Transcripcin Enzimologa (Clase dictada por: Nelson Varela)

Bioqumica Aplicada 2017

Nicols Arcs
Enzimas o enzimos, se define como biocatalizadores (catalizadores de tipo biolgico)
producidos por los organismos vivientes, que incrementan la velocidad de las reacciones
desarrolladas. No hay vida si no hay enzimas.
Propiedades:
- Son protenas
- Poseen amplios pesos moleculares
- Gran especificidad, lo que hace que usemos las enzimas como herramientas de
laboratorio. Si tengo una muestra con muchas cosas, gracias a la especificidad de
las enzimas, se puede lograr destruir o aislar distintos analitos en puntual (Ejemplo:
RNAsas para aislar el DNA)
- Altamente eficientes: yo no me tengo que sentar una hora o dos a esperar que una
enzima me destruya, por ejemplo, un DNA. Una mnima cantidad logra catalizar
muchas reacciones baratas y de fcil uso.
- La catlisis ocurre en un lugar especfico (sitio activo). Las enzimas poseen otros
sitios que no catalizan la reaccin, que pueden ser sitios de regulacin, que pueden
ser sitios que sufran fosforilaciones, pueden ser sitios alostricos (donde se une
molculas para la enzima funcione ms rpido o ms lento).
- Su actividad es regulada. Una forma de regular las enzimas es con sus cofactores.
Si yo le quito a una enzima su cofactor, su actividad disminuye e incluso puede ser
nula. Entonces por ejemplo usted toma una muestra de sangre y hay enzimas que
catalizan la reaccin de la coagulacin de la sangre, pero si ustedes a esa muestra
le agregan EDTA y el EDTA atrapa el Calcio, como el Ca es el cofactor de estas
enzimas, al ser atrapado estas enzimas no puede llevar a cabo su actividad y, en
consecuencia, no se puede llevar a cabo la cascada de coagulacin => La sangre
no coagula. Si ahora quiero medir la velocidad de coagulacin, ahora agrego Ca,
por ende, uno puede manipular el sistema como uno quiera.
- Las enzimas no se van gastando con la reaccin. La enzima cataliza una rxn y
queda totalmente libre para catalizar, pero como son protenas se van deteriorando
por el ambiente. Cambios de pH, agentes oxidantes, van daando a la enzima, por
ende, la enzima no es eterna Las enzimas tiene una vida til Glbulo Rojo: a
los 120 das las enzimas del GR fallan porque se deterioran, se hace viejo, no
flexible y se destruye en el bazo. Como el glbulo rojo no tiene ncleo, vive lo que
le dure la enzima
- NO afecta el equilibrio de la reaccin. Las enzimas aceleran la llegada al equilibrio
qumico, pero no alteran el equilibrio.
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Lo que hace las enzimas para poder catalizar las
reacciones es: cuando yo tengo un sustrato que
va a dar origen a un producto, ese sustrato tiene
que activarse para que esto ocurra, llegar a un
cierto nivel de energa mnimo para que se pueda
desencadenar la reaccin hasta la generacin de
producto. Hay una especie de barrera que
tenemos que pasar (la subida de la curva).
Ejemplo clsico: si yo tengo bencina con oxgeno
(del aire). La bencina no tiene por qu explotar
liberando calor, y generando CO2 y agua, porque
tenemos esta barrera, que impide que esto
ocurra. Pero basta con agreguemos calor o una
chispa, lo cual aportar la energa necesaria para
que estos sustratos salten esta barrera y con esto, se desencadenar la reaccin.
La enzima entonces ubica, orienta a las molculas para que se junten de una manera dada
(la ms efectiva) para que as entonces, reduzcamos esa energa de activacin y as la
reaccin ocurrir en forma mucho ms fcil.
La reaccin del grfico es del tipo exergnica porque la energa que tienen los sustratos es
mayor a la que tiene los productos.
