Vincicius Leite Pedro Bom COrrig

Universidade de So Paulo
Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto
A importncia da protena fosfatase sitA na adeso, integridade da parede
celular, biofilme e virulncia de Aspergillus fumigatus.
Vincius Leite Pedro Bom
Ribeiro Preto
2016
Universidade de So Paulo
Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto
Dissertao de Mestrado apresenado do

Programa de Ps-Graduao em
Bioqumca para obteno do Ttulo de
Mestre em Bioqumica
rea de Concentrao: Bioqumica
Orientado: Vincius Leite Pedro Bom
Orientador: Gustavo Henrique Goldman
Verso corrigida. A verso original encontra-se disponvel tanto na Biblioteca da Unidade que aloja o Programa,
quanto na Biblioteca Digital de Teses e Dissertaes da USP (BDTD)
Ribeiro Preto
2016
AUTORIZO A DIVULGAO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR
QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRNICO, PARA FINS DE
ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Bom, Vincius Leite Pedro

A importncia da protena fosfatase sitA na adeso, integridade da parede celular,
biofilme e virulncia de Aspergillus fumigatus. Ribeiro Preto, 2016
X p.: il: 30cm
Dissertao de Mestrado, apresentado a Faculdade de Medicina de Ribeiro
Preto/USP rea de Concentrao: Bioqumica
1. Aspergillus fumigatus. 2. Protena fosfatase. 3. sitA. 4. pkC.

FOLHA DE APROVAO
Vincius Leite Pedro Bom

Dissertao de Mestrado apresenado do

Programa de Ps-Graduao em
Bioqumca para obteno do Ttulo de
Mestre em Bioqumica
rea de Concentrao: Bioqumica
Orientado: Vincius Leite Pedro Bom
Aprovado em:
Banca Examinadora
Prof. Dr._________________________________________________________
Instituio:_________________________Assinatura:_____________________
Prof. Dr._________________________________________________________
Prof. Dr._________________________________________________________
Dedico,
Aos meus pais Jussara e Luiz, por todo carinho,
amor, exemplo de vida e por todo incentivo.
A minha irm Gabrielle, por todo carinho.
minha namorada Lilian, por todo amor, carinho
e por estar sempre presente em todos os
momentos.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Ao meu orientador, prof. Dr. Gustavo Henrique Goldman, obrigado por todo
conhecimento transmitido, pela oportunidade deste trabalho e pela pacincia
durante esses anos de aprendizado.
CAPES, pela bolsa de mestrado concedida.
FAPESP, Fundao de Amparo a Pesquisa do Estado de So Paulo, pelo

auxlio financeiro durante este trabalho.
AGRADECIMENTOS
s professoras. Dra. Maria Helena de Souza Goldman, Faculdade de Filosofia

Cincias e Letras USP, Ribeiro Preto, profa. Dra. Mrcia Regina von Zeska
Kress e profa. Dra. Mrcia Eliana da Silva Ferreira, Faculdade de Cincias
Farmacuticas USP, Ribeiro Preto, por todo suporte tcnico e gentilmente
permitir o uso de seus aparelhos e reagentes.
Aos colegas de laboratrio, Ariane, Adriana, Ana Cristina, Elodie, Enyara, Laure,
Laura, Leandro, Lilian, Lizziane, Maral, Nilton, Neil, Patrcia, Paula, Pollyne,
Simone, Santiago, Thaila, por toda a ajuda e por criarem um timo ambiente de
trabalho.
Aos tcnicos Lvia, Marcela e Paulo, por estarem sempre dispostos a ajudar, por
toda pacincia e pela boa companhia.
Aos meus pais Jussara e Luiz, por todo amor, carinho, pacincia, por estarem
comigo em todos os momentos e serem meus exemplos de vida, que me
ajudaram a me tornar o que sou hoje, sem eles nada disso seria possvel.
toda minha famlia, em especial minha madrinha Denise e minha irm Gabrielle
por todo o incentivo e fora durante esta etapa.
minha namorada Lilian, mulher que amo e admiro imensamente, por estar
presente em todos os momentos, sempre me apoiando e me incentivando a
seguir em frente e superar meus obstculos, por todo amor e carinho.
Aos meus grandes amigos Alysson, Amauri, Arthur, Bruno, Leonardo, Murilo,
Pedro, Rafael, Thiago e Rodrigo, por todo carinho e companheirismo, sempre
fazendo acreditar nos meus sonhos e por estarem presentes na minha vida
desde muito tempo, me ajudando sempre a passar pelos momentos difceis e a
curtir os timos.
Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto USP, juntamente com todos os

funcionrios e professores do departamento de Bioqumica.
todas as instituies que contriburam, de alguma forma, na realizao deste

projeto.
A dvida o princpio da sabedoria.

Aristteles
Resumo_____________________________________________________________________i
Resumo
BOM, V.L.P. A importncia da protena fosfatase sitA na adeso, integridade da

parede celular, biofilme e virulncia de Aspergillus fumigatus. 2016. 149f.
Dissertao (Mestrado). Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto
Universidade de So Paulo, Ribeiro Preto, 2016.
Aspergillus fumigatus um fungo patognico oportunista capaz de infectar

pacientes imunocomprometidos causando eventualmente infeces
disseminadas difceis de serem controladas e com alta taxa de mortalidade dos
indivduos infectados. Para um melhor entendimento de como esse fungo age
no hospedeiro importante saber como as vias de sinalizao que regulam
esses fatores de virulncia so orquestradas. Protenas fosfatases so centrais
em uma grande variedade de vias de transduo de sinal. Neste trabalho, ns
caracterizamos a protena fosfatase 2A (PP2A) SitA, a protena homloga de Sit4
em Saccharomyces serevisiae. O gene sitA no essencial e por isso fomos
capazes de construir um mutante nulo em A. fumigatus. A cepa sitA apresenta
aumento na fosforilao da MpkA, mais sensvel agentes que causam dano
na parede celular, tem um aumento na quantidade de -1,3-glicano e quitina, e
tambm tem problemas na adeso e formao de biofilme. O mutante sitA
mais sensvel a vrios metais e ons, como MnCl 2, CaCl2, LiCl, entretanto mais
resistente ZnSO4. O mutante sitA avirulento em modelo de aspergilose
pulmonar invasiva em camundongos. Esses resultados revelam que a fosfatase
SitA est envolvida na via de integridade da parede celular de A. fumigatus
possivelmente modulando a atividade de PkcA/MpkA.
Palavras-chave: 1. Aspergillus fumigatus. 2. Protena fosfatase. 3. sitA. 4. pkC.

Abstract_____________________________________________________________________ii
Abstract
BOM, V.L.P. The Aspergillus fumigatus sitA Phosphatase Homologue Is

important for Adhesion, Cell Wall Integrity, Biofilm Formation, and Virulence.
2016. 149f. Dissertation (Master). Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto
Universidade de So Paulo, Ribeiro Preto, 2016.
Aspergillus fumigatus is an opportunistic pathogenic fungus able to infect

immunocompromised patients causing eventually disseminated infections that
are difficult to be controlled, and lead to high mortality rates. It is important to
understand how are orchestrated the signalling pathways that regulate these
factors involved in virulence. Protein phosphatases are central to numerous
signal transduction pathways. Here we characterize A. fumigatus protein
phosphatase 2A (PP2A) SitA, the S. cerevisiae Sit4p homologue. The sitA gene
is not an essential gene and we were able to construct an A. fumigatus null
mutant. The sitA strain had increased MpkA phosphorylation, was more
sensitive to cell wall damaging agents, had increased -1,3-glican and chitin, and
was impaired in biofilm formation. The sitA strain is more sensitive to several
metals and ions such as MnCl 2, CaCl2, and LiCl, however, it is more resistant to
ZnSO4. The sitA strain was avirulent in a murine model of invasive pulmonary
aspergillosis. These results stress the importance of A. fumigatus SitA as a
possible modulator of PkcA/MpkA activity and its involvement in the cell wall
integrity pathway.
Keywords: 1. Aspergillus fumigatus. 2. Protein phosphatase. 3. sitA. 4. pkC.

Lista de Figuras______________________________________________________________iii
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 01 . rvore filogentica de homlogos de sitA em fungos............ 52
FIGURA 02. Anlise de Southern Blot para o mutante nulo sitA............... 55
FIGURA 03. Crescimento radial em Meio Completo e Meio Mnimo........... 56
FIGURA 04. Teste de sensibilidade estresse inico................................. 57
FIGURA 05. Teste de sensibilidade a Rapamicina...................................... 58
FIGURA 06. Sensibilidade do mutante sitA a agentes que causam
danos parede celular................................................................................. 59
FIGURA 07. Deteco da composio de -1,3-glicanos e quitina na
superfcie celular.......................................................................................... 60
FIGURA 08. Sensibilidade do mutante sitA a antifngicos........................ 61
FIGURA 09. Microscopia eletrnica de transmisso................................... 62
FIGURA 10. Ensaio demonstrando a hidrofobicidade, adeso e formao
de biofilme.................................................................................................... 65
FIGURA 11. Microscopia eletrnica de varredura....................................... 66
FIGURA 12. Sensibilidade a inibidores de protena quinase C................... 71
FIGURA 13. A virulncia do mutante sitA de A. fumigatus........................ 74
FIGURA 14. Reconhecimento de macrfagos e secreo de TNF- por
MDMOs........................................................................................................ 75
Lista de Tabelas______________________________________________________________iv
LISTA DE TABELAS
TABELA 01. Sequncia de oligonucleotdeos dos primers utilizados

nesse estudo................................................................................................ 33
TABELA 02. Protenas de superfcie identificadas no tipo selvagem e no
mutante sitA............................................................................................... 67
Lista de Abreviaturas, Siglas e Smbolos___________________________________________v
LISTA DE ABREVIATRUAS, SIGLAS E SMBOLOS
ASPGD Aspergillus Genome Data Base

ATCC American Type Culture Collection
BSA Albumina de Soro Bovino
cDNA DNA complementar
DEPC Dietil pirocarbonato
DMSO Dimetilsulfxido
dNTP Desxirribonucleotdes trifosfatos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
EDTA cido Etilenodiamina Tetraactico
g Gravidade
Kb Kilo bases
Mb Mega bases
MDMO Macrfagos Derivados de Medula ssea
mM Mili molar
MM Meio Mnimo
mRNA RNA mensageiro
ORF Regio Aberta de Leitura (Open Reading Frame)
PBS Salina Fosfato Tamponada
p/v peso/volume
pyrG gene orotidina-5-fosfato descarboxilase de A. fumigatu
r2 Coeficiente de correlao
rpm Rotao por minuto
RT-PCR Transcrio Reversa seguida de Reao em Cadeia da
polimerase
SBF Soro Bovino Fetal
SDS Dodecil Sulfato de Sdio
SSC Soluo Salina Citrato
TAE Tampo Tris-Acetato-EDTA
TE Tampo Tris-EDTA
Lista de Abreviaturas, Siglas e Smbolos___________________________________________vi
TRIS Tris-(hidroximetil)-aminometano
U Unidade
v/v volume/volume
Sumrio____________________________________________________________________vii
SUMRIO
RESUMO..................................................................................................... i
ABSTRACT................................................................................................. ii
LISTA DE FIGURAS................................................................................... iii
LISTA DE TABELAS.................................................................................. iv
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SMBOLOS................................ v
1. INTRODUO........................................................................................ 1
1.1 Aspergillus fumigatus.............................................................. 2
1.2 Aspergilose................................................................................ 3
1.3 A estrutura da parede celular.................................................. 6
1.4 A via de integridade da parede celular................................... 11
1.5 A protena fosfatase SIT4......................................................... 15
2. OBJETIVOS............................................................................................ 19
3. MATERIAIS E MTODOS...................................................................... 21
3.1 Declarao de tica.................................................................. 22
3.2 - Cepas e Meios de Cultura...................................................... 22
3.2.1 Sc-URA- (meio minimo)................................................. 22
3.2.2 YPD............................................................................... 23
3.2.3 L.B. (Lria Bertani)........................................................ 23
3.2.4 Meio Mnimo (MM)......................................................... 23
3.2.5 Meio Mnimo modificado (AMM).................................... 24

Sumrio___________________________________________________________________viii
3.2.6 Meio Completo (YAG, YUU, YG e YG+UU).................. 24
3.2.7 Meio RPMI 1640 (Gibco)............................................... 25
3.3 Solues e Tampes............................................................. 25
3.3.1 Salina Fosfato Tamponada (PBS)................................. 25
3.3.2 Tampo Tris-Acetato-EDTA (TAE) 50x concentrado.... 25
3.3.3 Tampo de ressuspenso de plasmdios...................... 26
3.3.4 Tampo de extrao de DNA........................................ 26
3.3.5 Tampo de amostra para eletroforese de DNA............. 26
3.3.6 Tampo MOPS 10x concentrado.................................. 26
3.3.7 Tampo de amostra para eletroforese de RNA............. 27
3.3.8 Tampo Tris-EDTA (TE) 1x........................................... 27
3.3.9 Tampo Acetato de Sdio 100mmol/L p.H. 4,6............. 27
3.3.10 Acetato de Ltio 1x....................................................... 27
3.3.11 Soluo de Elementos Traos..................................... 28
3.3.12 Soluo de Sais 20x para Meio Mnimo...................... 28
3.3.13 Soluo de Sais 20x para Meio Mnimo modificado
(AMM)..................................................................................... 28
3.3.14 Soluo 1 (protocolo de esferoplastizao de A.
fumigatus)............................................................................... 29
fumigatus)............................................................................... 29
3.3.16 - Soluo 3 (protocolo de esferoplastizao de A.
fumigatus)............................................................................... 29
Sumrio____________________________________________________________________ix
fumigatus)............................................................................... 29
fumigatus)............................................................................... 30
3.3.19 Soluo Salina Citrato (SSC) 20x concentrada........... 30
3.3.20 Soluo de lise para extrao de plasmdios.............. 30
3.3.21 Soluo de neutralizao para extrao de plasmdio 31
3.3.22 Soluo de SDS 10%.................................................. 31
3.3.23 Soluo de fixao para microscopia.......................... 31
3.3.24 Soluo de Calcoflor (CFW)...................................... 32
3.3.25 Tampo de extrao de Protenas.............................. 32
3.4 - Protocolos adotados.............................................................. 32
3.4.1 Construo do cassete de deleo pela tcnica de
recombinao in vivo em S. cereviseae............................... 32
3.4.2 Preparo de clulas competentes de S. cereviseae e
transformao......................................................................... 33
3.4.3 Extrao de DNA de S. cereveisae............................... 34
3.4.4 Preparo de clulas eletrocompetentes.......................... 35
3.4.5 Preparao em pequena escala de DNA plasmidial..... 35
3.4.6 Produo de esferoplastos de A. fumigatus.................. 36
3.4.7 Transformao de A. fumigatus.................................... 37
3.4.8 Southern Blot alcalino.................................................... 37
3.4.9 Marcao de sonda no radioativa............................... 38

Sumrio____________________________________________________________________x
3.4.10 Hibridao e revelao das membranas de Southern 38
Blot.........................................................................................
3.4.11 Extrao e manipulao de RNA................................ 39
3.4.12 Ensaios Fenotpicos.................................................... 40
3.4.13 Ensaios de formao de biofilme e adeso................. 40
3.4.14 Microscopia Eletrnica de Varredura.......................... 41
3.4.15 Microscopia eletrnica de transmisso....................... 41
3.4.16 Microscopias para determinao de quitina e -(1,3)- 42
glicanas..................................................................................
3.4.17 Anlise das protenas de superfcie dos condios....... 43
3.4.18 Modelo de aspergilose pulmonar em camundongos... 44
3.4.19 Histopatologia e Carga Fngica pulmonar.................. 45
3.4.20 ndice de Fagocitose................................................... 46
3.4.21 Destruio de condios por macrfagos alveolares..... 47
3.4.22 Determinao dos nveis de TNF-............................. 48
3.4.23 Inibio de PkcA.......................................................... 48
3.4.24 Western Blotting.......................................................... 49
4. Resultados.............................................................................................. 50
4.1 Identificao do homlogo de Sit4 em Aspergillus
fumigatus......................................................................................... 51
4.2 O mutante sitA tem problemas na integridade da parede
celular............................................................................................... 53
Sumrio____________________________________________________________________xi
4.3 A capacidade de adeso de sitA de A. fumigatus
reduzido........................................................................................... 63
4.4 O mutante sitA mais sensvel a inibidores de protena 70
quinase C.........................................................................................
4.5 SitA importante para a virulncia de A. fumigatus em
camundongos.................................................................................. 72
5. Discusso............................................................................................... 76
6. Concluso............................................................................................... 81
7. Referncias Bibliogrficas.................................................................... 83
8. APNDICE.............................................................................................. 112
8.1 Apndice A Artigo publicado: The Aspergillus fumigatus
sitA Phosphatase Homologue Is Important for Adhesion, Cell Wall
Integrity, Biofilm Formation, and Virulence. Eukariotic Cell. V. 14,
p. 728-744, 2015.... 113

_________________________________________________1. INTRODUO
Introduo__________________________________________________________________2
1.1 Aspergillus fumigatus
O gnero Aspergillus possui mais de 180 espcies (Samson, 1999),

incluindo Aspergillus fumigatus, um fungo saproftico, de distribuio ubqua na
natureza e capaz de colonizar diversos ambientes. A. fumigatus est associado
decomposio de matria orgnica e possui um papel muito importante na
reciclagem de nitrognio e carbono, alm de um amplo repertrio enzimtico
(Mullins et al, 1976; Debeaupuis et al, 1997).
Os condios de A. fumigatus so caracterizados pela sua colorao verde-
acinzentada, possuem entre 2,5 a 3m de dimetro, capacitando-os a alcanar
os alvolos pulmonares, (De Hoog G.S. e Guarro J, 1995; Pitt, 1994; Rchel e
Reichard, 1999). A micromorfologia desta espcie apresenta hifas hialinas e
septadas com paredes paralelas. A regio apical das hifas apresenta, ao
microscpio ptico, um aspecto de vesculas em forma de frasco, com uma srie
de filides uniseriadas, recobrindo dois teros superiores da superfcie. A.
fumigatus uma espcie termfila, que pode crescer em temperaturas
superiores a 55C e sobreviver a temperaturas acima de 70C (Samson, 1999;
Latg, 1999).
A existncia de uma forma teleomrfica (capacidade do fungo de se
reproduzir sexuadamente) de A. fumigatus foi durante muito tempo uma questo
de debate. Embora tenha sido descrito pela primeira vez h 145 anos, sua
capacidade de reproduo foi comprovada apenas recentemente (OGorman et
al, 2009), apesar de um screening no genoma ter revelado 215 genes
envolvidos no desenvolvimento sexual (Galagan et al, 2005; Dyer et al, 2009).
Algumas possveis explicaes para o fato do ciclo sexual em A. fumigatus no
ter sido reportado at hoje podem ser o fato de os parmetros ambientais na
natureza necessrios para iniciar o ciclo sexual raramente so encontrados, ou
a produo de cleistotcios pode ser confinada a substratos ainda no
sistematicamente monitorados (Dyer et al, 1992).
Introduo__________________________________________________________________3
A. fumigatus possui algumas caractersticas fisiolgicas que permitem

anlises moleculares precisas. Os condios so uninucleares e haplides,
permitindo o isolamento de clones e facilitando a seleo de mutantes atravs
do uso de tcnicas moleculares clssicas (DEnfert et al, 1999). Este gnero j
teve o seu genoma sequenciado (http://www.aspgd.org/) e, atualmente
diferentes mtodos de transformao e marcadores genticos esto bem
estabelecidos (Brakhage e Langfelder, 2002).
cada vez mais bvio que A. fumigatus possui caractersticas biolgicas
que lhe permitem suprimir e/ou escapar do sistema imune residual de pacientes
imunocomprometidos, tornando-o um patgeno oportunista agressivo. Os
determinantes de virulncia de A. fumigatus tais como aquisio de ferro,
produo de gliotoxina, melanina, sntese de policetdios, termo-tolerncia,
resistncia variaes de pH e ao estresse osmtico, enzimas com atividade
anti-oxidantes, proteases, toxinas, composio da parede celular, parecem ser
no mnimo diferentes entre a espcie no patognica A. nidulans (Brackhage,
2005).
1.2 - Aspergilose
A patogenicidade entre fungos, com raras excees, no necessria

para a manuteno ou disseminao das espcies. A capacidade dos fungos em
causar doenas parece estar relacionada ao estado imunolgico do paciente
(Wanke et al, 2000). A frequncia dessas infeces tem aumentado
significativamente ao longo das ltimas trs dcadas. (Brackhage, 2005) devido
o aumento drstico relacionado excessiva morbidade e relacionado ao
aumento de pacientes submetidos a transplantes de rgos, medula ssea,
transfuso de sangue, pacientes com AIDS, doenas neoplsicas, terapias
imunossupressivas, idade avanada e nascimentos prematuros (Pfaller e
Diekema, 2004; Bodey & Vartivarian, 1989; Ito & Lyons, 2002; Pegues et al,
2002; Duchini et al, 2002). Desta forma, o estabelecimento de uma infeco
fngica bem como seu desenvolvimento em tecidos hospedeiros requer certa
Introduo__________________________________________________________________4
agressividade do fungo sobre o hospedeiro quando este estiver debilitado (Latg

