INFORME DE

LABORATORIO
Laboratorio de Bioqumica

Integrantes: Flavia Aldana

Danhiella Espinoza
Dafnne Pizarro
Matas Rojas
Aylin Vergara
Docente: Luz Marina Gonzlez
Medicina Veterinaria
19 de junio de 2017
 LABORATORIO N3: ANLISIS CINTICO DE LA
ENZIMA FOSFATASA CIDA PARTE I

Introduccin

Las fosfatasas son una familia de enzimas que catalizan la hidrlisis de un grupo
fosfato (desfosforilacin). La actividad fosfatasa se puede medir mediante un
ensayo enzimtico colorimtrico basado en su capacidad de hidrlisis del p-
nitrofenilfosfato (pNPP) a p-nitrofenol: p-nitrofenilfosfato (pNPP) + H2O p-
nitrofenol + fosfato. A diferencia del pNPP, el producto de la reaccin p-
nitrofenol es un compuesto amarillo que presenta un mximo de absorbancia a
405 nm en un medio alcalino que se puede monitorizar mediante
espectrofotometra (IQS, 2015). En este laboratorio se determinar la actividad
de la fosfatasa cida a distintas concentraciones del sustrato p-nitrofenilfosfato.

Objetivos
Objetivo general
Analizar algunos de los principales factores que afectan las reacciones
enzimticas en los sistemas biolgicos.
Objetivo especfico
Estudiar el efecto de la cantidad del sustrato (p-nitrofenilfosfato) sobre la
accin enzimtica de la Fosfatasa cida.

Desarrollo del prctico

Reactivos:
p-nitrofenol 3,0 Mm
NaOH 0,1 M
MgCl2 25 Mm
Tampn citrato 0,1 M, pH 5,0
 Agua destilada
Solucin de enzima Fosfatasa cida: Se extrae jugo de una papa, se
centrifuga y se guarda el sobrenadante en el refrigerador. Para el anlisis
se toman 5 ml y se diluyen a 10, despus se toma 1 ml de esta dilucin y
se diluye a 10, quedando listo para el anlisis.
Materiales:
Tubos de Ensayo de 10 ml.
Gradilla para tubos de ensayo.
Vasos de precipitado.
Bao termorregulado.
Espectrofotmetro.
Cubetas para espectrofotmetro.
Agitador de tubos (Vortex).
Micropipeta P-1000.
Puntas para micropipeta P-1000.
Pipetas de 1, 2 y 5 ml.
Propipetas.
Papel milimetrado y regla.
Procedimiento:
1) Se prepar una serie de tubos adicionando los volmenes de los
componentes segn la siguiente tabla
Tabla 1: Contenido de los tubos utilizados (Volumen en ml)
Compuesto B 1 2 3 4 5 6
P-
Nitrofenilfosfato -- 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0 4,0
3,0 Mm
MgCl2 25 Mm 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0,5
Tampn Citrato
2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
pH 5,0
Agua destilada 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0,0 0,0
Enzima 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
 B: Blanco (no contiene sustrato)

2) Se agit cada uno de los tubos y luego se incubaron a 37C por 15

minutos.
3) Mientras se incubaban, se prepar 7 tubos ms, los cuales contenan 5 ml
de NaOH 0,1 M, luego se rotul cada uno respectivamente.
4) Al terminar la incubacin, se transfiri rpidamente una alcuota de 1 ml
de cada tubo incubado, a uno preparado con NaOH 0,1 M.
5) Desde cada uno de los tubos nuevos con NaOH y muestra incubada, se
transfiri un volumen de cada tubo a una cubeta de espectrofotmetro,
posteriormente estas se introdujeron en el espectrofotmetro.
6) Se ajust el espectrofotmetro a cero de absorbancia a una longitud de
onda de 405 nm utilizando el tubo B.
7) Se midi la absorbancia de los tubos restantes y se registraron los valores
obtenidos.
8) Se realiz una grfica de la absorbancia a 405nm versus la cantidad de
sustrato agregado (en ml).

Resultados:

Tabla 2: Efecto de la concentracin de sustrato en la absorbancia

B 1 2 3 4 5 6

Absorbancia (eje y) 0,003 0,095 0,496 0,714 0,883 1,017 0,982

Sustrato (eje x) 0 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0 4,0

 Absorbancia v/s cantidad de sustrato
1.2
1.017
0.982
1 0.883

0.8 0.714
Absorbancia

0.6 0.496

0.4

0.2 0.095
0.003
0
0 0.5 1.0 1.5 2.0 3.0 4.0

Sustrato

Grfico 1: Absorbancia versus cantidad de sustrato utilizado en cada tubo.

