b
a
b
A la vista de los valores mostrados en la Tabla VI.7, se puede comprobar la

existencia de distintas sensibilidades hacia el tensioactivo no-inico Findet1214N/23 por
las distintas especies de microalgas. As, se puede observar como las especies N. gaditana y
C. gracilis resultan especialmente sensibles a la presencia del agente de superficie, con
valores similares de IC50. Por el contrario, I. galbana y D. salina presentan una toxicidad
ligeramente menor que las microalgas anteriores. Finalmente, la microalga T. chuii presenta
una resistencia mucho mayor que el resto. Sin embargo, atendiendo a los valores de
concentracin de no efecto (NOEC), podemos observar como el rango de sensibilidades
vara ligeramente. As, N. gaditana resulta la especie con una menor concentracin de no
efecto; le sigue C. gracilis y T. chuii, ambas mostrando valores similares de NOEC. Por el
contrario, el crecimiento de las microalgas I. galbana y D. salina se ve afectado a mayores
concentraciones de tensioactivos que el resto.
VI-20
No se han encontrado referencias bibliogrficas relativas a la toxicidad del

tensioactivo Findet1214N/23 y, en general, de los alcoholes etoxilados sobre especies de
microalgas marinas. Respecto a especies de agua dulce, se han encontrado datos de
toxicidad relativas a otros alcoholes etoxilados, algunos con semejantes longitud de cadena
alqulica y nmero de unidades etoxiladas que el tensioactivo estudiado. Comparando los
valores obtenidos en el presente trabajo con los encontrados para otros alcoholes etoxilados
de semejante estructura qumica, los datos resultan del mismo orden de magnitud a los
obtenidos con otras especies de agua dulce. As, por ejemplo, Yamane y col. (1984)
encontraron valores de EC50 de 4-8, 5-10 y 10-50 mg L-1 C12-14EO9 para las microalgas de
agua dulce S. capricornutum, N. fonticola y M. aeruginosa, respectivamente. Por otro lado,
estudios de toxicidad aguda del alcohol etoxilado lineal C12-15EO9 sobre Selenastrum
capricornutum describieron valores de EC50 de 7,5 mg L-1 (Dorn et al., 1993).
En este apartado se muestran los resultados de toxicidad obtenidos para el

crustceo A. franciscana expuesto a crecientes concentraciones de Findet1214N/23. La
Figura VI.8 recoge el porcentaje de supervivientes obtenidos para periodos de exposicin
de 48 y 72 horas.
100 A. franciscana
Supervivientes (%)
80
60
40
20
48h
72h
0
0 10 20 30 40
Figura VI.8. Efecto del alcohol etoxilado Findet1214N/23 sobre A. franciscana a las 48
y 72 horas de exposicin. Los datos se representan como valor medio DE
(n=5).
Se puede apreciar un drstico aumento de la mortalidad de la poblacin de

nauplios en un rango de concentraciones comprendido entre 20 y 30 mg L-1
Findet1214N/23. Cabe hacer notar que las primeras concentraciones de txico y el control
VI-21
Captulo 6
presentaron una mortalidad inferior al 15%, si bien en el ensayo control no se observ

mortalidad alguna en ninguna de las rplicas al cabo de 72 horas. Por el contrario, a
concentraciones superiores a 30 mg L-1 el efecto letal observado fue del 100% en todas las
replicas ensayadas. Por otro lado, de la Figura VI.8 se desprende que los efectos letales
observados a periodos de exposicin de 48 y 72 horas son prcticamente similares.
Los valores de los parmetros de toxicidad LC50, NOEC y LOEC calculados para
un periodo de exposicin de 48 y 72 horas se recogen en la Tabla VI.8.
Tabla VI.8. Valores de LC50, NOEC y LOEC obtenidos en el ensayo de toxicidad estndar
con crustceos y el tensioactivo Findet1214N/23.

72-h LC50 23,33 (22,52-24,13)a
48-h NOEC 20,0b
48-h LOEC 24,0b
72-h NOEC 20,0b
72-h LOEC 24,0b
a
b
Comparando estos resultados con los datos bibliogrficos (Tabla VI.4) se obtienen
valores ligeramente superiores a los obtenidos con otros crustceos marinos y alcoholes
etoxilados de semejante estructura qumica (longitud de cadena alqulica y nmero de
unidades etoxiladas). En relacin con el camarn Mysidopsis bahia, Hall y col. (1989)
determinaron un valor de EC50 (48-h) de 2,2 mg L-1 para el alcohol etoxilado C13EO10,
mientras que para C10EO4 obtuvieron un valor de de EC50 de 5,6 mg L-1. En el caso de
especies de agua dulce, los valores obtenidos en el presente estudio resultan
significativamente superiores a los encontrados en la bibliografa. As, por ejemplo, Kaluza
y Taeger (1996) determinaron valores de EC50 (48-h) para el crustceo Daphnia magna de
1,2 mg L-1 para el tensioactivo C12-15EO7-8, mientras que para el alcohol etoxilado C12-
-1
15EO7-8 fue de 1,3 mg L (Kravetz y col., 1991; Dorn y col., 1993). Por otro lado, Wong y
col. (1997), para el mismo crustceo y el alcohol etoxilado C14-15EO13 obtuvieron valores de
EC50 (48-h) de 0,5 mg L-1. No obstante, estudios realizados por Lewis y Suprenant (1983)
sobre la toxicidad de alcoholes etoxilados en diversas especies de invertebrados de agua
dulce, obtuvieron un rango de concentraciones EC50 comprendido entre 0,29 y 270 mg L-1,
lo que viene a indicar la gran variabilidad inter-especfica que presentan estos tensioactivos.
VI-22
Respecto a las concentraciones de no efecto (NOEC), esto es, la mxima