& Calderone, 2002).
A taxa de mortalidade por infeco invasiva de C. albicans tem diminudo
drasticamente com o uso profiltico de fluconazol. Entretanto, muitos centros
reportaram um grande aumento nas infeces causadas por outros fungos (Marr
et al, 2002). Dentre eles, o maior causador de doenas pulmonares invasivas
A. fumigatus, responsvel pelo desenvolvimento da aspergilose. A aspergilose
um termo geral que designa a doena causada por agentes etiolgicos
pertencentes ao gnero Aspergillus. Este gnero compreende vrias espcies
oportunistas que podem causar doenas invasivas, dentre elas A. fumigatus, A.
niger, A. flavus, A. terreus e A. nidulans, entretanto, cerca de 90% dos casos de
aspergilose invasiva so causados por A. fumigatus (Loudon et al, 1994; Hogan
et al, 1996). Diagnsticos especficos ainda so limitados assim como as
intervenes teraputicas, o que leva a aspergilose a altos nveis de mortalidade,
variando de 30% a 90% (Brakhage, 2005). Comparado ao A. fumigatus, as
demais espcies do gnero Aspergillus esto frequentemente associadas
colonizao isolada ou sinusites apenas. Em pacientes com transplante de
clulas-tronco, a mdia de sobrevivncia em um ano de apenas 20% de todos
os pacientes com infeces fngicas (Marr et al, 2002). Com os avanos
significativos feitos para a preveno de infeces como citomegalovirose e
candidiase, os fungos filamentosos apresentam-se como a principal causa de
morte de pacientes imunocomprometidos. Marr e colaboradores (2002)
estudaram a epidemiologia de infeces fngicas invasivas de um grande centro
de transplantes durante 15 anos. O estudo constatou que o ndice de aspergilose
no mnimo triplicou. Alm disso, em pacientes submetidos ao transplante de
corao, Aspergillus foi o patgeno oportunista com maior ndice de mortalidade
(Montoya et al, 2003). Estatsticas revelam que nos Estados Unidos o custo total
de tratamentos para aspergilose em 1996 foi de aproximadamente 633 milhes
de dlares (Stevens, 2004).
Em geral, A. fumigatus pode causar trs tipos de infeces: no primeiro
tipo, pacientes imunocompetentes acometidos pela infeco por A. fumigatus
Introduo__________________________________________________________________5
no manifestam a doena clinicamente. Neste caso, a infeco facilmente

revertida atravs da remoo do agente causal pelo prprio organismo.
Clinicamente, os pacientes apresentam reaes alrgicas, tais como: asma,
sinusite alrgica e alveolite. Um segundo tipo pode causar infeces mais
graves, como: aspergilose alrgica bronco-pulmonar a qual ocorre
principalmente em pacientes portadores de asma atpica ou fibrose cstica, que
pode causar desde asmas at a destruio dos pulmes (Latg, 1999);
aspergiloma, que atinge pacientes com histricos de doenas pulmonares pr-
existentes, formando uma massa esferide de hifas embebidas em matriz
protica, fibrinas e estruturas esporulantes na periferia (Latg, 1999) e no
terceiro tipo, a aspergilose invasiva que representa a forma mais severa da
doena atinge de 5 a 10% de pacientes transplantados (Rivera et al, 2006),
causa leses granulomatosas nos pulmes e brnquios e pode se disseminar
para o encfalo, trato gastrointestinal e rins (Latg, 1999). Estes dois ltimos
casos geralmente requerem interveno teraputica e apresentam altos nveis
de mortalidade e ocorrem majoritariamente em pacientes imunocomprometidos
ou imunossuprimidos, (Bodey & Vartivarian, 1989; Shibuya et al, 2004; Denning,
1998; Ellis, 1999).
Assim como as demais clulas vivas, o fungo A. fumigatus enfrenta
desafios para sobreviver a alteraes ambientais. Centenas de condios desse
fungo vindos do ambiente so inalados diariamente pelo hospedeiro e
imediatamente passam por drsticas mudanas nas condies do ambiente, tais
como reduo da presso de oxignio, aumento na temperatura, etc (Brakhage.,
2005; Chazalet et al, 1998; Hospenthal et al, 1998). Em pacientes
imunocompetentes, a limpeza mucociliar e a defesa por macrfagos
normalmente impede a infeco de A. fumigatus. O reconhecimento de
microorganismos invasores pelo sistema imune inato o primeiro passo
fundamental na defesa do paciente. Os macrfagos alveolares, principais clulas
residentes dos alvolos pulmonares, juntamente com os neutrfilos (os quais so
ativamente recrutados durante a inflamao), so as principais clulas
envolvidas na destruio de condios e hifas de A. fumigatus.
Introduo__________________________________________________________________6
Inicialmente os macrfagos fagocitam e matam os condios produzindo

espcies reativas de oxignio (ROS, reactive oxygen species) (Philippe et al;
2003). Alm dos macrfagos, leuccitos polimorfonucleares tambm so
capazes de fagocitar e matar condios dormentes. Os condios que escapam dos
macrfagos alveolares conseguem se desenvolver e formar hifas, mas so
atacados por neutrfilos, a segunda linha de defesa fagoctica celular. Os
neutrfilos aderem superfcie das hifas, j que as hifas so grandes demais
para ser fagocitadas, e o contato entre os neutrfilos e a hifa desencadeia a
degranulao, uma exploso respiratria e secretam intermedirios reativos de
oxignio (Meshulam et al, 1995; Jahn et al, 1996). Entretanto, pacientes
imunocomprometidos, com o sistema imune debilitado permitem a entrada dos
condios para germinar e invadir os tecidos pulmonares (Ellis, 1999; Rchel e
Reichard, 1999). Por fim, clulas epiteliais e endoteliais internalizam condios,
servindo como foco de infeco (Paris et al, 1997).
Nesse contexto, A. fumigatus pode ser considerado como o principal
fungo patognico em humanos, seguido de Cryptococcus neoformans,
Histoplasma capsulatum e Candida albicans (Mayer et al, 2013).
1.3 - A estrutura da parede celular
Os fungos tm a capacidade de colonizar diversos ambientes, tais como

solos, plantas, animais, fontes termais, excrementos de pssaros, ambientes
aquticos, salinas, superfcies rochosas e at mesmo ambientes com
temperaturas congelantes. Toda essa plasticidade deve-se habilidade que
estes organismos possuem de regular e alterar a expresso gnica de diversas
vias de sinalizao responsveis pela resposta s mudanas de temperaturas,
pH, limitaes de nutrientes, estresses oxidativo e osmtico (Fuchs e Mylonakis,
2009). A principal defesa dos fungos para sobreviver a essas mudanas
ambientais a parede celular.
A parede celular dos fungos uma organela altamente complexa
responsvel pela definio da forma das clulas fngicas, proteo contra
Introduo__________________________________________________________________7
estresses osmticos e danos estruturais, entre outros (Lesage e Bussey, 2006).

A parede est intimamente em contato com a membrana citoplasmtica
(Svoboda, 2004), essencial no crescimento celular, diferenciao e reproduo
(Smits et al, 2001; Durn and Nombela, 2004) e est em uma constante
remodelamento durante o crescimento e desenvolvimento celular (Adams,
2004). Tais funes requerem um alto nvel de controle para no comprometer
sua funo protetora enquanto altera sua forma e tamanho. A parede celular
uma estrutura nica encontrada em fungos e plantas. Embora a composio da
parede celular possa variar entre os fungos, sua composio consiste
basicamente de - e -glicanos (o principal componente da bicamada da parede
celular), derivados de N-acetilglucosamina, manoprotenas e outros tipos de
glicoprotenas (Fuchs e Mylonakis, 2009). Devido aos danos infligidos, a parede
celular pode ser reparada e ainda aumentar a biossntese da parede celular e a
integrao de componentes quando exposta um ambiente favorvel ou hostl.
A quitina, um homopolmero de N-acetilglicosamina associada por ligaes (1-
4), um componente essencial na formao da parede celular e septos de todos
os fungos patognicos, sendo tambm encontrada nos cistos da ameba, nas
cascas de ovos, no revestimento intestinal de nemtodos e no exoesqueleto de
invertebrados vetores de doenas em humanos, como mosquitos, carrapatos e
caramujos (Lenardon et al, 2010; Munro e Gow, 2001; Latg, 2007). A cadeia
primria de polissacardeos nascente de quitina se dobra sobre si prpria criando
uma cadeia antiparalela, formando ligaes de hidrognio que aumentam a
rigidez do carboidrato em crescimento, dando origem as microfibrilas mais
resistentes da natureza, sendo mais rgida que o osso e o ao, em uma
comparao peso por peso (Lenardon et al, 2010). A rede 3D das microfibrilas
de quitina se associam covalentemente a (1,3)-glicanos, uma estrutura
secundria de polissacardeos amplamente encontrada principalmente nas
paredes celulares de fungos (Klis et al, 2006). Uma parte da quitina dos fungos
sintetizada e deacetilada em quitosana pela ao de uma ou mais quitina
deacetilases. Em C. albicans, menos de 5% da quitina deacetilada, enquanto
que a maioria dos zigomicetos e o basidiomiceto C. neoformans possuem mais
de dois teros de quitosana deacetilada (Bartnicki-Garcia, 1968; Baker et al,
Introduo__________________________________________________________________8
2007). A deacetilao de quitina em quitosana torna o polmero mais elstico e

protege contra a ao de quitinases.
A aparente simplicidade da estrutura primria de quitina mascara a
complexidade por trs de seu processo biossinttico. A quitina sintetizada por
uma ampla famlia de enzimas denominadas quitinas sintases (CHS, Chitin
Synthase), que dividida em sete subclasses. A atividade da classe I dessas
enzimas a mais bem compreendida em ensaios bioqumicos in vitro, porm
essa classe contribui apenas para a sntese de uma pequena frao de quitina
na parede celular. Mutantes com delees de CHSs classe I so altamente
viveis e apresentam suaves fentipos em condies sem estresse (Munro e
Gow, 2001). A classe II dessas enzimas frequentemente no mensurvel em
ensaios enzimticos e produzem pequena quantidade de quitinas, porm a
deleo dessas enzimas resulta em efeitos deletrios na viabilidade celular
atravs de processos vitais como a formao de septos (Munro et al, 2001). A
classe IV de CHS produz uma quantidade substancial de quitina, porm a
maioria dos mutantes so viveis, embora alguns apresentem atenuao na
virulncia (Bulawa et al, 1995). As classes IV, V e VII compartilham certa
homologia em suas sequncias, e as protenas de classe V e algumas classes
VII possuem domnios do tipo miosina. As protenas CHS do tipo III, V, VI e VII
foram identificadas apenas em fungos filamentosos e alguns fungos dimrficos,
mas esto ausentes em leveduras como S. cerevisiae e C. albicans. A
multiplicidade de enzimas CHS sugere que elas possam ter atividades
redundantes na sntese da parede celular. Est claro que a expresso e a
atividade de CHS altamente regulada durante o ciclo celular em condies de
estresse, como uma resposta potenciais agentes que causem dano
integridade da parede celular, tais como enzimas com atividade ltica,
antibiticos ou agentes oxidantes gerados dentro dos fagolisossomos ou
linfcitos. Entretanto, a importncia funcional das classes de CHSs no est
clara e parece ser varivel entre as espcies fngicas (Munro e Gow, 2001;
Latg, 2007). Assim, o papel de diversas CHSs est sendo investigado
principalmente por anlises de cepas mutantes contendo a deleo dessas
CHSs (Lenardon et al, 2010).
Introduo__________________________________________________________________9
Em 1980, Enrico Cabib e colaboradores descreveram um trabalho sobre

a sntese de -(1,3)-glicanos em S. cerevisiae e, desde ento tem sido
amplamente estudado em diversos organismos, tais como N. crassa (Hrmova et
al, 1989), A. nidulans (Kelly et al, 1996), A. fumigatus (Beauvais et al, 1993; Kurtz
et al, 1994), S. pombe (Ribas et al, 1991), C. albicans (Orlean, 1982), C.
neoformans (Thompson et al, 1999), Fusarium solani (Young-sil et al, 2006).
Embora existam em diversos organismos, todas as enzimas so complexos
associados membrana que utilizam UDP-glicose como substrato e produzem
uma cadeia linear de polissacardio (Douglas C.M., 2001). Em S. cerevisiae, dois
genes esto relacionados -(1,3)-glicano sintase, FKS1 e FKS2 (Mazur et al,
1995). As duas protenas Fks1p e Fks2p, com 87% de homologia so
consideradas subunidades do complexo enzimtico da enzima -(1,3)-glicano
sintase e, a deleo simultnea desses dois genes letal em S. cerevisiae
(Mazur et al, 1995). A atividade da (1,3)-glicano sintase em S. cerevisiae requer
Rho1p, uma protena que no s interage com Fks, mas tambm com a protena
quinase C (Pkc1p), que conhecido como regulador da cascada de sinalizao
da MAPK e da via de organizao do citoesqueleto de actina (Mazur et al, 1996;
Qadota et al, 1996; Kamada et al, 1996; Nonaka et al, 1995; Drgonova et al,
1996). Como um regulador multifuncional, Rho1p atua como um interruptor que
interage com diversas protenas, dentre elas o fator de troca de
guaninanucleotdios codificados por ROM1 e ROM2 (Delley e Hall, 1999) que
pode trocar Rho1p ligado a GTP por GDP e, protenas ativadoras de GTPases
tais como Bem2p. Sac7p e Lrg1p, que estimulam a transio da forma GTP ativa
para a forma GDP menos ativa (Watanabe et al, 2001). Alm disso, Rho1p
precisa ser modificada ps-traducionalmente para estimular a atividade (1,3)-
glicano sintase, se ligando diretamente a Fks1p (Inoue et al, 1999). A regulao
transcripcional da expresso dos genes FKS em S. cerevisiae reflete um
complexo circuito em resposta a diversos sinais de estresse, crescimento e
desenvolvimento. Durante o crescimento vegetativo, FKS1 preferencialmente
expresso (Abe et al, 2001), entretanto FKS2 altamente expresso durante
estresses causados por alta temperatura, crescimento em meio sem glicose,
Introduo_________________________________________________________________10
perda de FKS1, em resposta a fatores de sexuais e/ou incio de esporulao

(Mazur et al, 1995; Zhao et al, 1998).
Em muitas espcies, como em C. albicans, a maior classe de protenas

de parede celular est ligada por GPIs (1,3)-glicanos e quitina por ligaes
ramificadas (1,6)-glicanos (Klis et al, 2006).
Como relatado ante riormente, a internalizao dos esporos por
macrfagos o componente chave da primeira linha de defesa contra infeces
fngicas, incluindo aspergilose (Dagenais et al, 2010). Uma srie de estudos
relacionados fagocitose de esporos tem apresentado um entendimento parcial
desse processo complexo (Dagenais et al, 2010). O reconhecimento do esporo
um passo essencial para a fagocitose e a ativao dos macrfagos. Neste
processo, molculas de superfcie denominadas MAMPs (microbe-associated
molecular patterns, Didierlaurent et al, 2002) so componentes essenciais. A
MAMP mais bem caracterizada em fungos a (1,3)-glicana a qual
reconhecida em humanos pelo receptor dectina-1 (Brown, G. D. e S. Gordon,
2001). Em geral, os esporos prontamente fagocitados apresentam grande
quantidade de -(1,3)-glicano na superfcie. Por outro lado, esporos contendo
pequenas quantidades de -(1,3)-glicano superficial, como o caso de esporos
dormentes, esto associadas baixa taxa de fagocitose (Luther et al, 2007).
Neste sentido foi demostrado que a cepa mutante de A. fumigatus pksP
(condio sem pigmento), apresenta altas concentraes de -(1,3)-glicano na
superfcie dos condios e, consequentemente sofre altas taxas de internalizao
de seus condios (Jahn et al, 2002)
Adicionalmente ao reconhecimento de -(1,3)-glicanos, outras molculas
tm sido especuladas como participando no evento de fagocitose dos esporos
(Dagenais et al, 2010). Metablitos difundidos por esporos tm sido reportados
por afetar macrfagos, auxiliando no estabelecimento da aspergilose (Mitchell et
al, 1997). Estes metablitos, tais como gliotoxina (Mllbacher e Eichner, 1984) e
fumigatoxina (Fischer et al, 1999) agem de maneira a inibir a fagocitose (Bertout
et al, 2002). A arquitetura dos esporos tambm influencia na internalizao
celular e a camada mais externa da parede celular dos conidios de Aspergillus
Introduo_________________________________________________________________11
composta de microfibrilas proticas chamadas de rodlets. Essas protenas so

hidrofobinas codificadas primariamente por RodA, que conferem propriedades
fisioquimicas que medeiam a disperso conidial e, possivelmente, interaes
celulares (Girardin et al, 1999, Thau et al,1994). Em particular, mutantes rodA
que perderam a camada de rodlets, so mais sensveis morte por macrfagos
(Paris et al, 2003).
1.4 - A via de integridade da parede celular
Em S. cerevisiae, a via de integridade da parede celular (CWI, cell wall