Conclusin

Las enzimas son sustancias que catalizan reacciones metablicas en los

organismos, aumentando su velocidad de reaccin. Existen diferentes factores
que tienen directa relacin con el funcionamiento de las enzimas, como por
ejemplo la cantidad de sustrato que se utiliza en una reaccin. La absorbancia es
directamente proporcional a la cantidad de sustrato que se utilice, a medida que
una aumenta, la otra lo hace tambin. Cuando hay una alta concentracin de
sustrato, la velocidad de la reaccin se vuelve constante y ya no depende tanto
de la cantidad de sustrato, ya que los centros activos de la enzima se encuentran
saturados, por lo cual se dice que ha alcanzado una velocidad mxima. Luego
de esto la velocidad se mantiene constante o baja.
Bibliografa

Institut Qumic de Sarri (2015) Determinacin de las constantes cinticas de la

fosfatasa cida de germen de trigo y efecto del pH sobre su actividad.
Recuperado de:
http://www.gruposelecta.com/notasdeaplicaciones/category/determinacion-de-
las-constantes-cineticas-de-la-fosfatasa/
 LABORATORIO N 4: ANLISIS CINTICO DE LA
ENZIMA FOSFATASA CIDA PARTE II

Introduccin
La accin enzimtica depende tanto de la concentracin del sustrato como la de
otros factores. Las enzimas son especialmente sensibles a las variaciones de la
temperatura y del pH. La concentracin de iones hidrgeno (expresada como pH)
afecta a las enzimas de diversas formas, ya que los cambios de los grupos
ionizables pueden alterar la estructura terciaria de la enzima. Si el pH es lo
suficientemente alcalino para que el grupo pierda su protn, la actividad
enzimtica puede deprimirse (Nelson & Cox, 2009). Por otro lado, cualquier factor
ambiental que distorsione la estructura protenica puede alterar la actividad
enzimtica (McKee & McKee, 2014) En este laboratorio se estudiar el efecto de
la temperatura y el pH en la actividad enzimtica.

Objetivos
Objetivo general
Analizar los principales factores que afectan las reacciones enzimticas
en los sistemas biolgicos

Objetivo especfico
Determinar/estimar el pH y temperatura ptima para la reaccin de la
fosfatasa cida.

Desarrollo del prctico

Reactivos:
p-nitrofenol 3,0 Mm
NaOH 0,1 M
MgCl2 25 Mm
 Tampn citrato 0,1 M, pH
Agua destilada

Solucin de enzima Fosfatasa cida: Se extrae jugo de una papa, se

centrifuga y se guarda el sobrenadante en el refrigerador. Para el anlisis
se toman 5 ml y se diluyen a 10, despus se toma 1 ml de esta dilucin y
se diluye a 10, quedando listo para el anlisis.

Materiales:
Tubos de Ensayo de 10 ml.
Gradilla para tubos de ensayo.
Vasos de precipitado.
Bao termorregulado.
Espectrofotmetro.
Cubetas para espectrofotmetro.
Agitador de tubos (Vortex).
Micropipeta P-1000.
Puntas para micropipeta P-1000.
Pipetas de 1, 2 y 5 ml.
Propipetas.
Papel milimetrado y regla.
Hielo
Mechero Bunsen con rejilla y trpode
Parafilm cortado en cuadritos de 2x2 cm.

Procedimiento:
Efecto del pH de la accin enzimtica:
1) Se prepar una serie de tubos adicionando los volmenes de los
componentes segn la siguiente tabla:
Tabla 1: Contenido de los tubos utilizados (Volumen en ml)

Compuesto b c 1 2 3 4
P- - 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Nitrofenilfosfato
3,0mM
MgCl2 25mM 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Tampn citrato - - 2,5/pH=3 2,5/pH=5 2,5/pH=7 2,5/pH=8
Agua destilada 4,5 3,5 1,0 1,0 1,0 1,0

2) Luego, se agreg 1mL de enzima a cada tubo (menos el C)

3) Despus se agit suavemente cada tubo y se incubaron a 37C por 15
minutos.
4) Mientras se incubaban, se prepar 7 tubos ms, los cuales contenan 5 ml
de NaOH 0,1 M, luego se rotul cada uno respectivamente.
5) Al terminar la incubacin, se transfiri rpidamente una alcuota de 1 ml
de cada tubo incubado, a uno preparado con NaOH 0,1 M.
6) Desde cada uno de los tubos nuevos con NaOH y muestra incubada, se
transfiri un volumen de cada tubo a una cubeta de espectrofotmetro,
posteriormente estas se introdujeron en el espectrofotmetro.
7) Se ajust el espectrofotmetro a cero de absorbancia a una longitud de
onda de 405 nm utilizando el tubo B.
8) Se midi la absorbancia de los tubos restantes y se registraron los valores
obtenidos.
9) Se realiz una grfica de la absorbancia a 405nm versus el pH de cada
tubo.