Si observamos ahora la descomposicin del
perxido de hidrgeno en el cuadro morado,
resulta que el agua oxigenada no dura para
siempre, ya que con el tiempo se
descompone en agua y oxgeno. Entonces si
ustedes dejan el agua oxigenada sola a una
temperatura de 20C, esa agua oxigenada
necesita 18 Kcal por mol de agua oxigenada
para realizar este proceso. Si ahora ustedes le agregan el catin ferroso (Fe2+), ste acta
como catalizador porque ahora necesitar menos Kcal por mol de agua oxigenada (menos
energa) para que la descomposicin ocurra. Si usted ahora le agrega Catalasa (enzima),
la reaccin ocurrir con necesidad de mucho menos energa y, por ende, la descomposicin
ocurrir de forma ms rpida.
Nomenclatura enzimtica:
Generalmente llevan el nombre del sustrato terminado en asa (Sustrato + Asa), por
ejemplo, ureasa. Sin embargo, hay algunos nombres triviales.
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Clasificacin de las enzimas:
1. Oxidorreductasas: A se reduce y B se
oxida (B puede ser un cofactor). Catalizan
reacciones Redox. Utilizan coenzimas como
NAD+, NADP+, FAD+. Ej. deshidrogenasas,
oxidasas y peroxidasas.
2. Transferasa: un grupo qumico se transfiere.
Catalizan la transferencia de grupos (NH2,
COOH, CO, CH3, RCO, etc. Ej. Quinasas,
aminotranferasa, transcarboxilasa
3. Hidrolasas: rompen enlaces utilizando agua.
Catalizan la escisin de enlaces entre un
tomo de carbono y otro tomo por adicin
de agua. Ej. Peptidasas, amilasa, ureasa.
4. Liasas: rompen un enlace sin incorporacin del agua. Catalizan la ruptura de
enlaces carbono-carbono, carbono-azufre y ciertos tipos de enlaces carbono-
nitrgeno. Ej. Descarboxilasas, aldolasa, citrato liasa.
5. Isomerasas: cambian la posicin de algunos grupos qumicos. Catalizan la
racemizacin de isomros pticos o geomtricos. Ej. epimerasa, racemasa, mutasa.
6. Ligasas: Catalizan la formacin de enlaces carbono-oxgeno, carbonoazufre,
carbono-nitrgeno y otros tomos. Generalmente utilizan ATP para su accin. Ej.
Tioquinasa, carboxilasa. Se subclasfican en sintetasas (utiliza ATP) y sintasa (no
utiliza ATP).
En cuanto al centro activo enzimtico, es donde se
produce una interaccin muy precisa de los sustratos con
la enzima y ah hay una gran cantidad de interacciones de
tipo dbil, generalmente.
En el sitio activo hay una serie de aminocidos que tienen
sus residuos (sus grupos R) en una cierta orientacin,
carga elctrica, polaridad, etc. que hace que pueda
interactuar la enzima con el sustrato. En el caso de la
imagen, el sustrato es una protena porque se observa un
enlace peptdico y lo que hace esta enzima es que tiene
un sitio activo que logra interactuar con la protena, el cual
rompe el enlace peptdico y por lo tanto podemos decir
que est degradando esta protena (proteasa). En el sitio
activo, las proteasas tienen una cadena de serina (se ve
encerrado en amarillo en la imagen) y sta tiene un grupo
alcohol, el cual libera su hidrgeno, quedando un grupo altamente reactivo (se refiere al O-
), el cual es el que logra finalmente romper el enlace (serinproteasas).