concentracin que no provoca un efecto observable, en nuestro caso inhibicin del
crecimiento y mortalidad, se puede apreciar que los valores calculados en el presente
estudio, tanto para las microalgas como para el crustceo marino (NOEC= 2-20 mg L-1),
resultan 3-4 rdenes de magnitud superior a las concentraciones ambientales encontradas en
la bibliografa (<40 g L-1 en efluentes de EDARs y <4 g L-1 en ros). Atendiendo a estos
resultados, podemos concluir que las concentraciones de alcoholes etoxilados presentes en
el medio acutico no plantean, en principio, un riesgo ecolgico para estos organismos. Sin
embargo, al igual que ocurre con los otros tensioactivos estudiados, son escasos los datos
disponibles, por lo que sera necesario realizar un mayor nmero estudios de toxicidad
incluyendo un mayor nmero de especies as como un programa de monitoreo costero para
poder corroborar esta suposicin.
El presente apartado tiene como objetivo el estudio de la evolucin de la toxicidad

del medio de ensayo a lo largo del proceso degradativo, con el fin de determinar si el
tensioactivo estudiado presenta una biodegradacin ambientalmente aceptable, esto es, que
durante la biodegradacin del tensioactivo se produce una detoxificacin como
consecuencia de la formacin de metabolitos menos txicos (en naturaleza y/ cantidad) al
tensioactivo original.
En la Figura VI.9 se representa la evolucin temporal de la toxicidad del medio de

ensayo (% inhibicin del crecimiento/mortalidad) y grado de mineralizacin (%) durante el
ensayo de biodegradacin del tensioactivo no-inico Findet1214N/23.
VI-23
Captulo 6
100
N. gaditana 100 100 I. galbana 100

Biodegradacin (%)
Biodegradacin (%)
80 80 80 80
60 60 60 60
40 40 40 40
IC, 96-h (%) IC, 96-h (%)
20 20 20 20
0 0 0 0
0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100


Biodegradacin (%)
Biodegradacin (%)
80 80 80 80
60 60 60 60
40 40 40 40
IC, 96-h (%) IC, 96-h (%)
20 20 20 20
0 0 0 0
0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100

Biodegradacin (%)
Biodegradacin (%)
80 80 80 80
60 60 60 60
40 40 40 40
IC, 96-h (%) LC,72-h (%)
20 20 20 20
0 0 0 0
0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100
Figura VI.9. Evolucin del efecto txico del medio de ensayo (%) y porcentaje de
mineralizacin (%) durante el experimento de biodegradacin de
Findet1214N/23.
Observando los resultados mostrados en la Figura VI.9, se puede apreciar como

durante la mineralizacin del tensioactivo ensayado tiene lugar una clara detoxificacin del
medio de ensayo (caso a, ver captulo 3, apartado 3.3). As, en el caso de las microalgas N.
VI-24
gaditana e I. galbana tiene lugar una detoxificacin del medio de ensayo del 100% al cabo
de 36 das de ensayo. Por el contrario, en el caso de C. gracilis y D. salina esta disminucin
(100% detoxificacin) tiene lugar al cabo de 17 das. Respecto a la microalga T. chuii y el
crustceo A. franciscana, para los que se observaron una toxicidad inicial (0%
biodegradacin) del 20 y 70%, respectivamente, se observa tambin una completa
detoxificacin al cabo de 17 das de ensayos.
Para la mayora de las especies ensayadas se observa una completa detoxificacin

del medio cuando se ha alcanzado tan slo un 20% de mineralizacin del tensioactivo.
Como consecuencia, resulta difcil establecer un grado de sensibilidad al medio de ensayo;
si bien N. gaditana e I. galbana resultan las ms sensibles al medio de ensayo mostrando
una completa detoxificacin a porcentajes de mineralizacin iguales o superiores al 37%.
Podemos concluir, por lo tanto, que durante el proceso de mineralizacin del

tensioactivo no-inico Findet1214N/23 tiene lugar una clara detoxificacin del medio sin
formacin de metabolitos ms txicos (en cantidad y/ naturaleza) que el tensioactivo
original y por lo tanto, que el tensioactivo ensayado presenta una biodegradacin
VI-25
Captulo 6
4. Conclusiones
El tensioactivo no-inico Findet1214N/23 presenta una elevada biodegrabilidad

(porcentaje de mineralizacin superior al 90%) en el medio acutico marino bajo las
condiciones ensayadas, aunque a una velocidad de biodegradacin inferior a la
observada en aguas continentales y otros medios sintticos.
La cintica de biodegradacin final o mineralizacin del tensioactivo no-inico en agua

de mar bajo las condiciones ensayadas sigue un modelo cintico de orden cero.
La toxicidad del tensioactivo Findet1214N/23 depende significativamente del tipo de

organismo ensayado. As, de las diferentes especies de microalgas estudiadas, C.
gracilis y N. gaditana son las ms sensibles al tensioactivo, mientras que T. chuii se
muestra como la especie ms resistente. En el caso del crustceo marino A.
franciscana, a pesar de que los efectos estudiados han sido diferentes a los de las
microalgas, los valores de efecto obtenidos resultan inferiores a los obtenidos para la
microalga T. chuii, lo cual podra indicar una mayor sensibilidad al AE.
Los resultados obtenidos en los ensayos de toxicidad con microalgas y crustceos

marinos junto con los datos disponibles de niveles ambientales de AE parecen indicar
que las concentraciones de AE presentes en el medio acutico marino no suponen un
riesgo ambiental.
Las medidas de toxicidad obtenidas en los ensayos combinados de toxicidad con el

experimento de biodegradacin indican una clara detoxificacin del medio durante el
proceso de mineralizacin del tensioactivo no-inico Findet1214N/23 sin produccin
de intermediatos ms txicos (en cantidad y/ naturaleza) que el tensioactivo original.
Estos resultados permiten clasificar al tensioactivos ensayado como un compuesto de
biodegradabilidad ambientalmente aceptable.
VI-26
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VI-30
Captulo 7
ESTUDIO COMPARATIVO DE LA BIODEGRADABILIDAD Y
ECOTOXICIDAD DE LOS TENSIOACTIVOS
Resumen
En el siguiente captulo se realiza un anlisis comparativo de los resultados obtenidos en los