integrity) regula a sntese da parede durante o ciclo celular e possui atividade
reparadora quando a parede danificada (revisada em Levin, 2005). Elementos
essenciais nessa via incluem uma srie de sensores da membrana plasmtica,
que atuam atravs de GTPases tipo-Rho, atravs de uma cascada de protenas
efetoras. Uma das protenas efetoras mais importantes nessa via Pkc1p
(calcium-dependent protein kinase), uma protena quinase que regula uma srie
de genes relacionados parede celular e morfognese via cascata de MAP
(Mitogen Activated Protein) quinases. Vias similares existem em outras
leveduras, como Schizosaccharomyces pombe (Perez e Calonge, 2002), C.
albicans (Monge et al, 2006) e C. neoformans (Gerik et al, 2005). A via de
sinalizao da MAPK altamente conservada, formando uma via linear ativada
pela fosforilao de resduos de treonina e tirosina em um motivo altamente
conservado, de trs protenas quinases: a MAPK, MAPK quinase (MAPKK) e a
MAPK quinase quinase (MAPKKK). Em S. cerevisiae, Pkc1 ativa Bkc1
(MAPKKK), a qual fosforila Mkk1 e Mkk2 (protenas redundantes da MAPKK), e
ento fosforila Slt2/Mpk1 (MAPK). Finalmente, fatores de transcrio e outras
protenas alvos so regulados pela modulao da MAPK (Valiante et al, 2008).
Embora uma equivalncia completa da via de CWI em leveduras ainda
no seja demonstrada em fungos filamentosos, vrias linhas de evidncia
parecem existir. Em A.niger, estresses causados por diversos agentes, incluindo
CFW (Calcofluor White), um composto fluorescente que se liga s cadeias
nascentes de quitina desestabilizando desta forma a integridade da parede
Introduo_________________________________________________________________12
(Elorza et al, 1983), resultam em um aumento na transcrio dos genes de

sntese de parede celular GfaA (Ram et al, 2004) e AgsA (Damveld et al, 2005b),
que codificam respectivamente a glutamina:frutose-6-fosfato aminotransferase e
a -1,3-glicano sintase. A expresso desses genes regulada pelo fator de
transcrio Rlm1p, o qual possui papel ortlogo em levedura na via de CWI.
(Damveld et al, 2005a). Similarmente, em A. nidulans, a deleo de MpkA,
ortlogo do componente da cascada da MAP quinase, Mpk1 (Bussink e Osmani,
1999), ou o mau funcionamento de RhoA, ortlogo de Rho1 em leveduras (Guest
et al, 2004), produzem fentipos consistentes com o papeldessas protenas na
via de integridade da parede celular, como alterao na germinao, defeitos na
ramificao e alterao na parede celular. Os genes ortlogos para o restante
dos componentes da via de CWI em levedura foram identificados em genomas
de fungos filamentosos por pesquisas in silico (Muthuvijayan e Marten, 2004;
Fernandes et al, 2005) e assim, as principais vias que regulam o metabolismo
da parede celular tanto de leveduras quanto fungos filamentosos so
aparentemente bem conservadas, embora algumas diferenas sejam esperadas
(Teepe et al, 2006).
A anlise do genoma de A. fumigatus revelou a presena de 4 genes que
codificam MAP quinases, nomeadas SakA (ortlogo de Hog1), MpkA, MpkB e
MpkC (May et al, 2005). A SakA possui 82% de identidade com a MAP quinase
Hog1 de S. cerevisiae. A via Hog1 de S. cerevisiae ativada durante a
adaptao alta osmolaridade (Brewster et al, 1993). O Mutante sakA em A.
fumigatus est envolvido na regulao da germinao de condios, estresse
osmtico e privao de fontes de carbono e nitrognio (May et al, 2005; May,
2008; Reyes et al, 2006; Valiante et al, 2008; Valiante et al, 2009; Xue et al,
2004). A MpkC possui 65% de identidade com a Hog1. Os mutantes nulos de
mpkC em A. fumigatus so incapazes de crescer em meios contendo sorbitol
e manitol como fonte de carbono (Reyes et al, 2006). Com relao sequncia
de aminocidos, SakA e MpkC possuem alto grau de similaridade (68%) e,
segundo Hagiwara et al. (2014) ambas participam da via de HOG, sendo que
SakA possui um papel predominante na fase de hifa e, SakA e MpkC
cooperativamente conferem resistncia aos condios via fator de transcrio
Introduo_________________________________________________________________13
AtfA. O MpkB possui 60% de identidade com Fus3, e 61% com Kss1 de S.
cerevisiae. Em. S. cerevisiae, as vias reguladas por Fus3 e Kss1 contribuem
para reproduo, crescimento invasivo e vegetativo (Wang e Dohlman, 2005;
Bardwell, 2005). O MpkA compartilha 68% de identidade com Slt2/Mpk1 de S.
cerevisiae (Lee et al, 1993). Homlogos de MpkA tem sido relacionados com a
via de integridade da parede celular (Valiante et al, 2008).
Diante da importncia que desempenha, a parede celular tem sido
amplamente estudada como possvel alvo para combater o desenvolvimento de
fungos filamentosos incluindo A. fumigatus (Bruneau et al, 2001). A vantagem no
estudo da parede celular reside no fato de que essa estrutura no encontrada
em mamferos, sendo assim um potencial alvo para o desenvolvimento de
terapias sem riscos sade do paciente (Valiante et al, 2009). Apesar de sua
importncia, a parede celular fngica ainda pouco entendida em termos de
biossntese, composio e os mecanismos de sinalizao desencadeados
durante o crescimento vegetativo e em condies de estresse. Alguns genes
envolvidos no metabolismo da parede celular de A. fumigatus foram isolados
(Beauvais e Latg, 2001), de forma que seu conhecimento juntamente com
estudos bioqumicos comearam a nos dar algumas pistas sobre a sntese de
componentes da parede celular (Latg et al, 2005).
Uma das protenas efetoras mais importantes nessa via a protena
quinase C (Pkc) . Em S. cerevisiae, Pkc1 aciona a via de cascada de sinalizao
da MAP quinase em resposta a um dano na parede celular, ativando assim a
resposta transcricional (Heinisch, 1999). A PKC tambm regula o transportador
da quitina sintase (Chs3, Valdivia e Schekman, 2003). Pck1 e Pck2 de S. pombe
regulam a sntese de glicanos (Calonge et al, 2000, Katayama et al, 1999;
Arellano et al, 1999).
PKCs foram isoladas de outros fungos, incluindo fungos dimrficos e
filamentosos (Schmitz e Heinisch, 2003; Heung et al, 2004; Oeser, 1998;
Morawetz et al, 1996; Zhang et al, 2001; Paravicini et al, 1996; Ambra e Macino,
200; Aquino-Pinero e Rodriguez-Del Valle, 2002). A deleo de PKC1 no fungo
pleomrfico C. albicans resultou em lise celular, a qual foi revertida com aumento
da osmolaridade do meio de cultura (Paravacini et al, 1996). Estudos em N.
Introduo_________________________________________________________________14
crassa identificaram PKC como componente na resposta luz azul (Arpaia et al,
1999; Franchi e Macino, 2005).
As PKCs desempenham um papel importante na regulao do
crescimento e na sobrevivncia de clulas animais atravs da via de transduo
de sinais que causam a hidrlise lipdica. Pelo menos 10 isozimas de PKC foram
identificadas em mamferos (Gallegos et al, 2006; Newton, 2001, 2003). Essas
so classificadas em trs subfamlias baseadas na variabilidade de sua
estrutura, nos domnios reguladores e nos cofatores requeridos para a ativao:
(i) a PKC convencional ou clssica que requer Ca2+, diacilglicerol (DAG) e
fosfatidilserina (FS) para a ativao; (ii) novas PKCs que requerem FS e DAG
para sua ativao; e (iii) uma PKC atpica que no requer DAG ou Ca2+, apenas
FS. Os domnios reguladores para todas as isozimas de PKC em mamferos tm
duas funes principais: elas marcam apropriadamente a localizao celular das
quinases e regulam a sua atividade alterando a ligao de uma sequncia de um
pseudosubstrato que inativa o stio ativo (Newton, 2001, 2003). A ligao de
cofatores como DAG libera a autoinibio atravs de modificaes
conformacionais e libera o stio ativo para a fosforilao de substratos.
O genoma de N. crassa possui um nico gene de PKC (NPKC) predito
(Franchi et al, 2005). O mutante nocaute produzido pelo Projeto Genoma de
Neurospora (Colot et al, 2006) letal, indicando um papel essencial para essa
protena quinase em Neurospora. A sua sequncia de aminocidos mostra que,
como outras PKCs em fungos, mais similar nova PKC de mamferos do que
as PKCs convencionais, que predita como sendo Ca2+ dependente (Schmitz
e Heinisch, 2003).
As leveduras possuem uma ou duas PKCs que compartilham a mesma
estrutura das PKCs em mamferos. Um gene PKC (PKC1) de S. cerevisiae e
duas (pck1+, pck2+) de S. pombe foram identificadas e intensivamente
estudadas. Essas PKCs possuem domnios serina/treonina quinase, domnios
reguladores (viz., domnios C1, C2 e HR1) e uma sequncia de
pseudosubstratos. Em S. cerevisiae, os domnios C1 e HR1 esto envolvidos na
interao com GTPase Rho1 (Schmitz et al, 2001, 2002; Nonaka et al, 1995).
Embora as funes do domnio C2 permaneam pouco entendidas, o domnio
Introduo_________________________________________________________________15
C2 da Pkc1 fusionado GFP est localizado no fuso mittico (Denis e Cyert,

2005). Os pseudosubstratos so sequncias curtas de aminoacidos que se
assemelham a sequncias de protenas substrato, exceto pelo resduo do
fosforeceptor, que ocupado por uma alanina. As sequncias de
pseudosubstatos so preditas por ocupar o stio cataltico e manter a molcula
de PKC em um estado inativo (Nonaka et al, 1995; Watanabe et al, 1994). As
PKCs de S. cerevisiae e S. pombe esto envolvidas na regulao da parede
celular atravs de diversos mecanismos (Schmitz, 2003; Perez e Calonge,
2002).
1.5 - A protena fosfatase SIT4
Em muitos processos celulares, as reaes reversveis de

fosforilao/defosforilao desempenham um papel importante na regulao de
atividades proticas e na localizao subcelular. Como enzimas que neutralizam
a funo de protenas quinases, protenas fosfatases so bem estabelecidas
como coordenadores chaves de diversos eventos biolgicos (Son e Osmani,
2009). Trs critrios principais so utilizados para classificar as protenas
fosfatases: (i) a homologia da sequncia, (ii) a estrutura e (iii) os mecanismos
catalticos relacionados especificidade pelo substrato. De acordo com essas
caractersticas, as fosfatases so divididas em trs grupos principais: (i) as
fosfatases serina/treonina clssica, (ii) as protenas tirosina fosfatase e as (iii) as
protenas fosfatases com catlise baseada em aspartato (Moorhead et al, 2007).
As protenas fosfatases Ser/Thr clssicas podem ainda ser divididas em
fosfoprotenas fosfatases (PPP, phosphoprotein phosphatase) e protena
fosfatase dependente de Mg+2/Mn+2 (PPM). Todos os membros da famlia PPP
apresentam grande semelhana entre as suas sequncias e possuem um motivo
cataltico de fosfoesterase em comum altamente conservado (PP2Ac). Quanto
as funes biolgicas, estas podem variar desde a regulao mittica (PPI)
(Doonan e Morris, 1989), a resposta imunolgica (PP2B) (Beals et al, 1997), a
resposta ao dano ao DNA (PP4) (Gingras et al, 2005) e sinalizao da luz azul
em plantas (PP7) (Moller et al, 2003). As protenas fosfatases do tipo PP2C
Introduo_________________________________________________________________16
fazem parte da famlia PPM e so caracterizadas pela similaridade de sua

estrutura com o domnio cataltico das PPPs, apesar da ausncia de qualquer
similaridade na sequncia (Moorhead et al, 2007). A superfamlia da protena
tirosina fosfatase (PTP) distinta pelo seu motivo cataltico Cx5R compartilhada
por todas as protenas da famlia. Essas consistem da PTP clssica, a fosfatase
dupla-especfica (DSPs), fosfatases tipo Cdc25 e as fosfatases de baixo peso
molecular. As PTPs esto relacionadas a funes de adeso celular, sinalizao
clula-clula, podendo no somente defosforilar resduos de tirosina como
tambm possuindo atividade relacionada resduos de Ser/Thr. Elas influenciam
a sada da mitose (Visintin et al, 1998), a sinalizao de PIP3 (Goberdhan et al,
1999), a regulao da entrada na fase mittica pela ativao da protena quiinase
dependente de ciclina (Cdk1) (Gautier et al., 1991). As fosfatases baseadas na
catlise de aspartato so definidas por compartilhar o motivo DXDXT/V (CPDs).
O primeiro membro descoberto em S. cerevisiae, FCP1, uma fosfatase
essencial na coordenao na condio do domno C-terminal da subunidade
maior da RNA polimerase II (RNAP II CTD) e assim regula a atividade
transcricional da maquinaria (Kobor et al, 1999). Adicionalmente a essas
principais famlias de protenas fosfatases, SSU72 e as tirosina fosfatases so
consideradas dois tipos separados de fosfatases, embora ambas possuam
similaridade signfificativas em suas sequncias com as PTPs (Ganem et al.,
2003; Meinhart et al, 2005). No momento, a Cdc25 e a Cdc14 da superfamlia
PTP e PP1 e PP2A da famlia das fosfatases Ser/Thr clssicas so as protenas
fosfatases com funes mitticas mais bem estudadas (Son e Osmani, 2009).
Em S. cerevisiae, protenas fosfatases Msg5p e Sdp1p defosforilam Mpk1,
contribuindo para a regulao dessa via de transduo de sinal (Martn et al,
2005). Angeles de la Torre-Ruiz et al (2002) e Di Como e Arndt (1996) reportaram
que a correta regulao de ambas atividades basal e induzida das vias PKC1-
MAPK e TOR (Target of Rapamycin) requerem a funo da protena Sit4p. A
Sit4p uma protena fosfatase do tipo 2A serina-treonina que funciona na
transio de G1/S do ciclo mittico com localizao nuclear e que modula
funes mediadas por Pkc1p, incluindo a via de integridade da parede celular e
Introduo_________________________________________________________________17
organizao do citoesqueleto de actina (Sutton et al, 1991; Angeles de la Torre-

Ruiz et al, 2002; Zabrocki et al, 2002; Huh et al, 2003).
As vias de sinalizao das protenas Pkc1p e TOR so bem conservadas
em leveduras e em diversos fungos desempenhando papel relevante na
resposta ao estresse e a sobrevivncia. Alm de regular as atividades de
crescimento e metabolismo em clulas normais, essas vias tambm regulam
respostas celulares a estresse da parede celular durante o ciclo celular, choque
trmico, e outros agentes que possam comprometer a integridade celular
(Kamada et al, 1995; Gray et al, 1997; de Nobel et al, 2000).
Em S. cerevisiae, a via de TOR constituda de duas protenas Tor1p e
Tor2p, que esto localizadas em dois complexos proticos TORC1 e TORC2
(Loewith et al, 2002; Wedaman et al, 2003). O complexo TORC1 sensvel a
tratamentos com rapamicina e contm as protenas Tor1p ou Tor2p, Kog1p,
Tco89p e Lst8p (Loewith et al, 2002; Zheng et al, 1995; Helliwell et al, 1998; Hall,
1996). J o complexo TORC2 resistente ao tratamento com rapamicina contm
Tor2p, Avo1p, Avo2p, Avo3p, Bit61p, e Lst8p (Loewith et al, 2003; Zheng et al,
1995). Estudos recentes de localizao subcelular demonstraram que Tor1p
encontra-se de forma concentrada nas membranas vacuolares enquanto Tor2p
est predominantemente pontuada em estruturas prximas superfcie
citoplasmtica da membrana plasmtica (Sturgill et al, 2008). Essas diferenas
na composio, sensibilidade rapamicina e na localizao celular confirmam a
hiptese de que esses complexos trabalham separadamente (Loewith et al,
2002; Zheng et al, 1995; Sturgill et al, 2008). A via de sinalizao TOR
importante para o sensoreamento de nutrientes e acredita-se que desempenha
um papel importante na extenso da vida celular (Lavoie e Whiteway, 2008;
Kaeberlein et al, 2005; Kaeberlein e Kapahi, 2009; Selman et al, 2009).
Embora TOR seja uma via tanto estruturalmente quanto funcionalmente
conservada desde leveduras at humanos, seus papis no so idnticos
biologicamente entre as espcies e precisam de uma caracterizao mais
detalhada. Rho1p regulada por dois mecanismos, um mecanismo TOR
independente que ativado pelo estresse causado na parede celular e um
mecanismo separado TORC2-dependente que regula a reorganizao do
Introduo_________________________________________________________________18
citoesqueleto de actina atravs da Rho1p-dependente da ativao de PKC1

(Newton, 2010).
O gene SIT4 de S. cerevisiae codifica uma protena fosfatase que responsvel
pela defosforilao de Npr1p in vivo durante a privao de nutrientes (Schmidt
et al, 1998). Quando ativa, TORC1 fosforila Tap42p, que ento se liga em Sit4p
e a mantm inativa (Jiang e Broach, 1999), dessa forma, a atividade de Sit4p
negativamente regulada por TORC1 (Di como e Arndt, 1996). Em estudos
anteriores, Npr1p manteve-se em um estado hiperfosforilado no mutante sit4
tratado com rapamicina, indicando que a defosforilao diretamente
dependente da atividade de Sit4p (Jacinto, 2007; Jacinto et al, 2001).
Como descrito anteriormente, Sit4 participa de vrios processos celulares
tais como a via de Tor mediada por resposta a nutrientes (Di Como e Arndt, 1996;
Beck e Hall; 1999, Jiang e Broach, 1999), a via de sinalizao de PKC (Angeles
de la Torre-Ruiz et al, 2002), a regulao da homeostase de ons monovalentes
e pH intracelular (Masuda et al, 2000). A Sit4 possui tambm um papel
importante na regulao do ciclo celular, j que necessria para a correta
transio de G1 para a fase S (Sutton e Arndt, 1991; Mann et al, 1993) e por isso
mutantes nulos para SIT4 apresentam crescimento reduzido (Sutton e Arndt,
1991; Di Como et al, 1995; Sutton e Freiman, 1997; Clotet et al, 1999). Este
atraso causado em partes pelo papel de Sit4 no controle transcricional das
ciclinas CLN1 e CLN2 em G1 e, tambm no controle de SWI4, que codifica uma
protena ligadora de DNA necessria para a regulao transcricional de
CLN1/CLN2 (Fernandez-Sarabia et al, 1992; Di Como et al, 1995). Acredita-se
que Sit4 tambm regula CLN3 atravs da ativao da expresso de CLN1 e
CLN2 atravs de BCK2 (Di como et al, 1995).
__________________________________________2. OBJETIVOS
Objetivos__________________________________________________________________20
Recentemente, visando uma melhor compreenso das funes das

protenas fosfatases de A. fumigatus, nosso grupo identificou 32 genes que
codificam protenas fosfatases, dos quais 24 foram deletados (Winkelstrter et
al, 2015 ). Dentre os genes deletados nesta coleo de mutantes de protenas
fosfatases, ns identificamos SitA, a protena fosfatase homloga de Sit4p de S.
cerevisiae.
Com isso, o objetivo do presente trabalho :
(i) Isolar e caracterizar fenotipcamente o mutante sitA;
(ii) Analisar a virulncia de sitA em modelo de aspergilose pulmonar

invasiva em camundongos.
_______________________________3. MATERIAIS E MTODOS
Materiais e Mtodos__________________________________________________________22
3.1 - Declaraes de tica
Os princpios utilizados em nossos estudos so baseados na Declarao

de direitos animais descritos pela UNESCO em 27 de Janeiro de 1978, nos
artigos 8 e 14.
Todos os protocolos usados no presente estudo foram aprovados pelo
comit de tica para experimentos animais do Campus de Ribeiro Preto,
Universidade de So Paulo (Nmero de permisso: 08.1.1277.53.6; estudo na
interao de Aspergillus fumigatus com animais). Todos os animais foram
agrupados em gaiolas ventiladas contendo cinco animais cada e foram cuidados
de acordo com os princpios determinados pelo Colgio Brasileiro de
Experimentao Animal (Princpios ticos na Experimentao Animal Colgio
Brasileiro de Experimentao Animal, COBEA) e Guia de Princpios para
Pesquisa Envolvendo Animais e Seres Humanos, Sociedade Americana de
Fisiologia. Visando minimizar o sofrimento, os animais foram clinicamente
monitorados pelo menos duas vezes ao dia e animais moribundos (definido por
letargia, dispnia, hipotermia e perda de peso) foram humanamente sacrificados.
Todos os animais utilizados foram sacrificados por deslocamento cervical.
3.2 - Cepas e Meios de Cultura
3.2.1 - Sc-URA- (meio minimo)
Base de Nitrognio para Levedura 0,67% (p/v)