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Resulta que nosotros en nuestra sangre tenemos factores de coagulacin y cuando un vaso
sanguneo se daa, los factores de coagulacin se activan, pero tambin unos factores
pueden salir de ese sitio especfico y activar la cascada de coagulacin en la sangre, lo cual
sera extremadamente grave. Para solucionar esto, nosotros en el suero tenemos
inhibidores de serinproteasas, para que cualquiera de estos factores que logre moverse de
este sitio especifico donde se encuentra una hemorragia, por ejemplo, sea inhibido. En los
cultivos celulares, las clulas crecen pegadas a las placas y si quiero cambiar mi cultivo de
lugar, lo que debo hacer es sacar el medio de cultivo + agrego PBS + movimiento de la
placa botar el PBS agrego tripsina (enzima que fue previamente comprada, la cual
fue creada por una bacteria recombinante, a la cual le introdujeron el gen de la tripsina para
que produjera mucha tripsina) la tripsina corta las protenas que mantienen de unin para
que la clula se suelte de la placa Una vez que las clulas se soltaron, inmediatamente,
se debe agregar suero de vacuno (el suero de vacuno, al igual que el del humano, tiene
inhibidores de serinproteasas) para inhibir a la tripsina. Si ustedes no hacen este paso, la
tripsina seguir destruyendo las protenas celulares y terminar acabando completamente
con la clula.
Modelos de unin enzima-sustrato:
1) Rgido, Llave-cerradura: el sustrato tiene una forma determinada, la cual estara
encajando con el sitio activo de la enzima.
2) Encaje inducido: la enzima tiene un sitio bastante similar a la estructura del sustrato,
pero no idntico (como en el modelo anterior) y a medida que interacta el sustrato
con el enzima, se van produciendo cambios conformacionales en la enzima, lo que
provoca que se forme el complejo enzima-sustrato.
Cofactores enzimticos:
Son constituyentes NO PROTEICOS que requieren algunas enzimas (enzimas conjugadas)
para su catlisis. Dentro de stos, encontramos:
- Grupos prostticos: cofactor que se une covalentemente a la enzima (unin fuerte)
- Coenzima: estn ms bien libres, a diferencia de los grupos prostticos, se unen y
se sueltan.
- Estructuras inorgnicas: elementos metlicos que ayudan a llevar a cabo la accin
enzimtica (metaloenzimas)
Cuando la enzima no tiene su cofactor se le denomina APOENZIMA. Cuando la enzima
est en contacto con su cofactor se le denomina HOLOENZIMA
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Cintica enzimtica:
Cmo funciona esta cintica enzimtica? Tenemos
nuestra enzima disponible, que posee un sitio activo, al
cual se le unir un sustrato (sacarosa). Interacta la
enzima con la sacarosa y forman el complejo enzima-
sustrato. La enzima rompe un enlace glucosdico
utilizando agua (hidrolosa). Se libera el producto, glucosa,
quedando la enzima libre.

Cuando la enzima se une con el sustrato en el complejo

enzima-sustrato, tendremos dos velocidades. La primera
velocidad de reaccin es la velocidad con la que se une la
enzima al sustrato para formar este complejo (k1), pero tambin hay una velocidad que
puede ir en contra (k2) y que hace que el complejo se suelte antes de que ocurra la reaccin
(se desarma el complejo) y esto est en un equilibrio (por eso a cada velocidad le asign
una constante). Finalmente tenemos una tercera velocidad (k3) que tambin desarma el
complejo enzima-sustrato, pero con la formacin de producto.
La constante Michaelis (Km) depende de estas tres constantes anteriormente descritas. Km
significa afinidad de la enzima por el sustrato. Cuando la Km es muy pequea, hay una alta
afinidad de la enzima por el sustrato. Por lo tanto, el k1 debe ser muy grande y k2 con k3
deben ser muy pequeas, para que exista una alta afinidad de la enzima por el sustrato.
Vamos entonces al laboratorio, para construir una curva de
progreso de una reaccin enzimtica. Debo tener la enzima
y su sustrato. Una vez que yo ponga en contacto la enzima
con su sustrato, comenzar a ver el producto en el tiempo
que se va a formar. Entonces voy a tener lo que se muestra
en la imagen: al principio relacin es lineal y luego comienza
a transformarse en un plat constante, lo que quiere decir
que no se generar ms producto, la enzima se satur.