ensayos de biodegradacin y ecotoxicidad con los diferentes tensioactivos.
Captulo 7
1. Biodegradabilidad de los tensioactivos estudiados en el medio acutico marino
En el siguiente apartado se compara la biodegradabilidad en agua de mar de los

diferentes tensioactivos estudiados en los captulos anteriores, esto es, sal de alquil trimetil
amonio (ATMAC), nonilfenol etoxilado (NPEO), alquil etoxisulfato (AES) y alcohol
etoxilado (AE).
En la Figura VII.1A se ha representado la evolucin del porcentaje de substrato

residual (100% de biodegradacin) a lo largo del ensayo de biodegradacin para los 4
tensioactivos. Los puntos representan los porcentajes medios experimentales, mientras que
las lneas continuas representan los valores obtenidos a partir de los modelos cinticos
correspondientes.
La Figura VII.1B muestra los valores medios del tiempo de latencia (tiempo
necesario para alcanzar un 10% de biodegradacin, t10), t50 (tiempo transcurrido hasta
alcanzar un 50% de biodegradacin, sin considerar la fase de latencia) y t70 (tiempo
transcurrido hasta alcanzar un 70% de biodegradacin, considerando la fase de latencia).
100
A B
Concentracin residual (%)
100 t10
t50
80
80 t70
Tiempo (das)
ATMAC
NPEO
60
60 AES
AE
40 40
20 20
0
0
0 20 40 60 80 100 120 ATMAC NPEO AES AE
Tiempo (d)
Figura VII.1. Comparacin de los resultados obtenidos en los experimentos de

biodegradacin de los diferentes tensioactivos estudiados: (A) evolucin del
porcentaje medio de tensioactivo residual (%), (B) tiempos de latencia (t10),
t50 y t70 (ATMAC, sal de alquil trimetil amonio; NPEO, nonilfenol etoxilado;
AES, alquil etoxisulfato; AE, alcohol etoxilado).
Cabe hacer notar que los valores de t70 han sido calculados anlogamente a los
valores de t10 y t50, esto es, a partir de los modelos de mejor ajustes obtenidos en cada caso.
En el caso del AES, donde la curva de biodegradacin presenta dos etapas (A y B), se han
VII-2
Estudio comparativo
calculado los valores de t10, t50 y t70 del proceso global. As, para el clculo de t10 y t50 se ha
empleando el modelo cintico correspondiente a la etapa A (modelo de primer orden, 0-
60% biodegradacin) mientras que, para t70 se ha utilizado el modelo cintico
correspondiente a la etapa B, esto es, el modelo logstico (60-95% biodegradacin).
Se puede apreciar en la Figura VII.1A como slo el tensioactivo catinico

ATMAC presenta una fase previa de aclimatacin de los microorganismos (t10= 15,17 das,
Figura VII.1.B) mientras que para el resto de tensioactivos el proceso de biodegradacin
comienza rpidamente, mostrando bajos tiempos de latencia (t10= 3,51 das para NPEO y
3,33 das para AES, Figura VII.1.B). En el caso del tensioactivo no-inico AE, a pesar de
que en la Figura VII.1A no se observa una fase de aclimatacin, de manera cuantitativa
obtenemos un tiempo de latencia de 11,5 das (Figura VII.1B), fruto de la baja velocidad
de degradacin que presenta el tensioactivo.
Estas diferencias pueden justificarse atendiendo a la estructura qumica de los

diferentes tensioactivos, la cual determina el mecanismo del proceso biodegradativo de los
mismos. Si bien, todos los tensioactivos se caracterizan por presentar una cadena alqulica
de longitud variable (grupo hidrfobo), slo los tensioactivos NPEO, AES y AE presentan
cadena etoxilada, y son stos precisamente los que presentan unas curvas de biodegradacin
sin aclimatacin inicial (Fig. VII.1A), siendo los modelos cinticos que mejor describen
estos procesos de orden cero (AE) y primer orden (NPEO, AES). Por el contrario, el nico
tensioactivo que no presenta unidades etoxiladas en su estructura (ATMAC) es el que
presenta un modelo cintico de biodegradacin logstico con una marcada fase de latencia.
Este hecho parece indicar que cuando en el proceso de biodegradacin no se aprecia una
fase de latencia (NPEO, AES y AE), el nmero de microorganismos inicialmente presentes
en el medio con capacidad para llevar a cabo estas reacciones (hidrlisis) es mayor que
aquellos con sistemas enzimticos capacitados para realizar - oxidaciones (ATMAC).
Estos resultados estn acordes a los descritos por otros autores para diversos
tensioactivos y medios de ensayo. As, por ejemplo, Manzano y col. (1998), para un
tensioactivo NPEO, en los que la principal ruta de biodegradacin consiste en el
acortamiento hidroltico de la cadena etoxilada, encontraron tiempos de latencia
comprendidos entre 1 y 3 das en agua de ro prstina y empleando concentraciones iniciales
de tensioactivos de entre 2,5 y 10 mg L-1. Por el contrario, Perales y col. (2007), obtuvieron
valores de tiempo de latencia muy superiores (tiempo de latencia entre 6,06 y 7,27 das) en
agua de mar prstina y a una concentracin inicial de tensioactivo de 20 mg L-1.
Al objeto de analizar y comparar la velocidad del proceso de los diferentes

tensioactivos, se ha calculado el parmetro t50 (tiempo transcurrido hasta alcanzar un 50%
de biodegradacin, sin considerar la fase de latencia) para cada uno de los tensioactivos.
Atendiendo al histograma y la grfica de biodegradacin representadas en las Figuras
VII-3
Captulo 7
VII.1A y VII.1B, podemos observar como los tensioactivos DTMAC y NPEO son los que
se degradan a mayor velocidad, si bien el catinico DTMAC parece degradarse ligeramente
mas rpido (menor t50, mayor pendiente de la curva), mostrando valores de t50 de 12 y 17
das, respectivamente. Por el contrario, los tensioactivos AES y AE presentan bajas
velocidades de degradacin en el medio marino, mostrando valores de t50 de 30 y 41 das,
respectivamente.
Debido a que la directriz OPPTS 835.3160 Biodegradabilidad en agua de mar