Glicose 2,00% (p/v)
Lisina; Leucina; Triptofano 0,01% (p/v)
Histidina 0,005% (p/v)
gua desatilada q.s.p. 1.000 mL
O meio SC definido como um meio minimo de cultura de leveduras. As
substncias que compem o meio foram adicionadas em gua destilada e foram
esterilizados por calor mido em autoclave a 120C e 1 kgf/cm2 por 20 minutos.
3.2.2 YPD
Peptona 20 g
Extrato de levdura 10 g
Dextrose 40 g
gar 15 g
As substncias que compem o meio foram adicionadas em gua destilada e
foram esterilizados por calor mido em autoclave a 120C e 1 kgf/cm2 por 20
minutos.
3.2.3 - L.B. (Lria Bertani)
Bactotriptona 10 g
Extrato de levedura 5 g
Cloreto de Sdio 10 g
gar 18 g
gua destilada q.s.p. 1.000 mL
minutos.
3.2.4 - Meio Mnimo (MM)
Soluo de Sais 5,0% (p/v)

Dextrose 1,0% (p/v)
Soluo de elementos traos 0,1% (p/v)
gar (Difco) 2% (p/v)
minutos. Para MM 2x glicose, acrescentou-se duas vezes a quantidade de

glicose.
3.2.5 - Meio Mnimo modificado (AMM)
Soluo de Sais para AMM 5% (p/v)

Glicose 1% (p/v)
KCl 0,6 M
gar (Difco) 2% (p/v)
minutos. Ao meio autoclavado foi adicionado tartarato de amnio (Sigma) 10 mM
ou nitrato de amnio (Sigma) 10 mM.
3.2.6 - Meio Completo (YAG, YUU, YG e YG+UU)
Extrato de levedura 0,5% (p/v)

Glicose 2,0% (p/v)
gar 2,0% (p/v)
Soluo de elementos traos 0,1% (p/v)
minutos. YUU indica o meio de cultura completo YAG com a suplementao de
uridina 4 mmol/L e uracila 10 mmol/L. O meio de regenerao de esferoplastos,
utilizado na transformao de A. fumigatus consiste do meio completo
suplementado com KCl 0,6 mmol/L. Os meios YG e YG+UU so iguais em
composio, respectivamente com YAG e YUU, exceto pela ausncia de gar
2% (p/v). Para meio Top gar, utilizado na regenerao de esferoplastos, apenas
1% (p/v) de gar foi adicionado. Para YAG 2x glicose, acrescentou-se duas
vezes a quantidade de glicose.
3.2.7 Meio RPMI 1640 (Gibco)
Um sach de RPMI 1640 dissolvido em 1 Litro de gua destilada, podendo ser

suplementado com soro fetal bovino (FBS, Gibco), HEPES (2,4 g/L, J.T. Baker),
LCCM (L-929 cell conditioned media), L-glutamina e ento filtrado com o sistema
a vcuo Stericup and Steritop (Millipore).
3.3 Solues e Tampes
3.3.1 - Salina Fosfato Tamponada (PBS)
NaCl 8,00 g
KCl 0,20 g
Na2HPO4 1,15 g
KH2PO4 0,20 g
As substncias que compem o meio foram adicionadas em gua destilada e o
pH foi ajustado para 7,4. O tampo foi esterilizado por calor mido em autoclave
a 120C e 1 kgf/cm2 por 20 minutos.
3.3.2 - Tampo Tris-Acetato-EDTA (TAE) 50x concentrado
Tris Base 242 g

cido Actico Glacial 57 mL
EDTA 0,5 M pH 8,0 100 mL
As substncias que compem o meio foram adicionados em gua destilada e o
3.3.3 - Tampo de ressuspenso de plasmdios
EDTA 10 mmol/L
Tris HCl pH 8,0 25 mmol/L
Glicose 50 mmol/L
3.3.4 - Tampo de extrao de DNA
Tris-HCl pH 8,5 200 mmol/L

Cloreto de Sdio 250 mmol/L
EDTA 25 nmol/L
SDS 5% (p/v)
3.3.5 - Tampo de amostra para eletroforese de DNA
EDTA 10 mmol/L
Azul de bromofenol 0,25% (p/v)
Xileno cianol FF 0,25% (p/v)
Orange G 0,25% (p/v)
Sacarose 65,00%
Dissolveu-se os componentes no volume necessrio
3.3.6 - Tampo MOPS 10x concentrado
MOPS 0,2 mol/L

Acetato de sdio 0,5 mol/L
EDTA 0,01 mol/L
As substncias foram dissolvidas em gua destilada tratada com dietil

pirocarbonato (DEPC) 0,1% e o tampo foi ajustado para pH 7,0.
3.3.7 - Tampo de amostra para eletroforese de RNA
Azul de bromofenol 0,1 mg/mL

Glicerol 50% (p/v)
Tampo MOPS 1x
As substncias foram dissolvidas no volume necessrio
3.3.8 - Tampo Tris-EDTA (TE) 1x
EDTA 1 mmol/L
3.3.9 - Tampo Acetato de Sdio 100mmol/L pH 4,6
Acetato de sdio anidro 8,2 g

A substncia foi dissolvida em 800 mL de gua destilada, ajustado o pH para 4,6
com cido actico glacial e ento completado para o volume final.
3.3.10 - Acetato de Ltio 1x
Acetato de Ltio pH 7,5 100 mmol/L

O reagente foi dissolvido em gua destilada e seu pH ajustado para 7,5. O
tampo foi esterilizado por calor mido em autoclave a 120C e 1kgf/cm2 por 20
minutos.
3.3.11 - Soluo de Elementos Traos
ZnSO4.7H20 11 g
H3BO3 5,5 g
MnCl2.4H2O 2,5 g
FeSO4.7H2O 2,5 g
CoCl2.5H2O 0,8 g
CuSO4.5.H2O 0,8 g
(NH4)Mo7O24.4H2O 0,55 g
EDTA 25 g
gua destilada q.s.p. 100 mL
As substncias que compem a soluo foram adicionadas na ordem listada em
gua destilada, a soluo foi ento fervida e aps o resfriamento o pH foi
ajustado entre 6,5 e 6,8 com KOH e o volume foi ajustado para 100 mL.
3.3.12 - Soluo de Sais 20x para Meio Mnimo
NaNO3 120 g
KCl 10,4 g
MgSO4.7H2O 10,4 g
KH2PO4 30 g
As substncias foram dissolvidas em gua destilada.
3.3.13 - Soluo de Sais 20x para Meio Mnimo modificado (AMM)
KCl 140 mM
KH2PO4 220 mM
MgSO4.7H2O 40 mM
FeSO4.7H2O 0,0 9mM
ZnSO4.7H2O 0,02 mM
O pH foi ajustado para 6,5.
3.3.14 - Soluo 1 (protocolo de esferoplastizao de A. fumigatus)
(NH4)2SO4 0,8 mol/L

cido ctrico 0,1 mol/L
As substncias foram dissolvidas em gua destilada e o pH ajustado para 6,0
com hidrxido de sdio. A soluo foi esterilizada por calor mido em autoclave
Extrato de levedura 2% (p/v)

Sacarose 2% (p/v)
As substncias foram dissolvidas em gua destilada e a soluo foi esterilizada
por calor mido em autoclave a 120C e 1 kgf/cm2 por 20 minutos.
(NH4)2SO4 0,4 mol/L

cido ctrico 0,05 mol/L
Sacarose 1% (p/v)
gua destilada q.s.p 1.000 mL
As substncias foram dissolvidas em gua destilada e o pH ajustado para 6,0. A
soluo foi esterilizada por calor mido em autoclave a 120C e 1 kgf/cm2 por
20 minutos.
Polietilenoglicol 6000 25% (p/v)

CaCl2 100 mmol/L
KCl 600 mmol/L
Tris-HCl 10 mmol/L
gua deionizada q.s.p. 100 mL
As substncias foram dissolvidas em gua deionizada e o pH ajustado para 7,5.
A soluo foi esterilizada por calor mido em autoclave a 120C e 1kgf/cm2 por
20 minutos.
CaCl2 50 mmol/L
KCl 600 mmol/L
MES 10 mmol/L
gua deionizada q.s.p. 100 mL
As substncias foram dissolvidas em gua deionizada e o pH ajustado para 6,0.
A soluo foi esterilizada por calor mido em autoclave a 120C e 1 kgf/cm2 por
20 minutos.
3.3.19 - Soluo Salina Citrato (SSC) 20x concentrada
NaCl 3 mol/L
Na3C6H5O7.2H2O 300 mmol/L
As substncias foram dissolvidas em gua destilada e o pH ajustado para 7,0.
3.3.20 - Soluo de lise para extrao de plasmdios
NaOH 0,2 mol/L

SDS 1% (p/v)
A soluo foi preparada no momento do uso a partir das solues estoques de
NaOH 4 mol/L e SDS 10%.
Materiais e mtodos__________________________________________________________31
3.3.21 - Soluo de neutralizao para extrao de plasmdios
Acetato de potssio 3 mol/L

cido actico glacial 7,5 mL
O Acetato de potssio foi dissolvido em gua destilada e ento acressentou-se
o cido actico glacial. O volume da soluo foi ajustada para 500 mL e
esterilizada por calor mido em autoclave a 120C e 1 kgf/cm2 por 20 minutos.
3.3.22 - Soluo de SDS 10%
SDS 10 g
A substncia foi dissolvida em gua destilada e ajustada seu volume para 100
mL.
3.3.23 - Soluo de fixao para microscopia
Formaldedo 3,7% (v/v)

PBS 50 mmol/L
Tween 80 0,2% (p/v)
As substncias foram dissolvidas em Soluo fosfato salina.
3.3.24 - Soluo de Calcoflor (CFW)
Calcofluor 1 mg/mL
1 mg de calcoflor (Blankophor BBH, Standard SV-2460, Miles Organic Product
Division) foi dissolvido em gua destilada. A soluo foi mantida fora do alcance
da luz a -20C.
3.3.25 - Tampo de extrao de Protenas
Tris 50 mM
NaF 50 mM
DTT 1 mM
Na3VO4 1 mM
Complete Mini 1U/10mL
Coquetel Inibidor de fosfatase POO4 10 L
3.4 - Protocolos adotados
3.4.1 - Construo do cassete de deleo pela tcnica de recombinao in

vivo em S. cereviseae
A deleo do gene desse trabalho foi realizado como descrito por Colot e
colaboradores (2006) em N. crassa. A figura mostra um esquema da
recombinao homloga que acontece em S. cereviseae e que foi utilizado na
construo dos cassetes de delees clonados no vetor pRS426.
Para a construo de cassetes de deleo, todas as reaes de PCR foram
realizadas em volume final de 20 l utilizando uma DNA polimerase de alta
fidelidade (Phusion High-Fidelity DNA Polymerase, New England Biolabs,
inc). O DNA da linhagem CEA17 akuBku80 de A. fumigatus foi utilizado como
molde para amplificao dos fragmentos de aproximadamente 1,5 kb das
regies 5 e 3 que flanqueiam a regio aberta de leitura (ORF) do gene de
interesse. O vetor pCDA21 (CAHVEROCHE et al, 2000) foi utilizado para
amplificar o fragmento contendo o marcador gentico de auxotrofia, gene pyrG

de A. fumigatus, com tamanho aproximado de 1,9 kb.
A amplificao das regies flanqueadoras da ORF do gene alvo foram realizadas
com 500 ng de DNA genmico e com 20 M de primers especficos das regies
5 e 3, e o pyrG amplificado a partir de 200 ng do plasmdio pCDA21. Todos os
fragmentos amplificados apresentam extremidades homlogas entre si para
permitir a recombinao homloga entre os mesmos e o vetor pRS426 in vivo
em S. cerevisae. O vetor pRS426, antes de ser utilizado na construo do
cassete precisa ser linearizado com a ao de enzimas de restrio (EcoRI e
BamHI), de forma a expor as regies homlogas aos fragmentos amplificados
pela PCR.
Com a confirmao de colnias positivas da recombinao dos
fragmentos no plasmdio pRS426 na levedura (PCR), um clone positivo foi
selecionado e a partir desse, o cassete completo de deleo foi amplificado por
PCR utilizando os primers 5F e 3R. O produto da PCR foi ento fracionado em
gel de agarose 1%, corado com brometo de etdio e a banda especfica purificada
do gel e utilizada na transformao de A. fumigatus.
Primer Sequncia nucleotdica

Afu6g11470 pRS426 5fw 5GTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGCGGGATCTTGGTCAATTGTACC-3
Afu6g11470 pyrG 5rv 5- GCCTCCTCTCAGACAGAATGGTGCGGGTGCGGACGAACG -3
Afu6g11470 pyrG 3fw 5- GCATTGTTTGAGGCGAATTCCCTAGCATGCTTGATGGTCTG -3
Afu6g11470 pRS426 3rv 5'GCGGTTAACAATTTCTCTCTGGAAACAGCCCTGATTATTCCATTCCCGC-3'
Afu6g11470 ORF fw 5'-ATGGTGGACAACAAGATCCCTGAGCCGGG-3'
Afu6g11470 ORF rv 5'-GAGGTATTCTACAAGAAGTACTCGCTGCGGCCCG-3'
Afu6g11470 5ext fw 5-CCAGCCCTCCGACGGCCGCC-3
Tabela 01 Sequncia de oligonucleotdeos dos primers utilizados nesse estudo.
3.4.2 - Preparo de clulas competentes de S. cereviseae e transformao
Uma colnia isolada de S. cereviseae da cepa FGSC 9721, (cedida pelo Fungal
Genetic Stock Center) foi inoculada em 10 mL de YPD e incubada a 30C
overnight (O.N., 16 horas). Aps esse perodo uma alquota semeada em 50
mL de YPD (para DO600nm de 0,1) e a cultura permaneceu a 30C sob agitao
constante at alcanar uma DO600nm entre 0,4 e 0,6. As clulas foram ento
centrifugadas a 600 g por 2 minutos e lavados com tampo TE 1x. Em seguida
a clulas foram novamente centrifugadas e ressuspendidas em 1,5 mL de
soluo TE/LioAc 1x e incubadas 30C por 1 hora, sob leve agitao. Para
cada reao de transformao foram misturados 200 l de suspenso de clulas,
de 1-5 g de DNA plasmidial, diferentes concentraes dos fragmentos de DNA
purificados, provenientes das PCRs para a construo dos cassestes de deleo
e 200 g de esperma de salmo (previamente desnaturado a 99C por 5
minutos), em seguida 600 L de soluo contendo LioAc 1x/PEG-3350 40%
(p/v), gentilmente homogeneizados e ento incubados por 30 minutos a 42C.
As clulas foram ento centrifugadas a 2.500 g por 1 minuto, ressuspendido em
1 mL de TE 1x, precipitadas novamente e ento ressuspensas em 100 L de TE
1x, que foram ento plaqueadas em meio SC-URA-.
Como controles, um grupo foi transformado com o plasmdio pRS426
fechado, para checar a viabilidade das clulas e outro grupo transformado sem
DNA de esperma de salmo e sem fragmentos de DNA, para checar possveis
contaminaes.
3.4.3 - Extrao de DNA de S. cereveisae
Cerca de 10 colnias transformantes de S. cereviseae foram selecionados

e semeados em meio SC-URA- lquido e incubados por 48 horas a 30C e
agitao constante. Aps este perodo, as clulas foram centrifugadas a 2.500 g
por 5 minutos e em seguida ressuspensas em 1 mL de tampo de extrao de
DNA de leveduras e, esta soluo foi adicionado o mesmo volume de prolas
de vidro (previamente tratadas com cido ntrico 1 M para retirar as impurezas).
Os tubos contendo as clulas com as prolas foram acoplados a um vortex e
agitados vigorosamente durante 10 minutos. Aps esse perodo o sobrenadante
foi transferido para novos tubos contendo o mesmo volume de uma mistura
fenol:clorofrmio (1:1) e novamente vortexados por mais 10 minutos. Em seguida
a mistura foi centrifugada a 16.000 g durante 15 minutos, e a fase superior
(aquosa) contendo o DNA genmico foi recuperado. O DNA foi preciptado com
a adio de 600 L de isopropanol e centrifugao a 16.000 g por 10 minutos. O

DNA foi ento lavado com 100 L de etanol 70% (v/v) gelado e
novamentecentrifugado por 2 minutos a 16.000 g, o material foi secado
temperatura ambiente e o DNA ento ressuspenso em 50 l de gua deionizada
estril, com a adio de 1 L de RNAse A (10mg/mL) e incubados por 1 hora a
37C. A concentrao e pureza foram determinadas espectrofometricamente, de
acordo com Sambrook & Russel (2001).
3.4.4 - Preparo de clulas eletrocompetentes
Uma colnia isolada da linhagem de E. coli DH10 foi incubada em 10 mL

de meio de cultura LB por 16 horasa 37C e 200 rpm. Esse pr-inculo foi ento
adicionada 1 L de meio LB e mantido a 37C e agitao de 250 rpm at a
cultura atingir uma DO600nm de 0,4 a 0,5. O frasco de cultura foi resfriado em
banho de gelo por 30 minutos e as clulas foram recuperadas por centrifugao.
Em seguida, as clulas foram equilibradas em 10 mL de soluo aquosa de
glicerol 10% (v/v), resfriada a 4C e centrifugadas. O preciptado foi ressuspenso
em glicerol 10% (v/v) com volume necessrio para atingir uma concentrao de
1 a 3x1010 clulas/ml. A suspenso de clulas eletrocompetentes foi aliquotada
em microtubos e estocada a -80C at o momento do uso.
3.4.5 - Preparao em pequena escala de DNA plasmidial
A extrao de plasmdios foi realizada de acordo com Sambrook & Russel

(2001). Cada colnia selecionada foi semeada separadamente em tubos
contendo 5 mL de meio de cultura LB contendo o antibitico apropriado e
cultivado sob agitao de 150 rpm por 12 horas a 37C. Cerca de 1,5 mL da
suspenso de clulas de cada tubo foram transferidos para tubos de
microcentrfuga e centrifugados a 16.000 rpm por 1 minuto a 4C. As clulas
foram ressuspensas em 100 L do tampo de ressuspenso e foram
adicionados 1 L de RNAse A (10 mg/mL) e 200l de soluo de lise. A mistura
foi homogeneizada gentilmente por 4-5 vezes. Foram adicionados 150 L de
acetato de sdio 3 mol/L pH 5,4. A suspenso foi centrifugada a 16.000 g durante

