2014 28

Isabel Jimnez Pardo

Hidrogeles termosensibles y
fotopolimerizables derivados de
Pluronic para aplicaciones
biomdicas

Departamento
Qumica Orgnica

Director/es
Ros Latienda, Mara Blanca
Sierra Travieso, Teresa
 Tesis Doctoral

HIDROGELES TERMOSENSIBLES Y
FOTOPOLIMERIZABLES DERIVADOS DE
PLURONIC PARA APLICACIONES BIOMDICAS

Autor

Isabel Jimnez Pardo

Director/es

Ros Latienda, Mara Blanca

Sierra Travieso, Teresa

UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA
Qumica Orgnica

2014

Repositorio de la Universidad de Zaragoza Zaguan http://zaguan.unizar.es



TESISDOCTORAL

HIDROGELESTERMOSENSIBLESYFOTOPOLIMERIZABLES
DERIVADOSDEPLURONICPARAAPLICACIONES
BIOMDICAS

Autor

ISABELJIMNEZPARDO

Directores

MARABLANCAROSLATIENDA

TERESASIERRATRAVIESO

Dpto.deQumicaOrgnica

FacultaddeCienciasICMA

UniversidaddeZaragozaCSIC

Zaragoza,enerode2014



TESISDOCTORAL

HIDROGELESTERMOSENSIBLESYFOTOPOLIMERIZABLES
DERIVADOSDEPLURONICPARAAPLICACIONESBIOMDICAS

MemoriapresentadaenlaUniversidaddeZaragozaparaoptaral
gradodeDoctor

ISABELJIMNEZPARDO

Dpto.deQumicaOrgnica

FacultaddeCienciasICMA

UniversidaddeZaragozaCSIC

Zaragoza,enerode2014

Prof.MARABLANCAROSLATIENDA,CatedrticadelDepartamentodeQumica
OrgnicadelaFacultaddeCienciasdelaUniversidaddeZaragozay
Dra. TERESA SIERRA TRAVIESO, Investigador Cientfico del Consejo Superior de
InvestigacionesCientficasdelInstitutodeCienciadeMaterialesdeAragndela
UniversidaddeZaragozaCSIC.

HACENCONSTAR:

Que la Memoria titulada: Hidrogeles termosensibles y fotopolimerizables

derivados de Pluronic para aplicaciones biomdicas ha sido realizada bajo
nuestra direccin por DA. ISABEL JIMNEZ PARDO en el Departamento de
QumicaOrgnicadeestaUniversidadyrenelascondicionesrequeridasparasu
presentacincomotesisdoctoral.

Zaragoza,a30deenerode2014

Fdo.:Prof.MaraBlancaRosLatienda Fdo.:Dra.TeresaSierraTravieso


A mi familia, a Luis y a Clara

Agradecimientos

Ha llegado el momento. Despus de posponer y posponer la escritura

de los agradecimientos aqu estn. Es difcil recoger en poco espacio
todo lo vivido, profesional y personalmente, en estos 4 aos y pico de
mi vida, espero no enrollarme mucho y sobretodo no dejarme a nadie.

En primer lugar me gustara agradecer a mis directoras de tesis,

Teresa y Blanca. Gracias por darme la oportunidad de trabajar con
vosotras, por escuchar siempre mis ideas, por ensearme tanto y por
estar siempre disponibles para resolver mis dudas e inquietudes.
Gracias tambin por vuestra implicacin con este trabajo y por buscar
siempre colaboraciones con el fin de encontrar aplicaciones reales para
los materiales de esta tesis. Gracias Teresa por tus fantsticas ideas
qumicas y Blanca, gracias por tu gran capacidad para resumir mis
largas explicaciones. Creo que formis un gran equipo.

Quisiera agradecer al profesor Jos Luis Serrano, por acogerme en el

Grupo de Cristales Lquidos y Polmeros y por interesarse siempre por
mi trabajo. Tambin me gustara agradecer al resto del grupo: Luis,
Joaqun, Raquel, Milagros, Mercedes, Rosa, Santi, Ana, y
especialmente a Pilar, por su ayuda y disponibilidad para la realizacin
de experimentos de RMN.

Tambin agradecer a todas las personas que formaron parte del

proyecto de investigacin PI031/08 de la DGA: Jos Manuel Garca
Aznar, Clementina Rodellar, Francisco Vzquez, Iaki Ochoa, Mara
Jos Martnez Lorenzo, con el que se dieron los primeros pasos de
esta tesis, y del proyecto posterior PIPAMER (10/015), con el que se
continu.

Gracias a la doctora Mara Jos Martnez del Banco de Sangre y Tejidos

de Aragn, por la realizacin de los ensayos celulares con hidrogeles
de esta tesis y por acercarme al maravilloso mundo bio. Te
agradezco enormemente tu disponibilidad para la realizacin de los
ensayos y para responder siempre mis dudas del mundo bio.

Tambin me gustara agradecer a los miembros del grupo GEMM:

Iaki, Clara, Alexis, Aitor, por la realizacin de los ensayos
mecnicos, y sobre todo por hacerme aprender algo sobre el que yo
considero complicado mundo de las propiedades mecnicas.

En este punto me gustara agradecer a los servicios tcnicos que han

hecho posible la obtencin de parte de los resultados esta tesis.
Gracias a los servicios tcnicos del CEQMA. Gracias a Mara y Csar,
del Servicio de Microscopia e imagen del IACS, por vuestra ayuda con
los equipos de microscopa de fluorescencia y confocal. Gracias Carlos
y Rodrigo, del LMA del INA, por la obtencin de las imgenes de SEM y
TEM, y por las conversaciones entre medida y medida. Gracias Pedro,
Patricia y Miguel G., del Servicio de Calorimetra, por la realizacin de
los ensayos de DSC.

GRACIAS a mis compaeros del INA, por haber sido una verdadera
familia para mi, y por crear un gran ambiente de trabajo todos los
das. Eva G., tu llegada al INA fue una autntica revolucin positiva;
gracias por poner orden y sobre todo por tu positivismo contagioso en
el laboratorio. Gracias Emma, por estar siempre ah, dispuesta a
escuchar mis historias, tanto de trabajo como de cualquier otro asunto
que pasara por mi cabeza, y por supuesto gracias por tus consejos.
Julieta y Betta, gracias por ser unas compaeras geniales, por vuestra
ayuda dentro y fuera del laboratorio, y por escuchar con paciencia mis
historias de mi querido pueblo. Y aunque ahora ya no estis en el
grupo, gracias por seguir interesadas siempre por mi y por mi tesis en
estos ltimos meses. Gracias Luchi, por tu entusiasmo y alegra
contagiosa cada maana, por tus historias geniales y por estar siempre
dispuesta a tomar un caf conmigo. Alex ha llegado tu turno, espero
que los agradecimientos que llevas tanto tiempo esperando no te
defrauden, que el listn est muy altoGracias por aguantar con
humor las conversaciones de mujeres del INA, por los momentos que
hemos pasado tanto fuera (espero repetir este ao en Pamplona) como
dentro del laboratorio y por prestarme la molcula de rodamina.
Mariajo, como ya eres una ms del INA te incluyo aqu; gracias por tus
consejos y conversaciones sobre geles y otros temas de la vida, sobre
todo durante estos ltimos meses. Gracias tambin a los estudiantes
que han pasado por el INA: Eva, Diego, Chechu y Luca H. Gracias
Iigo, por facilitarnos el trabajo en el laboratorio.

Gracias tambin a toda la gente de ciencias, por preparar siempre

pasteles en mis visitas (os prometo que no lo haca a posta). Gracias a
Miguel C., compaero de vitrina durante mis primeros meses de tesis,
y a Jordi, por hacer ms llevaderas mis visitas a ciencias con vuestras
historias siempre divertidas. Gracias a Neli, por tu ayuda durante mis
primeras reacciones con los polmeros y por interesarte por mi tesis y
por mi futuro. Gracias tambin a Marta, Ismael, Jose, Madalina, Bea,
Albertico, Vero, Alf, Yuki, Hugos, Danieleme ha encantado conoceos a
todos y cada uno de vosotros. Gracias tambin a todos los que han
pasado por el grupo: Amedeo, Eva, Miguel L., Edu, Silvia, Jess,
Sandra, Ramn, Susana, Judith

Me gustara agradecer a Rebeca por la realizacin de los ensayos

celulares con nanogeles, por ser siempre tan paciente con mis
innumerables dudas y por responderlas siempre con una sonrisa.

Gracias a mis amigas de siempre: Elena, Sheila, Cris y Mire, porque

aunque cada vez nos vemos menos por cuestiones de la vida, s que
aunque no os vea en mucho tiempo siempre puedo contar con todas
vosotras.

Gracias a mis amigos de la pea, por los momentos compartidos que

me han ayudado a desconectar.

Gracias tambin a mis amigos de la pea la femera de Ainzn: Luis,

ngel, Guillermo, Ainhoa, Juan, Marta, Javi G., Adrin, Javi A., Estela,
Dani, Ivn, Enrique, Nadine, Alberto y Judit, por todos los momentos
compartidos, las jornadas gastronmicas, cenas de los jueves, cenas
de los sbados, bodega, casas rurales, nocheviejas, viajes de finde a la
playa, excursiones, cafs, cervezas, pinchos, risassimplemente
gracias a todos!!!

Gracias a Gloria, Aurelio y Alba, por acogerme en vuestra casa siempre

como una ms. Gracias tambin por interesaos por mi trabajo y por
hacernos siempre la vida ms fcil. Gracias Aurelio por las fotos de los
geles que has hecho para esta tesis.

Gracias a mi familia, mam, tato, tos y yaya, pero gracias sobre todo
a ti, mam. Gracias por comprenderme, escucharme, aconsejarme y
por confiar siempre en m y en todas mis decisiones, gracias por ser
como eres y transmitirme tus valores da a da. Me gustara acordarme
tambin de los que no estn, pap, yayos, tos, s que estarais
orgullosos de m. Tambin me gustara recordarte a ti, Clara, porque
aunque te fuiste muy pronto, en el tiempo que te conoc me enseaste
a luchar y a no rendirme ante los problemas, muchas veces sin
importancia real.

Y por ltimo, gracias a ti, Luis, por ser mi compaero de viaje, por tu
paciencia, compresin y apoyo en todos los momentos. Por hacerme
ver la vida desde otro punto de vista y por ser el motivo por el que
sonrer cada da. Gracias tambin por la realizacin de algunas de las
figuras y fotografas de esta tesis y por tu paciencia con los cambios de
ltima hora.

Finalizar agradeciendo al Gobierno de Aragn (DGA-FSE) a travs del

proyecto PI0131/08, Ingeniera de tejidos para la regeneracin de
cartlago articular: influencia de factores mecnicos, y del Grupo de
Cristales Lquidos y Polmeros (Grupo DGA E-04) y al IACS a travs del
Proyecto PIPAMER (10/015), mecanobiologa e ingeniera de
regeneracin de cartlago, por la financiacin econmica que he
recibido durante la realizacin de esta tesis doctoral.

Gracias a todos!!!!
ACRNIMOS

13
CRMN ResonanciaMagnticaNucleardecarbono
1
HRMN ResonanciaMagnticaNucleardeprotn

ADN cidodesoxirribonucleico

AlfaMEM MinimunEssentialMedium

BA alanina

bisMPA cido2,2bis(hidroximetil)propinico

BSA BovineSerumAlbumin

CC Ensayosmecnicosconfinados

CGC ConcentracinCrticadeGelificacin

CMC ConcentracinMicelarCrtica

CMT TemperaturaMicelarCrtica

DCC N,Ndiciclohexilcarbodiimida

DCU N,Ndiciclohexilurea

DLS DynamicLightScattering

DMAP Dimetilaminopiridina

DMEM DulbeccosModifiedEaglesMedium

DPBS DulbeccosPhosphateBufferedSaline

DPTS ptoluensulfonatodeN,Ndimetilaminopiridinio

DSC (DifferentialScanningCalorimetry)CalorimetraDiferencial
deBarrido

DTT Ditiotreitol

ECM (ExtracellularMatrix)MatrizExtracelular

EDMA Dimetacrilatodeetilenglicol

EE EficienciadeEncapsulacin

EM EspectrometradeMasas

EPR EnhancedPermeationRetentionEffect
FBS (FetalBovineSerum)Suerofetalbovino

FDA FoodandDrugAdministration

FGF FibroblastGrowthFactor

FTIR EspectroscopiainfrarrojacontransformadadeFourier

GL Glicerol

GMAchitosan Quitosanometacrilado

GPC (GelPermeationChromatography)Cromatografade
PermeacinenGel

HeLa ClulasHomoSapiensCervixAdenocarcinoma

HEMA Metacrilatode2hidroxietilo

HMBC HeteronuclearMultipleBondCorrelation

HSQC HeteronuclearSingleQuantumCorrelation

I2959 Irgacure2959

IT IngenieradeTejidos

LCF LiberacinControladadeFrmacos

LCST LowerCriticalSolutionTemperature

LSU LightScatteringUnits

MALDIMS MatrixAssistedLaserDesorption/IonizationMass
Spectroscopy

Mn Pesomolecularpromedioennmero

MSC (MesenchymalStemCells)ClulasMesenquimales

MTT Bromurode3(4,5dimetiltiazol2ilo)2,5difeniltetrazol

Mw Pesomolecularpromedioenpeso

NC Ensayosmecnicosnoconfinados

PBS PhosphateBufferedSaline

PCL Policaprolactona

PDI ndicedePolidispersidad

PEA Poliesteramidas
PEG Polietilenglicol

PEGDA Diacrilatodepolietilenglicol

PLA cidopolilctico

PLGA cidoPolilcticocogliclico

PNIPAAm PoliNisopropilacrilamida

PPG Polipropilenglicol

Py Piridina

RGD Arginina,glicina,cidoasprtico

RTG ReverseThermalGelation

S.D. Desviacinestndar

SA cidoSuccnico

SEM (ScanningElectronMycroscopy)Microscopaelectrnicade
barrido

TEA Trietilamina

TEG Tetraetilenglicol

TEM (TransmissionElectronicMycroscopy)Microscopa
electrnicadetransmisin

TsOH cidoptoluensulfnicomonohidrato

UCST UpperCriticalSolutionTemperature

UV Ultravioleta

W0 Pesoinicial

Wt Pesoatiempot

TGF TransformingGrowthFactor

G EnergadeGibbs

S Entropa
NDICE

CAPTULO1.ANTECEDENTES 1
1.1.HIDROGELESCOMOMATERIALESPARAAPLICACIONESENBIOMEDICINA 3
1.2.CARACTERISTICASDELOSHIDROGELESPARAAPLICACIONESBIOMDICAS 8
1.2.1.Hidrogelesconreticulacinfsica 9
1.2.2.Hidrogelesconreticulacinqumica 13
1.2.3.Hidrogelesnanoestructurados 22
1.3.PLURONICYSUSAPLICACIONESBIOMDICAS 25

CAPTULO2.OBJETIVOSYPLANTEAMIENTO 39
2.1.OBJETIVOS 41
2.2.PLANTEAMIENTODELTRABAJO 45

CAPTULO3.HIDROGELESDERIVADOSDEPLURONIC:POLIACRILATOS 49
3.1.SNTESISYCARACTERIZACIN 53
3.1.1.Derivadolineal 53
3.1.2.Derivadosdendrticos 55
3.2.DETERMINACINDELASPROPIEDADESSOLGEL 78
3.2.1.Mtododeinversindelvial 79
3.2.2.DSC 81
3.2.3.Discusindelosresultados 84
3.3.PREPARACINDEHIDROGELESFOTOPOLIMERIZADOS 87
3.4.CARACTERIZACINDELAMORFOLOGAINTERNAPORSEM 89
3.5.ESTUDIODEDEGRADACINDEHIDROGELESFOTOPOLIMERIZADOS 92
3.6.ENSAYOSDEVIABILIDADCELULAR 96
3.6.1.Resultadosdeviabilidadcelulardederivadosacrilados 100
3.6.2.Resultadosdeviabilidadcelulardederivadoscongrupos
benciloehidroxiloterminales 107

3.7.CARACTERIZACINMECNICA 114
3.7.1.Ensayosdecompresinuniaxialmonotnica 116
3.7.2.Ensayosdecompresinuniaxialdecargarelajacin 119
3.7.3.Ensayosdefatiga 121
3.7.4.Comparacinconpropiedadesmecnicasdelcartlago 122

CAPTULO4:HIDROGELESDERIVADOSDEPLURONIC:TIOLENOS 125
4.1.DERIVADOSDEPLURONICCONGRUPOSTIOLTERMINALES 129
4.1.1.Sntesisycaracterizacin 129
4.1.1.1.Derivadolineal 129
4.1.1.2.Derivadostioladosdendrticos 134
4.1.2.Determinacindelaspropiedadessolgel 141
4.1.2.1.Mtododeinversindelvial 142
4.1.2.2.DSC 144
4.1.2.3.Discusindelosresultados 147
4.1.3.Ensayosdeviabilidadcelular 148
4.2.FORMULACIONESDEDERIVADOSF127SHnYRETICULANTES
ACRILADOS 154
4.2.1.MaterialesbasadosenmezclasdeF127SHnconF127Acn 154
4.2.1.1.Preparacindeloshidrogelesprecursoresy
estudiodesureticulacin 155
4.2.1.2.Determinacindelaspropiedadessolgel
dehidrogelespolimerizables 164
4.2.1.3.CaracterizacindelamorfologainternaporSEM 167
4.2.1.4.Degradacindehidrogelesfotopolimerizados 171
4.2.1.5.Ensayosdeviabilidadcelular 173
4.2.2.MaterialesbasadosenmezclasdeF127SHnconotros
reticulantesacrilados 180
4.2.2.1.Preparacindeloshidrogelespolimerizables
ehidrogelesfotopolimerizados 181
 4.2.2.2.Caracterizacindelamorfologainternapor
SEMdehidrogelespolimerizadosbasadosenF127NHAc2 182
4.2.2.3.Degradacindehidrogelesfotopolimerizados 183
4.2.2.4.Ensayosdeviabilidadcelular 184
4.3.ESTUDIOCOMPARATIVOENTREHIDROGELESFOTOPOLIMERIZADOS
DELCAPTULO3Y4 186

CAPTULO5:HIDROGELESNANOESTRUCTURADOS(NANOGELES) 189
5.1.PREPARACINDENANOGELES 195
5.1.1.DeterminacindelaCMC 195
5.1.2.Fotopolimerizacindelosnanogeles 198
5.1.3.Liofilizacindelosnanogelesfotopolimerizados 203
5.2.ENCAPSULACINENNANOGELES 205
5.3.CARACTERIZACINMORFOLGICA 208
5.4.ENSAYOSCELULARES 219
5.4.1.Viabilidadcelular 220
5.4.2.Ensayosdeinternalizacin 222

CAPTULO6:PARTEEXPERIMENTAL 235
6.1.SNTESISYCARACTERIZACINDELOSCOMPUESTOS 239
6.2.PROTOCOLOSDETRABAJO 259
6.3.MATERIALESYTCNICAS 271

CAPTULO7.CONCLUSIONES 275

ANEXOS 279
ANEXOI.CARACTERIZACINESTRUCTURAL 283
ANEXOII.CARACTERIZACINDEHIDROGELESPORDSC 288
ANEXOIII.ENSAYOSDEVIABILIDADCELULAR 291

CAPTULO1

ANTECEDENTES

Captulo1

1.1.HIDROGELESCOMOMATERIALESPARAAPLICACIONESENBIOMEDICINA

Loshidrogelessonunaclasedematerialescapacesderetenerunagrancantidad
de agua como consecuencia de su estructura tridimensional, formada por
estructuraspolimricasentrecruzadas.1

Aprincipiosdelosaos50,enlabsquedadenuevosbiomateriales,Wichterley
Lim iniciaron un programa pionero para el desarrollo de hidrogeles para
aplicaciones biomdicas a partir de la copolimerizacin de metacrilato de 2
hidroxietilo(HEMA)ydimetacrilatodeetilenglicol(EDMA).2Estosmaterialeshan
mostradonumerosasaplicacionesenelcampodelaoftalmologa3(Figura1.1)y
lacirugaplsticadesarrolladaanivelclnico.4

Figura1.1.LentesdecontactodeHEMA/EDMA.3a

Elxitodeestosmaterialesimpulseldesarrollosimultneodegranvariedadde
hidrogeles con otras aplicaciones biomdicas tales como la reparacin de

1
(a)Li,Y.;Rodrigues,J.;Tomas,H.,ChemicalSocietyReviews2012,41(6),21932221.
(b)Kopeek,J.,Biomaterials2007,28(34),51855192.
2
Witchterle,O.,Lim,D.,Nature1960,185,117118.
3
(a) Kopecek, J., Journal of Polymer Science Part aPolymer Chemistry 2009, 47 (22),
59295946;(b)Krejc,L.;Harrison,R.;Withterle,O.,ArchOphthal1970,84(1),7682.
4
Voldrich,Z.;Tomnek,Z.;Vack,J.;Kopecec,J.,JBiomedMaterRes1975,9(6),675
685.

3

Captulo1Capitulok

cuerdas vocales daadas, prevencin de heridas tras cirugas y recubrimiento

paratmpanosperforados.5

Debidoalaltocontenidoenaguadeestosmateriales,queloshacesimilaresalos
tejidos naturales, su permeabilidad, porosidad, flexibilidad en la fabricacin y
posibilidad de variar su composicin para obtener las propiedades fsicas
necesarias en funcin de la aplicacin, o de diseo qumico que permita su
biocompatibilidad, los hidrogeles por s mismos o combinados con clulas, han
ampliado en la actualidad su espectro de aplicaciones biomdicas.1a As, los
hidrogelespuedenservirdeandamiajesoscaffoldsqueactancomounsoporte
paraelcrecimientocelular,6comomaterialesparalaencapsulacindeclulas,7
frmacos,8protenas9ogenes(terapiagnica),10comoadhesivosentretejidosy
superficies de materiales,11 como sistemas que permiten una respuesta
reversible ante un estmulo externo12 o como membranas porosas.13 En
particular,campostanactivoscomolaIngenieradetejidos(IT)14ysuusocomo

5
Kresa,Z.;Rems,J.;Witchterle,O.,ArchOtholaryngol1973,17,360.
6
(a)Puppi,D.;Chiellini,F.;Piras,A.M.;Chiellini,E.,ProgressinPolymerScience2010,
35 (4), 403440; (b) JagurGrodzinski, J., Polym. Adv. Technol. 2010, 21, 2747; (c)
Khademhosseini, A.; Langer, R., Biomaterials 2007, 28 (34), 50875092; (d) Drury, J. L.;
Mooney,D.J.,Biomaterials2003,24(24),43374351.
7
Wang,C.M.;Varshney,R.R.;Wang,D.A.,Adv.DrugDeliveryRev.2010,62,699710.
8
Hoare,T.R.;Kohane,D.S.,Polymer2008,49(8),19932007.
9
Vermonden,T.;Censi,R.;Hennink,W.E.,ChemicalReviews2012,112(5),28532888.
10
Oh,E.J.;Park,K.;Kim,K.S.;Kim,J.;Yang,J.A.;Kong,J.H.;Lee,M.Y.;Hoffman,A.S.;
Hahn,S.K.,JournalofControlledRelease2010,141(1),212.
11
(a) Sharma, B.; Fermanian, S.; Gibson, M.; Unterman, S.; Herzka, D. A.; Cascio, B.;
Coburn, J.; Hui, A. Y.; Marcus, N.; Gold, G. E.; Elisseeff, J. H., Science Translational
Medicine2013,5(167),167ra6;(b)Strehin,I.;Nahas,Z.;Arora,K.;Nguyen,T.;Elisseeff,
J.,Biomaterials2010,31(10),27882797.
12
Alarcon,C.d.l.H.;Pennadam,S.;Alexander,C.,ChemicalSocietyReviews2005,34
(3),276285.
13
Yang,Q.;Adrus,N.;Tomicki,F.;Ulbricht,M.,JournalofMaterialsChemistry2011,21
(9),27832811.
14
(a)OBrien,F.J.,MaterialsToday2011,14(3),8894;(b)Spiller,K.L.; Maher,S.A.;
Lowman,A.M.,Tissueengineering.PartB,Reviews2011,17(4),281299(c)Dankers,P.
Y.W.;Meijer,E.W.,BulletinoftheChemicalSocietyofJapan2007,80(11),20472073.

4

Captulo1

sistemas para transporte y Liberacin controlada de frmacos (LCF),3a,15 han

identificado a los hidrogeles como materiales con amplias posibilidades, e
impulsadoengranmedidasudesarrollo.

Una de las primeras definiciones de la Ingeniera de tejidos fue establecida en

1993 por Kanger y Vacanti16 quienes la describieron como un campo
interdisciplinar que aplica los principios de la ingeniera y de las ciencias de la
vida con el objetivo de desarrollar sustitutos biolgicos que restauren,
mantenganomejorenlasfuncionesdeltejidourganodaados.

UnadelaslneasdetrabajodelaITeselusodeunandamiajeoscaffoldcomo
soportedeclulasenunentornotridimensional(Figura1.2).

Figura1.2.EsquemasimplificadodelconceptodeIngenieradeTejidos(IT),extradode
lapginawebdelaSociedadEspaoladeBioqumicayBiologaMolecular.17

Elandamiajeproporcionaunentornoadecuadoparalaadhesin,proliferacin,
diferenciacin (en el caso de utilizar clulas no diferenciadas) y formacin de
Matriz Extracelular (ECM) por parte de las clulas, actuando como plantilla o
template para la regeneracin de tejidos y rganos. Estos andamiajes con

15
Hamidi, M.; Azadi, A.; Rafiei, P., Hydrogel nanoparticles in drug delivery. Advanced
DrugDeliveryReviews2008,60(15),16381649.
16
Langer,R.;Vacanti,J.P.,Science1993,260,920926.
17
www.sebbm.es

5

Captulo1Capitulok

clulas en su interior se pueden cultivar in vitro para sintetizar tejidos que son
implantadosaposteriorienellugardaadooinvivo,implantandoelandamiaje
con clulas directamente en el lugar daado y utilizando el propio cuerpo
humano para inducir la regeneracin de tejidos y rganos. As, la IT se ha
utilizado para la sustitucin de diferentes tejidos u rganos, entre los que se
encuentran el hueso,18 el cartlago,19 los nervios,20 los vasos sanguneos,21 la
piel22ydiferentespartesdelossistemasgastrointestinalourogenital.23

Para estos fines, el andamiaje o scaffold debe presentar una serie de

caractersticasatendiendoadiferentesaspectos:14a

Biocompatibilidad: El andamiaje debe permitir la supervivencia y en el

caso de ser necesario, posibilitar la diferenciacin celular en su interior.
Adems, una vez implantado, el hidrogel debe tener una respuesta
inmunenegativaparaimpedirprocesosdeinflamacinqueconduzcanal
rechazodelimplante.
Biodegradabilidad:Losandamiajessonimplantesnopermanentes,porlo
que el hidrogel debe ser biodegradable. El objetivo final es que se
produzcasudegradacinprogresivaysimultneaconelcrecimientodel
nuevo tejido. Adems los subproductos de la degradacin no deben ser
txicosydebenexcretarsedelcuerposininterferirconotrosrganos.

18
Williams, J. M.; Adewunmi, A.; Schek, M. R.; Flanagan, C. L.; Krebsbach, P. H.,
Biomaterials2005,26(23),48174827.
19
Mercier,N.R.;Constantino,H.R.;Tracy,M.A.;Bonassar,L.J.,Biomaterials2005,26
(14),19451952.
20
Lietz, M.; Dreesmann, L.; Hoss, M.; Oberhoffner, S.; Scholosshauer, B., Biomaterials
2006,27(8),14251436.
21
Vaz,C.M.;VanTujil,S.;Bouten,C.V.C.;Baaijens,F.T.P.,ActaBiomaterialia2005,1
(5),575582.
22
Dai, N. T.; Williamson, M. R.; Khammo, N.; Adams, e. F.; Coombes, A. G. A.,
Biomaterials2004,25(18),42634271.
23
Kim, S. S.; Kaihara, S.; Benvenuto, M. S.; Choi, R. S.; Kim, B. S.; Mooney, D. J.,
Transplantation1999,67(2),227233.

6

Captulo1

Propiedades mecnicas: El andamiaje debe tener unas caractersticas

mecnicas adecuadas para el lugar en el que va a ser implantado. El
andamiaje es un material que debe actuar como sustituto temporal del
tejidodaado,porloquehadeimitarlomejorposiblelascondicionesin
vivo.
Arquitecturadelandamiaje:Estossistemasdebenposeerunaestructura
deporosinterconectadosentresyunaelevadaporosidad,contamaos
de poro adecuados quepermitanlasupervivencia celular as como, una
adecuadadifusindenutrientesyproductosdedesecho.
Tecnologa de produccin del andamiaje: La fabricacin del andamiaje
debe ser rentable y debe ser escalable desde un nivel de laboratorio
hastaunnivelindustrial.

En cuanto al uso de hidrogeles como sistemas para el transporte y Liberacin

controlada de frmacos, existen numerosos inconvenientes para lograr un
transporteefectivoyunaliberacinreguladadelfrmaco,conelfindelograrun
efecto teraputico en humanos o animales. Por ejemplo, una liberacin
controlada ideal supone que la dosificacin del frmaco se produzca de forma
constante y prolongada en el tiempo, sin exceder los lmites de toxicidad y
superandoelnivelefectivomnimo(Figura1.3).24
Concentracindefrmaco

Liberacinproblemticadefrmaco
Niveltxico

Liberacincontroladaideal

Nivelefectivomnimo

Tiempo

Figura1.3.Perfildeliberacincontroladaideal(lneapunteadaencolorazul)y
liberacinnocontrolada(lneapunteadaencolorgris).24

24
Ward,M.A.;Georgiou,T.K.,Polymers2011,3(3),12151242.

7

Captulo1Capitulok

Para conseguir una liberacin controlada de un frmaco y para mejorar bajas

solubilidades, degradaciones, tiempos de circulacin en el torrente sanguneo
bajos,ascomoreducirlatoxicidadocontrolarlapenetracindelosfrmacosa
travsdelasbarrerasbiolgicas,sehapropuestoelusodetransportadoresde
frmacos,lamayoradeloscualesestnbasadosenmaterialespolimricos.25

Estos transportadores de frmacos pueden ser diseados para proporcionar la

liberacindelmedicamentoenfuncindelasnecesidadesteraputicas.Enesta
lnea,loshidrogeles6bensusdiferentesvariedades,porejemploloshidrogeles
nanoestructurados 15, 26 (identificados como Nanogeles, marca registrada por
SupratechPharmaInc.Montreal,Canad),poseencaractersticasqueloshacen
muy interesantes como sistemas para el transporte y liberacin controlada de
frmacos.

1.2.CARACTERSTICASDELOSHIDROGELESPARAAPLICACIONESBIOMDICAS

Loshidrogelessepuedenclasificardediferentesformasdependiendodelcriterio
aplicado.Enfuncindelorigendelgelificantequeformalaredtridimensional,se
identifican como naturales, sintticos o hidrogeles hbridos (compuestos por
mezclasdemolculasdeorigennaturalysinttico).Siseconsideralanaturaleza
qumicadelentrecruzamientodelared,sepuedehablardehidrogelesqumicos,
reticulados a travs de enlaces covalentes e hidrogeles fsicos, formados por
interaccionesdetipofsico.27

25
Ravichandran, R.; Sundarrajan, S.; Venugopal, J. R.; Mukherjee, S.; Ramakrishna, S.,
MacromolecularBioscience2012,12(3),286311.
26
(a) Ramos, J.; Imaz, A.; CallejasFernandez, J.; BarbosaBarros, L.; Estelrich, J.;
QuesadaPerez,M.;Forcada,J.,SoftMatter2011,7(11),50675082;(b)Kabanov,A.V.;
Vinogradov, S. V., Angewandte ChemieInternational Edition 2009, 48 (30), 54185429;
(c)Hamidi,M.;Azadi,A.;Rafiei,P.,AdvancedDrugDeliveryReviews2008,60(15),1638
1649.
27
Yu,L.;Ding,J.D.,ChemicalSocietyReviews2008,37(8),14731481.

8

Captulo1

En algunos casos, los dos tipos de interacciones, fsicas y qumicas, pueden

coexistirenunmismohidrogel.28

Porotraparte,loshidrogelespuedenutilizarsecondimensionesmacroscpicas,
desde varias micras a varios centmetros, o en sistemas nanoestructurados, los
citadosnanogeles,quesondispersionesacuosasdenanopartculasdehidrogel.

Enelcasodelasaplicacionesbiomdicas,eldesarrolloylascaractersticasdelos
hidrogeleshanestadoclaramentemarcadosporeltipodeaplicacionesalquese
hadirigidoelmaterial.

El trabajo recogido en esta Memoria est enfocado al desarrollo de hidrogeles

fsicos susceptibles de ser posteriormente reticulados qumicamente mediante
fotopolimerizacin, para ser procesados de forma macroscpica y utilizados
como soportes en cultivo celular, y procesados de forma nanoestructurada,
como nanogeles, para su utilizacin en transporte y Liberacin controlada de
frmacos.

Por dicho motivo, a continuacin se recogen los aspectos ms importantes de

estos tipos de hidrogeles, as como antecedentes recientes relacionados con el
planteamientodelpresentetrabajo.

1.2.1.Hidrogelesconreticulacinfsica

Los hidrogeles fsicos se caracterizan por estar constituidos por estructuras

tridimensionales generadas mediante interacciones no covalentes, como por
ejemplo,interaccioneselectrostticas,29hidrfobas30ointeraccionesporenlaces
dehidrgeno,31siendoestaestructuratridimensionalcapazdereteneragua.

28
(a)Klouda,L.;Hacker,M.C.;Kretlow,J.D.;Mikos,A.G.,Biomaterials2009,30(27),
45584566; (b) Hacker, M. C.; Klouda, L.; Ma, B. B.; Kretlow, J. D.; Mikos, A. G., S.,
Biomacromolecules2008,9(6),15581570.
29
Wang,Q.;Mynar,J.L.; Yoshida,M.; Lee,E.;Lee, M.;Okuro,K.;Kinbara,K.;Aida,T.,
Nature2010,463(7279),339343.

9

Captulo1Capitulok

Dentrodeloshidrogelesfsicostienengranimportanciaenbiomedicinaaquellos
que, en agua, sufren una transicin de fase reversible debido a un estmulo
externo como por ejemplo un cambio de temperatura, pH, campo elctrico,
concentracininica,etc.

El trabajo de esta tesis doctoral se ha centrado en hidrogeles fsicos

termosensibles,32cuyocomportamientosolgeldependedelatemperatura.Este
tipodehidrogelessepuedenclasificarendostipos:

Hidrogelestermosensiblespositivos,queporencimadeunatemperatura
seencuentranenelestadosolysugelificacinseproduceenelproceso
de enfriamiento, cuando se alcanza la denominada UCST (Upper Critical
SolutionTemperarure).
Hidrogelestermosensiblesnegativos,quepordebajodeunatemperatura
seencuentranenelestadosolysugelificacinseproduceenelproceso
decalentamiento,cuandosealcanzaladenominadaLCST(LowerCritical
Solution Temperature). Este fenmeno tambin se conoce como
GelificacinTrmicaInversa(RTG,ReverseThermalGelation).