(USEPA, 1998) establece como criterio para determinar la existencia de un potencial para
la biodegradacin de un determinado substrato en el medio ambiente marino su
biodegradacin en un porcentaje superior al 70% en un periodo de tiempo inferior a 60
das, en la Figura VII.1B se han representado los valores de tiempo estimado en alcanzar un
70% de mineralizacin, incluyendo el periodo de latencia (t70). Asimismo, se indica
mediante una lnea horizontal el valor lmite establecido por dicha directriz. Se puede
apreciar que en el caso de los tensioactivos DTMAC y NPEO existe un potencial para la
biodegradabilidad de estos tensioactivos en el medio marino. Por el contrario, los
tensioactivos AES y AE muestran valores muy superiores a este lmite, lo cual no descarta
la posibilidad de que existan un potencial para su biodegradabilidad pero se precisan
nuevos estudios, por ejemplo, empleando concentraciones de tensioactivos inferiores, para
poder afirmar que existe este potencial (USEPA, 1998). Sin embargo, si atendemos a los
resultados obtenidos en la Figura VII.1A se puede observar que a pesar de estas bajas
velocidades de biodegradacin se alcanzan altos porcentajes de biodegradacin final, lo
cual parece indicar que efectivamente existe un potencial para la biodegradabilidad de estos
tensioactivos en el medio marino.
VII-4
Estudio comparativo
2. Toxicidad aguda de los tensioactivos estudiados sobre organismos marinos
Los valores de las concentraciones de inhibicin del crecimiento (IC50, 96-h)

mortalidad (LC50, 72-h) y de no efectos observables (NOEC) para los diferentes organismos
marinos ensayados se presentan en la Figura VII.2.
Observamos como el crustceo A. franciscana presenta los valores ms bajos de

toxicidad para todos los tensioactivos, a excepcin del alcohol etoxilado (AE). A pesar de
que el efecto txico estudiado en el crustceo (mortalidad) es diferente al empleado para las
microalgas (inhibicin de crecimiento), estos resultados parecen indicar que el crustceo es,
en general, ms tolerante a estos tensioactivos que las microalgas. Por otro lado, los valores
de IC50 obtenidos muestran como, dentro del grupo de las microalgas, la especie T. chuii
parece ser la ms resistente al tensioactivo, mostrando valores de efecto superiores al resto
de las microalgas para todos los tensioactivos estudiados, a excepcin del AES donde se
obtuvieron valores similares a las microalgas N. gaditana e I. galbana.
En cuanto a la sensibilidad de los tensioactivos ensayados y a la vista de los

resultados mostrados en la Figura VII.2, no podemos afirmar que exista una especie
claramente ms sensible que el resto, pues la toxicidad vara significativamente en funcin
del tensioactivo. As, por ejemplo, la microalga D. salina es claramente ms sensible que el
resto a la exposicin del tensioactivo aninico AES, mientras que por el contrario para el
tensioactivo no-inico NPEO experimenta una toxicidad menor que N. gaditana, I. galbana
y C. gracilis. No obstante, se puede apreciar un comportamiento anlogo en las microalgas
N. gaditana, I. galbana y C. gracilis, las cuales no slo presentan el mismo orden de
sensibilidad a los tensioactivos (ATMAC > NPEO > AE > AES) sino que la relacin entre
ellos tambin es similar, siendo la toxicidad del tensioactivo AES muy inferior a los otros
tres.
Al igual que no hay un comportamiento general en cuanto a la sensibilidad de los

organismos frente a los cuatro tensioactivos estudiados, tampoco se puede realizar de forma
categrica una ordenacin de los tensioactivos acorde a su toxicidad. As, se puede apreciar
como el tensioactivo catinico ATMAC presenta un evidente mayor efecto txico que el
resto de los tensioactivos para todos los organismos ensayados, a excepcin del crustceo
marino, para el que sorprendentemente muestra una menor toxicidad que el resto de
tensioactivos (Figura VII.2). Por el contrario, el tensioactivo AES experimenta una baja
toxicidad para cuatro de las microalgas estudiadas, mientras que para D. salina el efecto
txico es muy acusado.
VII-5
Captulo 7
Concentracin tensioactivo (mg L-1)

40 40
N. gaditana I. galbana
30 30
20 IC50 20 IC50
NOEC NOEC
10 10
0 0
ATMAC NPEO AES AE ATMAC NPEO AES AE

40 40
C. gracilis D. salina
30 30
20 IC50 20 IC50
NOEC NOEC
10 10
0 0
40 40
T. chuii A. franciscana
LC50
30 30
NOEC
IC50
NOEC
20 20
10 10
0 0
Figura VII.2. Valores de IC50 (96-h), LC50 (72-h) y NOEC para diferentes organismos
marinos. Las barras de los histogramas muestran los valores medios,
mientras que las barras de error denotan el intervalo de confianza al 95%
(ATMAC, sal de alquil trimetil amonio; NPEO, nonilfenol etoxilado; AES,
alquil etoxisulfato; AE, alcohol etoxilado).
VII-6
Estudio comparativo
Variabilidad de los valores de efectos (EC50/LC50)
En las Figuras VII.3A y VII.3B se han representado los valores de los coeficientes
de variacin (porcentaje que supone la desviacin estndar de una muestra frente al valor
medio), de los datos de toxicidad (IC50 o LC50), agrupados de diferente forma. En la Figura
VII.3A se recoge el grado de dispersin para cada organismo de los datos de toxicidad de
los cuatro tensioactivos ensayados, mientras que en la Figura VII.3B se presentan los
coeficientes de variacin para cada tensioactivo de los datos de toxicidad obtenidos con los
diferentes organismos. Cabe destacar que en este caso, se ha representado la variabilidad
considerando los valores de efectos obtenidos para las microalgas y crustceos (color verde
oscuro) as como considerando exclusivamente los valores obtenidos para las microalgas
(color verde claro).
140 180
A B
Coeficiente de variacin (%)
Coeficiente de variacin (%)