15 minutos a 4C. Ao sobrenadante, foram adicionados 400 L de clorofrmio e
a mistura foi ento vortexada. Em seguida, os materiais foram centrifugados a
16.000 g por 4 minutos a 4C, a fase aquosa coletada e o DNA plasmidial foi
preciptado com 1 mL de etanol absoluto. A mistura foi centrifugada a 16.000 g
por 15 minutos a 4C. O sedimento contendo DNA plasmidial foi ento lavado
com etanol 70% (v/v), seco e ressuspenso em gua deionizada estril.
3.4.6 - Produo de esferoplastos de A. fumigatus
Para as transformas de A. fumigatus, a linhagem akuBku80 foi

utilizada. Essa linhagem foi obtida em nosso laboratrio e se trata de um mutante
cujo gene ku80 homlogo de A. nidulans (nkuA) est inativado (da Silva Ferreira
et al, 2006). Como se sabe os produtos dos genes ku70 e 80 so essenciais no
processo de non homologous end joining (NHEJ) no reparo do material
gentico, que causa um direcionamento de todo o DNA exgeno introduzido na
clula para a via de recombinao homloga (Ninomiya et al, 2004), aumentando
consideravelmente a insero do cassete de deleo no lcus do gene de
interesse e dessa forma, melhorando a eficincia da transformao (Oakley, B.
R.; dados no publicados).
A transformao seguiu a metodologia descrita por Tilburn et al, (1983),
porm com algumas modificaes. Um pr-inculo de aproximadamente 107
condios da cepa akuBku80(pyrG-) foram crescidos em 50 ml de meio YG+UU
a 37C por 16 horas. Aps esse perodo, o miclio foi coletado por centrifugao
a 2.000 g por 10 minutos e ressuspensos em 20 mL de soluo 1, suplementado
com 6,5 ml de soluo MgSO4 1mol/L. Separadamente, 400 mg de BSA e 300
mg de Glicanex (Novo Nordisk) foram dissolvidos em 20 mL de soluo 2, em
seguida esterilizados em filtros de 0,45 m e ento adicionado aos miclios. A
enzima Glicanex apresenta diversas atividades, entre elas glicanase, quinase e
protease, para a digesto da parede celular dos tubos germinativos, na presena
do estabilizador osmtico BSA. Os miclios foram ento incubados por 5 horas
a 30C e agitao constante de 70 rpm. Aps esse perodo, os esferoplastos
foram filtrados em seringas contendo l de vidro estril. A suspenso de

esferoplastos foi ento centrifugada a 3.000 g por 10 minutos e 4C e em seguida
lavadas duas vezes com soluo 3 para remoo do excesso de enzima, uma
alquota dos esferoplastos foi ento observado em microscpio de campo claro
para checar sua viabilidade e ento utilizados na transformao.
3.4.7 - Transformao de A. fumigatus
A transformao foi realizada como descrito por Tilburn et. al. (1983),
porm com algumas modificaes.
Os esferoplastos foram ressuspendidos em um volume de 50 L de
soluo 5 por transformao e incubados por 10 minutos em gelo. Em seguida
100 L por reao de soluo 4 foi adicionado suspenso de esferoplastos (a
soluo 4, contendo PEG, promove a fuso das membranas dos esferoplastos),
gentilmente misturada e ento aliquotados 150 l da suspenso contendo
esferoplastos em tubos separados e o DNA a ser transformado adicionado (4-20
g do DNA ressuspenso em no mximo 20 L) e incubados no gelo por 20
minutos. Aps esse perodo, 1 mL da soluo 4 foi adicionado e homogeneizado
na suspenso, que foi incubada temperatura ambiente por 20 minutos. Toda a
suspenso foi ento foi diluida em 30 mL de meio YAG Top gar contendo KCl
0,6 mol/L. As placas foram incubadas de 4 a 5 dias a 37C para verificar o
crescimento dos clones transformados.
3.4.8 - Southern Blot alcalino
Para demonstrar que a integrao do cassete foi transformado

homologamente no loci correto de A. fumigatus foi feito Southern Blot, descrito
por Sambrook et al (1989).
O gel de agarose foi submetido eletroforese para separao do DNA
digerido com uma enzima de restrio apropriada e, aps a corrida, tratada com
soluo depurinizante (HCl 0,25 mol/L) por 15 minutos. Aps esse tratamento, o
gel foi colocado sobre papel 3MM conectado um reservatrio contendo uma
soluo de NaOH 0,4 mol/L. Sobre o gel foi colocada a membrana de nylon
(Hybond-N+, Amersham-Pharmacia, USA) e 3 papis 3MM do tamanho do gel
previamente embebidos em soluo de NaOH 0,4 mol/L. Acima desse bloco
foram empilhadas vrias camadas de papel absorvente com um peso de
aproximadamente 0,5 kg (400 cm3/Kg) colocado por cima. Um plstico filme foi
colocado entre as bordas do gel e do papel 3MM para evitar o contato entre o
reservatrio de NaOH e os papis acima do gel e ao redor do reservatrio para
evitar a evaporao do NaOH. Aps 12 horas de transferncia, o sistema de
transferncia foi desmontado e a membrana de nylon foi lavada com SSC 2x. O
DNA foi fixado membrana utilizando o aparelho Stratalinker 1800 (Stratagene,
USA), utilizando sua funo autocrosslink (Southern, 1975).
3.4.9 - Marcao de sonda no radioativa
Como uma alternativa marcao das membranas utilizando 32P,

utilizamos o kit Amersham AlkPhos Direct Labeling and Detection System (GE
Healthcare Life Science).
Primeiramente, foi necessrio diluir 20 L da soluo crosskinker em 80L
gua destilada para preparar a soluo de uso. Em paralelo, dilumos o DNA que
ser utilizado na sonda para uma concentrao de 10 ng/mL, uma alquota de
10 L do DNA foi ento desnaturado em gua fervente por 5 minutos e
imediatamente resfriado em gelo, em seguida uma rpida centrifugao para
trazer o contedo de volta ao fundo do microtubo. Em seguida, ao DNA deve ser
adicionado 10 L do tampo de reao, 2 L do reagente de marcao e 10 L
da soluo de crosslinker, incubar por 30 minutos a 37C por 30 minutos.
3.4.10 - Hibridao e revelao das membranas de Southern Blot
As membranas de nylon utilizadas (Hybond N+,GE) foram pr-hibridadas

com o volume necessrio de soluo de hibridizao (kit Amersham AlkPhos),
com a adio de 0,4 M de NaCl e 4% (p/v) do reagente de bloqueio, por pelo
menos 15 minutos a 55C. As sondas foram ento adicionadas e incubadas por
pelo menos 16 horas. As membranas foram ento lavadas com SSC 2x 0,1%
SDS a 65C por 10 minutos duas vezes e em seguida lavadas mais duas vezes
com SSC 1x 0,1% SDS a 65C por 5 minutos. Para deteco adicionamos o
reagente de deteco CDP-STAR (GE Healthcare Life Sciences), cobrindo toda
a membrana e deixando por 5 minutos. Em seguida, o excesso do reagente de
deteco foi removido e as membranas expostas a filmes autorradiogrficos
(Amersham Hyperfilm ECL, 18 x 24cm, GE Healthcare Life Sciences) por 1 hora
e ento finalmente revelados.
3.4.11 - Extrao e manipulao de RNA
Cerca de 1x1010 condios das linhagens selvagem e mutante foram

inoculados em bales de erlenmeyer contendo MM e incubados por 10 horas a
37C. Os miclios foram filtrados a vcuo e imediatamente congelados em
nitrognio lquido para evitar degradao do material. Para romper a parede
celular do fungo, os miclios foram triturados em nitrognio lquido com a
utilizao de cadinho e pistilo estreis. O RNA foi extrato utilizando Trizol
(Invitrogen, USA), de acordo com as recomendaes do fabricante. O RNA foi
quantificado espectrofotometricamente em comprimento de onde de 260 nm e a
integridade verificada em gel de agarose 1,2% sob condies desnaturantes
corado com brometo de etdeo e visualizado sob luz UV de acordo com
Sambrook e Russel (2001), adotando como critrio a integridade das bandas
referentes aos RNAs ribossomais 28S e18S, sendo a intensidade da primeira
banda duas vezes mais forte que a segunda. Os RNAs a serem utilizados no RT-
PCR foram tratados com DNAse livre de RNAse, em um volume final de 50 l
contendo 1x tampo de DNAse (40mM Tris-HCl pH 7,5 e 6mM MgCl2), 2,5 l
DTT 100 mM (Ditiotreitol, Invitrogen, USA), 1 L de RNAse out (40 U/L,
Invitrogen, USA), 10 L de DNAse (1 U/L, Promega, Madison, USA) e 20 g do
RNA de interesse. A reao foi incubada a 37C por 1 hora, seguindo-se a etapa
de purificao pelo mtodo de fenol:clorofrmio (1:1) e preciptao do RNA com
acetato de sdio 0,3 M por 16 horas a -80C para aumentar o rendimento. A
ausncia de DNA foi verificada por RT-PCR utilizando uma sonda fluorescente
do gene constitutivo tubC de A. fumigatus. Amostras com deteco de sinal

negativo foram utilizadas para a sntese de cDNA.
Para a produo de cDNA nas reaes de RT-PCR, foram utilizados 20
g de RNA total contido num volume final de 6 L e 1,5 de Oligo dTV (estoque
100 M). A mistura foi aquecida a 75C por 10 minutos, rapidamente
centrifugada e mantida em gelo. Em seguida foram adicionados 5 l de First
Strand Buffer (5x, Invitrogen), 2,5 L de dNTP (10 mM cada). O tubos tubos
foram aquecidos a 42C por 5 minutos para termostatizar a reao e em seguida
1 L da enzima transcriptase reversa (Superscript II, Invitrogen USA, 200 U/L)
foi adicionado. A reao foi incubada a 42C por 1 hora e trinta minutos para
sntese do cDNA.
3.4.12 - Ensaios Fenotpicos
Para checar as diferenas no crescimento entre a cepa parental, a cepa

deletada e cepa restituda, 1x105 condios frescos foram semeados
pontualmente em diferentes meios de cultivo e seus halos de crescimento foram
medidos em 24, 48, 72 e 96 horas. Outro mtodo utilizado foi analisar o
crescimento inicial de condios em uma srie de diluies, tanto em temperaturas
diferentes, presena ou ausncia de agentes que causam estresse osmtico ou
oxidativo e agentes que causam danos na parede celular ou no DNA. Os drop-
outs foram realizados utilizando 5 L de uma suspenso inicial de 2x107 e ento
fazendo uma diluio seriada de 10x da cepa selvagem e dos mutantes
(concentrao final de condios por ponto de 1x105 at 1x102) em diferentes
meios e crescidos por 48 horas a 37C.
3.4.13 Ensaios de formao de biofilme e adeso
Os ensaios de cristal violeta e biofilme foram realizados segundo Mowat

et al (2007) e Shopova et al (2013) respectivamente. Para determinar a
habilidade de formar biofilme, 1x104 condios foram inoculados em 200 L de
meio MM ou YG lquido em uma microplaca de poliestireno de 96 poos e ento
incubados sem agitao por 24 horas a 37C. Aps esse perodo, a placa foi
lavada diversas vezes com PBS, secada na bancada e em seguida adicionado
200 L de cristal violeta 0,5% durante 5 minutos a temperatura ambiente. O
miclio corado foi ento lavado diversas vezes com gua destilada, at que todo
o excesso de cristal violeta fosse removido e ento novamente secado na
bancada. Finalmente, o cristal violeta foi eludo em 200 L de etanol 100% e a
absorbncia medida em 590 nm.
Para checar a formao de biofilme, 1x106 condios frescos foram
adicionados em 20 mL de RPMI 1640 tamponado com HEPES e glutamina (Life
Technologies) em placas de petri de poliestireno estreis. Aps uma aderncia
inicial de 4 horas de incubao esttica a 37C, os condios no aderidos foram
lavados trs vezes com PBS-0,1% Tween 80 estril. Em seguida, 20 mL de meio
RPMI fresco foram adicionados aos condios aderidos e cultivados durante 96
horas a 37C. Os miclios foram raspados da superfcie das placas e filtrados
em miracloth (Merck), o peso-seco do biofilme produzido foi ento analisado.
3.4.14 - Microscopia Eletrnica de Varredura
Condios das cepas selvagens e do mutante sitA foram inoculados em

meio RPMI em placas de 24 poos de cultura de clulas com lamnulas
Thermanox (13 mm). Aps 24 horas de incubao a 37C os biofilmes foram
processados e trabalhados como descrito previamente (Erlandsen et al, 2004).
Previamente, os biofilmes foram lavados 2x com PBS e fixados em 2%
paraformaldedo, 2% glutaraldedo e 0,15% [p/v] de alcian blue em 0,15 M de
cacodilato de sdio (pH 7.4). Os biofilmes foram ento corados com partculas
de ouro e visualizados com o microscpio eletrnico de varredura JEOL JSM-
6400 em com vcuo a 10 kV.
3.4.15 Microscopia eletrnica de transmisso
A preparao das amostras foi feita como descrito previamente (Walker

et al, 2008), porm com algumas modificaes. Previamente, clulas foram
coletadas e os pellets foram fixados em tampo PBS 0,1 M contendo

glutaraldedo 2,5% (v/v) por 24 horas a 4C. As amostras foram ento
encapsuladas em agarose de baixo ponto de fuso 3% (p/v) antes do
processamento para estimular a resina seguindo um cronograma de 24 horas no
processador de tecidos Lynx (fixao secundria com 1% OsO , contraste com
1% acetato de uranila, desidratao com etanol e, infiltrao com acetato/Spurr).
Uma infiltrao adicional foi feita sob vcuo a 60C antes da incorporao em
cpsulas (TAAB laboratrio e Microscopia, Reino Unido) e polimerizao a 60C
por 48 horas. Seces de cortes semi-finos (0,5 m) foram coradas com azul de
toluidina para identificar as reas de melhor densidade de clulas. Cortes ultra-
finos (60 nm) utilizando lmina de diamante Diatome no ultramicrotome Leica
UC6 e corado com acetato de uranila e citrato de chumbo para ser analisado no
microscpio de transmisso de eltrons JEM-1400Plus (JEOL [Reino Unido]
Ltd., Hertfordshire, Reino Unido), as imagens foram capturadas com cmera
AMT UltraVue e analisadas no software AMT Image Capture Engine V602
(Deben United Kingdom Ltd., Suffolk, United Kingdom).
3.4.16 - Microscopias para determinao de quitina e -(1,3)-glicanas
Para determinar a quantidade de -(1,3)-glicanas o procedimento utilizado

foi realizado de acordo com Shepardson et al (2013) e Chung et al (2014).
Previamente, 106 esporos de A. fumigatus foram incubados por 8 horas a 37C
em placas de 24 poos com lamnulas circulares de 13 mm estreis, contendo 1
mL de MM filtrado (para retirar resduos que possam interferir na microscopia),
irradiados com luz UV, para cessar o crescimento celular. Em seguida as
lamnulas foram lavadas trs vezes com PBS 1x estril por 5 minutos
temperatura ambiente e ento bloqueados com soluo de bloqueio (PBS 0,01
M; soro de cabra 2%; BSA 1%; Triton X-100 0,1%; Tween 20 0,05%; azida de
sdio 0,05%; pH 7.2) por 30 minutos a temperatura ambiente, com leve agitao.
Aps esse perodo, foi adicionado soluo de bloqueio 1 g/ml de Dectin-hFc
(Invivogen) e novamente incubado por 1 hora temperatura ambiente e leve
agitao. Em seguida, 20 L de IgG1 de cabra conjugado com DyLight 594 (1:50,
AbCam, USA) e incubados a temperatura ambiente por 1 hora e leve agitao.

Depois de corado, as lamnulas foram ento lavadas uma vez em PBS 1x e
visualizadas.
Para colorao da quitina, 5x106 condios foram incubados em 5 mL de
MM em placas de petri (60 mm x 15 mm) por 8 horas a 37C. Os tubos
germinativos foram irradiados com luz UV e em seguida tratados com 2 g/mL
de CFW por 5 minutos e depois lavados 1x com PBS.
As clulas coradas foram visualizadas sob condies idnticas para
comparao utilizando microscpio de fluorescncia Zeiss Observer.Z1 (Jena,
Germany) em objetiva de 100x com imerso de leo (EC Plan-Neofluar, abertura
numrica 1.3) equipado com mdulo de epifluorescncia e lmpada de mercrio
HBO 100 W. As imagens em campo claro com contraste de fase e em campo
escuro de fluorescncia foram capturadas com cmera AxioCan (Carl Zeiss),
visualizadas e processadas com o programa Axio Vision verso 3.1. Para
quantificar a fluorescncia, utilizamos o software ImageJ, que calcula a mdia de
fluorescncia da rea total do fungo.
3.4.17 - Anlise das protenas de superfcie dos condios
A protena total da superfcie dos condios foi extrada como descrito por
Beauvais et al. (2013). Primeiramente, 2x109 esporos de trs amostras
independentes das cepas selvagem e sitA foram tratadas com 200 L de
soluo de NaCl 0,5 M e incubadas temperatura ambiente por 2 horas. Em
seguida as amostras foram centrifugadas a 12.000 rpm por 5 minutos, e o
sobrenadante foi recolhido, liofilizado e depois ressuspenso em tampo Tris-HCl
0,1 M, pH 8,8 e ureia 8 M. As protenas foram ento quantificadas pelo mtodo
de Bradford com o kit Protein Assay Dye Reagent Concentrate Concentrate (Bio-
Rad, cd. 500-0006, Lote L9700067 Rev J). A preparao das amostras para a
espectometria de massa consiste em trs etapas: (I) reduo e alquilao da
protena adicionando 2.5 l de dithiotreitol na concentrao de 1 mg DTT/mg de
protena e incubado por duas horas em temperatura ambiente seguido pela
alquilao pela adio de 5 L de iodoacetamida (IA) na razo de 3 mg IA/mg
de protena e incubao de uma hora temperatura ambiente; (II) digesto

enzimtica das protenas com tripsina. As amostras foram diludas cinco vezes
em bicarbonato de amnio pH 8,0 com volume final de 300 L. As amostras
foram ento incubadas com 1 g de tripsina (Promega,V511A, Lot 30551310) a
37C por 16 horas; e (III) por ltimo a limpeza/dessalinizao das amostras
usando as colunas OASIS HLB Cartridge 1cc (cat. number: 186000383, Waters).
As colunas foram equilibradas com uma soluo contendo 5% de acetonitrila,
cido frmico 0,1%, e a eluio do material foi feito utilizando acetonitrila 80%.
As amostras foram secas e aplicadas no espectrmetro de massa LTQ
Orbitrap ELITE (Thermo-Finnigan) acoplado um sistema de cromatografia de
nano-fluxo (LC-MS/MS). Os dados adquiridos foram automaticamente
processados pelo CPAS (Computational Proteomics Analysis System) (Rauch et
al, 2006). Os peptdeos identificados foram agrupados em protenas usando o
algortimo Protein Prophet e uma lista de protenas identificadas foi estabelecida
utilizando um erro menor que 2%. Os dados foram ento comparados com o
banco de dados de proteoma de Aspergillus fumigatus (Af293 ou A1163) no site
www.aspgd.org.
3.4.18 - Modelo de aspergilose pulmonar em camundongos
O modelo de aspergilose pulmonar em camundongos foi realizada de