Durante las ltimas dcadas han adquirido especial importancia los hidrogeles
inyectables,quepermitenlaformacindelhidrogelinsitu.32b, 33Lainyeccines
una tcnica mnimamente invasiva que resulta favorable por su fcil
administracin y la mnima incomodidad que causa en el paciente. Por otra
parte, la inyeccin del hidrogel en el lugar de implantacin permite una mejor

30
Liu,C.B.;Gong,C.Y.;Pan,Y.F.;Zhang,Y.D.;Wang,J.W.;Huang,M.J.;Wang,Y.S.;
Wang, K.; Gou, M. L.; Tu, M. J.; Wei, Y. Q.; Qian, Z. Y., Colloids and Surfaces a
PhysicochemicalandEngineeringAspects2007,302(13),430438.
31
Pal,A.;Basit,H.;Sen,S.;Aswal,V.K.;Bhattacharya,S.,JournalofMaterialsChemistry
2009,19(25),43254334.
32
(a)Klouda,L.;Mikos,A.G.,EuropeanJournalofPharmaceuticsandBiopharmaceutics
2008,68(1),3445;(b)Jeong,B.;Kim,S.W.;Bae,Y.H.,AdvancedDrugDeliveryReviews
2002,54(1),3751.
33
(a) RuelGaripy, E.; Leroux, J.C., European Journal of Pharmaceutics and
Biopharmaceutics2004,58(2),409426

10

Captulo1

adaptacin del andamiaje al tejido circundante. Los hidrogeles termosensibles

negativosconstituyenunodelosmaterialesmsadecuadosparaeldesarrollode
biomaterialesinyectables.34Paralasaplicacionesbiomdicasdeestoshidrogeles
termosensibles inyectables, la LCST debe ser prxima a la temperatura
fisiolgica,permitiendolainyeccindelprecursordelhidrogelenelestadosola
bajatemperaturaysugelificacinatemperaturacorporal,talycomosemuestra
enlaFigura1.4.

Figura1.4.Procesodegelificacininducidoporelaumentodetemperaturaenun
hidrogeltermosensibledetiponegativo(conLCST).34a

Para que un hidrogel sufra una transicin solgel por efecto del aumento de
temperatura, el gelificante constituyente del hidrogel debe poseer naturaleza
anffila, con un delicado balance hidrfobo e hidrfilo en su estructura que
permita cambios de organizacin supramolecular en funcin de la
temperatura.35 La estructura qumica de algunos gelificantes, en concreto
polmeros,semuestranenlaFigura1.5.

34
(a)Moon,H.J.;Ko,D.Y.;Park,M.H.;Joo,M.K.;Jeong,B.,ChemicalSocietyReviews
2012,41(14),48604883;(b)Sosnik,A.,ArsPharm2007,48(1),83102.
35
Jeong,B.;Bae,Y.H.;Lee,D.S.;Kim,S.W.,Nature1997,388(6645),860862.

11

Captulo1Capitulok

a)

b)

c)

Figura1.5.Estructuraqumicadealgunospolmeroscapacesdegelificarendisolucin
porefectodelatemperatura,mediantetransicinsolgel:a)CopolmerobloquedePEG
PPGPEG(PluronicoPoloxamer);b)CopolmerobloquedePEGPLGAPEG;c)poliN
isopropilacrilamida.

Los polietilenglicoles (PEG) han sido ampliamente utilizados como segmento

hidrfilo en el diseo de gelificantes anffilos debido en parte a su
biocompatibilidadyasudeshidratacindependientedelatemperatura.Deesta
formasehandescritocopolmerosbloquedepolietilenglicolypolipropilenglicol
(PEG y PPG (como Pluronic o Poloxamer),36 copolmeros de polietilenglicol y
polisteres (como PEG con PLA (cido polilctico),35 PEG con PCL
(policaprolactona),37oPEGconPLGA(cidopolilcticocogliclico).38

As mismo, otro tipo de cadenas polimricas ampliamente utilizada en

gelificantesparahidrogelestermosensibleshasidolapoliNisopropilacrilamida
(PNIPAAm).28b,39

36
Alexandridis, P.; Hatton, T. A., Colloids and Surfaces aPhysicochemical and
EngineeringAspects1995,96(12),146.
37
Bae, S. J.; Joo, M. K.; Jeong, Y.; Kim, S. W.; Lee, W.K.; Sohn, Y. S.; Jeong, B.,
Macromolecules2006,39(14),48734879.
38
Jeong,B.;Lee,K.M.;Gutowska,A.;An,Y.H.,Biomacromolecules2002,3(4),865868.
39
Duarte,A.R.C.;Mano,J.F.;Reis,R.L.,ActaBiomaterialia2011,7(2),526529.

12

Captulo1

1.2.2.Hidrogelesconreticulacinqumica

Como se ha indicado, los hidrogeles qumicos se caracterizan por presentar

reticulacionesdetipocovalente.

Lasestrategiasutilizadasparaproducirlareticulacinqumicadehidrogeleshan
sido variadas, usando en muchos casos reacciones de polimerizacin clsicas,
talescomoreaccionesentremonmeroscongruposreactivoscomplementarios
(p.e.laadicindeMichael,reaccionesdecicloadicin1,3dipolarcatalizadaspor
Cu(I),formacindebasesdeSchiff,etc.) 40oreaccionesradicalarias,utilizando
un iniciador trmico (polimerizacin trmica) o mediante un fotoiniciador
(fotopolimerizacin).41Enelcasodehidrogelesdiseadosparaaplicacionesque
implican la polimerizacin en condiciones fisiolgicas, hay que tener en cuenta
que el entrecruzado qumico de estos materiales se debe producir sin causar
daosalasclulasomolculasqueseencuentrancombinadasconelhidrogel.

La fotopolimerizacin ha sido un procedimiento de reticulacin muy aceptado

enbiomedicinayaqueofreceventajascomoelcontrolespacialytemporaldela
polimerizacin, elevadas velocidades de curado que van desde minutos a
segundos,sonreaccionesquesepuedenllevaracaboatemperaturaambienteo
fisiolgicayproducenmuypococalor.As,lafotopolimerizacinofotocuradode
materialesseutilizaconxitoconagentesdeselladoorestauracionesdentales42
oenelselladodevasossanguneosmedianteadhesivosfotopolimerizables.43

Lafotopolimerizacinprecisageneralmentedelapresenciadeunfotoiniciador,
que posee una alta absorcin lumnica a una longitud de onda especfica (luz
visible o ultravioleta), generando los radicales libres iniciadores del proceso.

40
Ko,D.Y.;Shinde,U.P.;Yeon,B.;Jeong,B.,ProgressinPolymerScience2013,38(34),
672701.
41
Nguyen,K.T.;West,J.L.,Biomaterials2002,23(22),43074314.
42
Maffezzoli,A.;DellaPietra,A.,Biomaterials1994,15(15),12211228.
43
Dumanian, G. A.; Dascombe, W.; Hong, C.; Labadie, K.; Garret, K.; Sawhney, A. S.;
Pathak,C.P.;Hubbel,J.A.;Johnson,P.C.,Plast.ReconstrSurg1995,95,901907.

13

Captulo1Capitulok

Factores determinantes a la hora de seleccionar un fotoiniciador para la

reticulacin de hidrogeles incluyen su biocompatibilidad, solubilidad en agua y
estabilidad.41,44

Aunquesehanutilizadofotoiniciadoresbiocompatiblesactivosenelrangodela
luz visible, como Eosin Y,45 el fotoiniciador ms utilizado para la
fotopolimerizacindehidrogelesenaplicacionesbiomdicasesunfotoiniciador
activobajoluzultravioleta,Irgacure2959(I2959),productocomercial,solubleen
agua, cuya estructura qumica y proceso de generacin de radicales libres se
muestra en la Figura 1.6.46 Se ha demostrado que la tolerancia de este
fotoiniciador a diferentes concentraciones y para un gran nmero de lneas
celulares, por ejemplo clulas mesenquimales (MSC), condrocitos (clulas que
forman parte del cartlago natural) y osteoblastos (clulas de hueso), es
elevada.44

Figura1.6.EstructuraqumicadelfotoiniciadorIrgacure2959yformacinderadicales
libresporefectodelaluz.

En lo que respecta a los gelificantes fotopolimerizables utilizados en la

produccin de hidrogeles qumicos, su variedad es amplia e incluyen tanto
polmeros semisintticos, es decir polmeros naturales modificados

44
Williams,C.G.;Malik,A.N.;Kim,T.J.;Manson,P.N.;Elisseeff,J.,Biomaterials2005,
26(11),12111218.
45
Bahney,C.S.;Lujan,T.J.;Hsu,C.W.;Bottlang,M.;West,J.L.;Johnstone,B.,European
Cells&Materials2011,22,4355.
46
(a) You, Z.; Wang, Y., Advanced Functional Materials 2012, 22 (13), 28122820; (b)
Coutinho, D. F.; Sant, S. V.; Shin, H.; Oliveira, J. T.; Gomes, M. E.; Neves, N. M.;
Khademhosseini,A.;Reis,R.L.,Biomaterials2010,31(29),74947502;(c)Vermonden,
T.; Fedorovich, N. E.; van Geemen, D.; Alblas, J.; Van Nostrum, C. F.; Dhert, W. J. A.;
Hennink,W.E.,Biomacromolecules2008,9(3),919926.

14

Captulo1

qumicamente para introducir grupos fotopolimerizables (p.e. grupos acrilato o

metacrilato),comopolmerossintticos.

Dentro de los polmeros semisintticos se han descrito un gran nmero de

polisacridosnaturalesfuncionalizadoscongruposacrilatoometacrilato,como
sulfatodecondroitina,47cidohialurnico,48quitosano,49heparina50oalginato.51
Todos ellos se han utilizado en la encapsulacin de condrocitos o MSC con
buenos resultados en cuanto a supervivencia y adhesin celular, debido a la
presencia del polisacrido, y con propiedades mecnicas y de degradacin
controlables en funcin del grado de funcionalizacin con acrilatos o
metacrilatosreactivos.

Denuevo,unadelasestructurasqumicasutilizadaseneldiseodegelificantes
sintticos con ms xito en aplicaciones biomdicas, y especial inters en el
campodelaIT52ydelaencapsulacinyLCF,53eselPolietilenglicol(PEG),debido
a su naturaleza hidrfila y biocompatibilidad. Los sistemas fotopolimerizables
basados en PEG se componen principalmente de diacrilatos de PEG (PEGDA,
Figura1.7).

Figura1.7.EstructuraqumicadediacrilatosdePEG(PEGDA).

47
Li, Q.; Williams, C. G.; Sun, D. D. N.; Wang, J.; Leong, K.; Elisseeff, J., Journal of
BiomedicalMaterialsResearchPartA2004,68,2833.
48
Nettles, D. L.; Vail, T. P.; Morgan, M. T.; Grinstaff, M. W.; Setton, L. A., Annals of
BiomedicalEngineering2004,32,391397.
49
Amsden, B. G.; Sukarto, A.; Knight, D. K.; Shapka, S. N., Biomacromolecules 2007, 8,
37583766.
50
Seto,S.P.;Casas,M.E.;Temenoff,J.S.,CellandTissueResearch2012,347,589601.
51
Jeon, O.; Bouhadir, K. H.; Mansour, J. M.; Alsberg, E., Biomaterials 2009, 30, 2724
2734.
52
Peppas,N.A.;Hilt,J.Z.;Khademhosseini,A.;Langer,R.,Adv.Mater.2006,18,1345
1360.
53
Sawhney,A.S.;Pathak,C.P.;Hubbell,J.A.,Macromolecules1993,26,581587.

15

Captulo1Capitulok

La naturaleza no adhesiva del PEG lo ha hecho un candidato ideal para su uso

conclulasnoadherentes,comoporejemploloscondrocitos.54Sushidrogelesse
hanutilizadoparalaencapsulacindeestasclulaspermitiendo,ademsdeuna
elevada supervivencia celular, la secrecin por parte de los condrocitos de
proteoglicanosycolgeno,componentesestructuralesdelaECMdelcartlago.55

Sinembargo,conclulasadherentes(MSC,osteoblastos,fibroblastos,etc.)seha
trabajado con molculas de PEGDA funcionalizadas con la secuencia peptdica
RGD (R: arginina, G: glicina, D: cido asprtico). El RGD no solo promueve la
adhesin celular sino que tambin puede ser utilizado para conseguir la
respuestaselectivadedeterminadotipodeclulas.56As,unhidrogeltipoRGD
PEGDA se ha utilizado para la encapsulacin de MSC, consiguiendo su
diferenciacinaosteoblastos,conproduccindeECMcompuestaporprotenas
presentesenelhuesocomolafosfatasaalcalina.57

Tambin se han descrito hidrogeles de mezclas de molculas tipo PEGDA con

productosnaturales.58En2013,Elisseeffetal.describieronunodelosmateriales
con ms desarrollo en IT para regeneracin de cartlago.11 Este material es un
sistemamulticomponente(Figura1.8).11b

54
Lee,J.H.;Lee,H.B.;Andrade,J.D.,ProgPolymSci1995,20,10431079.
55
(a) Elisseeff, J.; McIntosh, W.; Anseth, K.; Riley, S.; Ragan, P.; Langer, R., Journal of
Biomedical Materials Research 2000, 51 (2), 164171; (b) Elisseeff, J.; Anseth, K.; Sims,
D.; McIntosh, W.; Randolph, M. A.; Yaremchuk, M.; Langer, M., Plast. Reconstr. Surg.
1999,104(4),10141022.
56
Hersel,U.;Dahmen,C.;Kessler,H.,Biomaterials2003,24(24),43854415.
57
Yang,F.;Williams,C.G.;Wang,D.a.;Lee,H.;Manson,P.N.;Elisseeff,J.,Biomaterials
2005,26(30),59915998.
58
Ouasti,S.;Donno,R.;Cellesi,F.;Sherratt,M.J.;Terenghi,G.;Tirelli,N.,Biomaterials
2011,32(27),64566470.

16

Captulo1

11b
Figura1.8.AdhesivobasadoensulfatodecondroitinayPEGNH2.

Uno de los componentes es un adhesivo de sulfato de condroitina con grupos

cidoterminales(activadosenformadeNhidroxisuccinimida),queseinyecten
el lugar del defecto del cartlago. Este adhesivo reacciona con el tejido
circundanteatravsdelosgruposaminoterminalesdelasprotenasytambin
lohaceconotrocomponente,PEGqueposeegruposterminalesamino(PEGNH2)
Posteriormente, en el mismo lugar se inyect una mezcla de cido
hialurnico+PEGDA que al fotopolimerizar in situ con luz ultravioleta forma el
hidrogel. Este material compuesto rellen completamente el defecto e
interaccion con el tejido circundante por la presencia del adhesivo basado en
sulfato de condroitina. Elisseeff et al. han publicado ensayos clnicos piloto
realizadosconestematerialen18pacientes,demostrandolaseguridadyposible
aplicacinclnicadelmaterial.11a

Junto a estos diseos moleculares, la estructura de PEG tambin se ha

incorporadoenestructurasmscomplejaseinnovadoras.Algunasdeellas,por
suimportancia,secomentanacontinuacin.

Grinstaff et al. propusieron la utilizacin de copolmeros bloque hbridos

dendrticolinealesbasadosenpolmerosdePEGparalaobtencindehidrogeles

17

Captulo1Capitulok

fotopolimerizables.59Loshbridosdendrticolinealessonestructuraspolimricas
ms complejas que combinan en su estructura cadenas lineales de polmero y
segmentosdendrticos.60

Centrndonos en estructuras dendrticas, de entre los diferentes tipos de

estructuras dendrticas se distinguen los dendrmeros, que se caracterizan por
ser macromolculas altamente ramificadas que poseen tres partes
fundamentales(Figura1.9):elncleo,lasunidadesderamificacinquedanlugar
a las distintas generaciones (generacin 1 (G1), generacin 2 (G2), etc.); y la
periferia, que permite la funcionalizacin con un gran variedad de grupos
funcionalescuyonmeroestdeterminadoporlageneracindeldendrmero.

NCLEO Dendrn
G1
G2
G3
G4

Figura1.9.Estructurageneraldelosdendrmerosydendrones.61

Como estructuras dendrticas ms sencillas, estn los dendrones, consideradas

como las unidades estructurales de un dendrmero (Figura 1.9). Se trata de
molculasramificadasqueposeenungrupofuncionalreactivocomopuntofocal

59
(a)Grinstaff,M.W.,JournalofPolymerSciencePartA:PolymerChemistry2008,46(2),
383400;(b)Degoricija,L.;Bansal,P.N.;Sontjens,S.H.M.;Joshi,N.S.;Takahashi,M.;
Snyder,B.;Grinstaff,M.W.,Biomacromolecules2008,9(10),28632872;(c)Sontjens,S.
H.M.;Nettles,D.L.;Carnahan,M.A.;Setton,L.A.;Grinstaff,M.W.,Biomacromolecules
2006,7(1),310316;(d)Carnahan,M.A.;Grinstaff,M.W.,JACS2001,123,29052906.
60
Gitsov, I., Journal of Polymer Science Part aPolymer Chemistry 2008, 46 (16), 5295
5314.
61
Movellan,J.,Dendriticderivativesasbuildingblocksforbiomedicalapplications.Tesis
doctoral,2013.

18

Captulo1

ygruposfuncionalesenlaperiferia,cuyonmerodependedelageneracin.La
denominacin utilizada para el nmero de generacin as como los mtodos
utilizados para su sntesis son idnticos tanto para dendrmeros como para
dendrones.

Los copolmeros bloque hbridos dendrticolineales se pueden sintetizar de

forma divergente,62 cuando el crecimiento se produce desde uno o ambos
extremos del polmerolineal haciala periferiade la estructura dendrtica, o de
forma convergente,63 consistente en la sntesis de dendrones y su posterior
acoplamientoaunooambosextremosdelpolmerolneal.

El diseo molecular propuesto por Grinstaff et al., con una estructura de tipo
ABA (Figura 1.10) dendrticolinealdendrtico basada en PEG, permite la
combinacindelaspropiedadesdelPEG,ylascaracteristicasdelosdendrones,
derivadosde metabolitosnaturales,comocidosuccnico(SA),glicerol(GL)y
alanina(BA).Porotraparte,lafuncionalizacindelosextremosdendrticoscon
grupos terminales tipo metacrilato han permitido obtener polmeros
fotopolimerizables.

La estructura dendrtica proporciona puntos de degradacin en el hidrogel a

travsdelosenlacessterycarbamatoascomonumerososgruposmetacrilato
fotopolimerizables en la periferia. Esta aproximacin ha permitido disponer de
un mayor nmero de grupos funcionales reactivos que puede dar lugar a un
aumentodeladensidaddeentrecruzamiento,sinincrementarlaconcentracin
depolmero.59b

62
Ihre, H.; Padilla De Jess, O. L.; Frchet, J. M. J., Journal of the American Chemical
Society2001,123(25),59085917.
63
Ihre,H.;Hult,A.;Frchet,J.M.J.;Gitsov,I.,Macromolecules1998,31(13),40614068.

19

Captulo1Capitulok

a)PGLSAPEG

b)PGLBAPEG

Figura1.10.CopolmerosbloquedendrticolinealdendrticoreactivosbasadasenPEGy
dendronesde:a)glicerolycidosuccnico;b)glicerolyalanina.59

El hidrogel fotopolimerizado obtenido a partir del hbrido dendrticolineal

PGLSAPEG(Figura1.10(a))sehautilizadocomoadhesivoparaeltratamientode
heridasenlacrnea.Losestudiosinvivorealizadosenaveshandemostradouna
curacin de dolencias con estos hidrogeles ms rpida que con las suturas de
nylonutilizadashabitualmente.59d,64

LoshidrogelesdePGLSAPEGhansidotambinensayadosparalaregeneracin
de cartlago.59c As, hidrogeles al 7.5 % y al 15 % (w/v) de PGLSAPEG se han
aplicado en la encapsulacin de condrocitos in vitro. Con el hidrogel de menor
concentracin se logr generar una gran cantidad de ECM compuesta por
proteoglicanos y colgeno secretados por los condrocitos. Sin embargo, este
hidrogelsedegradrpidamente,loquelimitasuaplicabilidadinvivo.

64
Grinstaff,M.W.,Biomaterials2007,28(35),52055214.

20

Captulo1

Conelfindemejorarlaspropiedadesdedegradacinsehanutilizadohidrogeles
dePGLBAPEGquecombinanlapresenciadeenlacestiposterytipocarbamato
(Figura 1.10 (b)).59b Estos hidrogeles presentan propiedades mecnicas que
varan con la concentracin de hidrogel, proporcionando en algunos casos
valoresdedurezayviscoelasticidadprximosalosdelcartlago.Ensayosinvivo
en conejos con hidrogeles al 10% (w/v), inyectados y fotopolimerizados en el
defecto, mostraron una alta tolerancia, estabilidad estructural y produccin de
ECMporlasclulas,tras24semanas.

Otra estrategia interesante de obtencin de hibrdos dendrticolineales

multifuncionales ha sido propuesta recientemente por Malkoch et al.65 El
hidrogelestcompuestoporunamezcladedoscomponentes:unodetipoPEG
con dos grupos tiol terminales (Figura 1.11 (a)) y un hbrido dendrticolineal
dendrtico de PEG (Figura 1.11 (b)) con estructuras dendrticas que incorporan
dobles enlaces C=C y unidades bioactivas enlazadas covalentemente (en color
rosa).Enestecaso,lareticulacinqumicaseproduceporadicindelgrupotiola
un doble enlace (reaccin de tiolenos) a travs de un mecanismo radicalario
fotoiniciado con luz UV,66 formndose as el hidrogel. Los autores han descrito
unasupervivenciadefibroblastosprximaal100%tras7dasencapsuladosen
elinteriordelhidrogel.

65
Oberg,K.;Hed,Y.;JoelssonRahmn,I.;Kelly,J.;Lowenhielm,P.;Malkoch,M.,Chemical
Communications2013,49(62),69386940.
66
Hoyle, C. E.; Bowman, C. N., Angewandte Chemie International Edition 2010, 49 (9),
15401573.

21

Captulo1Capitulok

a)

b)

Figura1.11.ComponentesdelhidrogeldescritoporMalkochetal,65a)derivadodePEG
congrupostiolterminales,b)Cadenadepolietilenglicolconunidadesdendrticasde
glicerol,yenposicionesterminalescondoblesenlacesymolculasbioactivas(encolor
rosa).

1.2.3.Hidrogelesnanoestructurados

Los hidrogeles nanoestructurados, tambin denominados Nanogeles, son

dispersionesacuosasdepartculasdehidrogeldetamaonanomtrico(101000
nm) que poseen las caractersticas de los hidrogeles macroscpicos y de las
nanopartculas.15, 67 Los nanogeles, al igual que sus anlogos macroscpicos,
presentan hidrofilicidad, flexibilidad en su fabricacin, versatilidad, gran
capacidaddeabsorcindeaguaybiocompatibilidad.

Los mtodos ms habituales para la produccin de nanogeles son la

polimerizacinenmicroemulsin,lapolimerizacinpormicroemulsininversao
el entrecruzamiento de nanopartculas polimricas autoensambladas.26b Las
polimerizacionespormicroemulsinomicroemulsininversautilizanemulsiones
deaceiteenaguaoaguaenaceite,quesonsistemasrelativamentecomplejosy
requieren numerosos pasos de purificacin para eliminar los monmeros y el
iniciador en exceso. Por el contrario, el entrecruzamiento de estructuras de

67
Saunders,B.R.;Vincent,B.,Adv.ColloidInterfaceSci.1999,80(1),125.

22

Captulo1

tamaonanomtricoautoensambladasesunaformamuyverstildeproduccin
denanogelesmedianteelbloqueodelasestructuraspreformadas.68

Los nanogeles se han utilizado en diferentes campos biomdicos tales como el

diagnstico por imagen,69 el diagnstico por resonancia70 o la Ingeniera de
tejidos,71 pero el campo de aplicacin ms activo hoy en da es su uso como
sistemasdetransporteyliberacincontroladadefrmacos.15,68a

Para este fin, un nanogel debe poseerelevada capacidadde carga de frmaco,

encapsulndolo por interacciones de tipo no covalente (interacciones inicas,
enlaces de hidrgeno, interacciones hidrfobas, etc) o incorporndolos
covalentementealamatrizpolimrica.Laeficaciadeencapsulacindependede
lanaturalezadelpropionanogelydecmolamolculaaencapsularinteraccione
conelnanogel.68b

El nanogel puede ser utilizado para mejorar la solubilidad, biodisponibilidad,

toxicidady/oestabilidaddelfrmacoenelinteriordelorganismovivo,ascomo
para producir su liberacin controlada en un lugar especfico. Tambin puede
actuar como un sistema que mejora y facilita la internalizacin celular del
frmaco con respecto al frmaco libre.72 Adems, debe estar fabricado a partir
de compuestos biodegradables que permitan una liberacin controlada y
prolongadaeneltiempoamedidaqueelnanogelsevadegradando.

68
(a) Chacko, R. T.; Ventura, J.; Zhuang, S.; Thayumanavan, S., Adv. Drug Delivery Rev.
2012, 64 (9), 836851; (b) Gonalves, C.; Pereira, P.; Gama, M., Materials 2010, 3 (2),
14201460.
69
Peng,H.S.;Stolwijk,J.A.;Sun,L.N.;Wegener,J.;Wolfbeis,O.S.,AngewandteChemie
InternationalEdition2010,49(25),42464249.
70
Oishi,M.;Sumitani,S.;Nagasaki,Y.,BioconjugateChemistry2007,18(5),13791382.
71
(a) Roux, R.; Ladavire, C.; Montembault, A.; Delair, T., Materials Science and
EngineeringC2013,33(3),9971007;(b)Hayashi,C.;Hasegawa,U.;Saita,Y.;Hemmi,H.;
Hayata,T.;Nakashima,K.;Ezura,Y.;Amagasa,T.;Akiyoshi,K.;Noda,M.,J.Cell.Physiol.
2009,220(1),17.
72
Chandna,P.;Saad,M.;Wang,Y.;Ber,E.;Khandare,J.;Vetcher,A.A.;A.,S.V.;Minko,
T.,Mol.Pharm2007,4(5),668678.

23

Captulo1Capitulok

Con el fin de conseguiruna liberacin del frmaco de forma controlada se han

diseadotambinnanogelesquerespondenaestmulosexternos.73Estetipode
materiales son transportadores de frmacos activos que modifican su
composicin estructural o conformacin, promoviendo la liberacin controlada
delasespeciesactivascontenidasenelnanogel.Unodelossistemasdeestetipo
msestudiadosonlosnanogelestermosensibles.74

Para la preparacin de nanogeles termosensibles se han utilizado materiales

polmericosquecontienenensuestructuraunidadestermosensibles,talescomo
PNIPAAm75oPluronic.76Lapresenciadelospolmerostermosensiblesconfierea
losnanogeleslaposibilidaddemodificarsutamaoenfuncindelatemperatura
(Figura 1.12). As, por debajo de su LCST, el polmero se encuentra hidratado y
portantoensuestadohinchado.Enesteestadolosnanogelespresentanuna
estructuramenoscompactaquepermitelafcilentradaysalidadelamolcula
encapsulada. Al aumentar la temperatura se produce la deshidratacin de las
cadenasdepolmero,loquesuponeladisminucindetamaoenlaestructura
del nanogel y la organizacin en una estructura ms compacta, que retiene el
frmaco, provocando su liberacin de forma ms lenta y controlada en el
tiempo.68a,77

73
Fleige,E.;Quadir,M.A.;Haag,R.,AdvancedDrugDeliveryReviews2012,64(9),866
884.
74
Pelton,R.,Adv.ColloidInterfaceSci.2000,85(1),133.
75
Cuggino, J. C.; Alvarez I, C. I.; Strumia, M. C.; Welker, P.; Licha, K.; Steinhilber, D.;
Mutihac,R.C.;Calderon,M.,SoftMatter2011,7(23),1125911266.
76
(a)Li,N.;Wang,J.;Yang,X.;Li,L.,ColloidsandSurfacesb:Biointerfaces2011,83(2),
237244;(b)Kim,J.Y.;Choi,W.I.;Kim,Y.H.;Tae,G.;Lee,S.Y.;Kim,K.;Kwon,I.C.,2010,
147(1),109117;(c)Huang,S.J.;Sun,S.L.;Feng,T.H.;Sung,K.H.;Lui,W.L.;Wang,L.
F., European Journal of Pharmaceutical Sciences 2009, 38 (1), 6473; (d) Missirlis, D.;
Kawamura, R.; Tirelli, N.; Hubbell, J. A., European Journal of Pharmaceutical Sciences
2006,29(2),120129;(e)Choi,S.H.;Lee,J.H.;Choi,S.M.;Park,T.G.,Langmuir2006,
22(4),17581762;(f)Missirlis,D.;Tirelli,N.;Hubbell,J.A.,Langmuir2005,21(6),2605
2613.
77
Yang, L.; Guo, C.; Jia, L.; Liang, X.; Liu, C.; Liu, H., Journal of Colloid and Interface
Science2010,350(1),2229.

24

Captulo1

Entradaysalidademolculas Molculasencapsuladas
enelinteriordelnanogel
EstadohinchadoT<LCST
EstadocolapsadoT>LCST

Figura1.12.Esquemarepresentativodelprocesodeentradaysalidadefrmacosenun
nanogelproducidaporefectodelatemperatura.

1.3.PLURONICYSUSAPLICACIONESBIOMEDICAS

En los apartados anteriores se ha podido comprobar que en la bsqueda de

materiales para aplicaciones biomdicas, el Pluronic ha sido uno de los
compuestos objeto de estudio en el campo de los hidrogeles termosensibles,
debidoasusparticularescaractersticas.

Con el trmino Pluronic se identifica a un copolmero bloque genrico

constituidopordosunidadesdePEG,separadasporunaunidadcentraldePPG
(Figura 1.5(a)). Comercialmente estn disponibles distintas variedades de
Pluronic(PluronicdeBASFoPoloxamerdeICI)yenunampliorangodepesos
molecularesylongitudesdelosbloquesconstituyentes.78Losdistintostiposde
Pluronic,ascomosunomenclatura,sepresentanenlaFigura1.13.36

78
Pluronic and Tetronic Surfactants, Technical Brochure,. BASF Corp., Parsippany, NJ.
1989.

25

Captulo1Capitulok

Figura1.13.VariedadesynomenclaturadeloscopolmerosbloquedePluronic.36

Los copolmeros que estn situados en la misma columna de la representacin

de la Figura 1.13 presentan el mismo porcentaje del bloque de PEG, mientras
queloscopolmerosqueseencuentranenlamismafilapresentanunbloquede
PPGdelmismopesomolecular.LanomenclaturaparalosderivadosdePluronic
comienza con las letras L (para Pluronic en estado lquido), P (para Pluronic en
pasta)oF(paraPluronicenestadoslido,enformadecopos).Losdosprimeros
nmeros son indicativos del peso molecular de la cadena hidrfoba de PPG, y
vandesdeelnmero3paraelcopolmeroconelmenorpesomoleculardePPG
hastaelnmero12paraeldemayorpesomoleculardePPG(ejeverticalenla
Figura 1.13). El ltimo nmero se refiere al porcentaje de PEG, y va desde el1
paraelmenorporcentajedePEGhasta8paraelmayorporcentajedePEG(eje
horizontalenlaFigura1.13).

26

Captulo1

UnadelasvariedadesdePluroniceselPluronicF127(Figura1.14).Elnmero
12 hace referencia a que se trata de un copolmero bloque con un peso
molecular del bloque de PPG de 4000 g/mol, mientras que el nmero 7 hace
referenciaalapresenciadeun70%dePEGenlamolcula.

Figura1.14.EstructuraqumicadePluronicF127.

La mayora de los copolmeros tipo Pluronic presentan las siguientes

caractersticasgenerales:

En disoluciones acuosas son capaces de autoorganizarse formando

micelas,lascualesconsistenenunncleohidrfobodePPGyunacorona
hidrfiladePEG(Figura1.15).Laautoorganizacinenmicelasseproduce
a partir de una determinada concentracin, denominada Concentracin
Micelar Crtica (CMC), que se define como la concentracin mnima de
material necesaria para dar lugar a micelas termodinmicamente
estables.OtroparmetrofundamentaleslaTemperaturaMicelarCrtica
(CMT) que es la temperatura a partir de la cual se forman las micelas,
siemprequeelpolmeroseencuentreporencimadesuCMC.

C>CMC

Figura1.15.EsquemadelaestructuramicelardelPluronicenagua,a
concentracionesporencimadesuConcentracinMicelarCrtica(CMC).
EncolorazulserepresentaelncleohidrfobodePPGyencolorverdela
coronahidrfiladePEG.

27

Captulo1Capitulok

LasdisolucionesacuosasabajasconcentracionesdePluronic,debidoa
sucapacidaddeautoorganizacinenformademicelasporencimadela
CMCydebidoalapresenciadesuncleohidrfoboysucoronahidrfila,
se han utilizado como sistemas de encapsulacin de frmacos tanto
hidrfobos, para mejorar su solubilidad en medio acuoso, como
hidrfilos, para mejorar el tiempo de residencia en el torrente
sanguneo.79

Algunas de las variedades de Pluronic disueltos en agua a altas

concentraciones presentan gelificacin termorreversible a partir de una
ConcentracinCrticadeGelificacin(CGC).Losfactoresquedeterminan
laCGC,ascomoalatemperaturadetransicinsolgel(LCST),sonelpeso
molecular del polmero, su arquitectura molecular (longitud de los
bloquesysecuenciadebloques)ylapresenciadeespeciesinicasenla
disolucin.80

ElmecanismodelagelificacindePluronicsiguesiendountemaquedespierta
mucha controversia. Se han propuesto distintos mecanismos que tratan de
explicar la transicin solgel de este copolmero bloque, que se comentan a
continuacin.

Rassing y Attwood81 explicaron la gelificacin del Pluronic por cambios

intrnsecos en las propiedades micelares, como el nmero de agregacin
(nmerodemolculasqueformanlasmicelas)ylasimetramicelar.

79
(a)Li,Y.Y.;Li,L.;Dong,H.Q.;Cai,X.J.;Ren,T.B.,Materialsscience&engineering.C,
2013,33(5),2698707;(b)Yoncheva,K.;Calleja,P.;Ageros,M.;Petrov,P.;Miladinova,
I.; Tsvetanov, C.; Irache, J. M., International Journal of Pharmaceutics 2012, 436 (12),
258264.
80
Lixin, F.; Degen, M.; Grupido, N.; Bendle, S.; Pennartz, P., Materials Science and
Engineering:A2010,528(1),127136.
81
Rassing,D.;Attwood,D.,UltrasoundInt.J.Pharm.1983,13,4755.

28

Captulo1

Vadnereetal.82atribuyeronlatransicinsolgelauncambiodeentropadebido
a la presencia de molculas de agua ordenadas prximas a las cadenas
hidrfobasdePPG.Lapresenciademolculasdeaguaordenadasalrededorde
las cadenas hidrfobas minimiza el contacto aguacadena hidrfoba. Para
polmeros que presentan LCST, el aumento de temperatura permite la
deshidratacindelascadenashidrfobas,provocandounaumentodeldesorden
enlasmolculasdeaguayportantounaumentodelaentropa(S),loquehace
que sea un proceso favorable (Energa de Gibbs, G<0). En esta situacin, las
interaccionesaguapolmerosehacendesfavorablesmientrasquesefavorecen
lasinteraccionesaguaaguaypolmeropolmero.Estefenmeno,queseconoce
como efecto hidrofbico,83 es probablemente el mecanismo ms aceptado
paralaexplicacindelagelificacindedisolucionesdePluronic.32a,84

Aos ms tarde, Wanka et al.85 propusieron la gelificacin como una

organizacin tridimensional estructurada. Las molculas de polmero se
autoorganizan en micelas por debajo de la LCST y por encima de la CMC. Al
aumentar la temperatura hasta la LCST, se produce el empaquetamiento de
micelas en una estructura ordenada formando mesofases litropas cristal
lquido.86

Sibienalprocesodegelificacinselehaprestadoatencin,latransicingelsol
en un calentamiento posterior ha sido poco estudiada. No obstante, se ha
propuestoquelatransicingelsolpuedeestarrelacionadaconelhinchamiento
queexperimentanlascadenasdePEGenlasmicelas,alaumentarlasolubilidad
conelincrementodetemperatura.32b

82
Vadnere,M.;Amidon,G.;Lindenbaum,S.;Haslam,J.L,IntJPharm1984,22,207218.
83
Southall,N.T.;Dill,A.D.;Haymet,D.J.,J.Phys.Chem.B,2002,106(3),521533.
84
Alexandridis, P.; Holzwarth, J. F.; Hatton, T. A., Macromolecules 1994, 27 (9), 2414
2425.
85
Wanka,G.;Hoffman,H.;Ulbricht,W.,JColloidInterfaceSci1990,268(2),101117.
86
Wanka,G.;Hoffman,H.;Ulbricht,W.,Macromolecules1994,27(15),41454159.