Entonces, en una curva de progreso, tenemos una velocidad
que luego empieza a disminuir hasta que se hace 0 porque
no hay pendiente en el plat.
Por qu pas? Porque se acab el sustrato. Se lleg al equilibrio.
La parte lineal, que es la importante, se le conoce como velocidad inicial (producto/tiempo).
Es importante para ver cmo se relacion el sustrato con la enzima.
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Si ahora yo hago una segunda curva de progreso. Tomo un tubo de ensayo y agrego ms
sustrato, pero mantengo constante la cantidad de enzima. Hago la curva de progreso
(producto/tiempo). Lo que observo en la curva de progreso es que como hay mayor cantidad
de sustrato, la pendiente es mayor y por lo tanto la velocidad aumenta mayor cantidad
de producto en el mismo tiempo.
Ahora realizo otra curva de progreso, la tercera, tomando una mayor de sustrato (mantengo
la cantidad de enzima). Al momento de realizar la curva de progreso, se observa una mayor
pendiente, debido a que aumenta la velocidad (an ms que en el caso dos).
Lo que hicieron Michaelis-Menten fue tomar esas tres
velocidades obtenidas y graficarlas con versus de
concentracin de sustrato porque se dieron con las
curvas de progreso que la concentracin de sustrato
provocaba un cambio en la velocidad. Cada punto de la
curva Michaeliana es una curva de progreso en
particular.
Este esquema lo que me demuestra es que la enzima
est saturada. Cuando se habla del plat de la curva de
progreso uno dice que la enzima ya convirti todo el
sustrato disponible en producto, por lo que llega al
equilibrio. En cambio, el plat de una curva Michaeliana
me indica que la enzima est saturada, lo que quiere decir que por ms que yo aumente la
concentracin de sustrato, generar la misma cantidad de producto por unidad de tiempo y
por lo tanto se habla de que nos encontramos frente a la velocidad mxima.
OJO: LA CANTIDAD DE ENZIMA ES FIJA.
La mitad de la velocidad mxima, si yo la intrapolo en la curva me da un valor de
concentracin de sustrato que se conoce como Km y a esa Km tendramos una cantidad
de sustrato que permite la mitad de la velocidad mxima.
Desde el origen del plano cartesiano hasta el Km
se puede decir que la reaccin es de orden 1, ya
que la velocidad depende de la concentracin de
sustrato.
Entre el orden 1 y el orden 0, el orden es difcil
conocer el orden de la reaccin ya que se pasa
como por una transicin desde orden 1 0
La velocidad de la reaccin cuando estamos en
Vmax, en el plat, es de orden 0 porque sta no
depende de la concentracin de sustrato.
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Si nos fijamos ahora en la ecuacin de
Michaelis-Menten (encerrada en el crculo
amarillo). Km = (k2+k3)/k1. Por lo tanto,
cuando la Km es muy grande significa que
k2 y k3 son muy grandes y desarman el
complejo enzima sustrato, por lo que k1 es
un valor pequeo, lo que es indicio de que
es difcil formar el complejo enzima-
sustrato. Lo anterior implica que, si la Km
es muy alta, tendremos una baja afinidad
de la enzima por el sustrato.
La otra ecuacin importante es la de
velocidad mxima. Vmax = k3*[E]t
(constante cataltica, multiplicado por la
concentracin de enzima total {enzima
libre+enzima unida al sustrato} ). Esto
quiere decir que la velocidad mxima
depende de la constante y de la concentracin de enzima. Si agrego ms enzima, la
velocidad mxima aumenta (relacin directa). Lo increble de esto y que, si ustedes le
calculan la Km a una reaccin en donde ustedes aumentaron la velocidad producto de que
aumentaron la concentracin de sustrato, sta no vara, lo que usted hizo solamente fue
levantar la curva.