acordo com Dinamarco et al (2012). Camundongos fmeas de seis semanas
(linhagem BALB/c; pesando entre 20 e 22 g) foram alojadas em gaiolas
ventiladas em grupos de 5 animais. Os camundongos foram ento suprimidos
com ciclofosfamida na concentrao de 150 mg/kg, administrado via
intraperitonial nos dias -4, -1 e 2 antes e depois da infeco. Hidrocortisona (200
mg/kg) foi injetada subcutaneamente no dia -3. Os condios de A. fumigatus
utilizado na infeco foram crescidos em meio completo YAG dois dias antes da
infeco. Condios frescos foram ressuspensos em PBS (Phosphate Buffer
saline) (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2PO4 em 1 litro
de gua destilada e pH 7,4) e filtrado em Miracloth (Calbiochem). A suspenso
de condios frescos foi ento centrifugado a 3.000 g por 5 minutos, lavado trs
vezes com PBS, contado utilizando um hematocitmetro e ento ressuspenso

em uma concentrao de 5x106 condios/mL. A viabilidade das suspenses de
condios utilizadas na infeco dos camundongos foi feita atravs de diluies
seriadas, sendo plaqueadas em meio YAG e incubadas a 37C e em seguida
contadas as unidades formadoras de colnias.
Os camundongos foram anestesiados com a inalao de halotano e em
seguida infectados com 1x105 condios em 20 L de PBS. Como controle
negativo um grupo de cinco camundongos recebeu apenas PBS. Os
camundongos foram ento pesados a cada 24 horas e avaliados pelo menos
duas vezes ao dia. Camundongos que apresentaram uma perda de 20% do seu
peso aps a infeco foram sacrificados. Os clculos estatsticos da
sobrevivncia dos camundongos foram feitos utilizando o kit de anlises do
Prisma, utilizando os testes "Gehan-Breslow-Wilcoxon Test e Log-rank (Mantel-
Cox) Test, os quais foram considerados estatisticamente significativos valores
menores que P<0,05. Adicionalmente, trs dias aps a infeco, dois
camundongos de cada grupo foram sacrificados e os pulmes foram removidos,
fixados e processados para anlises histolgicas.
3.4.19 - Histopatologia e Carga Fngica pulmonar
Aps 72 horas, um grupo de animais foi sacrificado e os pulmes

removidos e fixados por 24 horas em formaldedo-PBS 3,7%. As amostras foram
ento lavadas vrias vezes em etanol 70% antes da desidratao do material em
uma srie de solues aumentando gradativamente a concentrao de lcool.
Finalmente as amostras foram diafanizadas e em seguida embebidas em
parafina. Para cada amostra, seces sequenciais de 5 m foram coletadas em
lminas de vidro e coradas com GMS (Gomori methenamine silver) ou
hematoxilina e eosina (HE) seguindo o protocolo padronizado (Greenberger,
2002). Previamente, os cortes foram deparafinizados, oxidados com 4% de cido
crmico, corados com soluo de metenamina de prata e re-corado com
hematoxilina. Seces dos tecidos foram tambm corados com hematoxilina e
eosina para anlise histolgica a fim de verificar os danos no pulmo. Todas as

lminas foram lavadas, preservadas em meio de montagem e seladas com
lamnulas. As anlises histolgicas foram feitas utilizando o microscpio Axioplan
2 imaging microscope (Carl Zeiss) com as ampliaes estabelecidas em campo
claro.
Para investigar a carga fngica nos pulmes, os camundongos foram
infectados como descrito acima, porm com um inculo de 1x106 condios/20
L. O inculo mais concentrado em comparao com o inculo utilizado na curva
de sobrevivncia foi utilizado para aumentar a deteco de DNA do fungo. Os
animais foram sacrificados 72 horas aps a infeco e os pulmes removidos
foram congelados em nitrognio lquido imediatamente. As amostras foram
ento homogeneizadas por vortexao com beads de vidro e o DNA foi extrado
com o mtodo de fenol-clorofrmio. A qualidade e quantidade do DNA foi medida
utilizando o NanoDrop 2000 spectrophotometer (Thermo Scientific). Pelo menos
500 g do DNA total foi utilizado para PCR em tempo real quantitativo. Um primer
e uma sonda Lux (Invitrogen) foi utilizado para amplificar uma regio do rRNA
18S de A. fumigatus (primer, 5-CTTAAATAGCCCGGTCCGCATT-3; probe, 5-
CATCACAGACCTGTTATTGCCG-3) e uma regio intrnica de GAPDH
(glyceraldedo-3-fosfato desidrogenase) (primer, 5-
CGAGGGACTTGGAGGACACAG-3; sonda, 5-
GGGCAAGGCTAAAGGTCAGCG-3). Seis pontos da curva padro foram
calculadas utilizando diluies seriadas do gDNA das cepas de A. fumigatus
utilizadas neste estudo e tambm do camundongo no infectado. A quantidade
de DNA do fungo e do camundongo foi obtida pelos valores do threshold cycle
(CT) de uma curva padro apropriada. A carga fngica foi determinada atravs
da razo entre picogramas de DNA do fungo e microgramas de DNA do
camundongo.
3.4.20 - ndice de Fagocitose
Para estimar a porcentagem de condios fagocitados, macrfagos

alveolares foram coletados dos pulmes de camundongos BALB/c (8 a 10
semanas) utilizando um cateter intravenoso (Angiocath, Becton Dickinson) . Seis

camundongos por experimento foram sacrificados, a traqueia foi ento exposta
e o cateter introduzido. Para lavar os pulmes, 1 mL de meio RPMI 1640 (Sigma-
Aldrich) foi utilizado trs vezes . O sobrenadante foi removido e o pellet foi lavado
trs vezes com meio RPMI e ressuspenso em 1 mL de meio RPMI-10% Soro
fetal bovino (FBS) (Gibco). As clulas foram contadas com um hematocitmetro.
O ensaio fagoctico foi realizado de acordo com Mech et al (2011), porm com
algumas modificaes. Previamente, em uma placa de 24 poos contendo uma
lamnula de 15 mm por poo, 2x104 macrfagos foram incubados com 1 mL de
RPMI-FBS a 37C com 5% CO2 por 1 hora. Em seguida, os poos foram lavados
com 1 mL de meio para remover as clulas no aderentes. Em cada poo, 1 mL
de RPMI-FBS contendo 1x105 condios (1:5 macrfago/condios) de cada cepa,
em duplicata, foram adicionados e ento incubados a 37C com 5% de CO2 por
80 minutos, depois disso o sobrenadante foi removido e 500 l de PBS-
formaldedo 3,7% foi adicionado. Depois de 15 minutos as amostras foram
lavadas com 1 mL de gua ultra pura e novamente incubadas com 495 L de
gua e 5 L de CFW (10 mg/ml) por 20 minutos. As amostras foram lavadas e
montadas em lminas com 50% glicerol. O microscpio de fluorescncia Zeiss
Observer.Z1 foi utilizado para checar a porcentagem de esporos fagocitados. A
membrana dos macrfagos no permevel, portanto apenas esporos
fagocitados permanecem no corados pelo CFW. Pelo menos 100 condios
foram contados por amostra e o ndice de fagocitose foi calculado. Esse
experimento foi feito em triplicata.
3.4.21 - Destruio de condios por macrfagos alveolares
Para avaliar a destruio de condios por macrfagos alveolares, as

clulas fagocticas foram obtidas como descrito acima. Em uma placa de 96
poos, 1x104 macrfagos foram adicionados com 200 L de RPMI-FBS por poo
e incubados a 37C com 5% de CO2 por 1 hora. Em seguida, 5x104 condios
(1:5 macrfagos/condios) foram adicionados e incubados a 37C com 5% de
CO2 por 4 horas. Como controle positivo, poos sem a adio de macrfagos
foram utilizados. Para cada cepa utilizada esse ensaio foi realizado em duplicata.
Aps a incubao, 100 L de Triton X-100 3% foi adicionado. Em seguida, 10
minutos a temperatura ambiente, as amostras foram removidas da placa e
diludas sericamente em soluo salina estril. As diluies foram plaqueadas
em meio completo YAG (Mech et al, 2011) e incubados a 37C por 2 dias. A
destruio de condios foi calculada comparando o nmero de UFCs das
amostras incubadas com macrfagos contra o nmero de UFCs das incubadas
sem macrfagos. Este experimento foi feito em triplicata.
3.4.22 - Determinao dos nveis de TNF-
Para a determinao de citocinas, macrfagos derivados da medula

ssea (MDMO) de camundongos C57BL/6 foram preparados como descrito
anteriormente (Marim et al, 2010). Previamente, macrfagos da medula ssea
de fmur dos camundongos foram cultivados por seis dias em meio RPMI 1640,
contendo 20% FBS e 30% LCCM. Os macrfagos (5x105) foram adicionados em
placas de 24 poos por 16 horas a 37C com 5% CO2 em meio RPMI 1640
contendo 10% SFB e 5% LCCM. Para a infeco fngica, cultivamos
previamente 2x104 esporos por poo por 18 horas a 37C at o estgio de hifa,
irradiados com UV e ento usados para estimular os macrfagos. As clulas
foram centrifugadas para sincronizar a infeco e cultivados por 18 horas. Em
seguida, o sobrenadante foi coletado e os nveis de citocina foram medidos por
ELISA (measured by enzyme-linked immunosorbent) com um kit de TNF- de
rato (R&D Quantikine ELISA) de acordo com as instrues do fabricante.
3.4.23 Inibio de PkcA
A inibio farmacolgica de PkcA de A. fumigatus foi analisada pelo uso

de chelerytrin, calphostin C e cercosporamide. Condios (1x106) da cepas
selvagem, sitA, e complementado foram inoculados em 1 mL de meio YG
lquido em placas de poliestireno de 24 poos contendo 10% de alamarBlue (Life
Technologies) como indicador de viabilidade, de acordo com o mtodo de
Yamaguchi et al (2002). As clulas foram cultivadas durante 48 horas a 37C e

o crescimento foi avaliado em intervalos de 24 horas.
3.4.24 - Western Blotting
A deteco da fosforilao de mpkA por Western blotting foi realizada

como descrito por Hagiwara et al (2013), com pequenas modificaes.
Previamente, condios de A. fumigatus do tipo selvagem e o mutante sitA foram
cultivados em meio YPD lquido por 18 horas a 37C antes da adio de CR
(concentrao final de 200g/mL) durante 60 minutos. Para a extrao das
protenas, miclios foram ento macerados em nitrognio lquido, em tampo de
extrao de protenas contendo inibidores de proteases. A suspenso foi
centrifugada e o sobrenadante recolhido, as protenas foram quantificadas por
Bradford e ajustadas para uma concentrao de 60 g de protena em tampo
amostra e fervidas em banho maria a 95C por 5 minutos. As protenas foram
separadas no sistema NuPAGE (Invitrogen) e transferidas utilizando o sistema
de transferncia de gel iBlot 2 NC Regular Stacks (Novex, Life
Technologies). Para detectar as protenas, os anticorpos anti-fosfo-p44/42 e
anti-p44/42 foram utilizados contra a forma fosforilada (Mpka-P) e no fosforilada
da MpkA. Para detectar esses sinais na membrana, utilizamos o sistema de
deteco para Western blotting ECL Prime (GE Helthcare, Little Chalfont, UK) e
LAS1000 (FUJIFILM, Tokyo, Japan).
________________________________________4. RESULTADOS
Resultados_________________________________________________________________51
4.1 - Identificao da protena fosfatase SitA homloga em Aspergillus

fumigatus
Uma busca com BLASTp no genoma de A. fumigatus revelou uma nica

protena putativa ortloga protena Sit4 de S. cerevisiae (ScSit4p), Afu6g11470
(nomeado como SitA). A organizao de introns e exons do gene sitA foi
confirmada por RNA-seq (disponvel em www.aspgd.org) e trs ntrons preditos
esto localizados de 155 a 211, 603 a 656, e 989 a 1036 pares de bases. A
protena predita codificada por sitA provavelmente tem 388 aminocidos e possui
massa de 43,5kDa. A identidade entre as protenas de A. nidulans SitA e ScSit4
alta (1e-99; 72,9 % de identidade; 84,7 %). Uma comparao entre a estrutura
e a organizao da ScSit4 e SitA foi feita atravs da interface SMART
(http://smart.embl-heidelberg.de/). A organizao dos domnios catalticos das
protenas fosfatases 2A so conservadas em ambas as protenas (dados no
mostrados). Anlises filogenitcas identificaram inmeros homlogos de SitA
com fungos filamentosos (identidade das protenas maior que 70%), incluindo
vrias espcies da famlia Aspergilli, patgenos de plantas e fungos saprofticos
(Figura 01). Entretanto, as anlises filogenticas claramente demonstraram dois
grandes grupos diferentes entre fungos e leveduras (Figura 01).
Resultados_________________________________________________________________52
Figura 01 rvore filogentica de homlogos de sitA em fungos. A rvore foi inferida utilizando
o mtodo de neighbor-joining. O valor calculado de bootstrap para as 500 replicatas esto
indicadas nas ramificaes da rvore. As sequncias foram alinhadas por ClustalW e a rvore
construda utilizando o software MEGA6. F. verticillioides, Fusarium verticillioides; F. oxysporum,
Fusarium oxysporum; A. flavus, Aspergillus flavus; A. nidulans, Aspergillus nidulans; N. crassa,
Neurospora crassa; S. pombe, Schizosaccharomyces pombe.
Resultados_________________________________________________________________53
4.2 - O mutante sitA tem problemas na integridade da parede celular
Para obtermos um melhor entendimento de SitA em A. fumigatus, ns

deletamos o gene sitA (Figura 02.) e os fentipos do mutante foram comparados
com o tipo selvagem. O gene deletado foi posteriormente complementado com
o gene correspondente do tipo selvagem para checar a possibilidade de
mutaes secundrias durante a construo da cepa deletada. Os fentipos
relacionados ao mutante de S. cereviseae sit4 (Sutton et al., 1991; Stark, 1996;
Angeles de la Torre-Ruiz et al., 2002; Zabrocki et al., 2002) que pudessem afetar
a ausncia de sitA, como sensibilidade rapamicina, estresse por alta
osmolaridade, danos na parede celular, sensibilidade a metais e diferena no
crescimento em meios de cultura pobres em nutrientes foram investigados.
O mutante sitA demonstrou crescimento radial comparvel ao tipo
selvagem em meio mnimo e crescimento radial reduzido no tempo de 24 horas
em meio completo (Figura 03), sugerindo que sitA no importante para o
crescimento radial em condies de escassez de nutriente. O mutante sitA
mostrou-se mais sensvel uma srie de metais, tais como MnCl2, CaCl2 e LiCl
(figura 04); porm, o mutante mais resistente a ZnSO4 na presena de 1 mM
EDTA (usado visando quelar todos os metais pr-existentes no meio; Figura 04-
C). O mutante sitA igualmente sensvel a rapamicina quando comparado com
as cepas selvagem e complementadas (figura 05). O mutante sitA mais
sensvel a agentes que causam dano na parede celular, como Congo Red (CR),
Calcofluor White (CFW) e Sodium Dodecil Sulfate (SDS), que afeta a membrana
plasmtica (Figura 06-A, B e C).
Para determinar se sitA est envolvido na via da Mpk1 em A. fumigatus,
a quantidade e o estado de fosforilao do homlogo de Mpk1p , MpkA, foram
medidos na presena ou na ausncia de CR. Os nveis de fosforilao da
protena MpkA foram determinados utilizando o anticorpo anti-fosfop44/42 que
reconhece a MpkA fosforilada (figura 06-D). Na cepa selvagem, os nveis de
induo da fosforilao de MpkA foram de 5,68; 20,8 e 19.2 vezes aps a adio
de 300 g/ml de CR durante 15, 30 e 120 minutos respectivamente. O mutante
sitA apresentou nveis de fosforilao 3 vezes maiores que o tipo selvagem na
Resultados_________________________________________________________________54
ausncia de CR (figura 06-D). Entretanto, o mutante sitA demonstrou nveis de

induo da MpkA de 0,88; 5,45 e 4,13 vezes aps a adio de 300 g/ml de CR
durante 15, 30 e 120 minutos (figura 06-D). Os nveis de fosforilao da MpkA
do mutante sitA foram de 4 a 5 vezes menores quando comparados ao tipo
selvagem.
Esse aumento na sensibilidade agentes que causam dano a parede
celular podem estar relacionados composio da parede celular. Dessa forma,
analisamos a quantidade de quitina na parede celular do mutante sitA atravs
da colorao com Calcofluor White (CFW). A intensidade de fluorescncia por
rea fngica foi 20% mais alta no mutante sitA quando comparado com o tipo
selvagem ou a cepa complementada (Figura 07 A). Para identificar diferenas
na composio ou exposio de -(1,3)-glicanos na superfcie da parede celular,
utilizamos a colorao com Dectina-1. O mutante sitA apresentou nveis mais
elevados de -glicanos em comparao com o tipo selvagem e a cepa
complementada sitA::sitA+. A intensidade da fluorescncia por rea fngica no
mutante sitA foi 40% maior em relao ao tipo selvagem e a cepa
complementada (Figura 07-B, C). Dessa forma, esses resultados sugerem que
o mutante sitA possui mais -(1,3)-glicanos e quitina em relao ao tipo
selvagem. Diferenas na susceptibilidade caspofungina (mais resistente) e
anidulafungina (mais sensvel) foram observadas no sitA (Figura 08).
Evidncias adicionais para o papel de SitA na correta organizao da parede
celular foram confimadas por anlises de TEM (Transmission Electron
Microscopy, figura 09-A). Tubos germinativos no tratados de sitA foram
cultivados em MM e apresentaram parede celular aproximadamente 3 vezes
mais grossa que as cepas selvagem e o mutante complementado (figura, 09 B).
A exposio da parede celular dos tubos germinativos de sitA CR e CFW no
alteraram a espessura da parede (figura 09-A, B). Entretanto, a exposio das
cepas tipo selvagem e complementada CFW e CR apresentaram um aumento
de 2,5 a 3 vezes a espessura da parede celular (figura 09-A,B). Esses resultados
sugerem que SitA importante na via de integridade da parede celular em A.
fumigatus.
Resultados_________________________________________________________________55
Figura 02 (A) Anlise de Southern Blot para o mutante nulo Afu6g11470 (sitA). (B) Anlise por
PCR mostrando a complementao da cepa.
Resultados_________________________________________________________________56
Figura 03 Crescimento radial em Meio Completo (A) e Meio Mnimo (B), sugerindo que sitA no
necessrio para o crescimento normal em A. fumigatus (*=P<0,05 por Teste-T).
Resultados_________________________________________________________________57
Figura 04 O mutante sitA de A. fumigatus mais sensvel estresse inico. As cepas

selgavem, sitA ea cepa complementada de A. fumigatus foram incubadas durante 48 horas a
37C em MM contendo diferentes concentraes de MnCl2 (A), CaCl2 (B), ZnSO4 + 1mM EDTA
(C) e LiCl (D).
Resultados_________________________________________________________________58
Figura 05 Experimento de crescimento de condios em meio contendo diferentes