29

Captulo1Capitulok

Estas caractersticas de las estructuras de Pluronic, unidas a su

biocompatibilidad, han hecho que en sus distintas variedades, estn presentes
en productos de uso cotidiano tales como champs, enjuagues bucales,
desmaquillanteslimpiadores faciales, cremas antiacn, cremas
antiinflamatorias,87etc.

Como se ha resaltado, en las ltimas dcadas, el Pluronic ha sido uno de los

copolmerosbloquemsutilizadosenITyensistemasdetransporteyLiberacin
controladadefrmacos.88Sinembargo,ypesealasventajasquepresenta,estos
copolmeros estn lejos de ser considerados como un material ideal para
hidrogelesinyectables,debidoaquemuestrantiemposderesidenciacortosen
el lugar del implante (<1 da), baja adhesin celular al material y baja
biodegradabilidad de los bloques que lo componen. No obstante se considera
queelPluronicconpesomolecularinferiora13000g/molesbioabsorbiblepor
filtracinatravsdelrion.27

Es por ello que para mejorar la biodegradabilidad, compatibilidad y adhesin

celular, se han diseado derivados de Pluronic combinados con molculas de
origennatural89oconmolculasbioactivas,90utilizndolosenlapreparacinde
hidrogelestermosensibles.

87
Park,Y.J.;Yong,C.S.;Kim,H.M.; Rhee,J.D.;Oh,Y.K.;Kim,C.K.;Choi,H.G.,Int J
Pharm2003,263(12),105111.
88
(a) Basak, R.; Bandyopadhyay, R., Langmuir 2013, 29 (13), 43504356; (b) Lee, J. H.;
Kim,J.H.;Oh,S.H.;Kim,S.J.;Hah,Y.S.;Park,B.W.;Kim,D.R.;Rho,G.J.;Maeng,G.H.;
Jeon,R.H.;Lee,H.C.;Kim,J.R.;Kim,G.C.;Kim,U.K.;Byun,J.H.,Biomaterials2011,32
(22), 50335045; (c) Han, D. K.; Ahn, K. D.; Cha, S. H, 2007, Patent number WO
2007/064152A1;(d)Kumar,M.;Kumar,N.;Domb,A.;Arora,M.,AdvancesinPolymer
Science, 2002, 160, 45117 (e) Kavanov, a. V.; Alakhov, V. Y., Critical reviews in
therapeuticDrugCarrierSystems2002,19(1),173.
89
Park,K.M.;Lee,S.Y.;Joung,Y.K.;Na,J.S.;Lee,M.C.;Park,K.D.,ActaBiomaterialia
2009,5(6),19561965.
90
(a)Park,k.M.P.K.D.,MacromolecularResearch2008,16(6),517523;(b)Huang,K.;
Lee,B.P.;Ingram,D.R.;Messersmith,P.B.,Biomacromolecules2002,3(2),397406.

30

Captulo1

Porejemplo,Fangetal.91describieronunderivadodePluronicF127modificado
qumicamente en sus extremos mediante la unin a un polisacrido natural
comoelalginato(Figura1.16).

Figura1.16.EstructuraqumicadelderivadoPluronicF127AlginatodescritoporFanget
al.91

EstederivadoretienelaspropiedadesdegelificacindePluronicF127ymejora
la biocompatibilidad debido a la presencia del alginato. Hidrogeles de Pluronic
F127alginato se han utilizado como soporte para la administracin de forma
tpica y liberacin controlada de seleginina, frmaco indicado para el
tratamiento de desordenes depresivos. As mismo, se han utilizado en la
dispensacin, mediante inyeccin, de cisplatino en el tratamiento del cncer.
Estoshidrogelesmostraronunaliberacincontroladadecisplatinoascomoun
aumentodeladeposicindesteenzonastumorales.92

Rotondaetal.93combinaronPluronicF127conotropolisacridonatural,cido
hialurnico.Lapresenciadeestecidoprovocaladisminucindelatemperatura
degelificacinymejoralaspropiedadesdeadhesincelularenelhidrogel.Por
otra parte, la incorporacin covalente adicional de una protena bioactiva
implicada en los procesos de proliferacin celular y en procesos de

91
Chen,C.C.;Fang,C.L.;AlSuwayeh,S.A.;Leu,Y.L.;Fang,J.Y.,InternationalJournalof
Pharmaceutics2011,415(12),119128.
92
Fang,J.Y.;Hsu,S.H.;Leu,Y.L.;Hu,J.W.,J.Biomater.Sci.Polym.Ed.2009,20,1031
1047.
93
Mayol, L.; Quaglia, F.; Borzacchiello, A.; Ambrosio, L.; Rotonda, M. I. L., European
JournalofPharmaceuticsandBiopharmaceutics2008,70(1),199206.

31

Captulo1Capitulok

diferenciacin, la TGF (Transforming Growth Factor), favoreci la

diferenciacin celular de MSC a condrocitos y la produccin en conejos de una
matrizcartilaginosaendefectosdecartlagoarticular.94

ConelfindemejorarlaestabilidadmecnicadehidrogelesbasadosenPluronic
sehanpropuestodiferenteshidrogelesquecombinansutermosensibilidadcon
lapresenciaenloscomponentesdegruposfuncionalesreactivosquepermitanla
formacindeotraredtridimensional,entrecruzadaqumicamente.Conestefin,
las reacciones ms utilizadas en la preparacin de hidrogeles derivados de
Pluronic mixtos (reticulacin fsica + reticulacin qumica), ha sido la
fotopolimerizacindegruposacrilatosometacrilatosolaadicindegrupostiol
(SH) a dobles enlaces (C=C) deficientes en electrones (reaccin tioleno),
mediante un mecanismo inico (adicin de Michael) o por un mecanismo
radicalariofotoiniciado.41,95

Laaproximacinsintticamssencillaseguidaparalaobtencindeestetipode
derivados de Pluronic ha sido la funcionalizacin de los dos grupos hidroxilo
terminales de la molcula de Pluronic con grupos acrilato o metacrilato, y su
entrecruzamiento por fotopolimerizacin consigo mismo96 o con otros grupos
reactivosdepolmerosbiodegradables,naturales97osintticos.98

En esta lnea, Park et al.97 describieron un hidrogel termosensible y

fotopolimerizable basado en una mezcla de diacrilato de Pluronic F127 y cido
hialurnicofuncionalizadocongruposmetacrilato.Estosautoresprepararonun
amplionmerodehidrogeles,condiferentesdensidadesdeentrecruzamientoy
propiedades mecnicas, variando el tiempo de irradiacin con luz ultravioleta.

94
Jung,H.H.;Park,K.;Han,D.K.,JournalofControlledRelease2010,147(1),8491.
95
Tasdelen, M. A.; Yagci, Y., Angewandte Chemie International Edition 2013, 52 (23),
59305938.
96
Lee,S.Y.;Tae,G.,JournalofControlledRelease2007,119(3),313319.
97
Chun,K.W.;Lee,J.B.;Kim,S.H.;Park,T.G.,Biomaterials2005,26,33193326.
98
(a)Park,J.H.;Moon,J.R.;Hong,K.H.;Kim,J.H.,JournalofPolymerResearch2011,18
(2),273278;(b)Pang,X.;Chu,C.C.,Polymer2010,51(18),42004210.

32

Captulo1

Estos hidrogeles se utilizaron para encapsular ADN mediante la formacin del

hidrogel por efecto de la temperatura y la posterior fotopolimerizacin. Sus
estudiosdemostraronquelaliberacindeADNseproducadurante10das,de
forma lenta y controlada, con diferencias dependiendo del grado de
entrecruzamientodelhidrogel.

Chu et al.98b mezclaron diacrilato de Pluronic F68 con un polmero sinttico

biodegradablebasadoenpoliesteramidas(PEA)congruposacrilato,conelfinde
disponerdehidrogelestermosensiblesyfotopolimerizables(Figura1.17).

PEA

DiacrilatodePluronic

Figura1.17.Representacinesquemticadelhidrogelfotopolimerizadobasadoen
Poliesteramidas(PEA)ydiacrilatodePluronicF68,descritoporChuetal.98b

Han et al. 88c, 99 han descrito otra aproximacin diferente a la obtencin de

derivados fotopolimerizables de Pluronic. Utilizando el copolmero Pluronic
F68ysiguiendoelprocedimientoquesemuestraenlaFigura1.18,prepararon
un derivado de Pluronic F68 con dos grupos metacrilato fotopolimerizables y
dosestructuraspeptdicasRGD,incorporadasparafavorecerlaadhesincelular.
Estosmaterialeshansidoobjetodedospatentesorientadasasuutilizacinen
LCFeIT.88c,99a

99
(a)Han,D.K.;Park,K.;Kim,J.J.,2010,PatentnumberWO2007/064152A1;(b)Cha,
M.H.;Choi,J.;Choi,B.G.;Park,K.;Kim,I.H.;Jeong,B.;Han,D.K.,JournalofColloidand
InterfaceScience2011,360(1),7885.

33

Captulo1Capitulok

Figura1.18.RutasintticadeloscopolmerosreactivosdePluronicF68descritospor
Hanetal.99a

Comounaalternativaalafotopolimerizacindeacrilatosometacrilatos,varios
autores han utilizado la reaccin de tiolenos para la reticulacin qumica de
hidrogeles derivados de Pluronic. Con este fin se han utilizado un significativo
nmero de molculas funcionalizadas con grupos tiol, para su interaccin
covalente con diacrilato de Pluronic, desde molculas de origen natural, como
por ejemplo dextrano tiolado,100 hasta el propio Pluronic con grupos tiol
terminales.101

De forma general, en estos hidrogeles la reaccin de tiolenos se ha llevado a

cabo en condiciones suaves (condiciones fisiolgicas), dando lugar a materiales
conbuenabiocompatilibilidadybajogradodehinchamientoenentornoacuoso.

100
(a)Lin,C.;Zhao,P.;Li,F.;Guo,F.;Li,Z.;Wen,X.,MaterialsScienceandEngineering:C
2010,30(8),12361244;(b)Niu,G.;Zhang,H.;Song,L.;Cui,X.;Cao,H.;Zheng,Y.;Zhu,
S.;Yang,Z.;Yang,H.,Biomacromolecules2008,9(10),26212628.
101
(a)Cellesi,F.;Tirelli,N.,JournalofMaterialsScience:MaterialsinMedicine2005,16
(6), 559565; (b) Cellesi, F.; Tirelli, N.; Hubbell, J. A., Biomaterials 2004, 25 (21), 5115
5124; (c) Cellesi, F.; Tirelli, N.; Hubbell, J. A., Macromolecular Chemistry and Physics
2002,203(1011),14661472.

34

Captulo1

Si bien muchos ejemplos del uso del Pluronic en hidrogeles han estado
destinados a sus aplicaciones en IT, en la bibliografa se encuentran tambin
ejemplos de nanogeles termosensibles, en concreto derivados de diacrilato de
Pluronic, la mayora de ellos obtenidos por fotopolimerizacin, algunos de los
cualessecomentanacontinuacin.75bf

Tae et al.102 han descrito la preparacin de nanogeles termosensibles por

fotopolimerizacin de diacrilato de Pluronic F127. Los hidrogeles
nanoestructuradosfueronobtenidosenunsolopasoporfotopolimerizacinde
disoluciones diluidas del polmero por encima de la CMC, para garantizar el
autoensamblajeenmicelas.Losnanogelesconservanlanaturalezaanffiladelas
micelas, dando lugar a dominios hidrfobos e hidrfilos que permiten la
encapsulacin de frmacos de ambas naturalezas. Cabe destacar su gran
capacidad y versatilidad de carga, ya que han permitido encapsular tanto
protenascomonanopartculasdeoro.Estosnanogelespresentaroncambiosde
tamaoenfuncindelatemperatura,variandode46037nma555nmconel
aumentode4Ca37C.Estavariacindetamaosehautilizadoparaproducir
unaliberacindelaprotenaencapsuladaa37Cdeformamssostenidaenel
tiempoquelaqueseproducea4C,dondelaprotenaencapsuladaseliberade
formarpida(Figura1.19).

102
Choi, W. I.; Tae, G.; Kim, Y. H., Journal of Materials Chemistry 2008, 18 (24), 2769
2774.

35

Captulo1Capitulok

Liberacingradual

Figura1.19.Liberacingraduala37Cdeunaprotenafluorescentecargadaen
nanogelesdediacrilatodePluronicF127,descritaporTaeetal.102

En un estudio posterior de los mismos autores se demostr que los nanogeles

facilitan la permeabilidad a travs de la piel de protenas como insulina o
albmina,manteniendointactalaactividaddelasmismas.103

Asmismo,sehandescritonanogelespreparadosapartirdelacopolimerizacin
de diacrilato de Pluronic con distintos polisacridos naturales funcionalizados
congruposfotopolimerizables.76b,c,e

Porejemplo,Taeetal.76b copolimerizarondiacrilatodePluronic(F127yF68)con
el polisacrido quitosano, modificado qumicamente con grupos metacrilato
(Figura 1.20). Los nanogeles obtenidos mostraron baja citotoxicidad tras 24
horas,ascomointernalizacinenclulastumorales.

103
Choi , W. I.; Hyun Lee , J.; Kim , J. Y.; Kim , J.C.; Kim , Y. H.; Tae , G., Journal of
ControlledRelease2012,157,272278.

36

Captulo1

Figura1.20.Esquemadesntesisdelosnanogelesderivadosdequitosanocongrupos
metacrilato(GMAchitosan)ydediacrilatodePluronic(DAPluronic).76b

Siguiendounprocedimientosimilar,Wangetal.76ccopolimerizarondiacrilatode
Pluronic con sulfato de condroitina con grupos metacrilato, con resultados
anlogos a lo publicado por Tae et al.76b en cuanto a citotoxicidad e
internalizacinenclulastumorales.Ademsestosnanogelesseutilizaronpara
encapsular y liberar de forma controlada Doxorubicina, un frmaco
anticancergenohidrfobo,conungrannmerodeefectossecundarioscuando
seadministradeformalibre.

37



CAPTULO2

OBJETIVOSYPLANTEAMIENTODETRABAJO

Captulo2

2.1.OBJETIVOS

Elobjetivoprincipaldeestatesisdoctoralhasidoeldiseo,sntesis,preparacin
y caracterizacin de hidrogeles termosensibles y fotopolimerizables, para
aplicacin en Ingeniera de Tejidos y sistemas de encapsulacin y Liberacin
controladadefrmacos.

Como se ha expuesto en el apartado de antecedentes, el diseo molecular de

hidrogeles para aplicaciones biomdicas ha estado fuertemente condicionado
porlaaplicacinltimaquesedeseabaparaestosmateriales.Ennuestrocaso,
junto al hecho de estar considerando materiales que deben gelificar en medio
acuoso y combinar los requisitos propios de cualquier biomaterial, nuestro
inters se ha centrado en hidrogeles termosensibles que permitan ser
fotopolimerizados, con el fin de estabilizar estructuralmente tanto un soporte
para Ingeniera de tejidos, como nanogeles para encapsulacin y Liberacin
controladadefrmacos.

Basndonos en los antecedentes del tema y lapropia experiencia del grupo de

trabajo, el diseo qumico elegido se ha centrado en copolmeros bloque
dendrticolinealdendrtico,cuyaestructuraseesquematizaenlaFigura2.1.

Dendrn

Copolmerobloque

Gruposfuncionalesterminales

Figura2.1.Diseoestructuraldemacromolculasdendrticolinealdendrticoobjetode
estudio.

La estructura qumica de los compuestos propuestos presenta tres partes

claramente diferenciadas: un ncleo lineal polimrico, que a su vez es un

41

Captulo2Capitulok

polmerotribloqueABA(colorverdeyazulenlaFigura2.1),dosestructurasde
tipo dendrtico en las posiciones terminales (color morado) y distintos grupos
fotopolimerizables terminales que difieren en naturaleza qumica y en nmero
(colorrojo).

Laestructuraqumicapropuestadeestosbloquesrespondeadistintosaspectos.

Conelobjetivodeconseguircompuestosconpropiedadesdeautoensamblajey
termosensibilidad, se ha elegido un copolmero bloque de tipo Pluronic como
bloquelinealcentral,enconcretolavariedadPluronicF127,79a,88a,104unodelos
ms utilizados para aplicaciones biomdicas y aprobado por la FDA (Food and
DrugAdministration)endiferentesaplicacionesenelcampofarmacuticopara
su uso in vivo en humanos:105 disolucin oftlmica,106 administracin oral 107 o
usotpico(Figura2.2).

104
(c)Manaspon,C.;ViravaidyaPasuwat,K.;Pimpha,N.,JournalofNanomaterials2012;
(d)Abdi,S.I.H.;Choi,J.Y.;Lee,J.S.;Lim,H.J.;Lee,C.;Kim,J.;Chung,H.Y.;Lim,J.O.,
Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2012, 9 (1), 19; (e) Antunes, F. E.;
Gentile, L.; Oliviero Rossi, C.; Tavano, L.; Ranieri, G. A., Colloids and Surfaces b:
Biointerfaces 2011, 87 (1), 4248; (f) Shachaf, Y.; GonenWadmany, M.; Seliktar, D.,
Biomaterials2010,31(10),283647.
105
Approved drug products. Poloxamer 407 o Pluronic F127. USFDA, 2003,
www.accesdata.fda.gov/scripts/cder/igg/.
106
Li,H.;Sung,K.C.,JournalofControlledRelease2000,69(3),379388.
107
Padilla,M.;Clark,G.T.;Merril,R.L.,J.Am.Dent.Assoc.2000,131(2),184195.

42

Captulo2

Figura2.2.ConcentracionesmximaspermitidasdePluronicF127(Poloxamer407)
paradistintasaplicaciones,aprobadasporlaFDA.

Este copolmero posee un bloque de PPG con 67 unidades repetitivas y dos

bloquesdePEGde99unidadesrepetitivascadauno(Figura2.3).PluronicF127
tieneunpesomolecularde12600g/mol.

Figura2.3.EstructuraqumicadePluronicF127.

El Pluronic F127 se caracteriza por presentar una transicin de fase solgel a

temperaturafisiolgicaenunaconcentracindel16%(w/v)enagua.Esunode
los derivados comerciales de Pluronic que requiere una menor CGC para
producirlatransicinsolgelatemperaturafisiolgica.

43

Captulo2Capitulok

Como estructura dendrtica bsica se ha optado por polisteres basados en el

cido2,2bis(hidroximetil)propinico(bisMPA)(Figura2.4).

Figura2.4.Estructuraqumicadecido2,2bis(hidroximetil)propinico(bisMPA).

Los dendrmeros y dendrones de tipo polister basados en bisMPA presentan

una serie de caractersticas que los hacen candidatos ideales para aplicaciones
biomdicas: son biocompatibles tanto in vitro108 como in vivo, son solubles en
entornobiolgicoysoncapacesdedegradarseporunprocesohidrolticodelos
enlacesster. 108, 109Porotraparte,launidadmonomricadebisMPApresenta
ensuestructuragruposhidroxiloquepermitensufuncionalizacinconungran
nmero de grupos funcionales, mediante diferentes tipos de reacciones
orgnicas.110Asmismo,elgrupocidoenelpuntofocalposibilitasuinteraccin
congruposfuncionalescomohidroxilooaminodeotrasmolculas.

Como grupos funcionales terminales se ha optado por grupos fotoreactivos

acrilatoytiol.

ApesardelcrecientenmerodeaplicacionestantodelPluronic 104ab,111como
de los polisteres dendrticos110 de forma individual, hasta la fecha no se han
descritohbridosdendrticolinealdendrticoqueloscombinen.

108
Feliu, N.; Walter, M. V.; Montaez, M. I.; Kunzmann, A.; Hult, A.; Nystrm, A.;
Malkoch,M.;Fadeel,B.,Biomaterials2012,33(7),19701981.
109
Zhang,H.;Patel,A.;Gaharwar,A.K.;Mihaila,S.M.;Iviglia,G.;Mukundan,S.;Bae,H.;
Yang,H.;Khademhosseini,A.,Biomacromolecules2013,14(5),12991310.
110
Carlmark, A.; Malmstrom, E.; Malkoch, M., Chemical Society Reviews 2013, 42 (13),
58585879.
111
Wu, C.J.; Gaharwar, A. K.; Chan, B. K.; Schmidt, G., Macromolecules 2011, 44 (20),
82158224.

44

Captulo2

2.2.PLANTEAMIENTODELTRABAJO

Paralaconsecucindelobjetivoprincipaldeestetrabajodeinvestigacinseha
planteado la preparacin de dos series diferentes de compuestos dendrtico
linealdendrticoquerespondenalaestructuraantescomentada:

1.CopolmerosbloquedendrticolinealdendrticoderivadosdePluronic
F127 y de dendrones de bisMPA, y su anlogo lineal, con grupos acrilato
terminales (Serie A, Figura 2.5), que permitan la preparacin de hidrogeles
basadosenpoliacrilatosmediantepolimerizacinfotoinducida.

2.CopolmerosbloquedendrticolinealdendrticoderivadosdePluronic
F127ydedendronesdebisMPA,ysuanlogolineal,congrupostiolterminales
(SerieB,Figura2.6),quepermitanlapreparacindehidrogelesbasadosentiol
enos,mediantereaccinfotoinducida.Paralaincorporacindelosgrupostiolse
han seleccionado restos de tipo cisteamina unidos a los grupos hidroxilo
terminalesmedianteenlacescarbamato.

Para la identificacin de los diferentes compuestos lineales y dendrticolineal

dendrticoobjetodeestudiodeestamemoriasehautilizadounanomenclatura
F127GFTncomolaindicadaenlasFiguras2.5y2.6,quepermiteidentificarla
presenciadelaestructuradePluronicF127,lanaturalezaqumicadelosgrupos
funcionalesterminales(GFT)ysunmero(n).

Por ejemplo, F127Ac4 identifica al compuesto dendrtico lineal de Pluronic

F127 funcionalizado con dendrones de bisMPA de primera generacin, que
presentacuatrogruposacrilatoterminales.

45

Captulo2Capitulok

Figura2.5.EstructuraqumicaynomenclaturaparalasmolculasdelaSerieAcon
gruposacrilatoterminales.

46

Captulo2

O
H
N O O SH
HS O O N
99 67 99 H
O
F127SH2

O
H
N O O SH
HS O N
O O H
O O O O
H
N O 99 67 99 SH
HS O O N
F127SH4 H
O

O O
HS SH
NHO O O O NH
O
O O
HS SH
NH O O O O NH
O O O NH
NH O O O O SH
HS O
O O 99 67 99 O
O O
NH O F127SH8 O O NH
HS SH
O O

Figura2.6.EstructuraqumicaynomenclaturaparalasmolculasdelaSerieBcon
grupostiolterminales.

Elplandetrabajodesarrolladohaimplicadolossiguientesapartados:

Sntesis y caracterizacin estructural de las macromolculas mediante

diferentestcnicasexperimentales(1HRMN,13CRMN,FTIR,EMyGPC).
Determinacindelaspropiedadessolgeldelosmaterialesenfuncinde
laconcentracinenPBS(PhosphateBufferSaline)ydelatemperatura.
Preparacin de formulaciones binarias basadas en derivados acrilados y
tioladosydeterminacindesuspropiedadessolgel.

47

Captulo2Capitulok

ConelfindedesarrollarMaterialesparaaplicacionesenIngenieradeTejidos,
eltrabajodesarrolladosehaconcretadoen:

Preparacindehidrogelesmacroscpicosporaccindelatemperaturay
porfotopolimerizacin.
CaracterizacindesumorfologainternaporSEM.
Anlisisdesusprocesosdedegradacin.
Estudiosdeviabilidadcelular.
Evaluacindesuspropiedadesmecnicas.

Con el fin de desarrollar Materiales nanoestructurados para encapsulacin

(Nanogeles),eltrabajodesarrolladohasido:

Determinacin de la Concentracin Micelar Crtica (CMC) de las

molculas.
Preparacindenanogelesmediantefotopolimerizacin.
Estudiosdeencapsulacindemolculashidrfobasehidrfilas.
EstudiodelamorfologaytamaodelosnanogelesporTEM/SEMyDLS.
Estudiosdeviabilidadcelular.
Estudiosdeinternalizacindenanogelesenclulas.

48

CAPTULO3

HIDROGELESDERIVADOSDEPLURONIC:

POLIACRILATOS

Captulo3

EnestetercercaptulodelaMemoriaseexponeeltrabajodesarrolladorelativo

alapreparacinycaracterizacindelosdiferentesderivadosdePluronicF127

que presentan como caractersticas estructurales: la utilizacin de enlaces de

tiposterenlauninentreelpolmeroylasestructurasdendrticasydegrupos

acrilatocomounidadesreactivasterminales.

Para ello, la exposicin de los resultados y su discusin se ha dividido en los

siguientesapartados:

Sntesisycaracterizacinestructuraldelosproductos

Determinacindelaspropiedadessolgeldelosproductos

Preparacindeloshidrogelesfotopolimerizados

CaracterizacinmorfolgicadelaestructurainternaporSEM

Estudiodeladegradacindeloshidrogelesfotopolimerizados

Ensayosdeviabilidadcelular

Caracterizacinmecnicadeloshidrogelesfotopolimerizados

51

Captulo3

3.1.SNTESISYCARACTERIZACIN

3.1.1Derivadolineal:F127Ac2

La introduccin de grupos acrilato en la molcula comercial de Pluronic F127,

paralaobtencindeF127Ac2,hasidoabordadaporvariosautores,utilizando
diferentesprocedimientossintticos.9698, 101cEnnuestrotrabajo,laacrilacinse
llev a cabo utilizando cloruro de acriloilo y trietilamina (TEA) como base
(Esquema3.1).

Esquema3.1.RutasintticaparalaobtencindeF127Ac2.
Condicionesdereaccin:i)Clorurodeacriloilo,TEA,diclorometano.

AnteladificultadquepresentaelseguimientodelafuncionalizacindePluronic
F127porlosmtodoscromatogrficoshabitualesenqumicaorgnica,seopt
por utilizar 1HRMN como tcnica de deteccin de las seales del nuevo grupo
funcionalintroducido,ascomoporlaFTIRparalaobservacindelasbandasde
vibracin de los enlaces caractersticos de cada compuesto. A continuacin se
comentan de forma detallada los espectros de 1HRMN as como los de FTIR,
quesecomplementanconotrastcnicasadicionalesenelcasodesernecesario.

En la parte inferior de la Figura 3.1 se muestra el espectro de 1HRMN de

F127Ac2,ascomoeletiquetadodecarbonosysuscorrespondientesprotones
para Pluronic F127 y F127Ac2. Con respecto al del polmero comercial
Pluronic F127 (parte superior Figura 3.1), en el espectro de F127Ac2 se

53

Captulo3Captulokk

observlaaparicindedossealescaractersticas.Estassealescorrespondena
los grupos acrilato unidos al polmero, que aparecen como 3 dobletes de
dobletesentre5.7y6.5ppm(protonesI,JyJ)ylasealcorrespondientealos
protonesdelosgruposCH2delacadenadePEGdirectamenteunidosalenlace
sterformado(protonesG),tripletequeaparecea4.31ppm.

A
D,E
H2O
C
CDCl3
B

JIJ G F

7.4 7.0 6.6 6.2 5.8 5.4 5.0 4.6 4.2 3.8 3.4 3.0 2.6 2.2 1.8 1.4 1.0
f1 (ppm)
Figura3.1.Espectrosde1HRMNdePluronicF127comercial(partesuperior)yde
F127Ac2(parteinferior)enCDCl3,500MHz.

Para comprobar la completa funcionalizacin de Pluronic F127, la integracin

delasnuevasseales,protonesG(4H),I(2H),J(2H)yJ(2H),secorrelacioncon
la de los protones de los grupos metilo correspondientes al bloque de PPG de
Pluronic F127, protones de tipo A, que integran por 201 protones y de los
protones que corresponden a los grupos CH del mismo bloque, protones de
tipo B, que integran por 67 protones, constatando la proporcin relativa
esperada.

Mediante FTIR se comprob en el espectro de F127Ac2 la presencia de la

vibracindetensincorrespondientealgrupocarboniloa1724cm1(Figura3.2).

54

Captulo3

Transmitancia(u.a.)
Vibracinde
tensinC=O
a1724cm1

PluronicF127 F127Ac2

3.600 3.100 2.600 2.100 1.600 1.100 600

cm1

Figura3.2.EspectrosFTIRdePluronicF127comercialydeF127Ac2,muestra
preparadaapartirdelcompuestonetofundidosobrepastilladeNaCl.

3.1.2.Derivadosdendrticos:F127Ac4yF127Ac8

Los aspectos ms reseables de la obtencin de los diferentes compuestos

dendrticossediscutensegnlossiguientessubapartados:

a)Crecimientodelageneracin.
b)Desproteccindelosgruposhidroxiloporhidrogenolisis.
c)Introduccindegruposacrilato.
d)CaracterizacinporGPCyMALDIMS.

a)Crecimientodelageneracin

Como se ha comentado en la introduccin de esta memoria, existen varios

mtodos para la sntesis de estructuras dendrticas, el convergente y el
divergente.

Para la obtencin de los derivados dendrticolineales de Pluronic de primera y

segunda generacin se ensay en primer lugar el mtodo de sntesis
convergente,yaquehastaelmomentohasidoelprocedimientodesntesisde
molculas dendrticas ms habitual utilizado en nuestro grupo, el grupo de

55

Captulo3Captulokk

Cristales lquidos y Polmeros.112 De forma general, este mtodo consiste en el

crecimientodelosdendronesderivadosdebisMPAysuposterioracoplamiento
alncleocentralpolimricodePluronicF127.

Para la sntesis de los cidos dendrticos de bisMPA de primera [2] y segunda

generacin[5]conlosgruposhidroxiloprotegidosenformadeacetal,seutiliz
elmtododescritoporHult(Esquema3.2).63

Esquema3.2.Rutasintticaparalaobtencindedendronesdeprimera[2]ysegunda
generacin[5].Condicionesdereaccin:i)2,2dimetoxipropano,TsOH,acetona,ii)
bromurodebencilo,KOH,dimetilformamida,iii)DCC,DPTS,diclorometano,iv)Pd/C,
acetatodeetilo.

112
(a) Blasco, E.; Barrio, J. d.; SanchezSomolinos, C.; Pinol, M.; Oriol, L., Polymer
Chemistry2013,4(7),22462254;(b)Blasco,E.;Barrio,J.d.;Piol,M.;Oriol,L.;Berges,
C.;Snchez,C.;Alcal,R.,Polymer2012,53(21),46044613;(c)delBarrio,J.s.;Oriol,L.;
Alcal,R.;Snchez,C.,Macromolecules2009,42(15),57525760.

56

Captulo3

Elacoplamientodelosdendronesdeprimera[2]ysegundageneracin[5]con
Pluronic F127 se realiz por reaccin de esterificacin de Steglich entre los
gruposcidodelosdendronesylosgruposhidroxilodePluronicF127(Esquema
3.3).Sinembargo,estareaccinnoproporcionlafuncionalizacincompletadel
copolmerobloque,siendoimposiblelaseparacindelpolmerosinfuncionalizar
oparcialmentefuncionalizado,delcompletamentefuncionalizado,comosepudo
comprobar por la incorrecta correlacin del valor de las integrales
correspondientes a Pluronic F127 y las de los fragmentos dendrticos, en sus
correspondientesespectrosde1HRMN.

Esquema3.3.Rutasintticaconvergenteparalaobtencindelosderivadosdendrticos
deprimeraysegundageneracin,conlosgruposhidroxiloperifricosprotegidosen
formadeacetal.Condicionesdereaccin:i)[2],DCC,DPTS,diclorometano.ii)[5],DCC,
DPTS,diclorometano.

Estosresultadosllevaronaplanteardeformaalternativaelempleodelmtodo
de sntesis divergente utilizado por Frchet62 para la obtencin de copolmeros
bloquedendrticolinealdendrticoderivadosdebisMPAyPEG.Enestecaso,el
crecimiento de generacin se realiza directamente sobre el ncleo de PEG,
alternando etapas de crecimiento de generacin y desproteccin. Para el
crecimiento de generacin se utiliza un anhdrido derivado de bisMPA [7]

57

Captulo3Captulokk

(Esquema3.4),conelcualseconsiguenfuncionalizacionescompletas,elevados
rendimientosypurificacionessencillas.

Esquema3.4.RutasintticaparalaobtencindelanhdridoderivadodebisMPA[7].
Condicionesdereaccin:i)TsOH,acetonaii)DCC,diclorometano.

Finalmente,lasntesisdeloscompuestossedesarrollconformealarutaquese
muestra en el Esquema 3.5. La reaccin del anhdrido [7] con la molcula de
Pluronic F127 proporcion el derivado dendrticolinealdendrtico de primera
generacin protegido, F127Bn2 [8], con rendimientos superiores al 95%. Otra
ventaja de esta reaccin es la facilidad de purificacin, que consiste en un
pretratamiento del crudo de reaccin con metanol para la destruccin del
anhdrido[7]enexceso,queseconvierteenelcorrespondientecidobenciliden
2,2bis(oximetil)propinico[6]yqueadiferenciadelanhdrido[7]essolubleen
dietil ter, lo que permite la posterior precipitacin de F127Bn2 [8] en dietil

58

Captulo3

terfro.Deestaformaseobtieneelproductobuscadotrasfiltracinylavado
condietilterfro.

Esquema3.5.Rutasintticadivergenteparalaobtencindelosderivadosdendrticosde
primeraysegundageneracin,ensusformasprotegidascongruposbenciloyformas
desprotegidascongruposhidroxiloterminales.
Condicionesdereaccin:i)[7],DMAP,diclorometano,ii)Pd/C,acetatodeetilo.

59

Captulo3Captulokk

LacompletafuncionalizacindePluronicF127paradarF127Bn2 [8]sesigui
por1HRMNyporFTIR.

En la Figura 3.3 se observa el espectro de 1HRMN, as como el etiquetado de

carbonosysuscorrespondientesprotones,delderivadoF127Bn2[8].

A
CDCl3
D,E,I
C

B
J

N,PyQ L I G F

1
Figura3.3.Espectrode HRMNdeF127Bn2enCDCl3,400MHz.

Analizandoelespectrodemayoramenordesplazamientoqumico,a7.427.32
ppmaparecenlassealescorrespondientesalosprotonesaromticos(N,PyQ),
a 5.44 ppm aparece el protn benclico (L), a 4.66 ppm se observa un doblete
que corresponde a uno de los protones diastereotpicos del bisMPA (I),
apareciendoelotrodoblete(I)enmascaradoporlassealesdelcopolmeroque
estn entre3.373.82 ppm. Estos protones diastereotpicos se describen como
un sistema AX considerando la relacin II/JII > 4 [II (diferencia de
frecuencias entre las seales) y JII (constante de acoplamiento entre los
ncleos)].A4.36ppmsepuedeverlaaparicindeuntripletecaractersticoque
integrapor4protonesyquecorrespondealosprotonesGdelbloquedePEGdel

60

Captulo3

PluronicF127adyacentesalnuevoenlacesterformadoentreelpolmeroyla
parte dendrtica. Por ltimo, a 1.05 ppm aparece un singlete que integra por 6
protonescorrespondientesalosgruposmetilodelaestructuradebisMPA(J).