Ahora si analizamos la ecuacin V=Vmax* [S] / Km + [S] Qu ocurre si quiero conocer la
velocidad cuando la concentracin de sustrato es bastante menor a la Km? Se puede
eliminar la [S] del denominador, debido a que como la concentracin de sustrato es mucho
menor a la Km, no afecta en la divisin Qu ocurre ahora si la reaccin es de orden 0 (10
veces la Km), es decir, queremos conocer la velocidad cuando la concentracin de sustrato
es mucho mayor a la Km? V=Vmax
Si me dicen Te paso esta enzima, pero yo quiero que trabaje en orden 0, en otras palabras,
lo que me dicen es que quieren que trabaje a velocidad mxima. Entonces me voy a un
libro y veo el sustrato que le voy a tirar a la enzima, junto con su Km. Si la Km es 2, la
concentracin de sustrato que agrego ser 20, para asegurarme que estoy trabajando a
velocidad mxima.

Recordar que enzima total corresponde a la concentracin

de enzima libre + la concentrancin de enzima unida a
sustrato. Si despejo esta ecuacin, puedo obtener que la
concentracin de enzima libre es igual a la enzima total
menos la concentracin de enzima unida a sustrato.
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Nicols Arcs
A tiempo 0, tengo en el tubo de ensayo toda mi enzima
libre y todo mi sustrato sin enzima.
Cuando la reaccin empieza a andar, lo que tiene que
ocurrir es que la enzima libre disminuye porque se
comienza a unir al sustrato, aumenta la concentracin
de enzima unida al sustrato. Si esto ocurre, entonces la
concentracin de sustrato tambin disminuye y aumenta
la concentracin de producto.
Cuando esto avanza entonces, el producto aumenta y el
sustrato disminuye. En la parte lineal se mantiene algo
constante: una muy baja cantidad de enzima libre y una
cantidad desconocida de enzima unida a sustrato.
Michaelis-Menten crean el modelo estacionario para
concluir que, en velocidad inicial, la formacin de producto es constante. Concluyen tambin
que la generacin del complejo enzima-sustrato es pequea y es constante. Por lo tanto,
lo que dice Michaelis-Menten es que la V1 = V2 + V3 y tiene lgica porque si recordamos que
V1 y V3 son las velocidades que me desarman el complejo, si sumamos estas dos
velocidades me dar V1 porque es la nica forma de que el complejo enzima-sustrato se
mantenga constante.
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La Km es propia de la enzima o del sustrato? La Km no es de una ni de otro, es de ambos.
YO TENGO UNA KM DE UNA ENZIMA PARA UN DETERMINADO SUSTRATO. Siempre
se debe nombrar la enzima y el sustrato.

Si aumentamos la concentracin de enzima, entonces aumentar la velocidad mxima,

pero la Km se mantiene. Vmax, entonces depende de la concentracin de enzima. La Km
es propia de la enzima con su sustrato.
La curva Michaeliana tiene el problema de
que nunca toca la Vmax. Viene entonces
despus un par de caballeros que se les
ocurri aplicar los dobles recprocos a la
curva Michaeliana ya que mediante la curva
Michaeliana era muy complejo determinar la
Vmax y si no se puede calcular la Vmax,
entonces tampoco puedo calcular la Km.
Donde la recta corta en 1/[S] = 1/Km
Donde la recta corta en 1/[V0] = 1/Vmax
La pendiente de esta curva corresponde a
Km/Vmax, lo cual es conocido como
eficiencia cataltica porque una enzima es
ms eficiente en medida que la Km sea menor y la Vmax sea mayor Muy afn por su
sustrato y genera mucho producto en un determinado tiempo.
OJO: En medida en que la curva empieza a caer la enzima es mucho ms eficiente.
Si aumenta la pendiente (si agrego un inhibidor) la eficiencia cataltica est disminuyendo.