120 160
140 Microalgas + crustceo
100 Microalgas
120
80 100
60 80
60
40
40
20
20
0 0
NG IG CG DS TC AF ATMAC NPEO AES AE
Figura VII.3. Coeficiente de variacin (%) de los valores de efectos (IC50 para las
microalgas y LC50 para el crustceo) obtenidos para los diferentes
tensioactivos y especies. (A) Variabilidad por especie ensayada (NG= N.
gaditana, IG= I. galbana, CG= C. gracilis, DS= D. salina, TC=. T. chuii,
AF= A. franciscana); (B) variabilidad por tensioactivo estudiado (ATMAC,
sal de alquil trimetil amonio; NPEO, nonilfenol etoxilado; AES, alquil
etoxisulfato; AE, alcohol etoxilado).
Los resultados presentados en la Figura VII.3A muestran como las diferencias

encontradas en la toxicidad de los diferentes tensioactivos estudiados depende en gran
medida del taxn y/o del efecto estudiado. Como se puede observar en la Figura VII.3A, la
artemia presenta una variabilidad muy inferior al de las microalgas, esto es, que el efecto de
los diferentes tensioactivos sobre el crustceo ha sido muy similar. En el caso de las
microalgas, se observa asimismo que la variabilidad de los resultados no es homognea,
siendo la microalga C. gracilis la que muestra mayores diferencias entre los efectos entre
los tensioactivos (120%) y la microalga T. chuii la que menos (53%). Este hecho parece
VII-7
Captulo 7
indicar que la especie utilizada en los ensayos no slo ha de ser considerada a la hora de
ordenar los tensioactivos en funcin de su toxicidad, como se ha visto anteriormente, sino
que las diferencias entre las toxicidades de los compuestos tambin dependen del
organismo usado y/o del efecto medido.
Respecto a la Figura VII.3B, se puede apreciar, en primer lugar, como la

variabilidad obtenida considerando ambos taxones resulta muy similar en todos casos a los
obtenidos considerando exclusivamente el taxn algas, a excepcin del tensioactivo
catinico ATMAC. Si bien esto es debido a la elevada diferencia observada en los valores
de efectos de las microalgas (IC50 entre 0,69 y 6,34 mg L-1) y el crustceo (LC50= 34,19 mg
L-1). Por otro lado, se observa como, de manera anloga a la Figura VII.3A, el coeficiente
de variabilidad no presenta valores homogneos. As, las diferencias entre los valores de
toxicidad de las diversas microalgas cuando se ensay la toxicidad con AES, resultan ser
menores que la de los efectos observados para el resto de tensioactivos, que presenta una
variabilidad similar en torno al 80%. Este resultado parece sugerir que el compuesto
ensayado tambin, en ocasiones, puede influir en las diferencias observadas entre los
diferentes organismos ensayados, aunque no en sus sensibilidades, esto es, que no slo para
cada tensioactivo se ha observado un orden de sensibilidades que no necesariamente ha sido
el mismo, sino que adems en el caso del AES, las diferencias entre las sensibilidades de
las diferentes microalgas han sido menores.
Si se analizan en su conjunto los resultados obtenidos se puede observar que tanto

como para el organismo ms tolerante (Artemia franciscana) como para el tensioactivo que
con mayor frecuencia ha sido el menos txico (AES), la dispersin de resultados obtenida
es mucho menor que en el caso de la microalga que con mayor frecuencia ha sido la ms
sensible (C. gracilis) y el tensioactivo que con mayor frecuencia ha sido el ms txico
(ATMAC).
Como conclusin de este apartado se puede afirmar que las diferencias

encontradas entre los efectos txicos para los tensioactivos y especies estudiadas no
solamente se deben a la naturaleza del compuesto ensayado, sino tambin al amplio grado
de sensibilidad que muestran los diferentes organismos cuando son expuestos a estos
agentes de superficie.
VII-8
Estudio comparativo
3. Evolucin de la toxicidad del medio de ensayo durante la biodegradacin de los

diferentes tensioactivos estudiados
La evolucin de la toxicidad del medio de ensayo (% efecto) para las diferentes

especies ensayadas (N. gaditana, I. galbana, C. gracilis, D. salina, T. chuii y A.
franciscana) a lo largo de los experimentos de biodegradacin realizados se muestran en la
Figura VII.4.
Se puede observar como para todos los tensioactivos tiene lugar una detoxificacin
del medio de ensayo a medida que avanza el proceso biodegradativo, a excepcin del
tensioactivo no-inico NPEO para el que se observa un claro aumento de la toxicidad del
medio en la fase inicial del experimento para el crustceo y las microalgas D. salina y T.
chuii. Este comportamiento no se ha observado para las microalgas N. gaditana, I. galbana
y C. gracilis dada la elevada sensibilidad de estas tres microalgas al tensioactivo y a la
elevada concentracin inicial empleada en los ensayos de biodegradacin.
Por otro lado, la Figura VII.4 muestra una completa detoxificacin del medio de
ensayo para los tensioactivos AES y AE, mientras que para el tensioactivo NPEO la
detoxificacin es del 100% en todos lo casos, a excepcin de las microalgas I. galbana y D.
salina (75% de detoxificacin, aproximadamente). Asimismo, en el caso del tensioactivo
catinico ATMAC se observa un porcentaje residual de efecto comprendido entre el 20 y
10% para todas las especies, a excepcin de D. salina y A. franciscana para la que se
obtiene una completa detoxificacin.
Si se comparan los valores de velocidad de detoxificacin de los diferentes medios