Losvaloresdelasintegralesdelosnuevosgruposintroducidosenlamolculade
Pluronic F127 concuerdan con lo esperado considerando los valores de las
integralesdelosprotonestipoAytipoBdeestamolcula.

En el espectro infrarrojo de este compuesto se observa la aparicin de la

vibracindetensincaractersticadelenlacecarbonilodelgrupoCOORa1737
cm1(Figura3.4).

80

70

60

Transmitancia%
50
Vibracinde
40
tensindel
enlaceC=O 30
a1737 cm1 20

10

0
3.100 2.600 2.100 1.600 1.100 600
cm1
Figura3.4.EspectroFTIRdeF127Bn2,muestrapreparadaapartirdelcompuestoneto
fundidosobrepastilladeNaCl.

Para el crecimiento de generacin se realiz la desproteccin de los grupos

hidroxilo por hidrogenolisis de F127Bn2 [8] con Pd/C, obteniendo el derivado
deprimerageneracindesprotegidoF127OH4[9](reaccinquesecomentar
en el subapartado b). Sobre este derivado se introdujeron 4 nuevas unidades
derivadasdebisMPAapartirdelanhdridoderivadodebisMPA[7],talycomo
sehamostradoenelEsquema3.5,paralaobtencindeF127Bn4[10].

61

Captulo3Captulokk

En comparacin con la funcionalizacin del derivado de primera generacin, la

completa funcionalizacin de F127OH4 [9] requiri trabajar con excesos de
anhdrido[7]yDMAP,ascomomayorestiemposdereaccin(72horasfrentea
48 horas). En lo que respecta al compuesto F127Bn4 [10], permiti su
obtencinunapurificacinsencillasimilaralautilizadaconF127Bn2[8].

La correcta formacin de F127Bn4 [10] se sigui por 1HRMN y por FTIR. En

estecasoelespectroobtenidopresentabaelaspectoqueseobservaenlaFigura
3.5.Sepuedenverlassealescorrespondientesalosanillosaromticosa7.38
7.28ppm(protonestipoR,SyT)ylosprotonesbenclicosa5.40ppm(protones
tipoP).LosprotonesdelaestructuraderivadadebisMPAexterna(protonestipo
L y L) aparecen como dos dobletes ya que son protones diastereotpicos
correspondientesaunsistemaAX.Unodelosdobletesseencuentraa4.56ppm
eintegrapor8protones(protonestipoL),mientrasqueelotrodobleteaparece
enmascarado por las seales del ncleo polimrico (protones tipo L). Adems,
los protones correspondientes a las estructuras de bisMPA internas (protones
tipoI),aparecencomounsingletea4.37ppm.LosprotonestipoGaparecenen
estecasoa4.11ppm.Loshidrgenoscorrespondientesalosgruposmetilodelos
grupos de bisMPA internos (J) aparecen a 1.24 ppm, mientras que los de los
gruposdebisMPAexternos(N)aparecena0.93ppm.

62

Captulo3

A
D,E,L
CDCl3 C

N
B
I H2O J
R,S,T P
L G F

183.0
13.0

66.9

12.0
8.2

4.0

8.7
7.8
4.3
5.0

6.4

1
Figura3.5.Espectrode HRMNdeF127Bn4enCDCl3,300MHz.

En la Figura 3.6 se muestra el espectro FTIR de los derivados F127OH4 [9] y

F127Bn4[10].Lacompletafuncionalizacinseconfirmaporladesaparicinde
labandadevibracina3482cm1correspondientealosgruposhidroxilo.

Transmitancia(u.a.)

Desaparicin
vibracinOH
a3482cm1

F127OH4 F127Bn4
3.600 3.100 2.600 2.100 1.600 1.100 600
cm1

Figura3.6.EspectrosFTIRdeF127OH4yF127Bn4,muestrapreparadaapartirdel
compuestonetofundidosobrepastilladeNaCl.

63

Captulo3Captulokk

b)Desproteccindelosgruposhidroxiloporhidrogenolisis.

La eliminacin de los grupos bencilo de los derivados de Pluronic de primera

generacin, F127Bn2 [8] y de segunda generacin, F127Bn4 [10] se realiz
por hidrogenolisis, utilizando Pd/C como catalizador. Para llevar a cabo dicha
reaccinseprobarondosdisolventesdistintos.Enuncasoseutilizunamezcla
diclorometano/metanolenproporcion1:2,talcomosedescribeeneltrabajode
Frchet.62

Aunquelasdesproteccionestuvieronlugardeformacompleta,comoseobserv
por 1HRMNprincipalmenteporladesaparicindelassealescorrespondientes
alosgruposaromticos,secomprobunamalaconcordanciaentrelosvalores
de las integrales correspondientes a los protones tipo G, adyacentes al enlace
sterentrelapartedendrticayelpolmero,ylosprotonestipoAyBdelncleo
polimrico,loqueseatribuyaunaroturaparcialdelsistemadendrtico.Ante
estosresultadossedescartelusodelamezcladiclorometano/metanolparala
realizacindelasdesprotecciones.

El segundode los disolventes utilizados para llevar a cabo la desproteccin fue

acetatodeetilo.Enestecasoseobservunacorrectaintegracindelasseales,
comosedetallaacontinuacin.

EnladesproteccindeF127Bn2[8]paraobtenerF127OH4[9](Figura3.7),se
confirmladesaparicindelassealesdelosprotonesbenclicosyaromticos
mediante 1HRMN, as como el desplazamiento a campos mayores de los
protonestipoIeIcorrespondientesalosgruposCH2delsistemadebisMPA,
que en este caso aparecen enmascarados junto a los protones del polmero,
entre 3.37 y 3.82 ppm. La seal de los protones G, prximos al enlace ster
aparecea4.34ppmylosmetilosdelsistemadebisMPA(J)a1.11ppm.

64

Captulo3

A
C J

B
D,E
CDCl3

1
Figura3.7.Espectrode HRMNdeF127OH4enCDCl3,300MHz.

En el espectro infrarrojo de F127OH4 (Figura 3.8), comparndolo con su

anlogo protegido F127Bn2 [8], se observa la aparicin de la vibracin del
enlacecorrespondientealosgruposhidroxiloa3482cm1,ascomolabandade
vibracindetensincorrespondientealgrupocarbonilo.

Transmitancia(u.a.)

Aparicin VibracinC=O
vibracinOHa
3482cm1 F127Bn2 F127OH4
3.600 3.100 2.600 2.100 1.600 1.100 600
cm1
Figura3.8.EspectrosFTIRdeF127Bn2yF127OH4,muestrapreparadaapartirdel
compuestonetofundidosobrepastilladeNaCl.

65

Captulo3Captulokk

LadesproteccindeF127Bn4[10]queproporcionF127OH8[11]seconfirm
por la desaparicin de los protones del sistema benclico en el espectro de 1H
RMN (Figura 3.9). Adems los protones tipo I que en el precursor protegido
aparecan como un singlete, aparecen como un cuadruplete correspondiente a
un sistema AB a 4.32 ppm (IIq, 8H, II=35 Hz, JII= 11.2 Hz), considerando la
relacin II/JII < 4 [II (diferencia de frecuencias entre las seales) y JII
(constante de acoplamiento entre los ncleos)]. Parte de este cuadruplete
aparece solapado junto con el triplete a 4.26 ppm de los protones G del
polmero, adyacentes al enlace ster, siendo el valor total de la integral de 12
protones,8 correspondientesalosprotonesIeIyotros4correspondientesa
los protones G. Los protones L correspondientes a los grupos CH2 de las
estructuras de bisMPA externas, aparecen junto con las seales del polmero
entre3.37y3.82ppm.

Ademsseobservalaaparicindeunsingletedebidoalosgruposmetilodela
estructura de bisMPA interno (J) y otro singlete de los grupos metilo de las
estructuras de bisMPA externas (N). Los valores de las integraciones de los
extremosdendrticossoncoherentesconlasintegracionesdelosprotonesAyB
dePluronicF127.

66

Captulo3

L,D,E C

N
B
CDCl3
J
IG,I

207.4
67.0

12.3
4.6
8.7

6.4

1
Figura3.9.Espectrode HRMNdeF127OH8enCDCl3,400MHz.

EstudiosadicionalesdeHSQC,quemuestranlacorrelacinprotncarbonoaun
enlace,permitieronlacorrectaasignacindelassealesdecarbonoascomola
observacindelosprotonesdiastereotpicostipoIeIdescritosanteriormente
(Figura3.10).

II,G

Figura3.10.EspectrodeHSQCdeF127OH8enCDCl3,500MHz.

67

Captulo3Captulokk

EnelespectroFTIR(Figura3.11)seobservlaaparicindelabandaa3457cm1
correspondientesalavibracindelosgruposhidroxilosdelcompuestoF127OH
8, as como la presencia de la banda correspondiente a la vibracin de tensin
delenlacecarbonilodelgrupostera1733cm1.

Transmitanciau.a.
VibracinOH VibracinC=O
3457cm1 1733 cm1

F127Bn4 F127OH8
3.600 3.100 2.600 2.100 1.600 1.100 600
cm1
Figura3.11.EspectroFTIRdeF127Bn4yF127OH8,muestrapreparadaapartirdel
compuestonetofundidosobrepastilladeNaCl.

c)Introduccindegruposacrilato

UnavezincorporadoslosdendronesderivadosdebisMPAdeprimeraysegunda
generacin al ncleo de Pluronic F127, los grupos hidroxilo terminales de los
compuestos F127OH4 [9] y F127OH8 [11] se funcionalizaron mediante
esterificacin con cloruro de acriloilo en presencia de TEA (Esquema 3.6), de
forma similar a la descrita en el apartado 3.1.1. para la obtencin del derivado
acriladolineal.Debidoalaelevadadensidaddegruposacrilatopormolcula,se
aadi a la mezcla de reaccin una pequea cantidad de 4metoxifenol como
inhibidor de radicales, para evitar la polimerizacin. La esterificacin de los
gruposhidroxiloperifricostranscurrideformacompleta,yelaislamientodel
compuesto acrilado implic procesos de purificacin sencillos y rendimientos
satisfactorios.

68

Captulo3

HO O
O OH
O
HO O O
HO O O OH
O O OH
O O
99 67 99 O
HO O
[11] F127OH8 O OH

O
i) 4782% O
O O
O O
O
O O
O O
O
O O O O
O O O
O O O 99 67 99
O
O
O O O O
[13] F127Ac8
O O

Esquema3.6.Sntesisdeloscompuestosacriladosdeprimeraysegundageneracin
F127Ac4[12]yF127Ac8[13].Condicionesdereaccin:i)clorurodeacriloilo,TEA,4
metoxifenol(inhibidor),diclorometano.

Lacompletatransformacindelosgruposterminaleshidroxiloengruposacrilato
seconfirmpor1HRMNyporFTIR.

69

Captulo3Captulokk

En la Figura 3.12 se muestra el espectro de 1HRMN del compuesto F127Ac4

[12]. Se observ la aparicin de las seales debidas a los grupos acrilato entre
6.39y5.85ppm(protonesM,NyN).LosgruposCH2delsistemadebisMPA
(protonesIeI)sonunsistemaAB,4.34ppm(IIq,8H,II=7.6Hz,JII=11.2Hz).
Estos protones aparecen a mayor desplazamiento qumico que los mismos
protonesdelamolculaprecursoraF127OH4[9](Figura3.7),dndeestetipo
deprotonesaparecanjuntoconlassealesdelncleopolimrico.Losprotones
tipoGprximosalenlacesterqueproducelauninentrelapartedendrticay
el polmero, aparecen en forma de triplete a 4.27 ppm, ligeramente solapados
conlassealesdelosprotonestipoIeI.Losprotonesdelosgruposmetilode
losextremosdendrticos(J)aparecencomounsingletea1.30ppm.

D,E B H2O A
CDCl3
J
I,I
I
NMN
G F
211.8
12.4

75.8
3.8
3.6
4.0

6.1

1
Figura3.12.Espectrode HRMNdeF127Ac4enCDCl3,300MHz.

En la Figura 3.13 se muestra el espectro de 13CRMN de F127Ac4 donde se

observanclaramentelosdostiposdegruposcarboniloexistentesenlamolcula:

70

Captulo3

elgrupocarbonilodelenlacestermsprximoalncleopolimrico(H)a172.5
ppmyelcarbonilodelgrupoacrilato(L)a165.4ppm.

Figura3.13.Espectrode13CRMNdeF127Ac4enCDCl3,300MHz.
A

D,E
CDCl3
C

N,NM GI K J
H L

EnelespectroFTIRdeF127Ac4(Figura3.14)secompruebasufuncionalizacin
porlacompletadesaparicindelavibracindelgrupohidroxiloa3482cm1del
precursorF127OH4.
Transmitancia(u.a.)

F127OH4 F127Ac4
3.600 3.100 2.600 2.100 1.600 1.100 600
cm1
Figura3.14.EspectrosFTIRdeF127OH4yF127Ac4,muestrapreparadaapartirdel
compuestonetofundidosobrepastilladeNaCl.

71

Captulo3Captulokk

En cuanto al anlogo acrilado de segunda generacin, F127Ac8 [13] (Figura

3.15), en el espectro de 1HNMR se observa la aparicin de las seales
correspondientesalosgruposacrilato(protonestipoP,QyQ)entre6.35y5.85
ppm. Entre 4.30 y 4.23 se encuentran las seales de los grupos CH2 de los
sistemasdebisMPAexternos(tipoL)comounsinglete,lassealesdelosgrupos
CH2 de los grupos de bisMPA internos (tipo I), como otro singlete y los
protones tipo G como un triplete. Los protones tipo N de los metilos de la
estructura de bisMPA externa y tipo J de los metilos internos, aparecen como
singletesa1.27y1.23ppmrespectivamente.

CDCl3
D,E
C
L,I,G
B N,J
H2O
QPQ F
201.0
30.6

68.0

12.7
8.3
8.8
8.4

5.9

6.3

1
Figura3.15.Espectrode HRMNdeF127Ac8enCDCl3,300MHz.

Los espectros HSQC y HMBC (Figura I.1 y I.2 del Anexo I) muestran las
correlaciones protncarbono a uno y dos tres enlaces respectivamente, que
estndeacuerdoconlaestructuradelamolculaestudiada.

En FTIR, confirmando a la completa transformacin de grupos hidroxilo en

gruposacrilato,seobservenF127Ac8ladesaparicindelasealdelabanda

72

Captulo3

de vibracin correspondiente a los grupos hidroxilo de F127OH8 a 3457 cm1

(Figura3.16).

Transmitancia(u.a.)
F127OH8 F127Ac8

3.600 3.100 2.600 2.100 1.600 1.100 600

cm1
Figura3.16.EspectroFTIRdeF127OH8yF127Ac4,muestrapreparadaapartirdel
compuestonetofundidosobrepastilladeNaCl.

Comonormageneral,losproductoscongruposacrilatoensuestructuraqumica
fueronalmacenadosa4C,avacoyenoscuridadparaevitarsupolimerizacin.

d) Caracterizacin por Cromatografa de Permeacin en Gel (GPC) y

Espectrometrademasas(MALDIMS).

Las tcnicas de GPC y MALDIMS proporcionaron informacin adicional para la

caracterizacindelosdiferentescompuestos.

Mediante GPC, se determinaron los pesos moleculares promedio en nmero

(Mn), promedio en peso (Mw) y el ndice de polidispersidad (PDI), utilizando
patronesdepoliestirenoparaelcalibrado.

Para la realizacin de los cromatogramas de Pluronic F127 y sus derivados se

hanutilizadodostiposdecolumnascromatogrficas,StyrageHR1THFWatersy
PLgel5mMIXEDCdeAgilentTechnologies,nicascolumnasdisponibles.

73

Captulo3Captulokk

Los cromatogramas obtenidos (Figura I.3 del Anexo I) presentaron dos

distribucionesdepesosmolecularesmsomenosseparadasenfuncindeltipo
decolumnautilizadaydeltipodematerialensayado.

EnlaFigura3.17,amododeejemplo,semuestraelcromatogramadePluronic
F127comercialutilizado,quepresentadosdistribucionesdepesosmoleculares
conlacolumnaStyrageHR1THFWaters.

1500

1000
LSU

500

0
10 12 14 16 18 20
Tiempo(minutos)
Figura3.17.CromatogramadeGPCdePluronicF127utilizandocolumnasStyrageHR1
THFWaters.

Sinembargo,elusodecolumnasPLgel5mMIXEDCdeAgilentTechnologiesno
permite una separacin adecuada de las dos distribuciones de pesos
moleculares,aunquesmuestralapresenciadediferentespesosmoleculares,tal
ycomoseobservaenlaFigura3.18paraelderivadoF127Ac8.

25
20
15
10
LSU

5
0
10 12 14 16 18 20
Tiempo(minutos)
Figura3.18.CromatogramadeGPCdeF127Ac8utilizandocolumnasPLgel5mMIXED
CdeAgilentTechnologies.

74

Captulo3

En la Tabla 3.1 se recogen los resultados de Mn y PDI obtenidos por GPC,

proporcionndose dos valores de Mn cuando los cromatogramas mostraban
distribuciones de peso molecular ms separadas, y un solo valor para las
distribuciones de peso molecular peor separadas. Tambin se incluyen los
valores del peso molecular terico, calculados como la suma de los pesos
moleculares de los bloques individuales que forman cada uno de los derivados
analizados(Pmcalculado).

Tabla3.1.Pesomolecularpromedioennmero,ndicedepolidispersidadypeso
molecularcalculadoparalosderivadosdePluronicF127.

Mna PDIb Pmcalculadoc

PLURONICF127d 16748 1.03 12600
6438 1.1
e
F127Ac2 7713 1.09 12708
e
F127Bn2 7587 1.09 13008
d
F127OH4 18166 1.1 12842
F127Ac4e 7798 1.09 13048
F127Bn4e 6903 1.13 13649
F127OH8d 21910 1.01 13297
9218 1.02
F127Ac8e 8731 1.09 13729

a
Mn:Pesomolecularpromedioennmeroeng/molobtenidoporGPC
b
PDI:ndicedepolidispersidad(Mw/Mn)obtenidoporGPC
c
Pmcalculado:Pesomolecularcalculadoeng/molcomolasumadelos
pesosmolecularesdelosbloquesindividuales
d
ColumnaStyrageHR1THFWaters
e
ColumnaPLgel5mMIXEDCdeAgilentTechnologies

SicomparamoslosvaloresdeMnobtenidosporGPC,independientementedela
columna utilizada, con el Pm calculado, se obtiene una clara desviacin entre
ellos,tantoparaPluronicF127comoparatodossusderivados,talycomoseha
observado para otros copolmeros bloque dendrticolineales descritos en la

75

Captulo3Captulokk

bibliografa.112c,113ElpesomoleculardeterminadoporGPCesunpesomolecular
aparente, debido a las diferencias de volumen hidrodinmico existentes entre
Pluronic F127 y sus derivados, y los de estndares de poliestireno utilizados
paralacalibracin.

Aunque mediante GPC no se obtuvo informacin concluyente en cuanto a la

variacin de peso molecular, todos los cromatogramas de los derivados de
PluronicF127analizadosporGPCconfirmaronlapresenciade2distribuciones
de peso molecular (mejor o peor separadas) que corresponden al polmero
completamente funcionalizado, descartndose la presencia de molculas o
fragmentos de molculas no unidas al ncleo central polimrico o polmero
parcialmentefuncionalizado.

Mediante MALDIMS se observ, al igual que con GPC, la presencia de dos

distribucionesdepesosmolecularesparaPluronicF127ysusderivados(Figura
3.19). Las dos distribuciones de pesos moleculares observadas para todos los
compuestosaumentansumasaoladisminuyenenfuncindeltipodereaccin
llevada a cabo en el derivado. Con el crecimiento de generacin se produce el
desplazamientodelosmximosamayorrelacinm/z(masa/carga).

113
MartnRapn,R.;Marcos,M.;Omenat,A.;Serrano,J.L.;Luckhurst,G.R.;Mainal,A.,
ChemistryofMaterials2004,16(24),49694979.

76

Captulo3

100 4993.6 PluronicF127

Intensidad(%)
50 13041

0
2000 7000 12000 17000
m/z
100 5050.2 F127Bn2
Intensidad(%)

13297.2
50

0
2000 7000 12000 17000
m/z
100
Intensidad(%)

5213.9 F127OH4

50 13708.1

0
2000 7000 12000 17000
m/z
100 F127Bn4
Intensidad(%)

5615.9
13844.4
50

0
2000 7000 12000 17000
m/z
100
Intensidad(%)

5286.1 F127OH8

50 13693.8

0
2000 7000 12000 17000
m/z
Figura3.19.MALDIMSdelPluronicF127utilizadoysusderivadosdendrticos.

EnlaFigura3.20sepuedeobservareldesplazamientodeladistribucindepesos
amayoresrelacionesmasa/cargatraslafuncionalizacindePluronicF127(en
rojo) con dendrones derivados de bisMPA de segunda generacin terminados
en grupos acrilato, compuesto F127Ac8 (en morado). La introduccin de los
extremos dendrticos supone un aumento de peso molecular con respecto a

77

Captulo3Captulokk

Pluronic F127 de 1129 g/mol, calculado como la suma de los fragmentos

acoplados al ncleo central polimrico. Mediante MALDIMS se obtiene un
aumentodepesomolecularde1135.6g/mol,queconcuerdaconelvalorterico
calculado.

100
PluronicF127
90
80 F127Ac8
70
Intensidad(%)

60
50
40
30
20
10
0
2000 7000 12000 17000
m/z
Figura3.20.ComparacindelosespectrosdeMALDIMSdePluronicF127yF127Ac8.

3.2.DETERMINACINDELASPROPIEDADESSOLGEL

En el campo de investigacin de geles supramoleculares se han descrito

bsicamentedosmetodologasparalaLCST(LowCriticalSolutionTemperatura):
elmtododeinversindelvialylacalorimetradiferencialdebarrido(DSC).

Con este fin, y utilizando ambos mtodos, se han preparado y caracterizado

disoluciones(enPBS10mMypH7.4)decadaunodelosderivadosdePluronic
F127sintetizados,aconcentracionesdel16.5%,18%,20%,23%y25%(w/v).

78

Captulo3

3.2.1.Estudiodegelificacinmedianteelmtododeinversindelvial

El mtodo de inversin del vial consiste en determinar la temperatura de

gelificacin(LCST)alacualnoexisteflujodelgelalrealizarlainversindelvial
quelocontiene(Figura3.21).

SOL T GEL

Figura3.21.Procesoreversibledegelificacinobservadoporelmtododeinversindel
vialyproducidoporelaumentodelatemperatura.

Una vez alcanzado el estado gel, continuando el calentamiento se consigue

determinarlatemperaturadelatransicingelsol.

EnlaTabla3.2semuestranlastemperaturasdetransicindefasesolgelygel
sol obtenidas para los materiales estudiados. Con la determinacin de las dos
temperaturas queda reflejado el intervalo de existencia del estado gel.
Experimentalmente, ambas temperaturas se establecieron siguiendo el
protocolodescritoenelapartado6.2.a,delaParteExperimental.

79

Captulo3Captulokk

Tabla3.2.Temperaturasdetransicindefasesdelosdiferenteshidrogelesobtenidas
porelmtododeinversindelvial.

Concentracin LCSTamtodo Temperatura

(%w/v) inversinvial(C) transicingelsol
(C)
PluronicF127 16.5% 37 78
18% 36 76
20% 26 68
23% 21 65
25% 18 59
F127Ac2 16.5% 40 50
18% 34 57
20% 28 68
23% 25,5 89
25% 24 96
F127Bn2 16.5% NOGEL NOGEL
18% NOGEL NOGEL
20% NOGEL NOGEL
23% 38 43
25% 30 52
F127OH4 16.5% NOGEL NOGEL
18% NOGEL NOGEL
20% 31 52
23% 25 65
25% 22 68
F127Ac4 16.5% NOGEL NOGEL
18% 37 39
20% 34 44
23% 31 48
25% 28 54
F127Bn8 16.5% NOGEL NOGEL
18% NOGEL NOGEL
20% NOGEL NOGEL
23% NOGEL NOGEL
25% NOGEL NOGEL
F127OH8 16.5% NOGEL NOGEL
18% NOGEL NOGEL
20% NOGEL NOGEL
23% 31 52
25% 25 56
F127Ac8 16.5% NOGEL NOGEL
18% NOGEL NOGEL
20% NOGEL NOGEL
23% 37 42
25% 35 46
a
LCST(LowCriticalSolutionTemperature),temperaturadetransicinsolgel.

80

Captulo3

Los datos experimentales tabulados han permitido establecer los diagramas de

fase que se muestran en la Figura 3.22 y que facilitan el estudio comparativo
entrelosdistintosmateriales.

95

85
PluronicF127
75 F127Ac2
Temperatura(C)

F127Bn2
65
F127OH4
55 F127Ac4
45 F127OH8
F127Ac8
35

25

15
15 17 19 21 23 25 27
Concentracion(%w/v)
Figura3.22.Diagramadefasesdeloshidrogeles,preparadosenPBS10mMpH7.4,con
PluronicF127yconsusdiferentesderivados,aconcentracionesdel16.5%,18%,20%,
23%y25%(w/v).

3.2.2. Estudio de gelificacin mediante Calorimetra Diferencial de Barrido

(DSC)

El procedimiento de preparacin de las muestras para el estudio por DSC se

describeenelapartado6.2.b,delaParteExperimental.

ParaelestudioporDSCseaplicelprocedimientoexplicadoenelAnexoII,que
proporcionatermogramasconlaprimeraderivadadelflujodecalorconrespecto
altiempofrentealatemperatura.Elprimerpicoendotrmicoobservadoeneste
tipo de termogramas, identifica la CMT, que es la temperatura a la cual se
produce la micelizacin para una disolucin de polmero de una determinada
concentracin,mientrasqueelsegundopicocorrespondealaLCST.

81

Captulo3Captulokk

Amododeejemplo,enlaFigura3.23,semuestranlostermogramasdeDSCpara
F127Ac4 para tres de las concentraciones estudiadas. En cada uno de los
termogramassehamarcadolatemperaturademicelizacin(enmorado),laLCST
(enazul)ylaLCSTobtenidaporelmtododeinversindelvial(enverde).

ParaelderivadoF127Ac4al16.5%(Figura3.23(a))noseobservaelpicodela
gelificacinyaqueelpolmeronoescapazdeformarhidrogelestermosensibles,
loqueescoherenteconloobtenidoconelmtododeinversindelvial.

Paralasconcentracionesintermedias,18%y20%(Figura3.23(b)),lospicosde
gelificacinseobservancomounpicodebajaintensidad.

Los picos de gelificacin se detectan de forma ms clara y definida para los

hidrogelesdemayorconcentracin,23%y25%(Figura3.23(c)).

Estavariacindeintensidaddelospicosdebidosalagelificacinenfuncindela
concentracin es extensible al resto de copolmeros bloque lineal y dendrtico
linealdendrtico.

82

Captulo3

a) 4 14.5C 16.5%
3

Deriv.Flujocalor
(mW/min)
2
1
0
1
2
0 5 10 15 20 25 30 35
Temperatura(C)
b) 4 20%
3 10.6C
Deriv.Flujocalor

2
(mW/min)

1
19.7C 34.0C
0
1
2
0 5 10 15 20 25 30 35
Temperatura(C)
4 9.4C 25%
c)
3
Deriv.Flujocalor

2
(mW/min)

1
28C
0 18.0C

1
2
0 5 10 15 20 25 30 35
Temperatura(C)
Figura3.23.TermogramasdeDSCdeF127Ac4:a)al16.5%(w/v),b)al20%(w/v)yc)
25%(w/v)enPBS10mMpH7.4,correspondientesalarepresentacindeladerivada
delflujodecalorconrespectoaltiempo(mW/min)frentealatemperaturaenelciclode
calentamiento;enmorado,Tdemicelizacin(CMT),enazul,Tdegelificacin(LCST
porDSC),enverde,LCSTobtenidaporelmtododeinversindelvial.

83

Captulo3Captulokk

3.2.3.Discusindelosresultados

En la Tabla 3.3 se muestran los valores de LCST obtenidos por el mtodo de

inversin de vial (LCST inversin vial) y por DSC (LCST por DSC), as como las
temperaturasdemicelizacindelosdiferentesmaterialesacadaconcentracin.

Comosepuedecomprobar,losresultadosdeLCSTobtenidosporelmtodode
inversin del vial y los determinados por DSC, no coinciden. Por DSC las
temperaturasobtenidassonmenoresqueporelmtododeinversindelvial.Sin
embargo,latemperaturaobservadaporelmtododeinversindelvialpresenta
concordancia con la temperatura a la que se estabiliza la lnea base del
termograma,talycomosepuedeobservarenlaFigura3.23(b)y(c).

Lasignificativadiferenciadetemperaturasobservadaenfuncindelastcnicas
utilizadas podra deberse a la lenta velocidad de gelificacin observada
experimentalmenteenestosmateriales,encomparacinconelcomportamiento
que presentan los materiales del Captulo 4 de esta Memoria, para los que se
observmayorvelocidaddegelificacinymejorconcordanciadeestosdatos.

84

Captulo3

Tabla3.3.LCSTytemperaturademicelizacindediferentesmaterialesobtenidascon
diferentesmetodologas.

LCST
Concentracin LCSTpor Micelizacin
inversin
%(w/v) DSC(C) (C)
vial(C)
16.5% 40 23 13.8
18% 34 21 13.2
F127Ac2 20% 28 20 10.8
23% 25 19 10.5
25% 24 21 12.8
16.5% NOGEL NOGEL 14.2
18% NOGEL NOGEL 13.9
F127Bn2 20% NOGEL NOGEL 12.8
23% 38 20 11.4
25% 30 20 10.3
16.5% NOGEL NOGEL 11.7
18% NOGEL NOGEL 15
F127OH4 20% 31 20 11.5
23% 25 18 8.2
25% 22 19 9.1
16.5% NOGEL NOGEL 14.5
18% 37 24 13.6
F127Ac4 20% 34 20 10.8
23% 31 20 10.6
25% 28 18 9.4
16.5% NOGEL NOGEL 12.8
18% NOGEL NOGEL 12.4
F127Bn4 20% NOGEL NOGEL 10.7
23% NOGEL NOGEL 8.5
25% NOGEL NOGEL 6.3
16.5% NOGEL NOGEL 13.3
18% NOGEL NOGEL 9
F127OH8 20% NOGEL NOGEL 14.1
23% 31 19 10.3
25% 25 18 8.8
16.5% NOGEL NOGEL 13.1
18% NOGEL NOGEL 13.4
F127Ac8 20% NOGEL NOGEL 13.2
23% 37 25 15.9
25% 35 19 8.7

85

Captulo3Captulokk

Todos los derivados analizados por DSC en disolucin presentan pico de

micelizacin a las 5 concentraciones estudiadas. En general, la temperatura de
micelizacinesmenorcuantomayoreslaconcentracindepolmero.

Segn la naturaleza de los grupos funcionales introducidos en los derivados de

Pluronic se pueden producir cambios en el balance hidrfobohidrfilo de la
molcula que afectan a sus propiedades de gelificacin, llegando incluso a no
formarse el hidrogel por efecto de la temperatura.12, 27, 114 Por ejemplo, la
presencia de los grupos funcionales bencilo hidrfobos y muy voluminosos
produce un gran aumento de la concentracin de polmero necesaria para
producir la gelificacin con respecto a los precursores terminados en grupos
hidroxilo,einclusoimpideelprocesodegelificacin.As,elderivadoF127Bn4
no forma hidrogeles termosensibles a ninguna de las concentraciones
estudiadas.Tansloseobservquealcalentarlasdisolucionesaunos37Cse
producaciertaturbidezenlamuestra.Estopuedeserindicativodeagregacin,
aunque no llega a gelificar debido a la presencia de grupos funcionales tan
voluminosos e hidrfobos que impiden las interacciones hidrfobas entre
micelas.

La funcionalizacin de los grupos hidroxilo con grupos acrilato hidrfobos no

modificaprcticamentelaconcentracindepolmeronecesariaparaproducirla
gelificacin.Sinembargo,produceunadisminucindelrangodeestabilidaddel
estadogelconrespectoalosanlogosterminadosengruposhidroxilo,comose
puedeobservareneldiagramadefasesmostradoenlaFigura3.22.

114
Joo,M.K.;Park,M.H.;Choi,B.G.;Jeong,B.,JournalofMaterialsChemistry2009,19
(33),58915905.

86

Captulo3

3.3.PREPARACINDEHIDROGELESFOTOPOLIMERIZADOS

Con el fin de preparar los diferentes hidrogeles fotopolimerizados, se procedi

delaformaqueseesquematizaenlaFigura3.24yquesedetallaenelapartado
6.2.c.,delaParteExperimental.Elprocesoconsisteenlaobtencindelhidrogel
porefectodelatemperatura(transicinsol,Figura3.24(a),agel,Figura3.24(b))
ylafijacinmedianteluzdelaestructurapreformada.

Figura3.24.Procesodeformacindeloshidrogelesfotopolimerizadosa37C.a)estado
sola4C,b)estadogela37C,c)hidrogeldesmoldadotrasfotopolimerizacin.

El proceso se llev a cabo irradiando con luz ultravioleta durante 10 minutos

sobre hidrogeles fsicos del polmero fotopolimerizable, teniendo en cuenta las
concentracionesdegelificacindescritasenelapartadoanterior.As,F127Ac2
yF127Ac4sefotopolimerizaronadosconcentracionesdiferentes,18%(w/v)y
23%(w/v),yF127Ac8al23%(w/v)(hidrogelesfsicos+qumicos).Losestudios
se completaron con la fotopolimerizacin de F127Ac8 al 18% (w/v) en su
estadosol(hidrogelqumico),yaqueaesaconcentracinnoescapazdeformar
gelesporefectodelatemperatura.LosmaterialessedisolvieronenPBS10mM
(pH=7.4)conun0.1% defotoiniciadorultravioleta(UV). Comofotoiniciadorse
ha seleccionado Irgacure 2959 (I2959), debido a sus buenas propiedades de

87

Captulo3Captulokk

solubilidadenaguaybiocompatibilidadcomosehadescritoenelCaptulo1de
laMemoria.

Previamente a la seleccin del fotoiniciador I2959 activo en UV, se estudi

tambinlafotopolimerizacindelosgelesutilizandounfotoiniciadoractivoenel
rangodelaluzvisiblebasadoenEosinY.Aunqueseconsiguieronresultadosde
fotopolimerizacin anlogos a los obtenidos con el fotoiniciador ultravioleta en
cuanto a aspecto de los hidrogeles fotopolimerizados, la fluorescencia residual
debida a Eosin Y interfiri en la cuantificacin posterior de la viabilidad celular
basada en un mtodo que utiliza la fluorescencia. Por este motivo se decidi
trabajar con radiacin UV. No obstante, ante una posible aplicacin in vivo se
puede pensar en la posibilidad de trabajar conEosin Y, muy atractivodebido a
quesetratadeunsistemabiocompatiblequeademsutilizaluzvisible.45

Para diferenciar los hidrogeles sin fotopolimerizar (formados por efecto de la

temperatura)delosfotopolimerizados(formadosporefectodelatemperaturay
reticulados posteriormente de forma qumica) se ha utilizado la siguiente
nomenclatura: Las formulaciones precursoras gelificadas sin fotopolimerizar se
identifican con una H (Hidrogel), seguida de la concentracin del polmero %
(w/v)yelderivadoutilizadoparasupreparacin:H18F127Ac2,H23F127Ac2,
H18F127Ac4, H23F127Ac4, H18F127Ac8 y H23F127Ac8. Mientras que
los materiales obtenidos tras la fotopolimerizacin se identifican con una P
(Polimerizado): P/H18F127Ac2, P/H23F127Ac2, P/H18F127Ac4, P/H23
F127Ac4, P/H18F127Ac8 y P/H23F127Ac8. Los ensayos con F127Ac8 al
18%(w/v),aunquesetratadeungelqumicoobtenidoapartirdelpolmeroen
disolucin, se denominan de la misma forma con el fin de facilitar los estudios
comparativosdescritosalolargodeestecaptulo.