concentraes de rapamicina. Diluies seriadas dos condios (de 105 a 102) das cepas
selvagem, sitA e a cepa complementada foram cultivadas em Meio Completo lquido contendo
diferentes concentraes de rapamicina. Nenhuma diferena entre as cepas foi observada.
Resultados_________________________________________________________________59
.
Figura 06 O mutante sitA de A. fumigatus possui parede celular comprometida. (A e B) O

mutante sitA mais sensvel a agentes que causam danos parede celular como CR e CFW.
Diluies seriadas dos condios (de 10 5 a 102) das cepas selvagem, sitA e a cepa
complementada foram plaqueadas em meio Mnimo (A) e completo (B). (C) O mutante sitA de
A. fumigatus mais sensvel SDS. (D) Anlises de Immunoblot para fosforilao de MpkA em
resposta estresse causado por CR. As cepas selvagem e o mutante sitA foram cultivados por
18 horas a 37C, ento CR (300 g/ml) foi adicionado por 15, 30 e 120 minutos ou no (controle).
O anticorpo anti-fosfo-p44/42 MAPK contra a forma fosforilada de MpkA foi utilizado para detectar
a fosforilao de MpkA (MpkA-P). O anticorpo Anti--tubulina foi utilizado para controle da
quantidade de protenas aplicadas no gel. Como controle adicional, a colorao do gel por
Coomassie brilliant blue (CBB) foi utilizada. A intensidade dos sinais foi quantificada pelo
software Image J e a razo da intensidade de MpkA-P pela intensidade do sinal de -tubulina foi
calculada.
Resultados_________________________________________________________________60
Figura 07 Deteco da composio de -(1,3)-glicanos e quitina na superfcie celular. Condios

foram cultivados em meio lquido at o estgio de hifas, irradiados com UV e corados com
dectina-1 solvel ou calcoflor (A) para detectar a quantidade de quitina (B) ou -glicanos (C),
respectivamente. A intensidade da colorao foi quantificada pela mdia da rea total corada de
cada clula fngica utilizando o software Image J. Os experimentos foram feitos em triplicatas e
os resultados so demonstrados em nmeros arbitrrios (valores mdios com erro padro; * =
P<0,05 por Teste-T). Barras, 5m. DIC (Differencial Interference Contrast)
Resultados_________________________________________________________________61
Figura 08 O mutante sitA de A. fumigatus mais resistente caspofungina em relao ao

tipo selvagem e a cepa complementada. (A) E-tests para o tipo selvagem e sitA de A. fumigatus.
106 condios foram inoculados em 50 mL de MM e cultivados por 24 horas a 37C na presena
de e-tests de caspofungina, aniduladungina, posaconazol, itraconazol e voriconazol. (B) Drop-
outs com caspofungina.
Resultados_________________________________________________________________62
Figura 09 Microscopia eletrnica de transmisso (TEM) para a cepa selvagem, o mutante sitA
e a cepa complementada. Condios foram cultivados na presena ou no de CFW ou Congo
Red. (A) Anlises por TEM (barras, 100 nm). (B) A espessura da parede celular de 50 seces
de diferentes condios. Os resultados foram expressos como mdias com desvios padres.
Resultados_________________________________________________________________63
4.3 - A capacidade de adeso de sitA de A. fumigatus reduzido
A alterao na composio da parede celular pode afetar tambm a

adeso de condios e miclios a superfcies ou outras clulas fngicas. Os
condios de sitA possuem uma alterao drstica na sua hidrofobicidade e
reduo na quantidade da hidrofobina RodA (Figura 10-A, B). Assim, analisamos
a capacidade do fungo em formar biofilmes em superfcies slidas. A formao
de biofilme foi analisada por: (i) Cristal Violeta (CV), o qual o mutante apresentou
uma reduo de 40% e 60% em meio Mnimo contendo 0,1% e 1% de glicose
respectivamente (Figura 10-C) e; (ii) medimos tambm o acmulo da biomassa
atravs do peso seco das cepas cultivadas em meio RPMI durante 96 horas,
neste experimento sitA teve uma reduo de 20% em sua biomassa com
relao ao tipo selvagem e a cepa complementada (Figura 10-D). A microscopia
eletrnica de varredura (SEM, Scanning Electron Microscopy) do miclio revelou
que sitA tem influncia na superfcie celular e na matriz extra-celular durante a
formao de biofilme (Figura 11). A superfcie do sitA lisa, em contraste com
o tipo selvagem (Figura 11). Dessa forma, esses resultados demonstram a
influncia do sitA na composio da superfcie celular do condios e das hifas,
alterando a hidrofobicidade, adeso e a formao de biofilme.
Ns tambm investigamos a quantidade total de protenas na superfcie
celular do sitA comparada com o tipo selvagem, extraindo as protenas da
superfcie celular com NaCl 0,5M (Beauvais et al., 2013). As protenas extradas
da superfcie celular de ambas as cepas foram analisadas por LC-MS/MS
(Tabela 02). No total, 213 protenas na superfcie dos condios foram
identificadas (Tabela 02), porm apenas 52 dessas protenas so diferentemente
expressas entre as cepas analisadas (Tabela 02). Vinte e duas dessas protenas
diferentemente expressas so ou ausentes no mutante sitA (11 protenas) e
presentes no tipo selvagem ou presentes no sitA (11 protenas) e ausentes no
tipo selvagem (Tabela 02). Cinquenta por cento
dessas protenas so enzimas e a maioria delas esto envolvidas na
remodelagem da parede celular, como a NagA (N-acetilhexosaminosidase) e
Gel1 (1,3-beta glicolsiltransferase) (Tabela 02). Quarenta por cento so
Resultados_________________________________________________________________64
protenas hipotticas e 10% so protenas do tipo adesinas. Essas protenas so

compostas por 7 enzimas, 2 pertencendo a maquinaria de translocao e 2
alrgenos (Aspf13 e Aspf34; Tabela 02). Dezesseis protenas so mais
expressas no tipo selvagem: elas so 8 enzimas, 1 relacionada a maquinaria de
translocao, 1 toxina, 5 protenas hipotticas, e 1 alrgeno, Aspf1 (Tabela 02).
Esses resultados implicam a importncia de sitA para a correta distribuio de
protenas de superfcie celular.
Resultados_________________________________________________________________65
Figura 10 A cepa mutante de A. fumgatus sitA possui capacidade de adeso reduzida. A

capacidade de adeso, formao de biofilme e hidrofobicidade influenciada por sitA. (A)
Condios do tipo selvagem, sitA e a cepa complementada em interface gua-leo (tributirina)
1:1. (B) Gel de poliacrilamida mostrando a concentrao de hidrofobinas de condios da cepa
selvagem, sitA e sitA::sitA+. RodAp corresponde RodA nativa e RodAp* que pode ser a
RodA parcialmente degradada ou processada. (C) A adeso, medida pelo ensaio de Cristal
Violeta, reduzida no mutante sitA tanto em glicose 0,1% quanto 1% (*, P = 0,01 comparado
com a cepa selvagem). (D) A Formao de Biofilme tambm reduzido no mutante sitA. As
barras de erro indicam o desvio padro.
Resultados_________________________________________________________________66
Figura 11 Microscopia eletrnica de varredura (SEM) para o tipo selvagem e o mutante sitA.
Aumentos x 1.000. As setas indicam a matriz extracelular.
Resultados_________________________________________________________________67
A.fumigatus Function Mass Length Ratioa % coverage % coverage

Protein (kDa) sitA/WTb mutant
Conidia surface proteins absent in the sitA mutant strain
Afu1g17410 Beta-glucosidase 84 782 Only in WT NI 2
Afu3g14030 Alkaline phosphatase, phoB-regulated 72 653 Only in WT NI 17
Afu2g00690 Glican 1,4-alpha-glucosidase activity, 67 631 Only in WT NI 6
role in polysaccharide metabolic
process and Golgi apparatus,
endoplasmic reticulum, prospore
membrane localization
Afu2g17530 Laccase involved in conidial pigment 65 587 Only in WT NI 15
biosynthesis
Afu7g05140 Putative class III family 18 chitinase 46 448 Only in WT NI 16
Afu3g00270 Cell wall glicanase; predicted 44 450 Only in WT NI 5
glycophosphatidylinositol (GPI)-anchor;
secreted protein
Afu2g05240 Ortholog(s) have extracellular region 42 400 Only in WT NI 11
localization
Afu2g00680 ORF, uncharacterized; Has domain(s) 40 375 Only in WT NI 8
with predicted catalytic activity
Afu7g05650 ORF, uncharacterized; Ortholog of 23 225 Only in WT NI 8
A.fumigatus A1163 : AFUB_091230
Afu5g01420 ORF, uncharacterized; Ortholog(s) 22 205 Only in WT NI 30
have extracellular region localization
Afu2g13600 Pyruvate dehydrogenase (acetyl- 20 187 Only in WT NI 8
transferring) kinase activity, role in
carbon utilization, peptidyl-serine
phosphorylation and mitochondrion
localization
Conidia surface proteins absent in the wild-type strain
Afu8g05020 NagA, secreted N- 67 600 sitA 8 NI
acetylhexosaminidase; highly
expressed in biofilm
Afu2g02100 dihydrolipoamide dehydrogenase; 54 513 sitA 27 NI
reacts with rabbit immunosera exposed
to A. fumigatus conidia
Afu2g01170 Gel1, 1,3-beta-glicanosyltransferase 48 452 sitA 6 NI
with a role in elongation of 1,3-beta-
glican chains;
glycosylphosphatidylinositol (GPI)-
anchored protein; constitutively
expressed during hyphal growth;
hypoxia induced protein
Afu7g05740 NAD-dependent malate 35 340 sitA 17 NI
dehydrogenase; protein abundant in
conidia; immunoreactive; reacts with
rabbit immunosera exposed to A.
fumigatus conidia; induced by L-
tyrosine; transcript downregulated in
response to hypoxia
Afu6g10930 ORF, uncharacterized; Protein of 30 290 sitA 8 NI
unknown function
Afu6g14370 AraC-like ligand binding domain protein 23 213 sitA 9 NI
Afu3g00880 Putative adhesin protein; MedA 21 219 sitA 13 NI
regulated transcript; transcript
repressed by exposure to human
airway epithelial cells
Afu3g09390 Laminin-binding protein with 18 177 sitA 14 NI
extracellular thaumatin domain;
predicted adhesin-like protein;
expression induced in biofilm;
repressed by exposure to artemisinin
Afu1g01980 ORF, uncharacterized; Ortholog(s) 18 179 sitA 6 NI
have role in hyphal growth, response to
cold, response to heat, response to
oxidative stress, response to salt
stress, sporocarp development involved
in sexual reproduction
Resultados_________________________________________________________________68
Afu5g01990 ORF, uncharacterized; BYS1 domain 16 156 sitA 12 NI

protein
Afu4g09320 DpplV, extracellular dipeptidyl-peptidase; 85 765 30.5 18 NI
predicted signal sequence for secretion;
induced by growth on BSA as a sole
nitrogen source; expression dependent
on PrtT
Conidia surface proteins more expressed in the sitA mutant strain
Afu5g10490 Amidase; secreted protein; fibrinogen- 65 611 18.8 5 3
binding
Afu5g03540 Ortholog(s) have flavin-linked sulfhydryl 42 386 11.7 12 14
oxidase activity, role in oxidation-
reduction process and extracellular
region localization
Afu4g13750 Mep20, penicillolysin/deuterolysin 39 370 9.6 5 5
metalloprotease; predicted signal
sequence for secretion
Afu1g06390 Tef1, translation elongation factor EF-1 53 494 4.9 14 3
alpha subunit; protein abundant in
conidia; protein induced by heat shock
Afu3g08290 Aspartyl aminopeptidase; 54 504 3.9 6 5
immunoreactive; secreted protein;
nitrogen source
Afu8g00710 ORF, uncharacterized; Has domain(s) 10 101 3.2 34 48
with predicted role in defense response,
negative regulation of growth
Afu2g09030 DppV, secreted dipeptidyl-peptidase; 79 721 2.9 24 12
nitrogen source; immunoreactive protein
Afu7g07010 Adh1, alcohol dehydrogenase; predicted 37 353 2.0 5 4
gene pair with AFUA_5G06240 (alcC);
induced by L-tyrosine; transcript up-
regulated in conidia exposed to
neutrophils
Afu5g09240 Sod1, Cu/Zn superoxide dismutase; 15 154 2.0 28 30
recognized by sera from aspergillosis
patients; highly expressed in conidia;
transcript induced by copper starvation,
menadione, gliotoxin and growth at high
temperature; protein induced by
hydrogen peroxide
Afu3g02270 Cat1, mycelial catalase; induced in 79 728 2.0 22 21
hyphae exposed to neutrophils; protein
induced in amphotericin B and H2O2;
stuA-dependent up-regulation in
developmentally competent hyphae;
hypoxia repressed; SrbA-regulated;
repressed by gliotoxin exposure
Afu5g01120 ORF, uncharacterized; Ortholog of A. 36 354 1.8 4 9
nidulans FGSC A4 : AN8927, A. oryzae
RIB40 : AO090003001298, Aspergillus
flavus NRRL 3357 : AFL2T_01773 and
Neosartorya fischeri NRRL 181 :
NFIA_041050
Afu2g12630 Aspf13, allergen Asp f 13; putative 15 152 1.8 43 44
alkaline serine protease; higher
expression in biofilm vs planktonic cells;
transcript induced by growth on
hydrogen peroxide
Afu3g03060 Aspf34, allergen Asp f 34; putative phiA 19 185 1.8 9 9
family cell wall protein; induced calcium;
repressed by exposure to artemisinin
Afu1g12070 ORF, uncharacterized; Ortholog(s) have 18 175 1.6 9 9
glycine dehydrogenase
(decarboxylating) activity, role in glycine
catabolic process, one-carbon metabolic
process,
protein lipoylation and mitochondrion
localization
Resultados_________________________________________________________________69
Afu3g15090 Adenosine deaminase family protein; 66 587 1.3 16 15

secreted protein; predicted secretory
signal sequence; ortholog of A. nidulans
AN2494
Conidia surface proteins more expressed in the wild-type strain
Afu1g15730 40S ribosomal protein S22 14 130 0.9 11 11
Afu1g14450 ExgO, exo-beta-1,3-glicanase; secreted 10 947 0.8 10 13
protein; predicted secretory signal
sequence; ortholog of A. nidulans
AN0779
Afu3g07030 Gta1, glutaminase A; secreted protein; 76 691 0.8 16 20
predicted secretory signal sequence
Afu3g00590 AspHS, Asp-hemolysin; hemolytic toxin; 15 139 0.7 20 25
highly secreted; enriched in conidia;
expression increases in vivo; binds
lysophosphatidylcholine
Afu1g05770 Exg12, secreted beta-glucosidase; 94 873 0.6 10 20
predicted secretory signal sequence;
fibrinogen-binding
Afu1g10970 Aalpha-1,2-mannosidase family protein 92 839 0.6 2 19
Afu6g14470 Ortholog of A. nidulans FGSC A4 : 26 234 0.5 10 18
AN5353, A. niger CBS 513.88 :
An02g05680, A. oryzae RIB40 :
AO090103000108, Aspergillus wentii :
Aspwe1_0131073 and Aspergillus
sydowii : Aspsy1_0050268
Afu2g00967 Ortholog of A. nidulans FGSC A4 : 21 196 0.5 7 8
AN7635/binA, AN11904, A. fumigatus
Af293 : Afu3g02216, Afu7g00610 and A.
niger CBS 513.88 : An10g00560
Afu6g03210 ConJ, protein of unknown function; 87 83 0.4 35 26
conidia-enriched protein; ortholog of
Neurospora crassa
Afu8g00630 uncharacterized; Ortholog(s) have 37 347 0.3 27 41
extracellular region localization
Afu4g09280 ORF, uncharacterized; Ortholog of A. 18 167 0.2 28 54
niger CBS 513.88 : An02g00330,
Neosartorya fischeri NRRL 181 :
NFIA_106720, Aspergillus niger ATCC
1015 : 36613-mRNA and Aspergillus
carbonarius ITEM 5010 :
Acar5010_203109
Afu4g11800 Alp1, secreted alkaline serine protease; 42 403 0.2 12 22
cleaves human complement
components C3, C4, and C5; predicted
signal sequence for secretion;
fibrinogen-binding
Afu6g12070 FmqD, Flavoprotein amide oxidase 54 497 0.2 5 14
(FAD); has FAD activity; member of the
fumiquinazoline biosynthetic cluster;
may contain an N-terminal signal
sequence and multiple N-glycosylation
sites; transcript downregulated in
response to voriconazole
Afu1g14560 MsdS, 1,2-alpha-mannosidase; secreted 53 493 0.2 2 7
protein; fibrinogen-binding
Afu7g06140 Exg13, secreted 1,4-beta-D-glican 78 739 0.1 2 7
glicanhydrolase
Afu5g02330 Aspf1, Allergen Asp f 1; ribonuclease 19 176 0.05 7 17
mitogillin family of cytotoxins; similar to
restrictocin; inhibits protein synthesis in
mammalian cells; 18kD IgE-binding
protein; expression increases in vivo;
biofilm-induced vs planktonic cells
Tabela 02 Protenas de superfcie identificadas no tipo selvagem e no mutante sitA. Os

valores esto relacionados a contagens espectrais de trs replicatas para cada cepa.
Resultados_________________________________________________________________70
4.4 - O mutante sitA mais sensvel a inibidores de protena quinase C
A protena fosfatase Sit4p de S. cereviseae necessria para a correta

regulao da atividade de PKC1 tanto basal quanto induzida (de la Torre-Ruiz et
al., 2002). Calfostina C, queleritrina e cercosporamida tm sido utilizados em
mamferos e fungos como inibidores de protena quinase C (Herbert et al., 1990;
Arpaia et al., 1999; Jarvis e Grant, 1999; da Rocha et al., 2002; Sussman et al.,
2004; Juvvadi et al., 2007). Ns hipotetizamos que se sitA est modulando a
atividade da protena quinase C, a susceptibilidade esses inibidores deve ser
alterada. Como esperado, o crescimento do mutante sitA foi drasticamente
inibido por queleritrina, calfostina e cercosporamida (figura 12-A, B e C). Este
resultado foi confirmado posteriormente pela reduo na fosforilao de MpkA
no mutante sitA em relao ao tipo selvagem, quando as cepas foram expostas
calfostina C (figura 12-D). Esses resultados fortemente sugerem que a cepa
sitA possui uma reduo na atividade da protena quinase C e que
provavelmente modula a expresso da protena quinase C.
Resultados_________________________________________________________________71
Figura 12 A cepa sitA possui atividade reduzida da protena quinase C. (A a C) A viabilidade

dos condios do tipo selvagem, sitA e a cepa complementada na presena ou no de calfostina
C, cercosporamida e queleritrina so mostrados atravs do indicador de viabilidade alamarBlue.
Os condios so menos viveis quando o indicador apresenta intensa colorao azul, indicando
uma reduo na atividade mitocondrial. Rosa e vermelho indicam viabilidade. (D) Western blot
para a fosforilao de MpkA. O tipo selvagem e o mutante sitA foram cultivados por 16 horas a
37C, o miclio foi ento transferido para um meio fresco contendo calfostina C durante 30, 60 e
120 minutos. Para a deteco da fosforilao de MpkA, o anticorpo anti-fosfo-p44/42 que
reconhece a MpkA fosforilada foi utilizado. Para controle de carregamento das amostras, o
anticorpo anti--tubulina foi utilizado. Como controle adicional da quantidade de protena
utilizada, o gel corado com CBB tambm foi utilizado. A intensidade dos sinais foi quantificada
utilizando o software Image J e a razo da intensidade de MpkA-P pela intensidade do sinal de
-tubulina foi calculada.
Resultados_________________________________________________________________72
4.5 - SitA importante para a virulncia de A. fumigatus em camundongos
A importncia de SitA para a patogenicidade do fungo A. fumigatus foi

analisada no modelo de aspergilose pulmonar invasiva em camundongos
neutropnicos (Figura 13-A). A infeco com a cepa selvagem resultou em 100
% de mortalidade 12 dias aps a infeco, enquanto a infeco com o mutante
sitA resultou numa significativa reduo na taxa de mortalidade,
aproximadamente 15 % em 15 dias aps a infeco (Figura 13-A,p<0,0003 e
p<0,0007 comparao entre o tipo selvagem e o mutante, nos testes Log-rank,
Mantel-Cox e Gehan-Breslow-Wilcoxon respectivamente). A virulncia foi
restaurada em uma cepa independente resultante de uma simples reintegrao
ectpica do locus sitA da cepa selvagem e no h diferena estatstica entre o
tipo selvagem e a cepa complementada (Figura 13-C p>0,3 e p>0,4 entre o tipo
selvagem e a cepa complementada, nos testes Log-rank, Mantel-Cox e Gehan-
Breslow-Wilcoxon respectivamente), relacionando diretamente a atenuao do
sitA funo de SitA.
Exames histopatolgicos revelaram que 72 horas aps a infeco os
pulmes dos camundongos infectados com a cepa selvagem apresentaram
vrios focos de infeco de hifas invasivas penetrando o epitlio pulmonar, alm
de vrias ramificaes de hifas emergindo dos alvolos (Figura 13-B). Em
contraste com a cepa selvagem, a infeco com sitA revelou inflamaes nos
bronquolos, com poucos conidos germinados ou no germinados (Figura 13-
B). A carga fngica nos pulmes foi medida por qPCR, comprovando que o sitA
no cresceu to bem quanto as cepas selgavem e complementada (Figura 13-
B). Dessa forma, esses resultados sugerem que SitA tem um papel importante
na virulncia de A. fumigatus.
O problema na integridade da parede celular de sitA com a drstica
reduo na virulncia podem contribuir para a alterao na resposta
imunolgica. Macrfagos alveolares tem um papel essencial na remoo de
condios de A. fumigatus dos pulmes (Philippe et al., 2003).
Resultados_________________________________________________________________73
Aproximadamente 15% dos condios das cepas selvagem e de A.