de ensayos para cada una de las especies, se observa que stas siguen un patrn comn. As,
se puede apreciar como en todos los organismos el orden de detoxificacin es el siguiente:
AE > ATMAC > NPEO AES, siendo el medio de ensayo correspondiente al tensioactivo
noinico AE el primero en detoxificarse. En trminos de porcentajes de mineralizacin, se
obtiene que en el caso del alcohol etoxilado (AE) se produce una completa detoxificacin
cuando se alcanza porcentajes de mineralizacin comprendidos entre el 19 y 37%, mientras
que para el tensioactivo catinico (ATMAC) la mxima detoxificacin tiene lugar a
porcentajes de biodegradacin del 81-95%. Respecto al NPEO y AES la detoxificacin del
medio tiene lugar cuando el tensioactivo ha sido mineralizado un 92 y 78-98%,
respectivamente.
VII-9
Captulo 7
80 80
Efecto txico (%)
Efecto txico (%)

60 60
ATMAC ATMAC
NPEO NPEO
40 AES 40 AES
AE AE
20 20
0 0
0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120

100 C. gracilis 100 D. salina
80 80
Efecto txico (%)
Efecto txico (%)
60 60
ATMAC ATMAC
NPEO NPEO
40 AES 40 AES
AE AE
20 20
0 0
0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120
100 T. chuii 100 A. franciscana
80 80
Efecto txico (%)
Efecto txico (%)
60 60
ATMAC ATMAC
NPEO NPEO
40 AES 40 AES
AE AE
20 20
0 0
0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120
Figura VII.4. Evolucin del efecto txico del medio de ensayo (%) de cada uno de los
organismos ensayados a lo largo del experimento de biodegradacin de los
diferentes tensioactivos (ATMAC, sal de alquil trimetil amonio; NPEO,
nonilfenol etoxilado; AES, alquil etoxisulfato; AE, alcohol etoxilado).
VII-10
Estudio comparativo
En la Tabla VII.1 se muestran los valores de tiempo de vida media del proceso de
mineralizacin (t1/2), esto es el tiempo necesario para alcanzar un porcentaje de
mineralizacin del 50%, y tiempo de vida media del proceso de detoxificacin (t1/2*), es
decir, el tiempo necesario para alcanzar un porcentaje de detoxificacin del 50%, para cada
uno de los tensioactivos estudiados.
Tabla VII.1. Valores de tiempo de vida media del proceso biodegradativo (t1/2) y de
detoxificacin (t1/2*) para los diferentes tensioactivos estudiados (ATMAC, sal
de alquil trimetil amonio; NPEO, nonilfenol etoxilado; AES, alquil
etoxisulfato; AE, alcohol etoxilado).
Tiempo de vida media Tiempo de vida media

Tensioactivo mineralizacin (t1/2) detoxificacin (t1/2*)
(das) (das)
ATMAC 26,9 18-35
NPEO 23,1 43-61
AES 35,0 25-35 (70a)
AE 56,8 10-23
a
Valor obtenido para la microalga D. salina
Los resultados mostrados en la Tabla VII.1 reflejan tres comportamientos

diferentes. As, en el caso del tensioactivo AE, a pesar de presentar un elevado valor de t1/2
(56,8 das) se obtiene el menor valor de t1/2* (10-23 das), lo que viene a indicar una rpida
velocidad de detoxificacin del medio de ensayo con formacin de metabolitos menos
txicos que el tensioactivo original. Por el contrario, se puede apreciar como NPEO, a pesar
de presentar el menor valor de t1/2 (23,10 das), alcanza tiempos de vida media de
detoxificacin muy superiores (t1/2*= 43-61 das), lo cual indica que la velocidad de
detoxificacin del proceso es muy inferior a la de mineralizacin. Este hecho puede deberse
a la formacin de metabolitos ms txicos durante la biodegradacin del tensioactivo, tal y
como se coment en el captulo 4, indicando as su biodegradabilidad ambientalmente no
aceptable. Por otro lado, el tensioactivo ATMAC presenta tiempos de vida media de
mineralizacin y detoxificacin similares, lo que implica una detoxificacin del medio de
ensayo con formacin de metabolitos menos txicos o de igual toxicidad que el
tensioactivo original. Cabe resaltar el amplio intervalo de tiempos de vida media
observados para el tensioactivo AES y los diferentes organismos (t1/2*= 25-70 das); si bien
para todas las especies estos valores estn comprendidos entre 25 y 35 das a excepcin de
la microalga D. salina.
VII-11
CONCLUSIONES GENERALES
Conclusiones generales
En los captulos anteriores aparecen recogidas las conclusiones ms importantes

obtenidas a partir de los ensayos de biodegradacin, toxicidad y estudios combinados de
toxicidad y biodegradacin para cada uno de los tensioactivos estudiados. En este apartado,
se enumeran las conclusiones generales ms relevantes obtenidas a partir de los resultados
mostrados y de las consideraciones realizadas a lo largo del desarrollo de la presente Tesis
Doctoral.
1. Para la evaluacin del riesgo ambiental de tensioactivos en el medio marino resulta

necesario realizar ensayos de biodegradacin en agua de mar puesto que se han
encontrado diferencias en las velocidades de biodegradacin obtenidas en este medio
frente a las aportadas por otros autores para otros medios de ensayo, si bien los datos
bibliogrficos disponibles para poder realizar comparaciones son escasos.
2. La modelizacin cintica del proceso biodegradativo se muestra como una alternativa

vlida frente al procedimiento tradicional propuesto por diferentes organismos tales
como la Agencia de Proteccin Ambiental de los Estados Unidos (USEPA), la
Organizacin para la Cooperacin Econmica y el Desarrollo (OECD), etc. El uso de
modelos no slo permite caracterizar la cintica de biodegradacin del compuesto sino
tambin calcular de una forma ms rigurosa los valores que definen la cintica del
proceso, como por ejemplo, el tiempo de latencia y vida media.
3. El uso de forma generalista del periodo necesario en alcanzar una biodegradacin del
10% como tiempo de latencia puede inducir en ocasiones a error, indicando la presencia
de una fase de aclimatacin en procesos degradativos lentos en los que claramente sta
no se observa. Por ello se propone una modificacin del tratamiento de datos consistente
en el clculo del periodo de latencia solo en aquellos casos en los que el modelo cintico
de mejor ajuste contemple esta fase.
4. En aquellos casos en los que no se cumpla el criterio establecido por la Agencia de