Los hidrogeles covalentemente reticulados (geles polimerizados) han sido

caracterizados morfolgicamente por SEM y se han realizado tambin ensayos
dehinchamientoydegradacin.

88

Captulo3

3.4.CARACTERIZACINDELAMORFOLOGIAINTERNAPORSEM

Para llevar a cabo el estudio por SEM de los hidrogeles fotopolimerizados, las
muestrassefracturarontalycomosedescribeenelapartado6.2.d.,delaParte
Experimental.

EnlasFiguras3.25,3.26y3.27serecogenlasimgenesdeSEMdelosdiferentes
materiales en las que se pueden ver las estructuras internas porosas de los
hidrogeles fotopolimerizados derivados de F127Ac2, F127Ac4 y F127Ac8,
respectivamente.

50m 50m

a)P/H18F127Ac2 b)P/H18F127Ac2

50m 30m

c)P/H23F127Ac2 d)P/H23F127Ac2
Figura3.25.ImgenesSEMdelaestructurainternadehidrogelesdeF127Ac2a
concentracionesde18%(w/v)(ayb)y23%(w/v)(cyd).

89

Captulo3Captulokk

50m 5m

a)P/H18F127Ac4 b)P/H18F127Ac4

100m 30m

c)P/H23F127Ac4 d)P/H23F127Ac4

Figura3.26.ImgenesSEMdelaestructurainternadehidrogelesdeF127Ac4a
concentracionesde18%(w/v)(ayb)y23%(w/v)(cyd).

50m 5m

a)P/H18F127Ac8 b)P/H18F127Ac8

50m 5m

c)P/H23F127Ac8 d)P/H23F127Ac8

Figura3.27.ImgenesSEMdelaestructurainternadehidrogelesdeF127Ac8a
concentracionesde18%(w/v)(ayb)y23%(w/v)(cyd).

90

Captulo3

Todosloshidrogelesestudiadospresentanunamorfologaporosairregular.Con
elfinderealizarelestudiocomparativo,enlaTabla3.4,serecogenlosintervalos
correspondientesalosvaloresmnimoymximodetamaodeporoobservados
porSEM(estudionoestadstico).

Tabla3.4.TamaodeporodeloshidrogelesdederivadosacriladosdePluronic
observadosporSEM.

HIDROGEL Tamaosdeporoa(m)
P/H18F127Ac2 225
P/H23F127Ac2 215
P/H18F127Ac4 225
P/H23F127Ac4 240
P/H18F127Ac8 16
P/H23F127Ac8 14
a
Intervaloscorrespondientesalosvaloresmnimoymximodetamao
deporoobservadosporSEM(estudionoestadstico).

En el caso de los hidrogeles fotopolimerizados P/H18F127Ac2 (Figura 3.25,

imgenesayb)seobservaunaestructuraconelevadadensidaddeporos,con
un tamao medio de poros de alrededor de 15 m, si bien los tamaos varan
entre 2 y 25 m. Para el anlogo de mayor concentracin P/H23F127Ac2
(Figura3.25,imgenescyd)lamorfologaporosaessimilar,sibienseobserva
unpredominiodeporosdemenortamaodealrededorde10m(Figura3.25,
imagen d), lo que da lugar a una estructura ligeramente ms compacta. Los
poros observados corresponden a poros huecos, que sugiere la interconexin
entrelosmismos.

LoshidrogelesP/H18F127Ac4(Figura3.26,imgenesayb)yP/H23F127Ac4
(Figura3.26,imgenescyd)poseentambinunaestructurainternaporosa,de
tamaos de poro de 225 m y de 240 m, respectivamente. En este caso el
aumento de concentracin no supone una reduccin del tamao de poro e
inclusoP/H23F127Ac4parecetenerunamayorpredominiodeporosdemayor
tamao (Comparacin de imgenes a y c en la Figura 3.26; se debe tener en

91

Captulo3Captulokk

cuenta que la escala de las dos imgenes es diferente). En las imgenes b y d

(Figura3.26)semuestranconmsdetallelosporosinterconectadosentres.

Elaumentodegruposacrilatoporcopolmerobloquereactivo,2paraF127Ac2
y4paraF127Ac4,nosuponeunadisminucindeltamaodeporoniportanto
la formacin de una estructura interna ms compacta en los hidrogeles
fotopolimerizados.SinembargolaestructuradeP/H18F127Ac8yP/H23F127
Ac8 es mucho ms compacta, menos porosa y con un mayor predominio de
porosdepequeotamao.Estascaractersticassepuedenobservarclaramente
sicomparamoslasimgenesaycdelasFiguras3.25y3.26conlasimgenesay
cdelaFigura3.27.EnlasimgenesbyddelaFigura3.27seobservaendetalle
la estructura de poros compactos donde no se aprecia claramente conexin
entre los poros. El mayor nmero de grupos acrilato por molcula proporciona
unamayorcapacidaddeentrecruzamientoenlareaccindefotopolimerizacin,
lo que se traduce en una significativa reduccin del tamao de poro en una
estructuramuchomscompactaquelaobtenidaparaP/H18F127Ac2,P/H23
F127Ac2,P/H18F127Ac4yP/H23F127Ac4.

3.5.ESTUDIODEDEGRADACINDELOSHIDROGELESFOTOPOLIMERIZADOS

Anteunaposibleaplicacindelos hidrogelesfotopolimerizadoscomoscaffolds
para IT es importante conocer el proceso de degradacin de stos, ya que es
necesariaunadegradacinprogresivadelmaterialenuntiemposuficienteque
permitaladiferenciacincelularascomolaproduccindeECMporpartedelas
clulas.

El proceso de degradacin de todos los hidrogeles fotopolimerizados, P/H18

F127Ac2, P/H23F127Ac2, P/H18F127Ac4, P/H23F127Ac4, P/H18F127
Ac8 y P/H23F127Ac8, se analiz siguiendo el protocolo de trabajo que se
describeenelapartado6.2.e.,delaParteExperimental.Estametodologaseha
establecido siguiendo un procedimiento descrito por Wen,100a en el que la
degradacinseevidenciaatravsdelhinchamientodelasmuestras.

92

Captulo3

Se define como hinchamiento al cociente entre el peso del material a un

determinado tiempo (Wt) y el peso inicial del hidrogel (W0). El grado de
hinchamiento a tiempo cero es 1, mientras que cuando el hidrogel est
completamentedegradadoelvalordelhinchamientoes0.

W
Gradodehinchamiento
W

Los hidrogeles que poseen un bajo grado de hinchamiento inicial y que

experimentan un aumento del grado de hinchamiento con el paso del tiempo,
permiten un soporte inicial de las propiedades mecnicas que se van
transfiriendoalaECMendesarrolloconelpasodeltiempo.Mayoresgradosde
hinchamientoenloshidrogelesconelpasodeltiemposonbeneficiososparala
produccindeECM.14b

En la Figura 3.28 se representa el perfil de degradacin para los hidrogeles

P/H18F127Ac2 y P/H23F127Ac2. Estos hidrogeles muestran un bajo grado
dehinchamientoinicial,ligeramentesuperiorparalaconcentracindel23%en
peso.Tras35dasdeensayoseobservacomoloshidrogelesvanaumentandoel
grado de hinchamiento debido a que los enlaces ster se van degradando,
produciendolaprdidadelaintegridadestructuralquehacequeelhidrogelsea
capazdeabsorbermsagua.Alos42das,elhinchamientoesmsnotablepara
ambos,einclusoseobservaprdidadelaformacilndricaoriginaldelmonolito
(Figura 3.28 (a) para P/H18F127Ac2, (c) para P/H23F127Ac2), siendo esta
prdidamsevidenteenelcasodelaconcentracindel18%.

Alcabode49daslaformasehaperdidocompletamente(Figura3.28(b)para
P/H18F127Ac2, (d) para P/H23F127Ac2) y tras 57 das de ensayo ambos
hidrogelessehandegradadocompletamente.

EnlaFigura3.29semuestranlosperfilesdedegradacinparaP/H18F127Ac4y
P/H23F127Ac4. Como en los anteriores materiales, inicialmente el

93

Captulo3Captulokk

hinchamientoesmuybajoparaambasconcentraciones.Apartirdelos57 das
deensayoloshidrogelescomienzanahincharsehastaalcanzarsupesomximoa
los77dasparaP/H18F127Ac4yalos84dasparaP/H23F127Ac4.Elmayor
grado de hinchamiento se alcanza antes para los hidrogeles de menor
concentracin,loquepuededeberseaunadegradacindelosenlacessterde
lasunidadesdendrticas108ligeramentemsrpida,debidoalamenordensidad
delaredentrecruzada.Apartirdeahloshidrogelescomienzanaperdermasa
hasta su completa degradacin, a los 93 das para P/H18F127Ac4 y 98 das
paraP/H23F127Ac4.

ElmayortiempodeestabilidaddeloshidrogelesP/H18F127Ac4yP/H23F127
Ac4frentealoshidrogelesP/H18F127Ac2yP/H23F127Ac2estdeacuerdo
conunmayorentrecruzamientodelaredpolimrica,posibleporelaumentode
gruposacrilatoenelderivadotetracriladofrentealdiacrilado.

P/H18F127Ac2yP/H23F127Ac2 42das49das
3,5
3 P/H18F127Ac2
2,5 P/H23F127Ac2
Hinchamiento

a b
C D
2
1,5
1
c d
0,5
A B
0
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo(das)
Figura3.28.HinchamientodeloshidrogelesP/H18F127Ac2yP/H23F127Ac2en
funcindeltiempo.

94

Captulo3

P/H18F127Ac4yP/H23F127Ac4 49das70das
3,5
3
P/H18F127Ac4
2,5
P/H23F127Ac4 a b
2
Hinchamiento

1,5
1
0,5 c d
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Tiempo(das)

Figura3.29.HinchamientodeloshidrogelesP/H18F127Ac4yP/H23F127Ac4en
funcindeltiempo.

En esta lnea, los hidrogeles P/H18F127Ac8 y P/H23F127Ac8 (Figura 3.30)

presentan un bajo grado de hinchamiento inicial sin ningn indicio de
degradacin tras ms de 200 das de ensayo. A partir de los 240 das el
hinchamientodeloshidrogelesylaprogresivaprdidadelamorfologacilndrica
comienzan a ser notables, producindose la degradacin total del hidrogel
P/H18F127Ac8en276dasydeP/H23F127Ac8en286das.

P/H18F127Ac8yP/H23F127Ac8 248das261das

3,5
3 P/H18F127Ac8
a b
Hinchamiento

2,5 P/H23F127Ac8
2
1,5
1
c d
0,5
0
0 50 100 150 200 250 300
Tiempo(das)
Figura3.30.HinchamientodeloshidrogelesP/H18F127Ac8yP/H23F127Ac8en
funcindeltiempo.

95

Captulo3Captulokk

Estos resultados tambin son coherentes con la morfologa interna observada

porSEM(apartado3.4,deestecaptulo),queresultabasermuycompactaenlos
derivadosoctacriladosporelaltogradodeentrecruzamiento.

Comoresumendeloobservado,laTabla3.5recogelostiemposdedegradacin
obtenidos para cada uno de los hidrogeles fotopolimerizados. El tiempo de
degradacinsepuedemodularconelnmerodegruposacrilatopresentesenel
copolmerobloquelinealodendrticolinealdendrticoyconlaconcentracin.

Tabla3.5.TiempodedegradacindehidrogelesfotopolimerizadosdeF127Ac2,F127
Ac4yF127Ac8.

HIDROGEL Tiempodedegradacin
(das)
P/H18F127Ac2 57
P/H23F127Ac2 57
P/H18F127Ac4 93
P/H23F127Ac4 98
P/H18F127Ac8 276
P/H23F127Ac8 286

3.6.ENSAYOSDEVIABILIDADCELULAR

Losensayosdeviabilidadbiolgicahansidorealizadosconclulashumanas,en
untrabajodecolaboracinconlaDra.MaraJosMartnezLorenzodelBancode
Sangre y Tejidos de Aragn. Para la realizacin de estos ensayos se eligieron
clulasmesenquimaleshumanas(MSC)extradasdecartlago.

Las MSC fueron estudiadas por primera vez por Friedenstein en los aos 70.115
Dos de las principales caractersticas de estas clulas, como define la Sociedad
Internacional de Terapia Celular, son su capacidad de adhesin al plstico,
adquiriendounaformacaractersticaalargada,enformadeaguja,ysucapacidad
dediferenciacinadistintostiposdeclulasquedanlugaradistintasvariedades

115
FriedensteinAJ,G.J.,KulaginaNN,ExpHematol1976,4,267274.

96

Captulo3

de tejidos, como se puede observar en la Figura 3.31.116 Esta capacidad de

diferenciacinadistintostejidosfuedeterminantealahoradeelegireltipode
clulasparalarealizacindenuestrosensayos,antelaposibilidaddeaplicacin
deloshidrogelescomoandamiajesparaIngenieradetejidos.

Figura3.31.EsquemadelasdiferentesviasdediferenciacindelasMSCahueso,
cartlago,msculo,mdula,tendonesoligamentosytejidosconectivos.116

En la Tabla 3.6 se resumen los tipos de experimentos realizados, incluyendo a

continuacin algunos comentarios relativos. La exposicin y discusin de los
resultadosseharealizadoenfuncindelgrupofuncionalterminalpresenteenla
estructuraqumicadelosmateriales:gruposacrilato(resumendeexperimentos
en color rosa en la Tabla 3.6) y grupos bencilo o hidroxilo (resumen de
experimentos en color azul en la misma tabla). Las viabilidades celulares
obtenidassehancomparadoentodosloscasosconlasupervivenciacelularen

116
(a) Senseb, L.; Krampera, M.; Schrezenmeier, H.; Bourin, P.; Giordano, R., Vox
Sanguinis2010,98(2),93107;(b)Caplan,A.I.,TheJournalofPathology2009,217(2),
318324.

97

Captulo3Captulokk

presenciadelpolmeroPluronicF127,determinadadelamismaformaquepara
loscopolmerosbloquelinealodendrticolinealdendrtico.

Tabla3.6.Tablaresumendelosensayosdeviabilidadcelularrealizados.

TIEMPO DISOL. H P/H T

COMPUESTO EXPTO. EXPTO.
(h) (%w/v) (%w/v) (%w/v) (C)
F127Ac2 24/48/72 5y10 2D 18y23 18y23 2Dy3D 37
F127Ac4 24/48/72 5y10 2D 18y23 18y23 2Dy3D 37
F127Ac8 24/48/72 5y10 2D 18y23 18y23 2Dy3D 37
PluronicF127 24/48/72 5y10 2D 18y23 2Dy3D 37
F127Bn2 24/48/72 5y10 2D 23 2Dy3D 37
F127OH4 24/48/72 5y10 2D 23 2Dy3D 37
F127Bn4 24/48/72 5y10 2D 2Dy3D 37
F127OH8 24/48/72 5y10 2D 23 2Dy3D 37

La viabilidad celular se ha evaluado a las 24, 48 y 72 horas de incubacin, y se

hanllevadoacabo2tiposdeensayos,quesehandenominadoensayos2Dy3D,
cuyarepresentacinesquemticasepuedeverenlaFigura3.32.

a) b)

Figura3.32.Esquemailustrativode:a)experimentos2D,capadeclulascubiertasporel
hidrogel,yb)experimentos3D,clulasdistribuidasenunentornotridimensionalenel
interiordelhidrogel.

98

Captulo3

Los ensayos 2D consisten en cubrir una capa de clulas con el hidrogel (Figura
3.32(a)),mientrasquelos3Dconsistenenformarelhidrogelconlasclulasen
suinterior(Figura3.32(b)).

Losensayossehanrealizadosobrelospolmerosdisueltosenmediodecultivo
DMEM (Dulbeccos Modified Eagles Medium) tanto en disolucin a
concentraciones a las cuales no se forma el hidrogel por efecto de la
temperatura, concentraciones del 5 y 10 % (w/v) (ensayos en 2D), y que se
pueden considerar ensayos con el monmero en disolucin; como con los
materiales en estado gel, a concentraciones del 18 y 23 % (w/v) (ensayos 2D y
3D). En estos casos se ha trabajado sobre hidrogeles sin fotopolimerizar y
fotopolimerizados. Las concentraciones para los ensayos en el estado gel se
eligieron teniendo en cuenta las concentraciones de gelificacin determinadas
paracadaunodeloscopolmerosbloquelinealesodendrticolinealdendrtico,
en el apartado 3.2 de este captulo. El protocolo de preparacin de las clulas,
preparacin de las disoluciones de polmero y preparacin de los ensayos de
viabilidad celular 2D y 3D, sobre hidrogeles sin fotopolimerizar y
fotopolimerizadossedescribenconmsdetalleenelapartado6.2.f.,delaParte
Experimental.

Delosmtodosdescritosenlaliteraturaparaevaluarlaviabilidadcelular,elms
adecuado para estos materiales result ser el mtodo live/dead (Invitrogen)
basado en las tinciones fluorescentes especificas de clulas vivas (verde) y
muertas(rojo).46b, 117OtrosmtodoscomoelMTT,118fuerondescartadosdebido
a dificultades experimentales. Los mtodos live/dead y MTT se describen con
detalleenelAnexoIII.

117
(a)Wu,J.;Wu,D.;Mutschler,M.A.;Chu,C.C.,AdvancedFunctionalMaterials2012,
22(18),38153823;(b)Howard,D.;Takae,S.;Wang,W.X.;Vermonden,T.;Hennink,W.
E.;Stayton,P.S.;Hoffman,A.S.;Endruweit,A.;Alexander,C.;Howdle,S.M.;Shakesheff,
K.M.,Biomacromolecules2009,10(10),28952903.
118
(a)Denizot,F.;Lang,R.,JournalofImmunologicalMethods1986,89(2),271277;(b)
Mosmann,T.,JournalofImmunologicalMethods1983,65(12),5563.

99

Captulo3Captulokk

La nomenclatura seguida para la discusin de los resultados de los ensayos

celularesutilizaeltipodeensayocelular,2D3D,alprincipiodelidentificador
del material. As, el trmino 2D/H18F127Ac4 correspondera a un ensayo
celularenunentorno2D,deunmaterialsinfotopolimerizar(hidrogelformado
sloporefectodelatemperatura),paradisolucionesdel18%(w/v)delderivado
F127Ac4disueltoenDMEM.Eltrmino2D/P/H18F127Ac4corresponderaa
un ensayo celular en entorno 2D, con un material fotopolimerizado (hidrogel
formadoporefectodelatemperaturayreticuladoqumicamenteporefectode
la luz), para disoluciones del 18 % (w/v) del derivado F127Ac4 disuelto en
DMEMquecontieneun0.1%defotoiniciadorI2959.Losensayoscelularescon
el material en disolucin utilizan la misma nomenclatura descrita con la
sustitucindelaletraHporlaletraD(Disolucin).

Losresultadosdeviabilidadcelularsemuestranenlossiguientesapartados.En
primerlugarseincluyenlosresultadosobtenidosconensayosenentorno2Dy
3DparalosderivadosacriladosF127Ac2,F127Ac4yF127Ac8,paraexponer
posteriormente los resultados correspondientes a F127Bn2, F127OH4, F127
Bn4yF127OH8.

3.6.1.ResultadosdeviabilidadcelulardederivadosacriladosF127Acn
(n=2,4,8):F127Ac2,F127Ac4yF127Ac8.

EnlasFiguras3.33y3.34serecogenlosresultadosdeviabilidadcelulardeestos
materialesenentornos2Dy3Drespectivamente.

Elanlisisdelosensayos2Dendisolucin(Figura3.33,ayb),2D/D5F127Acn
(n=2, 4, 8) y 2D/D10F127Acn (n=2, 4, 8), muestra una disminucin de la
viabilidadcelularalasconelaumentodeconcentracin,especialmentemarcada
conelaumentodegruposacrilatoreactivospormolcula.

100

Captulo3

a) 2D/D5F127Acn(n=2,4,8) b) 2D/D10F127Acn(n=2,4,8)
99.6
100.6 99.3 96.2 96.6
99.8 97.6 98.4 91.8 93.3 100
100 76.3

Viabilidadcelular(%)
Viabilidadcelular(%)
75.5 80 73.6
80 69.0
53.9 60
60
35.9
40 40
21.1 22.8
20 13.2 20
0 0 0 0 0
0 0
24horas 48horas 72horas 24horas 48horas 72horas

c) 2D/H18F127Acn(n=2,4,8) d) 2D/H23F127Acn(n=2,4,8)
94.5 94.2 91.6
100 88.2 100
77.6 79.5 78.5

Viabilidadcelular(%)
Viabilidadcelular(%)

80 80 72.1
59.6
53.9 56.3 56.0 52.9
60 60
40.8 39.9 39.9
36.7 30.0
40 40
20 9.0 20
0 0 0 0.5 0
0 0
24horas 48horas 72horas 24horas 48horas 72horas

e) 2D/P/H18F127Acn(n=2,4,8) f) 2D/P/H23F127Acn(n=2,4,8)
93.8
100 88.4 91.6 100 89.3 92.6
77.6 85.4 70.8 75.8
78.5
Viabilidadcelular(%)

Viabilidadcelular(%)

80 80 72.1 60.7
59.6 58.2
53.9 52.9
60 46.9 60
40.8
40 40

20 20
0 0 0 0 0 0
0 0
24horas 48horas 72horas 24horas 48horas 72horas

PluronicF127F127Ac2F127Ac4F127Ac8
Figura3.33.ViabilidadcelulardederivadosacriladosF127Ac2,F127Ac4yF127Ac8
enentorno2D:a)al5%(w/v)endisolucin,b)al10%(w/v)endisolucin,c)al18%
(w/v)enestadogelsinfotopolimerizar,d)al23%(w/v)enestadogelsin
fotopolimerizar,e)al18%(w/v)enestadogelfotopolimerizadoyf)al23%(w/v)en
estadogelfotopolimerizado.

Cuandolosensayos2Dserealizaronenestadogel(Figura3.33,cyd),2D/H18
F127Acn (n=2, 4, 8) y 2D/H23F127Acn (n=2, 4, 8), que supone trabajar con
concentraciones mayores de reticulante, se comprueba que disminuye
ligeramente la toxicidad con respecto al monmero libre al 10 % (w/v). Esto

101

Captulo3Captulokk

puede explicarse porque en el estado gel los grupos acrilato presentan menor
movilidad que en disolucin ya que se encuentran fijados en la estructura del
hidrogelformadoporefectodelatemperatura.Ademsseobservaquecuanto
mayor es la densidad de grupos acrilato por molcula, menores son las
viabilidades.

Finalmente,enlosensayos2Denestadogelfotopolimerizado(Figura3.33,eyf),
conexcepcindelosmaterialesoctacrilados(hidrogelesdelderivadoF127Ac8),
los hidrogeles fotopolimerizados 2D/P/H18F127Ac2 y 2D/P/H23F127Ac2 y
losderivadosdeF127Ac4,permitenviabilidadessuperioresal50%presentando
una viabilidad celular similar e incluso superior a la de los anlogos sin
fotopolimerizar.Adems,cabedestacarqueenlosensayos2D/P/H18F127Ac2,
2D/P/H23F127Ac2,2D/P/H18F127Ac4y2D/P/H23F127Ac4seobtuvieron
viabilidadescelularesmejoradasconrespectoalpolmeroPluronicF127,siendo
loshidrogelesconmayorviabilidadcelularlosdelmaterialF127Ac4.

Analizandolosensayos 3Denestadogelsinpolimerizar(Figura3.34,ayb),se
puede observar que los hidrogeles 3D/H18F127Acn (n=2, 4) y 3D/H23F127
Acn (n=2, 4) permitieron viabilidades celulares en algunos casos superiores al
50%,siendodenuevoelmaterialmenosadecuadoF127Ac8.

A diferencia de lo observado para los ensayos 2D, la fotopolimerizacin en

hidrogeles en entorno 3D (Figura 3.34, c y d) produce una disminucin de la
viabilidad celular, con biocompatibilidades inferiores a Pluronic F127.
3D/P/H18F127Ac4 y 3D/P/H23F127Ac4 presentaron una gran mortalidad
celular tras 24 horas de ensayo, si bien el valor de viabilidad se mantiene
constantetras48y72horas.

102

Captulo3

a) 3D/H18F127Acn(n=2,4,8) b) 3D/H23F127Acn(n=2,4,8)
100 91.7 83.1 100
72.0 85.4 86.0

Viabilidadcelular(%)
Viabilidadcelular(%)
80 70.0 60.5 80
50.6 53.3
60 51.6 60 41.5
29.9 40.9
40 31.2 20.5 40 29.2
21.1
16 10.0
20 20
0 0 0 0.5 0
0 0
24horas 48horas 72horas 24horas 48horas 72horas

c) 3D/P/H18F127Acn(n=2,4,8) d) 3D/P/H23F127Acn(n=2,4,8)

100 100
Viabilidadcelular(%)

Viabilidadcelular(%)
80 72.0 80
60.5
43.4 51.6
60 60 41.5
31.0 29.2 40.9
40 30.5 40 28.7 26.7
22.9 19.2
16.7
20 20 5.7
4.4 3.2 2.3
0 0 0 0 0 0
0 0
24horas 48horas 72horas 24horas 48horas 72horas

PluronicF127F127Ac2F127Ac4F127Ac8
Figura3.34.ViabilidadcelulardederivadosacriladosF127Ac2,F127Ac4yF127Ac8
enentorno3D:a)al18%(w/v)enestadogelsinfotopolimerizar,b)al23%(w/v)en
estadogelsinfotopolimerizar,c)al18%(w/v)enestadogelfotopolimerizadoyd)al23
%(w/v)enestadogelfotopolimerizado.

Deformageneral,sehanobservadomayoresvaloresdeviabilidadcelularenlos
ensayosdeloshidrogelesfotopolimerizadosenentorno2Dqueenlosensayos
3D. Las razones que pueden conducir a estos resultados son variadas y, en
particular,puededebersealamayorrestriccindeespacioymayorsuperficiede
contactodelasclulasconelhidrogelalproducirselafotopolimerizacinenun
entorno3D.

Por otra parte, como se ha indicado, los materiales que presentan una mejor
viabilidadcelularsonloshidrogelesdeF127Ac4tantoenentorno2Dcomoen
entorno 3D. Este hecho puede estar relacionado con la formacin de una
estructurainternacontamaosdeporoligeramentesuperiores,talycomoseha
observadoporSEM(Tabla3.4).

103

Captulo3Captulokk

La menor viabilidad celular mostrada por los hidrogeles fotopolimerizados de

F127Ac8sepuederelacionar,asmismo,conelpequeotamaodeporoque
presentan, tal y como se ha observado por SEM (entre 1y 6 m, Tabla 3.4). El
reducido tamao de los poros puede producir muerte celular debido a la
restriccin de espacio, principalmente en los ensayos 3D, adems de limitar el
transportede nutrientes y sustancias de desecho, efecto que ser ms notable
enlosensayos2D.

Ademsdelosresultadosdeviabilidadcelularaqucomentados,sehaanalizado
mediantemicroscopiadefluorescencialamorfologacelularencadaunodelos
ensayosrealizados.Paratodosellossehaobservadounamorfologacelularque
escaractersticaenfuncindeltipodeensayo,2Do3D.

Entodoslosensayos2D,lasclulasseencuentranadheridasalfondodelpocillo
delaplacadecultivoypresentanlamorfologatpicaalargadadelasMSC(Figura
3.35,2D/P/F127Ac4).

Encambio,enlosensayos3D,lasclulaspresentanunamorfologaredondeada
lo que sugiere una baja adherencia al hidrogel (Figura 3.36, 3D/P/F127Ac4).
Estabajaadhesinalmaterialpuedesernegativaalahoradelasupervivencia
celular,perolamorfologaredondeadaqueadquierenalnoadherirsepuedeser
positivaparaladiferenciacindelasMSCacondrocitos,quesonclulasdetipo
noadherentequepresentandichamorfologa.

104

Captulo3

2D/P/H18F127Ac4 2D/P/H18F127Ac4

2D/P/H23F127Ac4 2D/P/H23F127Ac4

Figura3.35.Imgenesdemicroscopiadefluorescenciaparaensayos2Ddehidrogeles
fotopolimerizadosdeF127Ac4al18%y23%tras24horasdeensayo,alaizquierdaen
colorverdeseobservanlasclulasvivasyaladerechaencolorrojolasclulasmuertas.

3D/P/H18F127Ac4 3D/P/H18F127Ac4

3D/P/H23F127Ac4 3D/P/H23F127Ac4

Figura3.36.Imgenesdemicroscopiadefluorescenciaparaensayos3Ddehidrogeles
fotopolimerizadosdeF127Ac4al18%y23%tras24horasdeensayo,alaizquierdaen
colorverdeseobservanlasclulasvivasyaladerechaencolorrojolasclulasmuertas.

Con el fin de disponer de una observacin tridimensional de las clulas

encapsuladas en el interior del hidrogel, la morfologa celular en los ensayos
3D/P/H23F127Ac4secaracteriztambinmediantemicroscopiaconfocal,tras
24 horas de ensayo. Para la tincin de las clulas vivas se utiliz Calcein AM y
paralosncleosdelasclulas,DAPI,queesunmarcadorfluorescenteenelazul

105

Captulo3Captulokk

queseunealassecuenciasdeADNenelncleo.Elmarcajedelasclulasenel
interiordeloshidrogelesserealizdelaformadescritaenelapartado6.2.f.,de
laParteExperimental.

EnlaFigura3.37(a)semuestraunaimagenen3Ddeunaclulaencapsuladaen
elinteriordelhidrogel.EnlaFigura3.37(b)y(c)semuestraunodelosplanosdel
hidrogel con clulas en su interior con marcaje de Calcein AM y DAPI
respectivamente. Adems, en la Figura 3.37 (d) se observa la superposicin de
losmarcajesfluorescentesconlasclulasobservadasencontrastedefases.

a)

b) c) d)

Figura3.37.Imgenesdemicroscopiadefluorescenciaconfocalparaensayos3Dde
hidrogelesfotopolimerizadosdeF127Ac4al23%tras24horasdeensayo,a)imagen
en3Ddeunaclulaencapsuladaenelinteriordelhidrogel,b)clulasvivasteidascon
CalceinAMencapsuladasenelhidrogelsituadasenunmismoplano,c)ncleoscelulares
declulasteidosconDAPIsituadasenunmismoplano,d)superposicindeimgenes
defluorescenciaenelverde,fluorescenciaenelazulsobreimagenencontrastede
fases.Laescalacorrespondea30m.

106

Captulo3

Conesteensayosehademostradoquelasclulasseencapsulanenelinteriorde
los hidrogeles tras la formacin de estos por efecto de la temperatura y la
posteriorfotopolimerizacin.

Los resultados de viabilidad celular obtenidos, en particular con hidrogeles

fotopolimerizados de F127Ac4 en entorno 3D, han permitido seleccionarlos
paraprepararcorteshistolgicos,estudioqueseestrealizandoenlaactualidad.
Este tipo de preparaciones permitir cuantificar el grado de diferenciacin
celular en el interior de los hidrogeles, mediante la tincin especfica de los
distintostiposdeprotenasconstituyentesdelaECMexcretadosporlasclulas
enelcasodeproducirsedichadiferenciacin.

3.6.2.ResultadosdeviabilidadcelulardederivadosF127Bnn(n=2,4):F127
Bn2yF127Bn4yF127OHn(n=4,8):F127OH4yF127OH8.

En las Figuras 3.38 y 3.39 se recogen los resultados de viabilidad celular en

entorno 2D y 3D, respectivamente, de estos materiales no reactivos tambin
estudiadosenestetrabajo,tantoendisolucin(D)comoenformadehidrogeles
(H).

107

Captulo3Captulokk

a) 2D/D5F127Bnn(n=2,4)
2D/D5F127OHn(n=4,8)

Viabilidadcelular(%)
99.8 100.2 99.3 98.4 95.3 93.0
96.7 99.4 90.5 97.9 93.3 93.4
100 83.3 86.4
80 65.2
60
40
20
0
24horas 48horas 72horas

b) 2D/D10F127Bnn(n=2,4)
2D/D10F127OHn(n=4,8)
Viabilidadcelular(%)

96.2 98.8 98.4 93.5

91.4 94.6 93.289.4
100 76.3 85.5
77.6 71.9
80 66.9
60 35.9
34.6
40
20
0
24horas 48horas 72horas

c) 2D/H23F127Bnn(n=2)
2D/H23F127OHn(n=4,8)
98.8
Viabilidadcelular(%)

95.8 97.795.1 90.7

100 72.1 87.6
80 67.9 59.6
50.6 52.9
60
31.4
40
20
0
24horas 48horas 72horas

PluronicF127F127Bn2F127OH4F127Bn4F127OH8
Figura3.38.ViabilidadcelulardederivadosF127Bn2,F127OH4,F127Bn4yF127
OH8,enentorno2D:a)al5%(w/v)endisolucin,b)al10%(w/v)endisolucinyc)al
23%(w/v)enestadogel.

108

Captulo3

3D/H23F127Bnn(n=2)
3D/H23F127OHn(n=4,8)
96.9 97.6 92.4 96.5
100 85.4
81.1

Viabilidacelular(%)
80 PluronicF127
60 41.5 40.9 F127Bn2
40 29.2 F127OH4
20 7.8 7.7 2.5 F127OH8
0
24horas 48horas 72horas

Figura3.39.ViabilidadcelulardederivadosF127Bn2,F127OH4,F127Bn4yF127
OH8,enentorno3Dal23%(w/v)enestadogel.

Delanlisisdelosresultadosobtenidosenensayoscelulares2Ddedisoluciones
al5%(w/v)(Figura3.38,(a)),2D/D5F127Bnn(n=2,4)y2D/D5F127OHn(n=4,
8),sededuceunaviabilidadcelulardeestoscompuestossimilaraPluronicF127
yprximasal90%tras72horasdeensayoenlamayoradeloscasos.

Alaumentarlaconcentracinal10%(w/v)(Figura3.38,(b)),con2D/D10F127
Bnn (n=2, 4) y 2D/D10F127OHn (n=4, 8) se observa una disminucin de la
viabilidad celular en todos los materiales. Sin embargo, esta disminucin es
incluso menos significativa que la observada para Pluronic F127,
mantenindoseenvaloressuperioresal65%tras72horasdeensayo.

Cuandolosensayosserealizanenentorno2Dconlosmaterialesal23%(w/v)en
estadogel(Figura3.38,(c)),2D/H23F127Bnn(n=2)y2D/H23F127OHn(n=4,
8),sibienseproduceunadisminucindelaviabilidadcelularparaF127Bn2con
respectoalosmaterialesendisolucin,loshidrogelesdelosderivadosF127OH
4yF127OH8presentanunaviabilidadcelularentornoal90%tras72horasde
ensayo.

Esta buena viabilidad de los materiales polihidroxilados se mantiene incluso en

los ensayos 3D con los materiales en estado gel al 23% (w/v) (Figura 3.39),
3D/H23F127OHn(n=4,8),superandosignificativamentealPluronicF127.

109

Captulo3Captulokk

En las Figuras 3.40 a 3.46 se muestran las morfologas celulares observadas en

losensayos2Dy3Ddelosdiferenteshidrogeles,ascomoendisolucin.