fumigatus foram fagocitados aps 80 minutos de incubao com macrfagos
alveolares (Figura 14), porm 40% dos condios de sitA foram fagocitados aps
o mesmo tempo (Figura 14). Aps 4 horas de incubao, no houve diferena
na fagocitose de condios in vitro entre as cepas selvagem, sitA e a cepa
complementada (dados no mostrados). Esses resultados sugerem que sitA
est mais suscetvel fagocitose, porm no existe nenhuma diferena na ao
fagoctica dos macrfagos. Subsequentemente, os nveis do fator de necrose de
Tumor alfa (TNF-, Tumour necrosis factor alpha) liberados por macrfagos
derivados da medula ssea (MDMO) depois de co-incubao com A. fumigatus
foi investigada. TNF um importante mediador da inflamao liberado por
macrfagos quando expostos A. fumigatus (Taramelli et al., 1996; Mehrad et
al., 1999). MDMOs co-cultivados com sitA mostraram nveis mais altos de
produo de TNF quando comparados com a cepa selvagem e a
complementada (aproximadamente 2,4 vezes, Figura 14). Esses resultados
sugerem que os efeitos causados pelo SitA na integridade da parede celular so
importantes para o reconhecimento feito pelo macrfago e a subsequente
induo da resposta inflamatria.
Resultados_________________________________________________________________74
Figura 13 A. fumigatus sitA contribui para a virulncia em camundongos neutropnicos. (A)

Anlise comparativa do tipo selvagem com as cepas mutantes em modelo de aspergilose
pulmonar em camundongos neutropnicos. Grupos de 10 camundongos por cepa foram
infectados via intranasal com 20l de suspenso de 105 condios. (B) Anlises histolgicas do
pulmo dos camundongos foram realizadas 72 horas aps a infeco. (C) Anlise da carga
fngica nos pulmes determinados por qPCR 72 horas aps a infeco. Os resultados foram
expressos baseados no gene do RNA ribossomal 18S de A. fumigatus dividido pelo resultado da
regio intrnica do gene GAPDH de camundongo.
Resultados_________________________________________________________________75
Figura 14 Reconhecimento de macrfagos e secreo de TNF- por MDMOs. (A)

Porcentagem de condios fagocitados por MAs. Houve um acrscimo no ndice de fagocitose dos
condios de sitA por MAs. Os resultados so mostrados como mdias com desvios padres. *,
P<0,01 em comparao com o tipo selvagem e o mutante complementado. (B) As hifas de sitA
ativam significativamente a liberao de TNF- por MDMOs em comparao com o tipo
selvagem e a cepa complementada. MDMOs de camundongos C57BL/6 foram infectados com
hifas de A. fumigatus durante 18 horas e o sobrenadante das clulas coletados para determinar
os nveis de TNF- por ELISA. Os dados so mostrados como mdias com desvios padres. *,
P0,005 em comparao com o tipo selvagem e a cepa complementada. NI, No Infectado.
__________________________________________5.DISCUSSO
Discusso__________________________________________________________________77
A. Fumigatus um fungo cosmopolita capaz de viver e se adaptar em

diversos ambientes. Porm essa habilidade requer uma grande versatilidade
metablica e a capacidade de se adaptar esses diversos nichos ecolgicos,
atravs da regulao precisa da rede de cascadas de sinalizao e seus efeitos
downstream. A. fumigatus pode eficientemente utilizar o corpo humano como
nicho, causando diversas formas de doenas severas, dependendo das
condies do sistema imune do hospedeiro. Como A. fumigatus capaz de
escapar do sistema imune do hospedeiro e estabelecer a infeco depende das
coordenadas da via de transduo de sinais. Um melhor entendimento desses
mecanismos de adaptao pode ajudar em novas estratgias para controlar a
doena. Recentemente, para compreendermos um pouco mais sobre essas vias
de sinalizao, ns metodicamente investigamos todos os 32 genes que
codificam protenas fosfatases de A. fumigatus e construmos uma coleo de
24 mutantes nulos para estes genes (Winkelstrter et al, 2015). Neste trabalho,
ns focamos em uma nica protena fosfatase, SitA, e caracterizamos
detalhadamente o seu papel na sinalizao celular e virulncia.
O gene sitA de A fumigatus codifica uma protena fosfatase do tipo
Ser/Thr, membro da famlia fosfatase PPP, e relacionada a famlia PP2A
(Winkelstrter et al, 2015). Apesar do alto nvel de identidade de SitA de A.
fumigatus com a Sit4p de S. cereviseae, ns no fomos capazes de
complementar o mutante SIT4 de S. cereviseae. Isso pode ter acontecido
provavelmente pelo fato de a subunidade regulatria de Sit4p de S. cereviseae,
Tap42 (Jiang Broach, 1999) no ter sido capaz de interagir e modular a atividade
de SitA. De fato, a homologia da suposta Tap42 de A. fumigatus, Afu5g11780,
baixa com a Tap42p (31,1% de identidade, 54,5% de similaridade, evalue 3e-
37).
O defeito de crescimento do SIT4 em S. cerevisiae foi apenas
parcialmente restaurado com a expresso de FgSIT4 de Fusarium graminearum
(Yu et al, 2014). Em S. cereviseae, Sit4p desempenha um papel crtico no
crescimento celular e na proliferao (Di Como and Jiang, 2006) e est envolvido
em inmeros processos biolgicos, como a via de resposta nutrientes mediada
por TOR (Di Como and Arndt, 1996; Beck and Hall, 1999; Jiang and Broach,
Discusso__________________________________________________________________78
1999), a regulao de ons monovalentes, homeostase e pH intracelular

(Masuda et al, 2000), e a via de regulao do ciclo celular (Angeles de la Torre-
Ruiz et al, 2002).
Ns observamos que o mutante de A. fumigatus sitA no possui
problemas de crescimento e desenvolvimento. A Sit4p de S. cereviseae
fosforilada por TOR, negativamente regulando Sit4p atravs da associao de
Sit4p com Tap42p. Os principais sinais para a ativao de Sit4p so o tratamento
com rapamicina ou privao de nitrognio (Jacinto, 2007). Quando a Sit4p
ativada os efetores downstream de TOR so defosforilados de forma Sit4p
dependente (Jacinto 2007). A cepa sitA de A. fumigatus no mais sensvel
rapamicina que a cepa selvagem e no observamos problema nutricional nessa
cepa. Homlogos de Sit4 tm sido caracterizados em dois outros fungos,
Candida albicans e F. graminearum (Lee et al, 2004; Yu et al, 2014). Em C.
albicans, a inativao do homlogo de SIT4 resultou em reduo na taxa de
crescimento e na virulncia em modelo de infeco em camundongos (Lee et al,
2004). Esses autores observaram que a Sit4p de C. albicans est envolvida no
crescimento das hifas via regulao da biognese da parede celular,
osmossensibilidade e translocao de protena. Recentemente, Sit4p foi
identificada como potencial reguladora de resposta hipxia em C. albicans
(Sellam et al, 2014).
Antes desse trabalho, apenas uma nica protena homloga a Sit4 foi
descrita em fungo filamentoso, FgSIT4 em Fusarium graminearum (Yu et al,
2014). No patgeno de planta F. graminearum, FgSit4 tem papel importante em
vrios processos celulares, incluindo crescimento micelial, virulncia e
desenvolvimento sexual (Yu et al, 2014). FgSit4 afeta a via de integridade da
parede celular regulando positivamente a fosforilao de FgMgv1, a MAP
quinase na via de integridade da parede celular.
A parede celular de A. fumigatus composta principalmente por
polissacardios, tais como -(1,3)-glicanos e quitina, -(1,3)-(1,4)-glicanos e
galactomananas, que so covalentemente ligadas e -(1,3)-glicanos, que possui
propriedade adesiva e estabiliza a parede celular (Beauvais et al, 2013). A
parede celular dos condios coberta por uma camada externa contendo
Discusso__________________________________________________________________79
rodlets e melanina, que possuem propriedades hidrofbicas e so inertes

imunologicamente (Aimanianda et al, 2009; Aimanianda and Latg, 2010;
Carrion Sde J et al, 2013). A camada externa da parede celular dos condios
possui galactosaminogalactana, enquanto o miclio cresce embebido em uma
matriz extracelular rica em polissacardios, hidrofobinas e melanina (Beauvais et
al, 2013). Ns observamos que o sitA de A. fumigatus apresenta reduo na
quantidade de hidrofobinas, mais sensvel agentes que causam danos na
parede celular e possui um aumento na fosforilao de MpkA. Alm disso, os
tubos germinativos de sitA de A. fumigatus apresentam aumento na quantidade
de -(1,3)-glicanos e quitina e a hifa apresenta reduo na adeso, formao de
biofilme e produo de matriz extracelular. A composio de protenas da
superfcie do condio de sitA distinta do tipo selvagem. Entretanto, anlises
quantitativas dos componentes da parede celular de sitA ficaro para uma
futura investigao. Todos esses dados sugerem fortemente defeitos na via de
integridade da parede celular (CWI). A via PKC1-MAPK (protein kinase C-
mediated mitogen-activated protein kinase) essencial para a ativao da CWI
(Levin, 2005; Rispail et al, 2009). A SIT4 de S. cereviseae apresenta atraso na
transio de G1 para S no ciclo celular, que mediada pela regulao positiva
da ativade de Pkc1 (Angeles de la Torre-Ruiz et al, 2002). Em S. cereviseae, Sit4
opera negativamente nos sensores da membrana plasmtica Mid2, Wsc1 e
Wsc2 e positivamente com a Pkc1, afetando as funes de Pkc1, tais como a
atividade de Mpk1 e CWI, organizao do citoesqueleto de actina e transcrio
de genes ribossomais (Angeles de la Torre-Ruiz et al, 2002). Ainda falta ser
investigado se a SitA de A. fumigatus est modulando diretamente ou
indiretamente PkcA ou outros alvos que estejam envolvidos na via de CWI.
Ns mostramos que sitA possui virulncia atenuada e aumento no
reconhecimento por macrfagos. No modelo de aspergilose pulmonar invasiva
em camundongos imussuprimidos, sitA avirulento quando comparado com o
tipo selvagem e a cepa complementada. Os nveis de TNF, um dos mediadores
para a inflamao secretados pelos macrfagos em resposta hifas, foi
aumentada no sitA em relao ao tipo selvagem e a cepa complementada. O
Discusso__________________________________________________________________80
TNF tem um papel importante na induo da resposta imune inata A. fumigatus

(Taramelli et al, 1996).
O aumento na quantidade de -(1,3)-glicanos, quitina e outras
modificaes na parede celular de sitA pode ter contribudo para o
reconhecimento do fungo pelo receptor dectina, favorecendo o aumento na
fagocitose pelo macrfagos alveolares e consequentemente aumentando a
produo de TNF, j que -glicanos so potentes estimuladores na produo de
TNF em resposta ao fungo (Hohl et al, 2005; Steele et al, 2005; Huang et al,
2009; Faro-Trindade et al, 2012).
Em resumo, ns identificamos SitA como uma fosfatase importante para
construo da parede celular e essencial para virulncia e reconhecimento por
macrfagos. Ainda falta ser investigado como SitA est afetando a organizao
da parede celular. Entretanto, baseado nos estudos em S. cereviseae, provvel
que SitA esteja modulando a atividade de PkcA. Esse melhor entendimento na
funo de SitA em A. fumigatus pode fornecer a oportunidade de entendermos
melhor como A. fumigatus regula a integridade da parede celular e sua
composio durante a virulncia.
_________________________________________6. CONCLUSO
Concluso_________________________________________________________________82
Com base nos resultados obtidos neste trabalho, podemos concluir que:
(I) O mutante sitA apresenta aumento na fosforilao de MpkA;
(II) mais sensvel a agentes que causam dano parede celular;
(III) tem um aumento na produo de -1,3 gicana e quitina;
(IV) apresenta problemas na adeso e formao de biofilme e;
(V) O mutante sitA tambm avirulento em modelo de aspergilose
pulmonar invasiva em camundongos.
Esses resultados mostram a importncia da protena fosfatase SitA de A.
fumigatus como um possvel modulador da atividade de CWI e virulncia.
_______________________7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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___________________________________________8. APNDICE
Apndice_________________________________________________________________113
BOM VLP, DE CASTRO PA, WINKELSTRTRER LK, MARIN M, HORI JI,

RAMALHO LNZ, DOS REIAS TF, GOLDMAN MHSG, BROWN NA,
RAJENDRAN R,RAMAGE G, WALKER LA, MUNRO CA, ROCHA MC,
MALAVAZI I, HAGIWARA D, GOLDMAN GH. The Aspergillus fumigatus sitA
Phosphatase Homologue Is Important for Adhesion, Cell Wall Integrity, Biofilm
Formation, and Virulence. Eukaryo Cell, v. 14, p. 728-744, 2015.

Vincicius Leite Pedro Bom COrrig

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Universidade de So Paulo

Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto

A importncia da protena fosfatase sitA na adeso, integridade da parede

celular, biofilme e virulncia de Aspergillus fumigatus.

Vincius Leite Pedro Bom

Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto

A importncia da protena fosfatase sitA na adeso, integridade da parede

celular, biofilme e virulncia de Aspergillus fumigatus.

Dissertao de Mestrado apresenado do

Bom, Vincius Leite Pedro

1. Aspergillus fumigatus. 2. Protena fosfatase. 3. sitA. 4. pkC.

Vincius Leite Pedro Bom

A importncia da protena fosfatase sitA na adeso, integridade da parede

Dissertao de Mestrado apresenado do

CAPES, pela bolsa de mestrado concedida.

FAPESP, Fundao de Amparo a Pesquisa do Estado de So Paulo, pelo

s professoras. Dra. Maria Helena de Souza Goldman, Faculdade de Filosofia

Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto USP, juntamente com todos os

todas as instituies que contriburam, de alguma forma, na realizao deste

A dvida o princpio da sabedoria.

BOM, V.L.P. A importncia da protena fosfatase sitA na adeso, integridade da

Aspergillus fumigatus um fungo patognico oportunista capaz de infectar

Palavras-chave: 1. Aspergillus fumigatus. 2. Protena fosfatase. 3. sitA. 4. pkC.

BOM, V.L.P. The Aspergillus fumigatus sitA Phosphatase Homologue Is

Aspergillus fumigatus is an opportunistic pathogenic fungus able to infect

Keywords: 1. Aspergillus fumigatus. 2. Protein phosphatase. 3. sitA. 4. pkC.

FIGURA 01 . rvore filogentica de homlogos de sitA em fungos............ 52

FIGURA 02. Anlise de Southern Blot para o mutante nulo sitA............... 55

FIGURA 03. Crescimento radial em Meio Completo e Meio Mnimo........... 56

FIGURA 04. Teste de sensibilidade estresse inico................................. 57

FIGURA 05. Teste de sensibilidade a Rapamicina...................................... 58

FIGURA 06. Sensibilidade do mutante sitA a agentes que causam

danos parede celular................................................................................. 59

FIGURA 07. Deteco da composio de -1,3-glicanos e quitina na

FIGURA 08. Sensibilidade do mutante sitA a antifngicos........................ 61

FIGURA 09. Microscopia eletrnica de transmisso................................... 62

FIGURA 10. Ensaio demonstrando a hidrofobicidade, adeso e formao

FIGURA 11. Microscopia eletrnica de varredura....................................... 66

FIGURA 12. Sensibilidade a inibidores de protena quinase C................... 71

FIGURA 13. A virulncia do mutante sitA de A. fumigatus........................ 74

FIGURA 14. Reconhecimento de macrfagos e secreo de TNF- por

TABELA 01. Sequncia de oligonucleotdeos dos primers utilizados

LISTA DE ABREVIATRUAS, SIGLAS E SMBOLOS

ASPGD Aspergillus Genome Data Base

LISTA DE FIGURAS................................................................................... iii

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SMBOLOS................................ v

1.1 Aspergillus fumigatus.............................................................. 2

1.3 A estrutura da parede celular.................................................. 6

1.4 A via de integridade da parede celular................................... 11

1.5 A protena fosfatase SIT4......................................................... 15

3.1 Declarao de tica.................................................................. 22

3.2 - Cepas e Meios de Cultura...................................................... 22

3.2.1 Sc-URA- (meio minimo)................................................. 22

3.2.3 L.B. (Lria Bertani)........................................................ 23

3.2.4 Meio Mnimo (MM)......................................................... 23

3.2.5 Meio Mnimo modificado (AMM).................................... 24

3.2.6 Meio Completo (YAG, YUU, YG e YG+UU).................. 24

3.2.7 Meio RPMI 1640 (Gibco)............................................... 25

3.3 Solues e Tampes............................................................. 25

3.3.1 Salina Fosfato Tamponada (PBS)................................. 25

3.3.2 Tampo Tris-Acetato-EDTA (TAE) 50x concentrado.... 25

3.3.3 Tampo de ressuspenso de plasmdios...................... 26

3.3.4 Tampo de extrao de DNA........................................ 26