Proteccin Ambiental de los Estados Unidos (biodegradacin superior al 70% en un
tiempo inferior a 60 das) pero se observe una clara tendencia descendente en la
concentracin residual de substrato transcurridos 60 das, se propone prolongar la
duracin del ensayo. En estos casos, si la curva de biodegradacin se asintotiza en
valores superiores o iguales al 70%, se puede afirmar que existe un potencial para la
biodegradacin del compuesto en el medio marino, mientras que valores inferiores
requeriran estudios adicionales.
5. Su facilidad de cultivo, disponibilidad, relevancia ecolgica y sensibilidad hacen de las

microalgas marinas N. gaditana, I. galbana, C. gracilis, D. salina y T. chuii especies
recomendables en ensayos ecotoxicolgicos estndares en el medio acutico marino.
CG-2
Conclusiones generales
6. La elevada tolerancia observada en los ensayos con Artemia franciscana ponen en

entredicho la utilizacin de ensayos de mortalidad del crustceo para la evaluacin del
riesgo ambiental de los tensioactivos en el medio marino. No obstante, dada las
numerosas ventajas que presentan estos organismos (fcil manipulacin, disponibilidad,
etc.) resultara conveniente desarrollar ensayos de toxicidad estndar a nivel subletal
empleando estos crustceos.
7. Los resultados obtenidos en los ensayos de toxicidad presentan diferencias importantes

dependiendo del taxn, especie y efecto estudiado, lo que pone de manifiesto la
necesidad de realizar mltiples ensayos empleando diversas especies correspondientes a
diferentes taxones para poder tomar decisiones sobre criterios de calidad y/o
limitaciones de utilizacin, tal y como contempla la Directiva Marco de Aguas y la Gua
Tcnica para la Evaluacin de Riesgos de la Comisin Europea.
8. En los protocolos de evaluacin de riesgo ambiental los ensayos combinados de

toxicidad y biodegradacin constituyen una herramienta til pues permiten determinar
de manera rpida y sencilla, si durante el proceso de biodegradacin se generan
metabolitos ms txicos que el compuesto ensayado, o si por el contrario, ste presenta
una biodegradabilidad ambientalmente aceptable.
Como consecuencia de los resultados obtenidos, se han generado nuevas lneas de

actuacin que deberan ser consideradas en futuros trabajos:
* Realizacin de ensayos de biodegradacin primaria y mineralizacin de los diferentes

tensioactivos empleando concentraciones iniciales de tensioactivos reales, al objeto de
conocer la cintica real del proceso biodegradativo.
* Realizacin de ensayos de toxicidad aguda estndar a nivel letal y subletal empleando un

mayor nmero de especies as como organismos pertenecientes a otros grupos
taxonmicos, como por ejemplo, peces y anfibios.
* Realizacin de un programa de monitoreo ambiental para establecer las concentraciones

de estos tensioactivos en aguas residuales que permitan, en un primer nivel, estimar las
concentraciones ambientales (PEC), y si esto no fuese suficiente, determinar los niveles
de estos tensioactivos en el medio marino.
* Determinacin de los valores de no efecto (NOEC) para diferentes estados del proceso
biodegradativo.
CG-3
GENERAL CONCLUSIONS
General conclusions
The general conclusions obtained from the present Doctoral Thesis are:
1. Conducting biodegradation studies using natural sea water is extremely necessary in

order to assess the risk of surfactants in the marine aquatic environment. Although
literature concerning the biodegradation of these compounds in natural environment is
very scarce, significant differences have been found between the biodegradation rates
obtained in this work and those described by several authors in other test media.
2. Kinetic modelling of the biodegradative process is a scientifically valid alternative to the

traditional procedure included in the guidelines proposed by different organisations such
as the United States Environmental Protection Agency (USEPA) and Organisation for
Economic Co-operation and Development (OECD). These models not only make it
possible to characterise the chemical biodegradation kinetic but also to estimate the
kinetic parameters such as the lag and half-life times accurately.
3. The general use of the parameter lag time (time needed to reach 10% of biodegradation)
may be inappropriate in certain cases, as in some processes with a very slow
biodegradation rates where this phase does not really exist. For this reason, we propose a
modification consisting of the calculation of this parameter only in those cases where the
fitted kinetic model considers it.
4. In cases where a negative result (<70% DOC removal before 60 days) and a clearly
decreasing tendency of the residual substrate concentration are observed, we propose to
increase the maximum test duration (60 days). Whether the biodegradation percentage is
equal or higher than 70%, it may be concluded that there is a potential fro
biodegradation in the marine environment. However, a negative result (<70%) does not
preclude such potential but indicates that further study is necessary.
5. We recommend using the marine microalgae N. gaditana, I. galbana, C. gracilis, D.