Resultados

Tabla 2: Absorbancia de los tubos

tubo Abs

B 0
C -0.008
1 1.017

2 2.188
3 0.990

4 1.042

Absorbancia v/s pH
2.5
2.183

2
Absorbancia

1.5

1.017 0.990 1.042

1

0.5

0
3 5 7 8
pH

Grfico 1: Absorbancia versus pH de 4 tubos

Efecto de la Temperatura en la Accin Enzimtica

1) Para cada temperatura (0C, Temperatura ambiente, 37C y 100C) se
prepar los tubos control, blanco y T (12 en total) segn la siguiente tabla:
Tabla 3: Contenido de los tubos utilizados
Compuesto B C T
P-Nitrofenilfosfato - 1,0 2,0
3,0mM
MgCl2 25mM 0,5 0,5 0,5
Tampon citrato pH 2,5 2,5 2,5
5,0
Agua destilada 2,0 1,0 1,0
2) Se agreg 1mL de enzima a cada tubo (menos el C)
3) Cada tubo se agit suavemente y se incub por 15 minutos a las
respectivas temperaturas.
4) Durante la incubacin, se prepararon 12 tubos ms los cuales contenan
5 ml de NaOH 0,1 M
5) Al terminar la incubacin, se transfiri rpidamente una alcuota de 1 ml de
cada tubo incubado, a uno preparado con NaOH 0,1 M.
6) Desde cada uno de los tubos nuevos con NaOH y muestra incubada, se
transfiri un volumen de cada tubo a una cubeta de espectrofotmetro,
posteriormente estas se introdujeron en el espectrofotmetro.
7) Se ajust el espectrofotmetro a cero de absorbancia a una longitud de
onda de 405 nm utilizando el tubo B elaborado para una temperatura dada.
8) Se midi la absorbancia de los tubos C y T elaborados para la misma
temperatura del tubo B (por ejemplo a 0C).
9) Luego se sigui el mismo paso para medir la absorbancia de los tubos que
estaban a las otras temperaturas.
10) Se registr todos los datos de absorbancia para cada temperatura,
despus se procedi a realizar la siguiente correccin para eliminar el
producto formado por la hidrlisis qumica del sustrato que es dependiente
de la T y as obtener la absorbancia real.

Absorbancia real= Absorbancia de tubo T Absorbancia de tubo C

11) Con los datos de cata tubo se procedi a realizar un grfico de absorbancia
a 405 nm versus la temperatura de cada tubo.
Resultados

Tabla 4: Absorbancia real de los tubos utilizados

Temperatura Absorbancia Abs. real (T-C)
0 B : 0,000 0,343
C : -0,031
T : 0,374
Temperatura ambiente B : 0,002 0,385
C : -0,036
T : 0,349
37 B : 0,001 1,2
C : 0,002
T : 1,202
100 B : 0,001 0,619
C : 0,034
T : 0,653

Absorbancia v/s Temperatura

1.4
1.2
1.2

1
Absorabncia

0.8
0.619
0.6
0.385
0.343
0.4

0.2

0
0 TA 37 100
Temperatura

Grfico 2: Absorbancia versus temperatura de los tubos

Conclusin
La temperatura es un parmetro ambiental que afecta positivamente la
velocidad de las reacciones qumicas al incrementar la velocidad cintica. La
velocidad aumenta junto con la temperatura, ya que generalmente la velocidad
aumenta 1,5 y 5 veces por cada 10C de aumento de temperatura.

Por otro lado, la intensidad mxima de la actividad de la enzima, ocurre en

el pH ptimo (pH en el cual la conformacin es la ms adecuada), con rpida
disminucin de la actividad a cada lado de este valor de pH. La actividad ptima
en este experimento es 5. El pH ptimo de una enzima puede guardar relacin
con cierta carga elctrica de la superficie, o con condiciones ptimas para la
fijacin de la enzima a su sustrato.

Bibliografa

Nelson, D & Cox, M. (2009) Lehninger: Principios de Bioqumica. 5ta. Ed.

Ediciones Omega

McKee, T & McKee, J. (2014) Bioqumica Las Bases Moleculares de La Vida. 5ta.
Ed. Editorial McGraw-Hill Interamericana