Como se puede comprobar en los ensayos de derivados F127Bn2 en entorno

2Dlasclulasposeenunamorfologaalargadayredondeadaen3D(Figuras3.40
y3.41,respectivamente).

2D/D5F127Bn2 2D/D5F127Bn2 2D/D5F127Bn2

2D/D10F127Bn2 2D/D10F127Bn2 2D/D10F127Bn2

2D/H23F127Bn2 2D/H23F127Bn2 2D/H23F127Bn2

Figura3.40.Imgenesdemicroscopiadefluorescenciaparaensayos2Ddedisoluciones
ehidrogelesdeF127Bn2tras72horasdeensayo.Primeracolumna:Imgenesen
contrastedefases;Segundacolumna:Clulasvivas;Terceracolumna:Clulasmuertas.

3D/H23F127Bn2 3D/H23F127Bn2 3D/H23F127Bn2

Figura3.41.Imgenesdemicroscopiadefluorescenciaparaensayos3Ddehidrogeles
deF127Bn2tras72horasdeensayo.Primeracolumna:Imgenesencontrastede
fases;Segundacolumna:Clulasvivas;Terceracolumna:Clulasmuertas.

110

Captulo3

La morfologa celular alargada tambin se observ en ensayos celulares en

entorno 2D para los derivados F127OH4 y F127OH8 (Figura 3.42 y 3.43,
respectivamente)atodaslasconcentracionesestudiadas.

2D/D5F127OH4 2D/D5F127OH4 2D/D5F127OH4

2D/D10F127OH4 2D/D10F127OH4 2D/D10F127OH4

2D/H23F127OH4 2D/H23F127OH4 2D/H23F127OH4

Figura3.42.Imgenesdemicroscopiadefluorescenciaparaensayos2Ddedisoluciones
ehidrogelesdeF127OH4tras72horasdeensayo.Primeracolumna:Imgenesen
contrastedefases;Segundacolumna:Clulasvivas;Terceracolumna:Clulasmuertas.

111

Captulo3Captulokk

2D/D5F127OH8 2D/D5F127OH8 2D/D5F127OH8

2D/D10F127OH8 2D/D10F127OH8 2D/D10F127OH8

2D/H23F127OH8 2D/H23F127OH8 2D/H23F127OH8

Figura3.43.Imgenesdemicroscopiadefluorescenciaparaensayos2Ddedisoluciones
ehidrogelesdeF127OH8tras72horasdeensayo.Primeracolumna:Imgenesen
contrastedefases;Segundacolumna:Clulasvivas;Terceracolumna:Clulasmuertas.

En los ensayos 3D/H23F127OH4 (Figura 3.44) tras 24 horas de ensayo se

observunpredominiodeclulasconmorfologaredondeada,loqueindicabaja
adhesindelasclulasalmaterial.

24horas 72horas

3D/H23F127OH4 3D/H23F127OH4

Figura3.44.Imgenesdecontrastedefasesparaensayos3Ddehidrogelesde
F127OH4tras24y72horasdeensayo.Enlaimagendelaizquierdasesealaconuna
flechaunaclulaconmorfologaredondeada.Enlaimagendeladerechasesealacon
unaflechaunaclulaconmorfologaalargada.

112

Captulo3

Tras 72 horas de ensayo se comprueba que la mayora de las clulas han

adquiridosucaractersticamorfologaalargadadebidoalaadhesinalaplacade
cultivo (imagen derecha, Figura 3.44). Se deduce por tanto que las clulas han
migradodesdeelhidrogelhastaelfondodelpocillo.Laelevadamigracincelular
queseproducealfondodelpocillopermitededucirquesetratadeunhidrogel
demasiadoblandoparaalojarclulasensuinterior.

En la Figura 3.45 se muestran las imgenes en contraste de fases y de

fluorescencia en el verde y el rojo, para 3D/H23F127OH4 tras 72 horas de
ensayo.

3D/H23F127OH4 3D/H23F127OH4 3D/H23F127OH4

Figura3.45.Imgenesdemicroscopiadefluorescenciaparaensayos3Ddehidrogeles
deF127OH4tras72horasdeensayo.Primeracolumna:Imgenesencontrastede
fases;Segundacolumna:Clulasvivas;Terceracolumna:Clulasmuertas.

El ensayo anlogo con el material 3D/H23F127OH8 present un

comportamientosimilarencuantoamigracincelularalfondodelpocillo.Como
se puede observar en la Figura 3.46, la migracin celular ya es visible a las 24
horasdadalaelevadacantidaddeclulasadheridasalfondodelpocillo,siendo
msnotablelapresenciadeclulasconestamorfologatras72horasdeensayo.

113

Captulo3Captulokk

24horas 72horas

3D/H23F127OH8 3D/H23F127OH8

Figura3.46.Imgenesdecontrastedefasesparaensayos3Ddehidrogelesde
F127OH8tras24y72horasdeensayo.

3.7.CARACTERIZACINMECNICADELOSHIDROGELES

Como se ha indicado al comienzo de esta Memoria, una de las posibles

aplicacionesplanificadasparaloshidrogelesfotopolimerizadosestudiadosessu
utilizacin en la preparacin de scaffolds adecuados para Ingeniera de tejidos,
en concreto para andamiajes de regeneracin decartlago articular.Por ello se
decidirealizarlacaracterizacinmecnicadelosmaterialesmedianteensayos
queseutilizanhabitualmenteenlacaracterizacindecartlago.

Enlacaracterizacinmecnicadematerialesesposibleutilizardistintostiposde
ensayos,loscualessepuedenclasificarenfuncindemltiplesparmetros.Una
posibleclasificacinvienedeterminadaporlarealizacindelosensayosaaltao
bajavelocidaddeaplicacindelacarga,clasificndosecomoensayosdinmicos
oestticosrespectivamente.

Dentrodeestostiposdeensayoslosmsutilizadosenlacaracterizacindelas
propiedadesmecnicasdelcartlagoarticularsonensayosdetipoesttico,entre
los que se incluyen los mtodos de compresin uniaxial monotnica y los
mtodosdecompresinuniaxialdecargarelajacin.Ambosmtodossepueden
realizar en compresin no confinada (NC), compresin confinada (CC) o de
indentacin dependiendo del utillaje utilizado para la aplicacin de la carga
(Figura3.47)(verAnexoIV).

114

Captulo3

Carga
Carga

Carga

No Confinado Confinado Indentacin

Figura3.47.Tiposdeensayosmecnicosdetipoestticoycompresinuniaxial.

Todos los ensayos realizados en este trabajo son del tipo NC y CC y se han
realizado en colaboracin con el Dr. Ignacio Ochoa del grupo GEMM (Group of
StructuralMechanicsandMaterialsModeling)delI3A(InstitutodeInvestigacin
enIngenieradeAragn).

Para la caracterizacin mecnica se han seleccionado los hidrogeles

polimerizados siguientes: P/H18F127Ac2, P/H23F127Ac2, P/H18F127Ac4,
P/H23F127Ac4, P/H18F127Ac8 y P/H23F127Ac8, cuya manipulacin y
anlisisdedatossedescribeenelapartado6.2.g.,delaParteExperimental.

SehadeterminadoelMdulodeYoung(ES)delosgelesP/H18F127Acn(n=2,
4y8)aconcentracionesdel18%y23%(w/v)delreticulante,paraestablecer
comparaciones entre los hidrogeles con dos, cuatro u ocho grupos acrilato
terminales.

Adicionalmente, se ha completado el estudio de las propiedades mecnicas de

P/H18F127Ac2 y de P/H23F127Ac2 (Mdulo Agregado (HA), Coeficiente de
Poisson(),permeabilidad()yensayosdefatiga)enelmarcodelProyectoFin
deCarreradeAlexisAlluevaArjol.119

119
Allueva,A.,CaracterizacinmecnicadehidrogelesdePluronicparaaplicacionesen
ingenieriadetejidos.Proyectofindecarrera,2012.

115

Captulo3Captulokk

3.7.1.Ensayosdecompresinuniaxialmonotnica

Enestetipodeensayoslacargasevaaplicandodeformalinealyuniforme.Con
estos ensayos se obtiene el Mdulo de Rigidez (Emedido), que se denomina de
diferenteformaenfuncindeltipodeensayorealizadoencondicionesNCoCC:
MdulodeYoung(ES),enensayosNCyMduloAgregado(HA)enensayosCC.

Ambosparmetrosproporcionanunamedidadeladurezadelhidrogelbajolos
efectosdeunacarga.120Elclculodeambosparmetrosapartirdelascurvasde
tensindeformacinseexplicaenelAnexoIV.

CompresinNoConfinadaMdulodeYoung(ES)

En la Figura 3.48 se muestra la grfica de tensindeformacin para

P/H23F127Ac2 as como el ajuste en la zona lineal, cuya pendiente
corresponde a ES. Todos los hidrogeles ensayados presentaron curvas tensin
deformacinconlamismaforma.

EnelgrficodelaFigura3.49semuestranlosvaloresdeESobtenidosparalos
diferentes materiales estudiados: P/H18F127Ac2, P/H23F127Ac2, P/H18
F127Ac4,P/H23F127Ac4,P/H18F127Ac8yP/H23F127Ac8.

120
Acosta,V.A.,IngenieriadeTejidosdelCartlagoArticular:Caracterizacinymodelado
delcomportamientomecnico.Tesisdoctoral2011.

116

Captulo3

a) b)

Zonalineal

Figura3.48.a)Curvatpicadetensin()vs.deformacin()obtenidaparaP/H23F127
Ac2enunensayodecompresinuniaxialmonotnicanoconfinada.Encolorrojo,la
seleccindelrangolineal.b)Seleccinyajustelinealpormnimoscuadradosparael
clculodelMdulodeYoung(ES).

P/H18F127Ac2yP/H23F127Ac2
P/H18F127Ac4yP/H23F127Ac4
P/H18F127Ac8yP/H23F127Ac8
00000
MdulodeYoungEs(MPa)

00000
00000
18%
00000
23%
00000 0.111
00000 0.099
00000 0.048 0.039 0.0420.050
00000
F127Ac2 F127Ac4 F127Ac8

Figura3.49.ValoresmediosdeMdulodeYoung(ES)paraloshidrogeles
fotopolimerizadosdeF127Ac2,F127Ac4yF127Ac8.

Comosepuedeobservar,enloshidrogelesdeF127Ac2yF127Ac4seproduce
un aumento del Mdulo de Young con el aumento de concentracin de
copolmero gelificante en el hidrogel. Para P/H23F127Ac2 el aumento de
concentracindeun5%conrespectoaP/H18F127Ac2suponeunaumentodel

117

Captulo3Captulokk

ESdehastaeldoble.ParaP/H23F127Ac4elmismoaumentodeconcentracin
supone triplicar el valor de ES. Estos hechos estn de acuerdo con la mayor
rigidezesperableparalosmaterialesdemayorconcentracindereticulante.Sin
embargo, no ocurre lo mismo para los hidrogeles de F127Ac8 que mantienen
valoresparecidosaambasconcentraciones.

Porotraparte,elaumentodelnmerodegruposacrilatopormolculaalpasar
deF127Ac2aF127Ac4yaF127Ac8nosuponeunaumentosignificativoen
cuantoalvalordelES,obtenindosevaloresmuysimilaresentornoa0.04MPay
a 0.1 MPa entre los distintos hidrogeles, con excepcin de P/H23F127Ac8
antescomentadoquemantienesuEsentornoa0.045MPa.

CompresinconfinadaMduloagregado(HA)

Este tipo de medidas slo se realizaron para P/H18F127Ac2 y

P/H23F127Ac2.EnlaFigura3.50semuestralagrficadetensindeformacin
para P/H23F127Ac2 as como el ajuste en la zona lineal cuya pendiente
corresponde a HA. Los dos hidrogeles ensayados presentaron curvas tensin
deformacinconlamismaforma.

En la Figura 3.51 se muestran los resultados de HA para los hidrogeles de

F127Ac2.Comosepuedeobservar,elaumentodeconcentracindegelificante
suponeunligeroaumentodeHAde0.1a0.15MPa,conformealoesperadopara
un aumento de rigidez de los hidrogeles debido al incremento del grado de
reticulacin.

Si comparamos los valores de HA (Figura 3.51) con los de ES (Figura 3.49) se

observaquelosvaloresdeHAsonmayoresquelosdeES,acordeconeltipode
ensayosrealizados.LosensayosconfinadosapartirdeloscualesseobtieneHA
permiten mayor resistencia del hidrogel a la tensin al estar el material en un
habitculodondesloselepermitedeformacinenunadireccin,adiferencia
deloqueocurreconlosensayosnoconfinados.

118

Captulo3

a) b)

Zonalineal

Figura3.50.a)Curvatpicadetensin()vs.deformacin()obtenidaparaP/H23F127
Ac2enunensayodecompresinuniaxialmonotnicaconfinada.Encolorrojola
seleccindelrangolineal.b)Seleccinyajustelinealpormnimoscuadradosparael
clculodelMduloAgregado(HA).

P/H18F127Ac2yP/H23F127Ac2
0,25
MduloAgregadoHA (MPa)

0,2

0,15 18%
0,1 23%
0.15
0,05 0.1

0
F127Ac2

Figura3.51.ValoresmediosdeMduloAgregado(HA)paraloshidrogeles
fotopolimerizadosdeF127Ac2.

3.7.2.Ensayosdecompresinuniaxialdecargarelajacin

Elensayorealizadoconsisteenaplicarunarampadecargarelajacinrealizando
6cargasseparadasporunarelajacinde15minutosentreellas.

Mediante este tipo de ensayos en condiciones NC y/o CC se puede calcular el

CoeficientedePoisson()ylaPermeabilidad()delmaterial.

119

Captulo3Captulokk

CompresinconfinadaynoconfinadaCoeficientedePoisson()

El coeficiente de Poisson es la relacin entre la deformacin lateral y la

deformacinaxialenunaprobetaconcargaaxial.Elclculodeapartirdelos
parmetrosESyHAserealizatalycomosedescribeenelAnexoIV.

En la Figura 3.52 se muestran los valores de de los dos hidrogeles

caracterizados.Seobservaunvalordeligeramentesuperiorparaelmaterialde
mayorconcentracin.

P/H18F127Ac2yP/H23F127Ac2
0,5

0,4
Coef.dePoisson

0,3
18%
0,2 0.42 23%
0.37
0,1

0,0
F127Ac2
Figura3.52.ValoresmediosdelCoeficientedePoisson()paraloshidrogeles
fotopolimerizadosdeF127Ac2.

CompresinConfinadaPermeabilidad()

Lapermeabilidaddeunmaterialhacereferenciaalacapacidadquetienestede
permitir el paso del lquido a travs de l, sin alterar su estructura interna. De
estemodoseconsideraqueunmaterialespermeablesidejapasarunacantidad
apreciabledefluidoenuntiempodado,eimpermeablesilacantidaddefluido
esdespreciable.121Enelcasodequeelmaterialseapermeablesepuedeafirmar
queelmaterialesporosoyademslosporosestninterconectadosentres,ya
queestehechoesnecesarioparaproducirelpasodefluidoatravsdelmaterial.

121
Pelegay,C.,CaracterizacindematerialescompuestosparasuusoenIngenieriade
Tejidos.Proyectofindecarrera2012.

120

Captulo3

Elclculodelapermeabilidad,,realizadosedetallaenelAnexoIV.

En la Figura 3.53 se muestran los resultados de obtenidos para los dos

hidrogeles ensayados, P/H18F127Ac2 y P/H23F127Ac2. Ambos materiales
son permeables, con un valor de ligeramente superior para el hidrogel de
menor concentracin, P/H18F127Ac2, lo que est de acuerdo con la mayor
permeabilidadquemuestranloshidrogelesmenosrgidos.Estosdatosestnen
concordanciaconloobservadoenlamedidadeESyHA;P/H18F127Ac2esun
hidrogel menos rgido que su anlogo de concentracin superior,
P/H23F127Ac2.

P/H18F127Ac2yP/H23F127Ac2
9.99E15
Permeabilidad(m2)

9.67E15
18%
23%

0
F127Ac2
Figura3.53.ValoresmediosdePermeabilidad()paraloshidrogelesfotopolimerizados
deF127Ac2.

3.7.3.Ensayosdefatiga

Un ensayo de fatiga permite determinar la vida til de un material sometido a

cargas fluctuantes. Habitualmente se registra el nmero de ciclos requeridos
paraproducirelfallodelmaterial.Enelcasoquenosocupa,sehaconsiderado
que se produce fallo o ruptura del material una vez que el hidrogel pierde sus
caractersticas elsticas, no recuperando el espesor inicial tras descargar la
probeta.

LosdatosprocedentesdelosensayosdefatigaserepresentanendiagramasSN.
EnelejeYserepresentalatensinsoportada(S)yenelejeXelnmerodeciclos

121

Captulo3Captulokk

(N).119 En la Figura 3.54 se muestran los resultados obtenidos para

P/H18F127Ac2 y P/H23F127Ac2. En la grfica puede observarse una
tendencia lineal para ambas concentraciones, las cuales poseen la misma
pendiente. Este comportamiento permite estimar que los hidrogeles
P/H18F127Ac2yP/H23F127Ac2secomportandelmismomodo,conlanica
diferencia de una mayor tensin soportada en el caso del hidrogel de mayor
concentracin,enconcordanciaconlamayorrigidezdelmaterial.

18%
Pluronic18%
30
23%
Pluronic23%
TensinSoportada(KPa)

25 y=5E05x+23,825
20 R=0,9531

15 y=5E05x+15,014
R=0,9718
10
5
0
0 50000 100000 150000
Ndeciclos
Figura3.54.GrficoSNparaloshidrogelesfotopolimerizadosdeF127Ac2.

A pesar de realizar todos los pasos de preparacin de las muestras en

condiciones estriles y adicionar antibitico a la disolucin de PBS, no se pudo
extenderlosensayoshastarupturadelmaterialdebidoalaaparicindehongos.
No obstante, estos resultados son prometedores ya que tras 130000 ciclos el
materialsiguesinllegararuptura.

3.7.4.Comparacinconpropiedadesmecnicasdelcartlago

Una vez determinados los parmetros mecnicos de los hidrogeles, las

propiedadesmecnicasdenuestrosmaterialessehancomparadoconlosvalores
queseestimancomonecesariosparasuaplicabilidad.Enconcreto,considerando
una posible aplicacin de los hidrogeles como soporte para regeneracin de

122

Captulo3

cartlago articular, los valores medidos para nuestros materiales se han

comparadoconvalorespromedioparacartlagohumanoyconlosdeunmodelo
animal(oveja).

En la Tabla 3.7 se muestran las propiedades mecnicas del cartlago articular.

Enlapartesuperiordelatablaseincluyenlosvalorespromedioexperimentales
tanto paraun modelo animal(oveja) como para cartlagohumano, que son los
queseutilizarnparaestablecercomparacin.

Junto a estos valores, en la parte inferior de la tabla, se recogen los valores

mximos y mnimos correspondientes a propiedades mecnicas de cartlago
humano, determinados experimentalmente, que dan idea de su gran
variabilidad.Lavariabilidaddelosdatosobservadaenlosparmetrosmecnicos
de cartlago articular humano se deben a que estos parmetros se encuentran
muyafectadospordiversosfactorescomolaedad,elsexoolaarticulacinenla
queseencuentraelcartlagoestudiado.

En la Tabla 3.8 se recogen los valores promedio experimentales de y

evaluadas para nuestros hidrogeles. Como se puede observar, nuestros
materiales muestran para estos parmetros ( y ) rdenes de magnitud
similares a los valores del modelo humano y del animal. Sin embargo, estos
hidrogelespresentanbajosvaloresdeESyHA,encomparacinconlosestudios
encartlago.

123

Captulo3Captulokk

Tabla3.7.Propiedadesmecnicasdecartlagoarticularenmodeloanimal(oveja)ydel

cartlagoarticularhumanodeterminadasexperimentalmente.119,120,121

Valorespromedioexperimentales(oveja)
ES(MPa) HA(MPa) (m2)
0.21 0.31 0.32 5.8E15
Valorespromedioexperimentales(humano)
ES(MPa) HA(MPa) (m2)
0.625 0.7 <0.4 5.5E16
Propiedadesmecnicasexperimentalesdelcartlagoarticular
humano
ES(MPa) HA(MPa) (m2)
Min. Max. Min. Max. Rango Min. Max.
0.45 0.8 0.5 0.8 <0.4 E16 E15

Tabla3.8.Propiedadesmecnicasmedidasendiferenteshidrogelesfotopolimerizados.

Valorespromedioexperimentales
ES(MPa) HA(MPa) (m2)
P/H18F127Ac2 0.048 0.1 0.37 9.9E15
P/H23F127Ac2 0.099 0.15 0.42 9.67E15
P/H18F127Ac4 0.039
P/H23F127Ac4 0.111
P/H18F127Ac8 0.042
P/H23F127Ac8 0.050

124

CAPTULO4

HIDROGELESDERIVADOSDEPLURONIC:

TIOLENOS

Captulo4

Los resultados descritos en el captulo anterior han permitido demostrar la

viabilidaddecopolmerosdendrticolinealdendrticoderivadosdePluronicpara
obtenerhidrogelestermosensiblesfotopolimerizables.

No obstante, con el fin de disponer de materiales fotorreticulables con menor

densidad de grupos acrilato, as como de incorporar algunas modificaciones
qumicas que puedan cambiar las interacciones intermoleculares y modular las
propiedades solgel, e incluso las interacciones con las clulas, se plante
trabajarconformulacionesbasadasenotrostiposdederivadosfotorreactivosde
Pluronic.

Enestenuevocaptulodelamemoriasedescribeeltrabajodesarrolladoconel
findeprepararhidrogelestermosensiblesfotopolimerizablesquepermitanuna
va alternativa de fotorreticulacin, en concreto mediante la reaccin de tioles
con alquenos, tiolenos (SH/CH2=CHCOO).66, 95 Para ello se ha optado por
mezclas binarias de compuestos con grupos acrilato y de derivados con grupos
tiol(SH)ensusposicionesterminales.

Losgrupostiol(SH)sehanincorporadoadiferentesmateriales:PluronicF127,
F127OH4 y F127OH8 mediante funcionalizacin de sus grupos hidroxilo
terminales con cisteamina (NH2CH2CH2SH), a travs de enlaces carbamato. El
grupo carbamato puede favorecer interacciones por enlaces de hidrgeno
intermoleculares, lo que puede tambin contribuir a modificar propiedades de
gelificacin,degradacinyviabilidadcelularconrespectoalasdescritasparalos
anlogosconenlacessterdescritosenelCaptulo3.

En la primera parte de este captulo, apartado 4.1, se describe la sntesis y

caracterizacindeloscompuestostioladosascomosuspropiedadesgelificantes
ydeviabilidadcelular.Enlasegundapartedelcaptulo,apartado4.2,sedescribe
la preparacin y caracterizacin de formulaciones binarias basadas en
componentestioladosyelestudiodesuspropiedadescomohidrogeles.

127

Captulo4

4.1.DERIVADOSDEPLURONICCONGRUPOSTIOLTERMINALES

4.1.1.Sntesisycaracterizacin

4.1.1.1.Derivadolineal:F127SH2

La sntesis del derivado lineal F127SH2 ha sido descrita por varios autores.122,
123
Para formar el enlace carbamato, que permite introducir la cisteamina, es
necesarioactivarpreviamentelosgruposhidroxiloterminalesdePluronicF127
con cloroformiato de pnitrofenilo, utilizando el procedimiento de sntesis
descritoenelEsquema4.1.

Esquema4.1.SntesisdeF127PN2[14].Condicionesdereaccin:i)cloroformiatodep
nitrofenilo,base,diclorometano.

En esta Memoria se ha abordado la sntesis de F127PN2 utilizando distintas

condiciones de reaccin, que se muestran en la Tabla 4.1. En primer lugar se
utilizTEAcomobase(mtodoA),siguiendoelmtododescritoporParketal.
en 2006.76e Sin embargo, no se consigui funcionalizar completamente los dos

122
(a)Tao,Y.;Han,J.;Ye,C.;Thomas,T.;Dou,H.,JournalofMaterialsChemistry2012,
22(36),1886418871;(b)Bae,K.H.;Choi,S.H.;Park,S.Y.;Lee,Y.;Park,T.G.,Langmuir
2006,22(14),63806384.
123
(a)Ryu,J.H.;Lee,Y.h.;Kong,W.H.;Kim,T.G.;Park,T.G.,JournalofControlledRelease2011,
152 (1) 236237; (b) Ryu, J. H.; Lee, Y.; Kong, W. H.; Kim, T. G.; Park, T. G.; Lee, H.,
Biomacromolecules2011,12(7),26532659;(c)Lee,Y.;Chung,H.J.;Yeo,S.;Ahn,C.H.;Lee,H.;
Messersmith,P.B.;Park,T.G.,SoftMatter2010,6(5),977983.

129

Captulo4Capitulok

gruposhidroxiloterminalesdePluronicF127,talycomosecomprobpor 1H
RMN (Tabla 4.1). Por ello se ensayaron otros tipos de base como piridina (Py)
(mtodoB)124odimetilaminopiridina(DMAP)(mtodosCyD),enlugardeTEA.
As mismo, se variaron otros parmetros de reaccin como el nmero de
equivalentes de las distintas bases y de cloroformiato de pnitrofenilo, con
respectoalacantidaddepolmero,ascomoeltiempodereaccin.EnlaTabla
4.1 se recogen, adems las condiciones de reaccin ensayadas, los porcentajes
de funcionalizacin de los grupos hidroxilo terminales de Pluronic F127 a que
handadolugar.

Tabla4.1.CondicionesdereaccinutilizadasenlaobtencindeF127PN2.

Relacinmolar Tiempode
%
Mtodo PluronicF127/cloroformiatodep reaccin
funcionalizadoa
nitrofenilo/Base (h)
A 1/8/8.8(TEA) 24 62
B 1/8/28(Py) 24 100
C 1/14/14(DMAP) 24 37
D 1/14/14(DMAP) 4 100

a
Porcentajedegruposhidroxiloterminalesfuncionalizadosdeterminadopor1HRMN.

De las dos opciones que dieron lugar a funcionalizacin completa de los

hidroxilos terminales de Pluronic F127, mtodos B y D, se eligieron las
condiciones de reaccin B ya que, a pesar de necesitar un mayor tiempo de
reaccin,eltratamientoposteriorresultomssencilloenestecaso(verapartado
6.1,delaParteExperiemental.

Loscompuestossintetizadossecaracterizaronprincipalmentepor 1HRMNyFT
IR.

124
Gillies,E.R.;Frchet,J.M.J.,JACS2002,124(47),1413714146.

130

Captulo4

EnlaFigura4.1semuestraelespectrode 1HRMNdeF127PN2.Seobservala
presenciadelassealescorrespondientesalosprotonesaromticosJyK(7.38
7.28 ppm), adems de la seal del triplete correspondiente a los protones
prximos al nuevo enlace carbonato formado, protones G (4.43 ppm). La
completafuncionalizacinseconfirmporlacorrectaintegracindelasseales
delosprotonesdelosgrupospnitrofenilo(KyJ)conrespectoalosprotonesdel
ncleodePluronicF127(AyB).

CDCl3

D,E;C,B A

K J
G F
207.5
69.2
3.6

4.0

4.3

1
Figura4.1.Espectrode HRMNdeF127PN2enCDCl3,300MHz.

ParalaobtencindelcompuestotioladoF127SH2apartirdeF127PN2sehan
descritoenlabibliografadosrutassintticasdiferentes,queserepresentanen
elEsquema4.2.Laprimeradeellas,mtodoE,consisteenelataquenuclefilo
delgrupocarbonatoconlacistaminaylaposteriorreduccindelenlacedisulfuro
a tiol utilizando ditiotreitol (DTT) que da lugara F127SH2.122 La segunda ruta,
mtodo F, supone el ataque nuclefilo al grupo carbonato de F127NF2
utilizandodirectamentecisteamina.123

131

Captulo4Capitulok

Esquema4.2.ObtencindeF127PN2[14]porlosmtodosdesntesisEyF.

En nuestro trabajo, mediante el mtodo de sntesis F se consigui obtener el

derivadoF127SH2mientrasqueconelmtodoEseproducalaroturadeparte
delosgruposcarbamatoformados,probablementedebidoaloslargostiempos
dedilisis,necesariosparaeliminarcompletamentelossubproductosoelagente
reductor. Adems, el tratamiento de la reaccin resulta mucho ms rpido y
sencillo en el mtodo F, tratndose de una simple precipitacin y lavado con
dietilterfrio.

La completa funcionalizacin de la molcula se determin por 1HRMN (Figura

4.2)yporFTIR(Figura4.3).

Mediante1HRMNsecomproblatotaldesaparicindelosprotonesaromticos
de los grupos pnitrofenilo de la molcula precursora F127PN2, as como el
desplazamiento de la seal de los protones G, prximos al enlace carbamato
formado, que aparece a 4.20 ppm. La seal a 2.79 ppm del espectro de
F127SH2 corresponde a los protones tipo J adyacentes a los grupos tiol de la
molcula.

132

Captulo4

B A

K J G

G J

1
Figura4.2.Comparativadelosespectrosde HRMNdeF127PN2(partesuperior),y
F127SH2(parteinferior),ambosrealizadosenCDCl3.

LosprotonestipoIdelamolculaF127SH2,adyacentesalenlacecarbamatose
encuentranenmascaradosporlassealesdelncleocentralpolimricopresente
a3.5ppm.Laobservacindeestosprotones,ascomolacorrectaasignacinde
carbonos,serealizmedianteHSQC(verFiguraI.4delAnexoI).

EnlaFigura4.3seobservaenFTIRlabandacorrespondientealenlaceC=Odel
grupo carbonato de F127PN2, a 1769 cm1, y la banda a 1732 cm1
correspondiente al mismo enlace del grupo carbamato y del grupo ster de
F127SH2.Sinembargonoesposibledetectarlabandadebidaalgrupotiolen
tornoa2600cm1.

133

Captulo4Capitulok

Transmitancia(u.a.)
OCOO1769cm1
OCON/COO 1732

F127PN2 F127SH2

3.600 3.100 2.600 2.100 1.600 1.100 600

cm1

Figura4.3.EspectroFTIRdeF127PN2yF127SH2,compuestosnetosfundidossobre
pastilladeNaCl.

4.1.1.2.DerivadostioladosdendrticosF127SH4yF127SH8

Para la obtencin del derivado dendrtico de primera generacin activado con

grupospnitrofeniloterminales,F127PN4,separtideF127OH4quesehizo
reaccionarconcloroformiatodepnitrofeniloypiridinacomobase(Condiciones
delmtodoBmostradasenlaTabla4.1,procedimientosintticomostradoenel
Esquema 4.3 y espectro de 1HRMN de F127PN4 en la Figura I.5 Anexo I). La
reaccin posterior con cisteamina proporcion el derivado dendrticolineal
dendrticoF127SH4concuatrogrupostiolterminales.

134

Captulo4

Esquema4.3.Rutasintticaparalaobtencindelderivadodendrticodeprimera
generacincongruposhidroxiloactivadosenformadegrupospnitrofeniloyposterior
reaccinconcisteaminaparadarF127SH4.
Condicionesdereaccin:i)cloroformiatodepnitrofenilo,piridina,diclorometano;
ii)cisteamina,diclorometano.

Aligualqueparaelcompuestolineal,lacompletafuncionalizacinsedetermin
mediante 1HRMNyFTIR.EnlaFigura4.4semuestraelespectrode 1HRMNde
F127SH4.

135

Captulo4Capitulok

D,E,F C B A

J
I,G N

200.3
12.1

67.0

8.2

6.5

1
Figura4.4.Espectrode HRMNdeF127SH4enCDCl3,500MHz.

Lassealesqueaparecenentre4.25y4.28ppmcorrespondenalosprotonesde
losCH2delasestructurasdebisMPA(protonestipoI)yalosprotonestipoG,
queentotalsuman12protones.

Lassealesanchasqueaparecena2.75y2.79 ppm,quesuman8protonesen
total,correspondenalosprotonestipoNadyacentesalosgrupostiolterminales.

Las seales de los protones M correspondientes a CH2 anexos al enlace

carbamato,aparecenenmascaradasporlassealesdelpolmeroentornoa3.5
ppm.

Para la correcta asignacin de las seales descritas se realizaron experimentos

complementariosdeRMN.EnlaFigura4.5semuestraelespectroHSQCdeeste
compuestodondeseobservanlascorrelacionesprotncarbonoaunenlace.

La seal de los protones I entre 4.25 y 4.28 ppm correlaciona con la seal de
carbonoa64.2ppm.AdemsseobservalacorrelacinentrelosprotonesG,que
aparecenjuntoconlosprotonesI,conlasealencarbonoa67.4ppm.

136

Captulo4

ProtonesM ProtonesN

f1 (ppm)
ProtonesI,I
ProtonesG

Figura4.5.EspectroHSQCdelamolculaF127SH4enCDCl3,500MHz.

Elgrupodesealesqueaparecena2.75y2.79ppmcorrespondenalosprotones
tipoNquecorrelacionanconelmismocarbonoa38.4ppm.

AdemssepuedeobservarlacorrelacinentrelosprotonestipoMa3.36ppm,
que se encuentran enmascarados por las seales del polmero, con su
correspondientecarbonoa41.8ppm.

EnlaFigura4.6serepresentaelespectrodeFTIRparaelderivadoF127SH4.Se
observaladesaparicindelasbandascorrespondientesalosgruposNO2a1527
cm1 yalgrupocarbonatoa1212cm1ya1772cm1,ascomolapresenciadela
banda de la vibracin del enlace C=O de los grupos carbamato y ster a
1733 cm1. Al igual que para el derivado lineal F127SH2, la banda
correspondientealosgrupostiolnosedetectporFTIR.

137

Captulo4Capitulok

Transmitancia%
OCOO1772cm1
OCON/COO1733cm1

F127PN4 F127SH4

3.600 3.100 2.600 2.100 1.600 1.100 600

cm1

Figura4.6.EspectroFTIRdeF127PN4yF127SH4,compuestosnetosfundidossobre
pastilladeNaCl.

Paralaobtencindelderivadodesegundageneracinactivadocon8gruposp
nitrofenilo(F127PN8),separtideF127OH8,comosemuestraenelEsquema
4.4. Las condiciones de reaccin fueron similares a las utilizadas para la
obtencindelosderivadoslinealydeprimerageneracin.

138

Captulo4

Esquema4.4.Rutasintticaparalaobtencindelderivadodendrticodesegunda
generacincongruposhidroxiloactivadosenformadegrupospnitrofeniloyposterior
reaccinconcisteaminaparadarF127SH8.
Condicionesdereaccin:i)cloroformiatodepnitrofenilo,piridina,diclorometano;
ii)cisteamina,diclorometano.

En la Figura 4.7 se muestra el espectro de 1HRMN de F127PN8. Su completa

funcionalizacin se puede confirmar por el valor de las integrales
correspondientes a los protones del ncleo polimrico y de las unidades
dendrticasintroducidas.Cabedestacarladificultaddeasignacindelasseales
delosgruposCH2delossistemasdebisMPA,yaquetantolosprotonestipoL

139

Captulo4Capitulok

como los I aparecen juntos en el espectro de 1HRMN, entre 4.35 y 4.53 ppm,
dandolugaraunmultiplete.

4.53
4.49
4.45
4.40
4.39
4.35
4.27

1.37
1.34
L,I,I G
D,E NJ A
CDCl3
C
S
S R
B

203.1
16.4

16.8

24.5

67.0

12.6
4.3

6.7

Figura4.7.EspectrodeprotndelamolculaF127PN8enCDCl3,300MHz.