salina and T. chuii as standard toxicity tests organisms in the marine environment
because of their ease of culture, commercial availability, ecological relevance and
sensitivity.
6. Since the high surfactant tolerance of the marine crustacean A. franciscana, mortality
tests using these organisms are not suitable in the assessment of the environmental risk
of surfactants in the marine environment. Nevertheless, their numerous advantages (ease
of culture, short generation time, cosmopolitan distribution and commercial availability
of the cysts) suggest considering these organisms as a test species in sub-lethal toxicity
tests.
GC-2
General conclusions
7. The results obtained from the acute toxicity tests show significant differences depending
on the taxonomic group, species and effects tested. These results support the Water
Framework Directive and the Technical Guidance Document of the European
Commission, indicating the necessity of carrying out multiple toxicity tests using several
species from different taxonomic groups in order to establish quality criteria or phase out
the use of these compounds.
8. Combined toxicity and biodegradation tests are a useful tool for the assessment of the
environmental risk procedures. These tests make it possible to determine whether during
the biodegradation process, generated metabolites are more toxic than the parent
compound or the compound shows an acceptable environmental biodegradability.
Based on the results obtained from this investigation, the following recommendations
should be considered for further researches:
* Conduct additional primary and ultimate biodegradation tests of different surfactants

using real environmental concentrations in order to determine the real kinetic of the
biodegradative process.
* Conduct additional lethal and sub-lethal acute toxicity tests including different species as
well as organisms from other taxonomic groups such as fishes or amphibious.
* Conduct an environmental monitoring program in order to estimate the environmental

predicted concentration (PEC). In a first tier, the concentrations should be determined in
wastewater treatment plants, and if it were necessary (tier 2) an additional monitoring
should be carried out in the marine environment.
* Estimate no-effect-observed concentration values (NOEC) at different stages of the

biodegradative process.
GC-3

Sibila Lores

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Facultad de Ciencias del Mar y Ambientales

Departamento de Ingeniera Qumica, Tecnologa de Alimentos

Miguel ngel Sibila Lores

Cdiz, Abril de 2008

LA PRESENTE TESIS DOCTORAL HA SIDO DIRIGIDA POR LOS PROFESORES

Es de bien nacido ser agradecido

Especial agradecimiento a mis directores de Tesis, Jose Mara Quiroga y

A D. Diego Sales Mrquez, director del Grupo de Investigacin de

A la Consejera de Innovacin, Educacin y Empresa de la Junta de

A mi segunda familia, Antonio Lieiro, Alberto, Abel, Txomin y

A la nueva generacin de investigadores y doctorandos, Jess, Pablo, Elisa,

A Jose Ignacio Lores, por su colaboracin en el diseo grfico del presente

A Beatriz Muoz, por su ayuda en las traducciones tanto de la presente

A los doctores Walter Giger y Hans-Peter Kohler del Instituto Federal

A mis compaeros del Instituto Federal Suizo, Simn, Daro, Patricia,

A Rafa, quien adems de ser de la familia considero uno de mis mejores

Finalmente, quisiera extender mi agradecimiento a todas esas personas, que

Introduccin y objetivos IO-1

Captulo 1. Antecedentes bibliogrficos

Captulo 3. Sales de alquil trimetil amonio

Captulo 4. Nonilfenoles etoxilados

Captulo 5. Alquil etoxisulfatos

Captulo 6. Alcoholes etoxilados

Captulo 7. Estudio comparativo de la biodegradabilidad y ecotoxicidad de los

Conclusiones generales CG-1

La presente Tesis Doctoral tiene como objetivo fundamental el estudio de la

En el captulo 1 se lleva a cabo una revisin general de los aspectos fundamentales

El captulo 2 describe la metodologa utilizada durante el desarrollo del trabajo

Los captulos 3, 4, 5 y 6 exponen los resultados obtenidos en los ensayos de

As, en el captulo 3 se lleva a cabo el estudio de la biodegradabilidad y

En el captulo 4 se muestran los resultados obtenidos para el tensioactivo no-inico

El captulo 5 est dedicado a la biodegradabilidad y ecotoxicidad del tensioactivo

En el captulo 6 se exponen los resultados obtenidos con un tensioactivo no-inico

The marine environment is made up of complex and diverse ecosystems such as

Chapter 1 shows a revision of the fundamental concepts related to this work.

Chapter 3 studies the biodegradability and ecotoxicity of an alkyl trimethyl

Chapter 5 studies the biodegradability and ecotoxicity of the commercial anionic

Chapter 6 provides the biodegradability and ecotoxicity of the alcohol ethoxylate

El medio marino constituye uno de los ecosistemas ms importante del planeta,

El medio ambiente marino desempea un papel determinante en las condiciones

A lo largo de la Historia, la distribucin de los asentamientos del hombre no ha

Como consecuencia del aumento demogrfico y de la industrializacin,

Los tensioactivos constituyen, por volumen, uno de los principales compuestos

La preocupacin por la conservacin del medio ambiente marino ha aumentado

La evaluacin de riesgo ambiental comprende el estudio del destino final de un

Al objeto de evaluar el destino final de un determinado compuesto resulta

El estudio de la toxicidad constituye otro de los factores clave en la evaluacin del

La presente Tesis Doctoral tiene como objetivo fundamental el estudio de la

Estudiar la biodegradacin final o mineralizacin de diferentes familias de

Modelizar la cintica de biodegradacin de los diferentes tensioactivos en agua de mar

Estudiar la toxicidad aguda de los tensioactivos sobre diferentes organismos marinos:

Estudiar la evolucin de la toxicidad de los diferentes medios de ensayos durante el

Comparar los resultados obtenidos en los ensayos de biodegradacin y ecotoxicidad

En el presente captulo se lleva a cabo una breve revisin bibliografa de los

1. Tensioactivos y Medio Ambiente

Los tensioactivos, tambin conocidos como agentes de superficie, constituyen un

Tabla I.1. Acrnimos de los principales tipos de tensioactivos (Ying, 2006).

Clase Nombre comn Acrnimo

Tensioactivos Haluros de alquil bencil dimetil amonio BDMAC

Dada la gran versatilidad de tensioactivos, estos compuestos encuentran aplicacin

Produccin y consumo de tensioactivos

La produccin mundial de tensioactivos alcanza unos 12,5 millones de toneladas

Figura I.1. Consumo mundial de tensioactivos durante el ao 2006 (Janshekar y col.,

En Europa, los datos ms recientes encontrados estimaban una produccin total de