En la sntesis de F127SH8 (Esquema 4.4), tras realizar el tratamiento de la

reaccinseobtuvounslidoaltamenteinsolubleendisolventesorgnicoscomo
diclorometano,cloroformooDMSO,porloquenofueposiblesucaracterizacin
por1HRMN.Posiblementelaaltadensidaddegrupostiolpormolculafavorece
la formacin de enlaces disulfuro y el entrecruzamiento del polmero,
justificandolabajasolubilidaddelproductofinal.

Todosloscompuestos obtenidosenlasntesisdelosderivadostioladosfueron
caracterizados por GPC, tcnica que confirm la presencia de dos nicas
distribuciones, conforme a lo esperado considerando el material de partida, y
correspondientes al polmero totalmente funcionalizado. En la Figura I.6 del
AnexoI,semuestranamododeejemplo,loscromatogramasobtenidosparalos
derivadoscongruposterminalespnitrofenilo.

140

Captulo4

Por otra parte, mediante MALDIMS se observaron dos distribuciones de peso

molecularquesedesplazanamayoresomenoresrelacionesm/zenfuncinde
losdistintosgruposfuncionalesterminalespresentesenlamolcula.Enelcaso
delderivadoF127SH2sloseobservladistribucindemenorpesomolecular.
LosespectrosdemasasdelosdiferentescompuestossemuestranenlaFigura
I.7delAnexoI.

Los valores de peso molecular obtenidos por dicha tcnica y los calculados a
partirdelasumadelospesosmolecularesdelosbloquesindividualesserecogen
en la Tabla 4.2. La distribucin de mayor peso molecular coincide con el peso
molecularcalculadoapartirdelasumadelosbloquesindividuales.

Tabla4.2.Valoresmximosderelacinmasa/cargaobtenidosporMALDIMSparalos
compuestoscongrupospnitrofenilotiolterminales.

DERIVADO m/za Pmcalculadob

4999.3
F127PN2 12948.02
12842.8
F127SH2 4849.7 12806.3
5340.8
F127PN4 13492.66
13561.3
5184.5
F127SH4 13244.82
13217.4
5871.7
F127PN6 14617.54
14635.1
a
Mximosm/zenelespectrodemasas.
b
Pmcalculado:Pesomoleculareng/molcalculadocomolasumadelos
pesosmolecularesdelosbloquesindividuales.

4.1.2.Determinacindelaspropiedadessolgel

Ladeterminacindelaspropiedadessolgeldeestospolmerossellevacabo
mediante el mtodo de inversin del vial y por DSC. Para ello se prepararon
muestrasdedistintasconcentracionesdeF127SH2yF127SH4(al5%,10%,
16%,18%,20%y23%(w/v)enPBS10mMpH7.4).

141

Captulo4Capitulok

LosproductosF127PN2,F127PN4yF127PN8seexcluyerondelestudiopor
suelevadainestabilidadendisolucionesacuosastalescomoelPBS.

A continuacin se exponen los resultados obtenidos aplicando cada uno de los

dosmtodos.

4.1.2.1.EstudiodeGelificacinmedianteelmtododeinversindel
vial

El protocolo de trabajo utilizado para la obtencin de las temperaturas de

transicin solgel y gelsol es el descrito en el apartado 6.2.a., de la Parte
Experimental.

EnlaFigura4.8semuestraeldiagramadefasesdelosdosderivadostiolados:
F127SH2 y F127SH4. Para ambos materiales se obtuvieron hidrogeles
termosensibles a partir de concentraciones iguales o superiores al 5% (w/v).
Comosepuedeobservar,ambospolmerosposenunintervalodetemperaturas
deexistenciadelhidrogelmuysimilar.

120

100 SOL
Temperatura(C)

80
F127SH2
60
GEL
F127SH4
40

20
SOL
0
0 5 10 15 20 25 30
Concentracin(%enpeso)
Figura4.8.Diagramadefasesdeloshidrogeles,preparadosenPBS10mMpH7.4,con:
F127SH2yF127SH4,aconcentracionesdel5%,10%,16%,18%,20%,23%y25%
(w/v).

142

Captulo4

En comparacin con los derivados de Pluronic F127 descritos en captulo

anterior, estos compuestos tiolados requieren una menor concentracin de
copolmero para la formacin de los hidrogeles por efecto de la temperatura.
Este resultado debe ser atribuido a la presencia del enlace carbamato y de los
grupostiolterminales,queconfierenalamolculalaposibilidaddeformacinde
enlaces de hidrgeno, modificando notablemente sus propiedades de
gelificacin.

Enestalneacomparativa,estoscompuestospuedenrelacionarseconanlogos
no azufrados preparados en nuestro grupo de investigacin como el que se
muestra en la Figura 4.9.125 Esta molcula es estructuralmente anloga al
derivado F127SH2 con la nica diferencia de la sustitucin de los grupos tiol
terminalesporgruposhidroxilo.

Figura4.9.EstructuraqumicadelderivadoF127NHOH2.

F127NHOH2 forma hidrogeles termosensibles a partir de concentraciones del

20% (w/v), lo que confirma la importancia de la presencia, no slo del enlace
carbamato,sinotambindelgrupotiolterminalparafavorecerlagelificaciny
portantoparadisminuirlaconcentracindecopolmeronecesaria.

125
Herrer Jimnez, I. L., Thermosensitive and photopolymerizable hydrogels based on
PluronicF127.TrabajoFindeMaster,2013.

143

Captulo4Capitulok

4.1.2.2.EstudiodegelificacinmedianteCalorimetraDiferencialde
Barrido(DSC)

Elprotocoloseguidoenlaobtencindelostermogramashasidoeldescritoenel
apartado 6.2.b., de la Parte Experimental. Los termogramas para tres de las
disolucionesensayadas,concentracionesal5%,16%y25%(w/v),deF127SH2
yF127SH4semuestranenlasFiguras4.10y4.11,respectivamente.

En todos los termogramas realizados se observa el pico correspondiente al

procesodemicelizacin(sealadoenlasgrficasencolormorado).Sinembargo,
el pico correspondiente al proceso de gelificacin se detecta a partir de
concentracionesigualesosuperioresal10%(w/v).Enestosgrficosseindicaen
color azul la LCST determinada en el pico de gelificacin y, en verde, la LCST
obtenidaporelmtododeinversindelvial.

144

Captulo4

a) 1,5 5%
1

Deriv.Flujocalor
19.5C

(mW/min)
0,5

0 29C

0,5

1
0 10 20 30 40
Temperatura(C)

16%
b) 1,5 12.7C

1
Deriv.Flujocalor
(mW/min)

0,5

0 21.7C
20C
0,5

1
0 10 20 30 40
Temperatura(C)
c) 2 25%
7.7C
1,5
Deriv.Flujocalor

1
(mW/min)

0,5
0 17.1C
15C
0,5
1
0 10 20 30 40
Temperatura(C)

Figura4.10.TermogramasdeDSCdeF127SH2:a)al5%(w/v),b)al20%(w/v)yc)25
%(w/v)enPBS10mMpH7.4,correspondientealarepresentacindederivadadelflujo
decalorconrespectoaltiempo(mW/min)frentealatemperaturaenelciclode
calentamiento;enmorado,Tdemicelizacin(CMT),enazul,Tdegelificacin(LCST
porDSC),enverde,LCSTobtenidaporelmtododeinversindelvial.

145

Captulo4Capitulok

a) 1,5
5%
1

Deriv.Flujocalor
19.1C

(mw/min)
0,5

0,5

1
0 10 20 30
Temperatura(C)
b) 1,5 16%
14.0C
1
Deriv.Flujocalor
(mW/min)

0,5

0 22.0C
20C
0,5

1
0 10 20 30
Temperatura(C)
c) 1,5 25%
8.8C
1
Deriv.Flujocalor
(mW/min)

0,5

0 18.9C
16C
0,5

1
0 10 20 30
Temperatura(C)

Figura4.11.TermogramasdeDSCdeF127SH4:a)al5%(w/v),b)al20%(w/v)yc)25
%(w/v)enPBS10mMpH7.4,correspondientealarepresentacindederivadadelflujo
decalorconrespectoaltiempo(mW/min)frentealatemperaturaenelciclode
calentamiento;enmorado,Tdemicelizacin(CMT),enazul,Tdegelificacin(LCST
porDSC),enverde,LCSTobtenidaporelmtododeinversindelvial.

146

Captulo4

4.1.2.3.Discusindelosresultados

EnlaTabla4.3seresumenycomparanlasLCSTobtenidasporambosmtodos
paralosdiferentesmaterialesestudiados.

Tabla4.3.LCSTytemperaturademicelizacindediferentesmaterialesobtenidascon
diferentesmetodologas.

LCSTa
Concentracin LCSTpor Micelizacin
inversin
(%w/v) DSC(C) (C)
vial(C)
5% 29 19.5
10% 22 23.8 16.4
16% 20 21.7 12.7
F127SH2 18% 19 21.6 12.3
20% 17 21.6 11.8
23% 16 19.5 10.0
25% 15 17.1 7.7
5% 36 19.1
10% 24 23.3 16.5
16% 20 22 14.0
F127SH4 18% 19 21.7 12.5
20% 18 20 10.2
23% 17 20 9.9
25% 16 18.9 8.8
a
LCST(LowCriticalSolutionTemperature)

Comosepuedeobservar,lasLCSTobtenidasporelmtododeinversindelvial
concuerdanbastantebienconlasLCSTobtenidasporDSC.Estecomportamiento
es diferente al descrito para los hidrogeles de los materiales estudiados en el
Captulo 3 de esta Memoria, donde las LCST obtenidas por el mtodo de
inversindelvialconcordabanmejorconlatemperaturaalacualseestabilizala
lnea base. Esta diferencia de comportamiento entre los materiales acrilados y
tioladospuedeserdebidaaqueparalosmaterialestioladossehaobservadouna
mayor velocidad de gelificacin con una mayor concordancia de las LCST
obtenidasporambosmtodosexperimentales.

147

Captulo4Capitulok

4.1.3.Ensayosdeviabilidadcelular

LosensayosdeviabilidadcelularsehanllevadoacaboconclulasMSChumanas
utilizandoelprotocolodepreparacindeclulas,preparacindelasdisoluciones
depolmeroypreparacindelosensayosdeviabilidadcelularensistemas2Dy
3Ddescritosenelapartado6.2.f.,delaParteExperimental.Laviabilidadcelular
sedeterminporelmtodolive/dead(AnexoIII).

Estos estudios se realizaron sobre concentraciones de F127SH2 y F127SH4

seleccionadasteniendoencuentasusdiagramasdegelificacin.Elestudioseha
limitadoaconcentracionesde5y10%(w/v)paralosensayos2D,yde5y10%
(w/v)paralosensayos3D.Paradeterminarlatoxicidaddeestoscompuestosen
disolucintambinseestudiarondisolucionesdelosmaterialesaconcentracin
2.5%(w/v)enensayos2D.

En las Figuras 4.12 y 4.13 se muestran los resultados de viabilidad celular en

ensayos 2D y 3D respectivamente, para el derivado lineal F127SH2 y para el
derivadodendrticoF127SH4.

Enensayos2D(Figura4.12),loshidrogelesdeambosmaterialespresentanuna
elevadaviabilidadcelulartantoendisolucincomoenestadogel.Losvaloresde
este parmetro tras 72 horas de ensayo son superiores o prximos al 90% en
todosloscasos.Elaumentodeconcentracinsuponeunaligeradisminucinde
laviabilidad.

Tambin se observ la elevada viabilidad celular en los ensayos 3D, como se

muestraenlaFigura4.13,convaloressuperioresal90%tras72horasdeensayo.

148

Captulo4

a) 2D/D2.5F127SHn(=2,4)

Viabilidadcelular(%)
99.8 100.1 99.2 97.1 99.6 98.9
100
80
60
40
20
0
24horas 48horas 72horas

b) 2D/H5F127SHn(n=2,4)

99.8 99.4 98.0 98.6 98.5 94.3

Viabilidadcelular(%)

100
80
60
40
20
0
24horas 48horas 72horas

c) 2D/H10F127SHn(n=2,4)
97.9 99.1 97.8 95.9 97.8
100 87.9
Viabilidadcelular(%)

80
60
40
20
0
24horas 48horas 72horas
F127SH2F127SH4
Figura4.12.ViabilidadcelulardederivadostioladosF127SH2yF127SH4,enentorno
2D:a)al2.5%(w/v)endisolucin,b)al5%(w/v)enestadogelyc)al10%(w/v)en
estadogel.

149

Captulo4Capitulok

a) 3D/H5F127SHn(n=2,4)
99.6 96.2 99.8 96.0 97.3
94.6
Viabilidadcelular(%)
100
80
60
40
20
0
24horas 48horas 72horas

b) 3D/H10F127SHn(n=2,4)
99.3 91.5 94.6 89.2 94.7 91.7
100
Viabilidadcelular(%)

80
60
40
20
0
24horas 48horas 72horas
F127SH2F127SH4
Figura4.13.ViabilidadcelulardelosderivadostioladosF127SH2yF127SH4,en
entorno3Denestadogel:a)al5%(w/v)yb)10%(w/v).

A diferencia de lo descrito en los ensayos celulares para algunos de los

materialescomentadosenelCaptulo3,elcambiodeentorno2Da3Dnoafecta
alasupervivenciacelularenestosmaterialescongrupostiol.

Las Figuras 4.14 y 4.15 recogen imgenes de microscopia de fluorescencia que

muestranlamorfologaalargadadelasclulasenlosensayos2D,utilizandolos
compuestosdeF127SH2yF127SH4,tras72horasdeensayo.Lasclulasvivas
aparecenencolorverde,teidasconCalceinAM,ylasclulasmuertasencolor
rojo,teidasconEthidiumhomodimer.

En los ensayos 3D de los hidrogeles de F127SH2 predomina, para ambas

concentraciones,lamorfologacelularredondeada(Figura4.16),loquesugiere
unabajaadhesindelasclulasalmaterial.Noobstante,tambinseobservan
algunas clulas con morfologa alargada en 3D/H5F127SH2. Esta morfologa
celularenlosensayosdelhidrogeldemenorconcentracinsugierequesetrata

150

Captulo4

de un material ms blando que el anlogo de mayor concentracin, lo que

permitelamigracindelasclulasalfondodelpocillo.

2D/D2.5F127SH2 2D/D2.5F127SH2 2D/D2.5F127SH2

2D/H5F127SH2 2D/H5F127SH2 2D/H5F127SH2

2D/H10F127SH2 2D/H10F127SH2 2D/H10F127SH2

Figura4.14.Imgenesdemicroscopiadefluorescenciaparaensayos2Ddedisoluciones
ehidrogelesdeF127SH2tras72horasdeensayo.Primeracolumna:Imgenesen
contrastedefases;Segundacolumna:Clulasvivas;Terceracolumna:Clulasmuertas.

151

Captulo4Capitulok

2D/D2.5F127SH4 2D/D2.5F127SH4 2D/D2.5F127SH4

2D/H5F127SH4 2D/H5F127SH4 2D/H5F127SH4

2D/H10F127SH4 2D/H10F127SH4 2D/H10F127SH4

Figura4.15.Imgenesdemicroscopiadefluorescenciaparaensayos2Ddedisoluciones
ehidrogelesdeF127SH4tras72horasdeensayo.Primeracolumna:Imgenesen
contrastedefases;Segundacolumna:Clulasvivas;Terceracolumna:Clulasmuertas.

3D/H5F127SH2 3D/H5F127SH2 3D/H5F127SH2

3D/H10F127SH2 3D/H10F127SH2 3D/H10F127SH2

Figura4.16.Imgenesdemicroscopiadefluorescenciaparaensayos3Ddehidrogeles
deF127SH2tras72horasdeensayo.Primeracolumna:Imgenesencontrastede
fases;Segundacolumna:Clulasvivas;Terceracolumna:Clulasmuertas.

En cuanto al hidrogel 3D/H5F127SH4, se observ un elevado nmero de

clulasconmorfologaalargada,silocomparamosconelhidrogel3D/H10F127

152

Captulo4

SH4(imgenesencontrastedefases,Figura4.17).Enelestudiodelasimgenes
decontrastedefasesparaelensayo3Daconcentracindel5%(w/v)a24,48y
72horas(Figura4.18)sepuedecomprobarqueelnmerodeclulasalargadas
adheridasalfondodelpocilloaumentaconelpasodeltiempo,loqueseatribuye
denuevoalamigracindelasclulasatravsdeunhidrogelmsblando.

3D/H5F127SH4 3D/H5F127SH4 3D/H5F127SH4

3D/H10F127SH4 3D/H10F127SH4 3D/H10F127SH4

Figura4.17.Imgenesdemicroscopiadefluorescenciaparaensayos3Ddehidrogeles
deF127SH4tras72horasdeensayo.Primeracolumna:Imgenesencontrastede
fases;Segundacolumna:Clulasvivas;Terceracolumna:Clulasmuertas.

24horas 48horas 72horas

3D/H5F127SH4 3D/H5F127SH4 3D/H5F127SH4

Figura4.18.Imgenesencontrastedefasesparaensayos3Ddehidrogelesal5%(w/v)
deF127SH4tras24,48y72horasdeensayo.

Losbuenosresultadosdeviabilidadcelularobtenidosparahidrogelesbasadosen
las molculas gelificantes F127SH2 y F127SH4, permitirn en un futuro la
utilizacin de estos hidrogeles como soportes para el cultivo de clulas
endotelialesenentorno2D.DichoestudioserealizarencolaboracinconelDr.
ngelLuisGarcaOtn,delGrupodeInvestigacindeProgenitoresAdultosdel

153

Captulo4Capitulok

SistemaCardiovascular(GIPASC),pertenecientealInstitutoAragonsdeCiencias
delaSalud(IACS).

4.2. FORMULACIONES DE DERIVADOS F127SHn Y RETICULANTES CON

GRUPOSACRILATO

Comoyasehaindicado,elobjetivoprincipaldetrabajarconderivadosdetipo
tiol ha sido el de disponer de hidrogeles termosensibles reticulables con una
menor densidad de grupos acrilato, pero capaces de polimerizar mediante una
reaccindetipotiolenoentregrupostiolygruposacrilato.

Considerando los resultados descritos en el apartado anterior, estos nuevos

compuestos F127SHn (n= 2, 4) que combinan el grupo carbamato y el grupo
tiol,gelificanaunamenorconcentracinypermitenbuenasviabilidades.As,la
menor concentracin de polmero necesaria para producir la gelificacin y la
reduccindeconcentracindegruposacrilatopermitenpensarparasusmezclas
enunamejoradelaviabilidadcelular,conrespectoalosderivadosdelCaptulo
3.

Este apartado se ha dividido en dos subapartados en funcin de los distintos

tiposdemonmeroacrilatoutilizado.Enelprimerodeellos,4.2.1.,sedescriben
loshidrogelesbasadosenlasmezclasdeloscompuestosF127SHn(n=2,4)con
los derivados F127Acn (n= 2, 4, 8) del Captulo 3 de esta Memoria. En el
segundo subapartado, 4.2.2., se recogen los resultados obtenidos sobre
formulaciones basadas en F127SHn (n= 2, 4) y otros agentes reticulantes de
tipoacrilato,conestructurasmssencillasynotermosensibles.

4.2.1.MaterialesbasadosenmezclasdeF127SHn(n=2,4)conF127Acn(n=
2,4,8)

Conforme al objetivo fundamental de nuestro trabajo con estos nuevos

materiales, la investigacin se ha centrado esencialmente en la preparacin de

154

Captulo4

las formulaciones y sus hidrogeles, el estudio de las condiciones de

polimerizacin y en la evaluacin de las propiedades de los nuevos hidrogeles
reticulados.

4.2.1.1 Preparacin de los hidrogeles precursores y estudio de su

reticulacin.

Eldesarrollodeestapartedeltrabajoprecisanalizardiferentesaspectos:

a)Laseleccindelaproporcindeloscomponentes.
b)Lametodologadepreparacindelasmezclas.
c)Establecerlascondicionesmsadecuadasdereticulacinqumica.

EnlaTabla4.4seresumenlosdiferentesensayosllevadosacaboconelfinde
seleccionar las condiciones de trabajo ms adecuadas respecto a los tres
aspectosmencionados.EsteestudioselimitamezclasdeF127Ac2conF127
SH2. Adems, con el fin de conocer el comportamiento de los polmeros de
forma individual en determinadas condiciones de trabajo, en casos indicados,
tambinsetrabajconhidrogelesmonocomponente.

Para identificar los diferentes hidrogeles con los que se ha trabajado, se ha

utilizadounanomenclaturaqueseexplicaconlaidentificacinparaelmaterial
H10(1:1)F127Ac2/F127SH2.ConH10(1:1)sehacereferenciaaunhidrogel,su
concentracin y su proporcin en moles entre los distintos componentes de la
mezcla,enestecasoconcentracindel10%(w/v)entotal,conunaproporcin
molar entre los componentes 1:1. A continuacin se indican los dos
componentes que forman la mezcla separados por una barra F127Ac2/F127
SH2. Para identificar a los hidrogeles anlogos fotopolimerizados se antepone
letraPalnombredelhidrogelprecursor,P/H10(1:1)F127Ac2/F127SH2.

En los prrafos siguientes se comentan algunos aspectos relativos al desarrollo

deestosestudios.

155




156

Captulo4kjdflkjdaslkfjasldkjfdslkjflkjkjsdlkjflfkjdlkjjlsdkjflksdjflkjfjlkj
Tabla4.4.Resumendelosensayosrealizadosparalaseleccindelascondicionesdetrabajo.

%(w/v)
Componente Componente Relacinmolar % Mezclado Reticulacin
N Material I2959 Resultado*** N
C1 C2 C1:C2 w/v
M1* M2* 0.1 0.5 PSL** PL**
1 + + negativo 1
2 + + negativo 2
3 + + + negativo 3
F127Ac2 F127SH2 1:1 10 H10(1:1)F127Ac2/F127SH2
4 + + + negativo 4
5 + + + negativo 5
6 + + + positivo 6
7 + + negativo 7
8 + + negativo 8
9 + + + negativo 9
F127Ac2 F127SH2 1:1.2 10 H10(1:1.2)F127Ac2/F127SH2
10 + + + negativo 10
11 + + + negativo 11
12 + + + positivo 12
13 + negativo 13
14 F127Ac2 5 D5F127Ac2 + + negativo 14
15 + + positivo 15
16 + negativo 16
17 F127SH2 5 H5F127SH2 + + negativo 17
18 + + negativo 18
Condicionesdetrabajo
1:1 10 M2 0.5 PL
seleccionadas

*M1:Preparacindelasdisolucionesdeloscomponentesporseparadoyposteriormezclado,M2:preparacinconjuntadeladisolucindelosdos
componentes**PSL.Polimerizacinsinluz,PL:polimerizacinconluz.***Ensayopositivo:Noreversindelhidrogelalestadosoltrasmantenerloa
4Cdurante10minutos.

Captulo4

a)Seleccindelaproporcindeloscomponentes:

Eltrabajodesarrolladosehacentradoendiferentescomposiciones,atendiendo
a la relacin molar de los componentes y la relacin estequiomtrica de los
gruposreactivos(CH2=CHCOO/SH).

b)Metodologadepreparacindelasmezclas:

Una de las caractersticas de nuestros materiales y de sus propiedades es la

formacin de micelas. Dado que los ensayos se realizan en condiciones que
superan la CMC, trabajar con mezclas de diferentes compuestos derivados del
Pluronic supone que el mtodo de mezclado claramente puede influir en la
composicin de estas micelas, con la particularidad de que stas deben
reaccionarenelprocesodereticulacin.Porelloseplantearonyanalizarondos
metodologasdemezcladodiferentes.

ElprocedimientodemezcladoquedenominaremosM1,suponeladisolucinde
cadaunodelosdospolmerosqueformanlamezclaporseparadoysuposterior
mezclado. Este procedimiento probablemente favorecera una organizacin en
micelasmonocomponenteenlamezcla(Figura4.19(a)).

El segundo procedimiento de mezclado, M2, consiste en la disolucin conjunta

delospolmeros.Ellopuedefavorecerlaformacindemicelasbicomponente
compuestasporlosdospolmerosdelamezcla(Figura4.19(b)).

Independientemente del procedimiento de mezcla utilizado, en todos los casos

laconcentracinfinaldelasmezclasdepolmeroshasidodel10%(w/v)enPBS
10mMpH7.4.

157

Captulo4Capitulok

a)

b)

Grupoterminalacrilato/Grupoterminaltiol
CadenaPEGhidrfila

CadenaPPGhidrfoba

Figura4.19.Representacinesquemticadelasmicelasqueformanloshidrogeles
preparadosporlosdistintosprocedimientosdemezclado,M1yM2.a)Organizacinen
micelaspurasfavorecidasenelprocedimientodemezcladoM1,b)organizacinen
micelasmixtasfavorecidasenelprocedimientodemezcladoM2.

Losprocedimientosdetrabajohansido:

Mtodo M1: Se prepararon dos disoluciones, una disolucin al 10%

(w/v) de F127Ac2 en PBS 10 mM PH 7.4 y otra de F127SH2 al 10%
(w/v) en PBS 10 mM PH 7.4. Los polmeros se dejaron disolver a 4 C
durantetodalanoche.Paralapreparacindelasmezclasbicomponente
se mezclaron volmenes idnticos de cada una de las disoluciones
durante30segundosa4C.

MtodoM2:Enunrecipienteseintrodujolacantidadcorrespondiente
al 5 % (w/v) de cada uno de los polmeros y se aadi el volumen

158

Captulo4

correspondientedePBS10mMpH7.4.Lospolmerossedejarondisolver
a4Cduranteunanocheyenoscuridad.

c)Condicionesoptimasdereticulacin:

Enelprocesodereticulacinqumica,atravsdelaadicindelgrupotiolaun
doble enlace, existen numerosas variables experimentales que se pueden
modificar,yenparticular,unaesencialeselusoonodefotoiniciadorparaque
se produzca la reaccin de adicin, lo que condiciona un mecanismo de
fotopolimerizacinradicalariaounmecanismoinico,respectivamente.66

Respondiendoalobjetivoinicialdeestatesis,lainvestigacinsehacentradoen
elprocesodefotopolimerizacinconluz(reticulacinidentificadacomoPL).No
obstante, dada la alternativa inica, tambin se ha estudiado la polimerizacin
sinluz(reticulacinidentificadacomoPSL).

Reticulacin qumica con luz (PL): Una vez preparadas las muestras de
losmaterialesaestudioenPBS10mMpH7.4,quecontenaun0.10.5
%enpesodelfotoiniciadorI2959previamentedisuelto,porlosdistintos
mtodosdemezclado,sellevacabolafotopolimerizacindelhidrogel
siguiendoelprotocolodetrabajo6.2.c.,descritoenlaParteExperimental.
Traslafotopolimerizacin,loshidrogelesobtenidossemantuvierona4C
durante10minutosparaobservarsilareticulacinqumicahabatenido
lugar.
Reticulacinqumicasinluz(PSL):Unavezpreparadaslasmuestrasde
losmaterialesaestudioenPBS10mMpH7.4,porlosdistintosmtodos
demezclado,seintrodujeronenunaestufaa37Cconelfindeprovocar
la reaccin entre los grupos acrilato y grupos tiol, manteniendo el
materialenestascondicionesdurante7das.Adeterminadosintervalos
de tiempo, la muestra se extrajo de la estufa, se enfri y se mantuvo
durante 10 minutos a 4 C para comprobar si el hidrogel reverta a su
estadosol,loqueseraindicativodequeelprocesosolgelesreversibley
portanto,indicabaquenosehabaproducidoreticulacin.

159

Captulo4Capitulok

LosresultadosobtenidosenlosensayosrealizadosquesemuestranenlaTabla
4.4permitenconcluirque:

En las mezclas bicomponente y a diferencia de lo descrito por otros

autores,101noseobservlareticulacinqumicasinluzenningunodelos
casos(experimentosn1,2,7y8).Noseobservareticulacintrmicani
con el aumento de la proporcin de grupos tiol con respecto de los
acrilatos(experimentosn1y2(proporcin1:1enmoles)frentean7y
8 (proporcin 1:1.2 en moles)), ni con el cambio de mtodo de
preparacin de las mezclas (experimentos n 1 y 7 (procedimiento de
mezcladoM1)frentean2y8(procedimientodemezcladoM2)).

Lareticulacinqumicaconluzdelosmaterialesbicomponenterequiere
unaumentodelaconcentracindefotoiniciadorhastael0.5%enpeso
(experimentos n 6 y 12) y slo se produce en el caso de que los
polmerossedisuelvenconjuntamente(M2).

La reticulacin qumica para los materiales monocomponente

(experimentos n 13 a 18) slo se produjo para el material acrilado con
unaconcentracindefotoiniciadordel0.5%enpeso(experimenton15).

Las condiciones de reticulacin qumica ms idneas de los materiales

bicomponenteson:
1.Disolucinconjuntadeloscomponentesdelamezclaenuna
relacinmolar1:1.
2. Utilizacin de PBS 10 mM pH 7.4 como medio acuoso y un
0.5%enpesodefotoiniciadorI2959.
3.Estabilizacindeladisolucindelosmaterialesa4Cdurante
unanoche.
4.Formacindelhidrogelfsicoa37C.
5. Fotopolimerizacin con luz UV durante 10 min con una
distanciadelalmparaalamuestrade8cm.

160

Captulo4

EnlaFigura4.20semuestraelaspectodelhidrogelP/H10(1:1)F127Ac2/F127
SH2obtenidomediantelaaplicacindeestascondicionesdetrabajo.

Figura4.20.AspectodelhidrogelP/H10(1:1)F127Ac2/F127SH2,obtenidoenlas
condicionesexperimentalesestablecidascomomsidneas.

Establecidas las condiciones de preparacin de los hidrogeles bicomponente

polimerizados,elestudioseampliadiferentesformulacionesconlosderivados
lineales y dendrticolinealdendrtico de primera y segunda generacin, tanto
acrilados(F127Acn(n=2,4,8)comotiolados(F127SHn(n=2,4).

Enlasformulacionesbasadasenelderivadolinealcongrupostiol,F127SH2y
copolmeros dendrticolinealdendrtico de primera y segunda generacin con
gruposacrilato(F127Ac4yF127Ac8),seprobarondosrelacionesenmoles,la
relacin 1:1 molar (H10(1:1)F127Ac4/F127SH2 y H10(1:1)F127Ac8/F127
SH2)quesuponeunexcesodegruposacrilatoconrespectoalosgrupostiol;yla
relacin 1:2 molar (H10(1:2)F127Ac4/F127SH2) y 1:4 (H10(1:4)F127Ac
8/F127SH2),quesuponeunarelacinestequiomtricaentregruposfuncionales
acrilatoytiol.Lasconcentracionesfinalesdelasmezclassemantuvieronal10%
(w/v),utilizandoelmtodoM2comoprocedimientodemezcladoydisolucinde
los componentes en PBS 10 mM pH 7.4 y presencia de 0.5 % en peso de
fotoiniciadorI2959.

En la Tabla 4.5 se recogen los experimentos realizados y los resultados

obtenidos.

161

162

Captulo4kjdflkjdaslkfjasldkjfdslkjflkjkjsdlkjflfkjdlkjjlsdkjflksdjflkjfjlkj
Tabla4.5.ResumendelosexperimentosrealizadosparamezclasF127Acn(n=2,4,8)yF127SHn(n=2,4).

Relacin %(w/v)
Componente Componente Proporcin % Mezclado Reticulacin
N molar Material I2959 Resultado*** N
C1 C2 C=C:SH w/v
C1:C2 M2* 0.5 PL**
6 F127Ac2 F127SH2 1:1 1:1 10 H10(1:1)F127Ac2/F127SH2 + + + positivo 6
19 F127Ac4 F127SH2 1:1 2:1 10 H10(1:1)F127Ac4/F127SH2 + + + positivo 19
20 F127Ac4 F127SH2 1:2 1:1 10 H10(1:2)F127Ac4/F127SH2 + + + negativo 20
21 F127Ac8 F127SH2 1:1 4:1 10 H10(1:1)F127Ac8/F127SH2 + + + positivo 21
22 F127Ac8 F127SH2 1:4 1:1 10 H10(1:4)F127Ac4/F127SH2 + + + negativo 22
23 F127Ac2 F127SH4 1:1 1:2 10 H10(1:1)F127Ac2/F127SH4 + + + positivo 23
24 F127Ac2 F127SH4 2:1 1:1 10 H10(1:1)F127Ac2/F127SH4 + + + negativo 24
25 F127Ac4 F127SH4 1:1 1:1 10 H10(1:1)F127Ac4/F127SH4 + + + positivo 25
26 F127Ac8 F127SH4 1:1 2:1 10 H10(1:1)F127Ac8/F127SH4 + + + positivo 26
27 F127Ac8 F127SH4 1:2 1:1 10 H10(1:1)F127Ac8/F127SH4 + + + negativo 27
Relacinmolarptima 1:1 + + +

*M2:preparacinconjuntadeladisolucindelosdoscomponentes**PL:polimerizacinconluz.***Ensayopositivo:Noreversindelhidrogelal
estadosoltrasmantenerloa4Cdurante10minutos.

Captulo4

Independientemente de los componentes utilizados, nicamente se detect

reticulacinqumicaadecuadaenelcasodelasmezclasenlasquelospolmeros
seencuentranenproporcionesmolares1:1(experimentosn6,19,21,23,25y
26)

En la Figura 4.21 se muestra el aspecto de los hidrogeles obtenidos por

fotopolimerizacin de materiales estudiados a partir del derivado lineal, F127
SH2 (imagen superior) y del derivado dendrticolinealdendrtico F127SH4
(imagen inferior), con F127Acn (n=2, 4, 8). Las imgenes reflejan que la
consistenciadelosdistintosmaterialesnoessimilaryqueelusodemolculas
con mayor nmero de grupos acrilato confiere a los hidrogeles una mayor
estabilidadmecnica(experimentosn21y26).

Exp.n6 Exp.n19 Exp.n21

Exp.n23 Exp.n25 Exp.n26

Figura4.21.AspectodeloshidrogelesP/H10(1:1)F127Ac2/F127SH2(exp.n6),
P/H10(1:1)F127Ac4/F127SH2(exp.n19),P/H10(1:1)F127Ac8/F127SH2
(exp.n21),P/H10(1:1)F127Ac2/F127SH4(exp.n23),
P/H10(1:1)F127Ac4/F127SH4(exp.n25),P/H10(1:1)F127Ac8/F127SH4
(exp.n26).

163

Captulo4Capitulok

4.2.1.2. Determinacin de las propiedades solgel de hidrogeles

polimerizables

Seleccionadas las formulaciones que permitan obtener hidrogeles

fotopolimerizados adecuados, se llev a cabo la caracterizacin solgel de los
materialesprecursoresfotopolimerizables.

Paraladeterminacindelaspropiedadessolgelseprepararonmuestrasdelas
mezclas H10(1:1)F127Ac2/F127SH2, H10(1:1)F127Ac4/F127SH2,
H10(1:1)F127Ac8/F127SH2 as como de H10(1:1)F127Ac2/F127SH4
H10 (1:1)F127Ac4/F127SH4 y H10(1:1)F127Ac8/F127SH4, disueltas en
PBS10mMpH7.4,preparadasmedianteelprocedimientoM2,ymanteniendo
lasmuestrasduranteunanochea4Cparasudisolucin.

Suscomportamientossolgelseestudiaronutilizandoelmtododeinversindel
vial y la calorimetra diferencial de barrido (DSC), siguiendo los protocolos de
trabajo6.2.a.y6.2.b.,descritosenlaParteExperimental.

EnlaFigura4.22y4.23semuestranlostermogramasobtenidosparalasmezclas
dederivadosF127Acn(n=2,4,8)conF127SH2yF127SH4,respectivamente.

164

Captulo4

a) 2
17C
1,5

Deriv.Flujocalor
1

(mW/min)
0,5
0 25C
23C
0,5
1
0 5 10 15 20 25 30 35
Temperatura(C)
2
b)
Deriv.Flujodecalor

1,5 17C
1
(mW/min)

0,5
0 25.7C
23C
0,5
1
0 5 10 15 20 25 30 35
Temperatura(C)

c) 2
1,5
Deriv.Flujocalor

16.9C
1
(mW/min)

0,5
0 23C 25.5C
0,5
1
0 5 10 15 20 25 30 35
Temperatura(C)
Figura4.22.DSCdelasmezclas:a)H10(1:1)F127Ac2/F127SH2,b)H10(1:1)F127Ac
4/F127SH2yc)H10(1:1)F127Ac8/F127SH2enPBS10mMpH7.4correspondientes
alarepresentacindeladerivadadelflujodecalorconrespectoaltiempo(mW/min)
frentealatemperaturaenelciclodecalentamiento;enmorado,Tdemicelizacin
(CMT),enazul,Tdegelificacin(LCSTporDSC),enverde,LCSTobtenidaporelmtodo
deinversindelvial.

165

Captulo4Capitulok

a)
1,1 16.9C

Deriv.FlujoCalor
0,9
0,7

(mW/min)
0,5
0,3
0,1
0,1 24C25C
0,3
0,5
0 5 10 15 20 25 30 35
Temperatura(C)

b) 1,1 16.7C
0,9
Deriv.FlujoCalor

0,7
(mW/min)

0,5
0,3
0,1 25C
0,1 25C
0,3
0,5
0 5 10 15 20 25 30 35
Temperatura(C)
1,1
c) 16.5C
0,9
Deriv.FlujoCalor

0,7
(mW/min)

0,5
0,3
0,1
0,1 24.2C25C
0,3
0,5
0 5 10 15 20 25 30 35
Temperatura(C)

Figura4.23.DSCdelasmezclas:a)H10(1:1)F127Ac2/F127SH4,b)H10(1:1)F127
Ac4/F127SH4yc)H10(1:1)F127Ac8/F127SH4enPBS10mMpH7.4,
correspondientesalarepresentacindeladerivadadelflujodecalorconrespectoal
tiempo(mW/min)frentealatemperaturaenelciclodecalentamiento;enmorado,T
demicelizacin(CMT),enazul,Tdegelificacin(LCSTporDSC),enverde,LCST
obtenidaporelmtododeinversindelvial.

166

Captulo4

EnlaTabla4.6serecogenlosresultadosdelastemperaturasdetransicinsol
gel (LCST) para todas las mezclas estudiadas, obtenidas por ambos mtodos.
Adems, se muestran las transiciones gelsol determinadas por el mtodo de
inversindelvialylasCMTestablecidasporDSC.

Tabla4.6.Temperaturasdetransicindefasesdelasmezclasobtenidasporel
mtododeinversindelvialyporDSC.

Temperatura
LCST
gelsol LCSTpor
inversin Micelizacin
inversindel DSC
delvial (C)
vial (C)
(C)
(C)
H10(1:1)F127Ac2/F127SH2 23 86 25 17

H10(1:1)F127Ac4/F127SH2 23 80 25.7 17

H10(1:1)F127Ac8/F127SH2 23 70 25.5 16.9

H10(1:1)F127Ac2/F127SH4 25 88 24 16.9

H10(1:1)F127Ac4/F127SH4 25 84 25 16.7

H10(1:1)F127Ac8/F127SH4 25 77 24.2 16.5

LasLCSTobtenidasporelmtododeinversindelvialconcuerdanbastantebien
con las LCST obtenidas por DSC. Las LCST y la temperatura de micelizacin
obtenidasporDSCsonmuysimilaresentrelasmezclas,sinapreciarsediferencias
enfuncindeltipodederivadoacriladoutilizado.

4.2.1.3.CaracterizacindelamorfologainternaporSEM

Utilizando las condiciones de polimerizacin seleccionadas se prepararon 6

hidrogeles fotopolimerizados: P/H10(1:1)F127Ac2/F127SH2, P/H10(1:1)
F127Ac4/F127SH2, P/H10(1:1)F127Ac8/F127SH2, P/H10(1:1)F127Ac
2/F127SH4, P/H10(1:1)F127Ac4/F127SH4 y P/H10(1:1)F127Ac8/F127SH
4, cuya morfologa se estudi mediante SEM, siguiendo el protocolo 6.2.d.
descritoenlaParteExperimental.

167

Captulo4Capitulok

En las Figuras 4.24, 4.25 y 4.26 se pueden observar las estructuras internas
porosas de los tres hidrogeles fotopolimerizados basados en F127SH2 con
F127Ac2,F127Ac4yF127Ac8,respectivamente.EnlasFiguras4.27y4.28se
muestran las estructuras internas porosas de dos de los hidrogeles
fotopolimerizados basados en F127SH4 con F127Ac4 y F127Ac8,
respectivamente. El hidrogel P/H10(1:1)F127Ac2/F127SH4 se degrad
completamente antes de transcurrir los tres das de incubacin en PBS,
necesariosparalapreparacindelasmuestrasparasuestudioconSEM.

El anlisis de las fotografas permite observar que los hidrogeles

fotopolimerizadospreparadosapartirdemezclasF127Acn(n=2,4,8)/F127SH
2, muestran estructuras internas porosas, siendo muy similares en cuanto a
rangodetamaosdeporo(Tabla4.7),peromuydiferentesencuantoacantidad
yconectividaddelosporos.

Los materiales basados en F127SH2, como el hidrogel P/H10(1:1)F127Ac

2/F127SH2 (Figura 4.24) presenta una estructura con elevada densidad de
porosinterconectadosentres,comosededucedelapresenciadeporoshuecos
en las imgenes de SEM (Figura 4.24 (b)). Sin embargo, el aumento de la
densidad de grupos acrilato por molcula como es el caso de los hidrogeles
P/H10(1:1)F127Ac4/F127SH2(Figura4.25)yP/H10(1:1)F127Ac8/F127SH2
(Figura4.26)diolugaraestructurasconmenordensidaddeporosyconmenor
interconexinentreellos,hechoqueesmsnotableparaelmaterialbasadoen
elderivadoconmayornmerodegruposacrilato(Figura4.26(b),comparacin
conimgenes(b)enlasFiguras4.24y4.25).

168

Captulo4

100m 50m

a)P/H10(1:1)F127Ac2/F127SH2 b)P/H10(1:1)F127Ac2/F127SH2

30m 10m

c)P/H10(1:1)F127Ac2/F127SH2 d)P/H10(1:1)F127Ac2/F127SH2

Figura4.24.ImgenesSEMdelaestructurainternadehidrogelesfotopolimerizadosde
mezclasdeF127Ac2/F127SH2,aconcentracionesdel10%enpeso(1:1enmoles).

100m 50m

a)P/H10(1:1)F127Ac4/F127SH2 b)P/H10(1:1)F127Ac4/F127SH2

Figura4.25.ImgenesSEMdelaestructurainternadehidrogelesfotopolimerizadosde
mezclasdeF127Ac4/F127SH2,aconcentracionesdel10%enpeso(1:1enmoles).

200m 100m

a)P/H10(1:1)F127Ac8/F127SH2 b)P/H10(1:1)F127Ac8/F127SH2

Figura4.26.ImgenesSEMdelaestructurainternadehidrogelesfotopolimerizadosde
mezclasdeF127Ac8/F127SH2,aconcentracionesdel10%enpeso(1:1enmoles).

169

Captulo4Capitulok

Con el componente tiolado F127SH4, el hidrogel P/H10(1:1)F127Ac4/F127

SH4 (Figura 4.27) proporciona un material con elevada densidad de poros,
interconectados entre s. Por el contrario, el aumento de grupos acrilato por
molcula en los hidrogeles P/H10(1:1)F127Ac8/F127SH4 (Figura 4.28),
supone la obtencin de una estructura interna menos porosa, de poros mas
grandesperopocointerconectadosentres,talycomosededucedelapresencia
deporoscompactosenlaestructura(detalledeporoscompactosenlaimagen
(b),Figura4.28).

100m 30m

a)P/H10(1:1)F127Ac4/F127SH4 b)P/H10(1:1)F127Ac4/F127SH4

Figura4.27.ImgenesSEMdelaestructurainternadehidrogelesfotopolimerizadosde
mezclasdeF127Ac4/F127SH4,aconcentracionesdel10%enpeso(1:1enmoles).

200m 100m

a)P/H10(1:1)F127Ac8/F127SH4 b)P/H10(1:1)F127Ac8/F127SH4

Figura4.28.ImgenesSEMdelaestructurainternadehidrogelesfotopolimerizadosde
mezclasdeF127Ac8/F127SH4aconcentracionesdel10%enpeso(1:1enmoles).

170

Captulo4

Tabla4.7.Tamaodeporodeloshidrogelesdemezclasdederivadostioladosy
acriladosobservadoporSEM.

HIDROGEL Tamaosdeporoa(m)
P/H10(1:1)F127Ac2/F127SH2 535
P/H10(1:1)F127Ac4/F127SH2 440
P/H10(1:1)F127Ac8/F127SH2 830
P/H10(1:1)F127Ac4/F127SH4 520
P/H10(1:1)F127Ac8/F127SH4 2560
a
Intervaloscorrespondientesalosvaloresmnimoymximodetamaode
poroobservadosporSEM(estudionoestadstico).

4.2.1.4.Degradacindehidrogelesfotopolimerizados

Elprocesodedegradacindelosseishidrogelesfotopolimerizadospreparados,
serealizsiguiendoelprotocolodetrabajoquesedescribeenalapartado6.2.e.,
de la Parte Experimental. Los resultados obtenidos se muestran en las Figuras
4.29y4.30,respectivamente.

Los perfiles de degradacin de los materiales P/H10(1:1)F127Acn (n= 2, 4,

8)/F127SH2 mostraron un pequeo hinchamiento inicial (Figura 4.29), que es
mayor cuanto menor es el nmero de grupos acrilato por molcula,
probablementedebidoaunamenordensidaddeentrecruzamiento.Eltiempode
degradacin aumenta con el incremento de grupos acrilato por molcula
presenteenlasformulacionesbicomponente.

LosperfilesdedegradacindelosgelesP/H10(1:1)F127Acn(n=4,8)/F127SH
4nomostraronhinchamientoinicial(Figura4.30),produciendounadegradacin
de forma gradual y continua en el tiempo. El tiempo de degradacin de estos
hidrogelesessuperiora150das,siendounensayoqueenlaactualidadnoseha
concluido.

En la Tabla 4.8 se resumen los tiempos de degradacin de los hidrogeles

fotopolimerizados.

171

Captulo4Capitulok

1,4 P/H10(1:1)F127Ac2/F127SH2
P/H10(1:1)F127Ac4/F127SH2
1,2
P/H10(1:1)F127Ac8/F127SH2
1
35das 63das92das
Hinchamiento

0,8

0,6
a b c
0,4

0,2

0 d e

0 50 100 150
Tiempo(das)
Figura4.29.HinchamientodeloshidrogelesP/H10(1:1)F127Acn(n=2,4,8)/F127SH
A 2enfuncindeltiempo.

1,4 P/H10(1:1)F127Ac4/F127SH4
P/H10(1:1)F127Ac8/F127SH4
1,2
63das92das
1
Hinchamiento

0,8

0,6

0,4

0,2

0
0 50 100 150 200
Tiempo(das)

Figura4.30.HinchamientodeloshidrogelesP/H10(1:1)F127Acn(n=4,8)/F127SH4
enfuncindeltiempo.

172

Captulo4

Tabla4.8.Tiempodedegradacindehidrogelesfotopolimerizadosdemezclas
F127Acn(n=2,4,8)/F127SHn(n=2,4).

Tiempodedegracin
HIDROGEL
(das)
P/H10(1:1)F127Ac2/F127SH2 42
P/H10(1:1)F127Ac4/F127SH2 107
P/H10(1:1)F127Ac8/F127SH2 135
P/H10(1:1)F127Ac2/F127SH4 3
P/H10(1:1)F127Ac4/F127SH4 >150a
P/H10(1:1)F127Ac8/F127SH4 >150a
a
Ensayosenproceso.

4.2.1.5.Ensayosdeviabilidadcelular

Sehanllevadoacaboestudiosdeviabilidadcelular,tantoenensayos2Dcomo
3D,sobrediferentestiposdemateriales:mezclasdecomponentesendisolucin,
hidrogeles sin polimerizar e hidrogeles polimerizados. Estos estudios in vitro se
realizaron con clulasMSC humanas, utilizando el protocolo de preparacin de
clulas y preparacin de las disoluciones de polmero descrito en el apartado
6.2.f.,delaParteExperimental.

ParaestosensayosseutilizDMEMcomodisolventeenelcasodelasmezclasen
disolucinyenelcasodelosensayossinfotopolimerizar,yDMEMcon0.5%de
fotoiniciador I2959 en los ensayos sujetos a fotopolimerizacin, utilizando en
todosloscasosparalapreparacindelasmezclaselprocedimientoM2descrito
enestecaptulo.

Las viabilidades celulares se han determinado sobre disoluciones e hidrogeles

basadosenmezclasF127Acn(n=2,4,8)yF127SHn(n=2,4),aconcentraciones
del5y10%(w/v)paraensayos2D,y10%(w/v)paralosensayos3D.Conelfinde
estimar la viabilidad de las mezclas de polmeros en disolucin se realizaron
ensayos2Dal5%(w/v),mientrasqueconlasmezclasal10%(w/v)seanalizla
viabilidad celular de los materiales en el estado hidrogel sin fotopolimerizar y
unavezfotopolimerizadosenlosensayos2Dy3D.

173

Captulo4Capitulok

Para diferenciar los distintos estudios y materiales se ha utilizado la

nomenclaturayadescrita,queantepone2D3Dparaindicareltipodeensayo.
As la nomenclatura 2D/H10(1:1)F127Ac2/F127SH2 identifica un ensayo
celularenunentorno2D,realizadoconelhidrogelformadosloporefectodela
temperatura(sinfotopolimerizar),apartirdeunadisolucional10%(w/v)deuna
mezcla1:1molardeF127Ac2yF127SH2,disueltaenDMEM.Lanomenclatura
2D/P/H10(1:1)F127Ac2/F127SH2 corresponde al ensayo celular realizado
sobre el material anterior una vez fotopolimerizado en presencia de 0.5 % de
fotoiniciadorI2959.Losensayoscelularesconelmaterialendisolucinutilizanla
misma nomenclatura descrita con la sustitucin de la letra H por la letra D
(Disolucin).

En las Figuras 4.31 y 4.32 se representan los resultados de viabilidad celular

realizados sobre los diferentes materiales, en ensayos en entorno 2D y en
entorno 3D, respectivamente. En tonos verdes, se representan los resultados
quecorrespondenalasmezclasdehidrogelestipoF127Acn(n=2,4)/F127SH2
yentonosrojos,loscorrespondientesalosdetipoF127Acn(n=2,4)/F127SH4.
Los resultados correspondientes a los materiales basados en F127Ac8 no se
incluyenenestasgrficasdebidoalatotalmortalidadcelularobservadatras24
horas de ensayo, tanto en disolucin como en estado gel sin fotopolimerizar y
unavezfotopolimerizado.

En ensayos 2D en disolucin, Figura 4.31 (a), las mezclas 2D/D5(1:1)F127Ac

2/F127SH2 y 2D/D5(1:1)F127Ac2/F127SH4 presentaron valores de
viabilidaddel46%y76%,respectivamente,tras72horasdeensayo,siendola
viabilidadde2D/D5(1:1)F127Ac4/F127SH2y2D/D5(1:1)F127Ac4/F127SH
4,quepresentanmayordensidaddegruposacrilato,igualomuyprximaacero.

174

Captulo4

a) 2D/D5(1:1)F127Acn/F127SHn(n=2,4)
95.1 99.7 94.1
100

Viabilidadcelular(%)
81.1 66.0 76.3
80
44.0
60 40.3 46.2
40
20 5.6 4.2 0
0
24horas 48horas 72horas

b) 2D/H10(1:1)F127Acn/F127SHn(n=2,4)
100 94.0 88.9
82.6
Viabilidadcelular(%)

77.6 75.5
80
59.6
60
40 25.9
12.6
20
0 1.8 0 0
0
24horas 48horas 72horas

c) 2D/P/H10(1:1)F127Acn/F127SHn(n=2,4)
100 88.7 87.996.5 85.4 85.0 83.0
Viabilidadcelular(%)

75.1 77.4
80 66.9
60
40
14.4
20 6.2 2.0
0
24horas 48horas 72horas
F127Ac2/F127SH2F127Ac4/F127SH2

F127Ac2/F127SH4F127Ac4/F127SH4

Figura4.31.ViabilidadcelulardemezclasF127Ac2/F127SH2,F127Ac4/F127SH2,
F127Ac2/F127SH4yF127Ac4/F127SH4,enentorno2D:a)al5%(w/v)en
disolucinb)al10%(w/v)enestadogelsinfotopolimerizaryc)al10%(w/v).enestado
gelfotopolimerizado.

Elaumentodeconcentracindegelificante,yportantoelpasoaestadogelpor
efectodelatemperatura(Figura4.31(b)),proporcionaresultadosdiferentesen
funcin de los materiales estudiados. As, supone un ligero aumento de la

175

Captulo4Capitulok

viabilidad celular para las mezclas 2D/H10(1:1)F127Ac2/F127SH2 y

2D/H10(1:1)F127Ac2/F127SH4 con respecto a las mezclas en disolucin,
mostrandoviabilidadessuperioresal60%tras72horasdeensayo.Sinembargo,
en los materiales 2D/H10(1:1)F127Ac4/F127SH2 y 2D/H10(1:1)F127Ac
4/F127SH4seobservaronviabilidadesnulastras48horasdeensayo.

Entodosestosensayos,elmayornmerodegruposacrilatolibrequeconfierela
presencia del derivado F127Ac4 puede explicar la mayor toxicidad observada
enlosmaterialesqueloincluyenensucomposicin.

Paralosensayos2Dsobremezclasdehidrogelesfotopolimerizados(Figura4.31
(c)) se obtuvieron viabilidades celulares superiores al 75%, para tres de los
materiales, destacando particularmente el material 2D/P/H10(1:1)F127Ac
4/F127SH4 que hace posible la viabilidad celular nicamente en el gel
fotopolimerizado.Aligualqueseobservaenlosmaterialessinfotopolimerizar,el
hidrogel2D/P/H10(1:1)F127Ac4/F127SH2muestraunaaltatoxicidad.

La gran diferencia de viabilidad celular existente entre los hidrogeles

2D/P/H10(1:1)F127Ac4/F127SH2 y 2D/P/H10(1:1)F127Ac4/F127SH4,
cuya nica diferencia radica en su composicin del componente tiolado, F127
SH2F127SH4,podraexplicarseporelexcesodegruposacrilatoconrespecto
a los grupos tiol presentes en el material precursor que parece persistir tras el
procesodefotopolimerizacin

Porotraparte,lamorfologiainternaobservadaporSEMparaP/H10(1:1)F127
Ac4/F127SH4 (Figura 4.27) sugiere una mayor densidad de poros e
interconexin entre ellos que podra ser determinante a la hora de facilitar el
transporte de nutrientes y sustancias de desecho a travs del hidrogel poroso
hastalasclulas,aumentandosusupervivenciaconrespectoaP/H10(1:1)F127
Ac4/F127SH2quepresentabaunaestructuramenosporosa(Figura4.25).

Los hidrogeles sin fotopolimerizar mostraron en ensayos 3D (Figura 4.32 (a))

peoresviabilidadesqueenensayos2D,siendo3D/H10(1:1)F127Ac2/F127SH

176

Captulo4

4 prcticamente el nico material con supervivencia celular tras 72 horas

superioral50%.

a) 3D/H10(1:1)F127Acn/F127SHn(n=2,4)
100 85.8
82.4
Viabilidadcelular(%)

80 61.0 57.1
60
38.7 27.6
40 23.8 26.8
20 6.9
0 0 0
0
24horas 48horas 72horas

b) 3D/P/H10(1:1)F127Acn/F127SHn(n=2,4)

100
Viabilidadcelular(%)

80
59.3
60 47.9
36.5
40 21.1 21.6
17.3
20 3.9 3.4 1.8 0 0 0
0
24horas 48horas 72horas

F127Ac2/F127SH2F127Ac4/F127SH2

F127Ac2/F127SH4F127Ac4/F127SH4

Figura4.32.ViabilidadcelulardemezclasF127Ac2/F127SH2,F127Ac4/F127SH2,
F127Ac2/F127SH4yF127Ac4/F127SH4,enentorno3D:a)al10%(w/v)enestado
gelsinfotopolimerizaryb)al10%(w/v)enestadogelfotopolimerizado.

En lo que respecta a los ensayos 3D con hidrogeles fotopolimerizados (Figura

4.32(b))sehadeconcluirquelaviabilidadtras72horasesprcticamentenulao
muybajacomoenelcasode3D/P/H10(1:1)F127Ac2/F127SH2.

Laelevadamortalidadcelularendisolucinoenhidrogelessinfotopolimerizarse
haatribuidoalapresenciadegruposacrilatolibres.Sinembargo,enhidrogeles
fotopolimerizadossepuedeatribuiralaformacindeestructurasinternasms
compactas para P/H10(1:1)F127Ac8/F127SH2 y P/H10(1:1)F127Ac8/F127

177

Captulo4Capitulok

SH4,conmenorinterconexinentreporos,talycomosepuedededucirdelas
imgenes de SEMenel apartado 4.2.1.3 de este captulo,en las Figuras 4.26 y
4.28,respectivamente.

Si se establece una comparativa con los resultados descritos en el capitulo

anteriorcentradoenlosderivadosacrilados,ladisminucindelaconcentracin
del gelificante y el cambio del tipo de reaccin qumica que permiten los
materiales bicomponente supone, para ensayos 2D de todas las mezclas
estudiadas con excepcin de las mezclas F127Ac4/F127Ac2, la obtencin de
valores de viabilidad celular similares a los mximos valores de viabilidad
alcanzadosenelCaptulo3parahidrogelesfotopolimerizadosdeF127Ac4.

Porotraparte,enelcasodeloshidrogelesbicomponentetantoendisolucin,
comoenestadogelnofotopolimerizadoyfotopolimerizadoenunentorno2D,
se ha observado que la morfologa celular es la tpica alargada de las clulas
adheridasalfondodelpocillo,mientrasqueparaelentorno3Dlamorfologade
las clulas es redondeada, lo que sugiere la baja adhesin de las clulas al
material.

EnlaFigura4.33semuestranimgenes,encontrastedefasesyfluorescencia,en
las que se aprecian las clulas con morfologa alargada, para los ensayos con
diferenteshidrogelesfotopolimerizadosbasadosenF127Acn(n=2,4)/F127SH
n(n=2,4),tras72horasdeensayoenunentorno2D.

Las clulas de los ensayos 2D/P/H10(1:1)F127Ac4/F127SH2 presentan

morfologaredondeadacomoconsecuenciadelaelevadamortalidadcelulartras
72horasdeensayo.

178

Captulo4

2D/P/H10(1:1)

F127Ac2/F127SH2 F127Ac2/F127SH2 F127Ac2/F127SH2

F127Ac4/F127SH2 F127Ac4/F127SH2 F127Ac4/F127SH2

F127Ac2/F127SH4 F127Ac2/F127SH4 F127Ac2/F127SH4

F127Ac4/F127SH4 F127Ac4/F127SH4 F127Ac4/F127SH4

Figura4.33.Imgenesdemicroscopiadefluorescenciadeensayos2Dsobrehidrogeles
fotopolimerizados2D/P/H10(1:1)F127Acn/F127SHn(n=2,4),tras72horasde
ensayo.Primeracolumna:Imgenesencontrastedefases;Segundacolumna:Clulas
vivas;Terceracolumna:Clulasmuertas.

En la Figura 4.34 se muestra la morfologa redondeada de las clulas

correspondientealmaterial3D/P/H10(1:1)F127Ac2/F127SH2,nicosensayos
en los que se observ una viabilidad celular significativa. La viabilidad celular
nulaobtenidaparaelrestodelasmezclasenensayos3Dpolimerizadoshaceque
sloseobservenclulasmuertas,consumorfologaredondeadacarcterstica.

179

Captulo4Capitulok

3D/P/H10(1:1)

F127Ac2/F127SH2 F127Ac2/F127SH2 F127Ac2/F127SH2

Figura4.34.Imgenesdemicroscopiadefluorescenciaparaensayos3Dsobre
hidrogelesfotopolimerizados3D/P/H10(1:1)F127Ac2/F127SH2,tras72horasde
ensayo.Primeracolumna:Imgenesencontrastedefases;Segundacolumna:Clulas
vivas;Terceracolumna:Clulasmuertas.

4.2.2. Materiales basados en mezclas de F127SHn (n=2, 4) con otros

reticulantesacrilados

Conelfindeinvestigarlaposibilidaddereticularlosgelesbasadosenpolmeros
tiolados con otros reticulantes tipo acrilato, se seleccionaron 4 reticulantes de
caractersticas muy diferentes (Figura 4.35): a) un derivado comercial con 4
gruposacrilatoreactivos,elpentaeritrioltetracrilato(PET),b)yc)dosdiacrilatos
lineales de PEG de diferente longitud, un compuesto comercial con 4 unidades
de etilengligol (TEGAc2) y otro con 45 unidades de etilenglicol (PEGAc2)
sintetizado para este estudio (compuesto [19]), y d) un derivado lineal de
PluronicF127,conenlacescarbamatoydosgruposacrilatoterminalestambin
preparadoparaesteestudio(F127NHAc2[21]).

Ninguno de estos reticulantes por s mismos dio lugar a la formacin de

hidrogelesporefectodelatemperatura,siendoportantoelpolmerocongrupos
tiolelnicoresponsableaprioridelagelificacindelmaterial.

180

Captulo4

a)

b) TEGAc2n=4
PET
c) PEGAc2n=45
d)

F127NHAc2
Figura4.35.Estructuraqumicadelosreticulantesacriladosutilizados.

4.2.2.1. Preparacin de los hidrogeles polimerizables e hidrogeles

fotopolimerizados

Paragarantizarlagelificacindelasmuestraseseleccionunaconcentracinde
lospolmerosF127SHn(n=2,4)al5%(w/v),enproporcin1:1enmolesconlos
reticulantes,mezclndolosporelmtodoM2enPBS10mMpH7.4quecontena
un0.5%defotoiniciadorI2959.

La fotopolimerizacin de los diferentes hidrogeles se realiz siguiendo el

protocolodetrabajodescritoenelapartado6.2.c.,delaParteExperimental.

Traslafotopolimerizacinloshidrogelessemantuvierona4Cparacomprobar
lareticulacinqumica.

ElnicoreticulantequeprodujolareticulacinqumicadeF127SH2yF127SH
4 fue F127NHAc2, formando hidrogeles fotopolimerizados con el aspecto que
semuestraenlaFigura4.36.

181

Captulo4Capitulok

a) b)

Figura4.36.Aspectodeloshidrogelesa)P/H10(1:1)F127NHAc2/F127SH2yb)P/H10
(1:1)F127NHAc2/F127SH4.

4.2.2.2.CaracterizacindelamorfologainternaporSEMdehidrogeles
polimerizadosbasadosenF127NHAc2

Las estructuras internas porosas de los hidrogeles P/H10(1:1)F127NHAc

2/F127SH2yP/H10(1:1)F127NHAc2/F127SH4semuestranenlaFigura4.37.

100m 100m

a)P/H10(1:1)F127NHAc2/F127SH2 b)P/H10(1:1)F127NHAc2/F127SH4

Figura4.37.ImgenesSEMdelaestructurainternadehidrogelesfotopolimerizados:a)
F127NHAc2/F127SH2;b)F127NHAc2/F127SH4aconcentracionesdel10%en
peso(1:1enmoles).

Ambos materiales presentan una estructura porosa con tamaos de poro de

1745 m para P/H10(1:1)F127NHAc2/F127SH2 y de 3575 m para
P/H10(1:1)F127NHAc2/F127SH4, aunque en estos ltimos se observa un
predomiodeporosconestructuraalargada.

182

Captulo4

4.2.2.3.Degradacindehidrogelesfotopolimerizados

Las curvas de degradacin de estos hidrogeles P/H10(1:1)F127NHAc2/F127

SH2yP/H10(1:1)F127NHAc2/F127SH4semuestranenlaFigura4.38.

P/H10(1:1)F127NHAc2/F127SHn(n=2,4)

2
1,8 P/H10(1:1)F127NHAc2/F127SH2
1,6 P/H10(1:1)F127NHAc2/F127SH4
1,4
Hinchamiento

1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Tiempo(das)
Figura4.38.Hinchamientodeloshidrogeles
P/H10(1:1)F127NHAc2/F127SHn(n=2,4)enfuncindeltiempo.

El comportamiento de los dos materiales fue completamente diferente. El

hidrogel P/H10(1:1)F127NHAc2/F127SH2 mostr un pequeo hinchamiento
inicial, mientras que el hidrogel P/H10(1:1)F127NHAc2/F127SH4 no mostr
hinchamientoantesdeempezaradegradarse.Estadiferenciapuededeberseal
excesodegrupostiolconrespectoaldegruposacrilato,loquepuededarlugara
larpidaliberacinalmediodedegradacindelasmolculascongrupostiolno
reticuladas qumicamente. Posteriormente, ambos hidrogeles pierden masa de
maneragradual,completndoseladegradacinen87dasparaP/H10(1:1)F127
NHAc2/F127SH2yen100dasparaP/H10(1:1)F127NHAc2/F127SH4.

183

Captulo4Capitulok

4.2.2.4.Ensayosdeviabilidadcelular

Los estudios de viabilidad celular en estos hidrogeles fotopolimerizados se

llevaronacaboconclulasMSChumanas,utilizandocondicionesdepreparacin
y de trabajo similares a las descritas para el resto de los hidrogeles
bicomponentedescritosenelapartado4.2.1.,tantoenensayos2Dcomo3D.
LosresultadossemuestranenlaFigura4.39.

Aligualqueloobservadoenlosestudiosanteriores,estosmaterialesmuestran
unabuenaviabilidadcelularenunentorno2D,conun44%desupervivenciaen
P/H10(1:1)F127NHAc2/F127SH2y70%deviabilidadcelularparaP/H10(1:1)
F127NHAc2/F127SH4, tras 72 horas de ensayo. El mayor valor de viabilidad
celular observado para P/H10(1:1)F127NHAc2/F127SH4 podra estar
relacionadoconelmayortamaodeporoobservadoporSEM,quepermiteuna
mejordifusindenutrientesysustanciasdedesechodelasclulas.Sinembargo
losresultadosensistemas3Ddenuevoindicanlaprcticamortalidadcelular.

184

Captulo4

a) 2D/P/H10(1:1)F127NHAc2/F127SHn(n=2,4)
100 89.4 89.0
90 82.8 84.8
80
Viabilidadcelular(%) 70.2
70
60 F127NHAc2/F127SH2
50 44.1
F127NHAc2/F127SH4
40
30
20
10
0
24horas 48horas 72horas
b)
3D/P/H10(1:1)F127NHAc2/F127SHn(n=2,4)
100
90
80
Viabilidadcelular(%)

70
60 F127NHAc2/F127SH2
50
F127NHAc2/F127SH4
40 34.833.5
30
18.1
20 13.1
10 4.9 4.1
0
24horas 48horas 72horas
Figura4.39.ViabilidadcelulardemezclasF127NHAc2/F127SH2,F127NHAc2/F127
SH4,hidrogelesal10%(w/v)enrelacinmolar(1:1)fotopolimerizados:
a)enentorno2Db)enentorno3D.

185

 Captulo4Capitulok

4.3. ESTUDIO COMPARATIVO ENTRE HIDROGELES FOTOPOLIMERIZADOS DEL

CAPTULO3YDELCAPTULO4

EnlaTabla4.9serecogenconfinescomparativoslosdatosobtenidosderango
detamaodeporosobservadosporSEM,tiempodedegradacinyporcentajes
deviabilidadcelulardeensayos2Dy3Dtras72horas,delosdistintoshidrogeles
fotopolimerizadosdescritostantoenelCaptulo3comoenestecaptulo.

Tabla4.9.Resumendepropiedadesdeloshidrogelesfotopolimerizadosdescritosenel
Captulo3yenelCaptulo4.

Viabilidad
MATERIAL Porosidad(m) Tiempo celular(%)a
%
HIDROGELPOLIMERIZADO (SEM) degradacin 72h.
(w/v)
(P/H)* (das)
2D 3D
18 225 57 47 3
F127Ac2
23 215 57 58 2
CAPTULO3

18 225 93 85 31
F127Ac4
23 240 98 76 19
18 16 276 0 0
F127Ac8
23 14 286 0 0
F127Ac2/F127SH2 10 535 42 75 37
F127Ac4/F127SH2 10 440 107 2 0
F127Ac8/F127SH2 10 830 135 0 0
CAPTULO4

F127Ac2/F127SH4 10 3 77 0
F127Ac4/F127SH4 10 520 >150** 83 0
F127Ac8/F127SH4 10 2560 >150** 0 0
F127NHAc2/F127SH2 10 1545 87 44 5
F127NHAc2/F127SH4 10 3575 100 70 4

*Mezclasbicomponenteenrelacin1:1molar;**Ensayosenproceso.

186

Captulo4

Se han preparado con xito hidrogeles fotopolimerizados basados en mezclas

bicomponenteconunamenorconcentracinrequeridaparalaformacindel
hidrogel (10% (w/v)) frente a la concentracin requerida para los materiales
descritosenelCaptulo3(18%(w/v)).

Losmaterialesestudiadoshanpresentadotamaosdeporoqueoscilanentrelas
2 m y las 75 m, y tiempos de degradacin que oscilan entre los 2 y los 10
meses.

Las viabilidades celulares obtenidas en entorno 2D han sido superiores a las

obtenidas en entorno 3D. La mayora de materiales en entorno 2D con los
hidrogelesfotopolimerizadoshanpresentadobuenasviabilidadescelulares,que
oscilanentreel44%yel85%.

187

CAPTULO5:

HIDROGELESNANOESTRUCTURADOS(NANOGELES)


Captulo5

Coneltrminonanogelesseidentificaahidrogelesestructuradosenformade
nanopartculas dispersas en disolucin acuosa. Desde el punto de vista de su
aplicacin, los nanogeles deben cumplir algunas de las especificaciones en
cuantoaestabilizacinytamaoquesecomentanacontinuacin.

Anteunaposibleaplicacindelosnanogelescomotransportadoresdefrmacos,
y con la finalidad de inyectarlos en organismos vivos donde los nanogeles
alcanzanunaltogradodedilucin,resultaimportanteasegurarlaestabilidadde
los nanogeles. La fijacin de estructuras micelares con la luz permite evitar la
conversindelasmicelasencopolmerosbloqueendisolucin,cuandostosse
encuentranencondicionesdealtadilucin,pordebajodesuCMC.

Con este mismo fin, otro aspecto a tener en cuenta es el tamao del nanogel,
que debe ser optimizado para su utilizacin como sistemas de transporte y
liberacincontroladadefrmacos.Eldiferentetamaodelosnanogelesafectaa
su tiempo de permanencia en el torrente sanguneo, as como a su
internalizacin en la clula y a la biodisponibilidad de las nanopartculas que
contienen el frmaco.126 El tamao ideal de los nanogeles para garantizar su
internalizacin por endocitosis en las posibles clulas diana debe ser inferior a
100 nm. Nanogeles con tamaos entre los 5 y los 10 nm son eliminados por
excrecinrenal.Laspartculasentre10y70nmpermitenunmayortiempode
permanenciaeneltorrentesanguneo,ysupequeotamaopermitellegaralos
capilaresdepequeotamaoquepresentanalgunostejidos.Laspartculasentre
70 y 200 nm presentan los tiempos de permanencia en el torrente sanguneo
ms prolongados.126, 127 Las partculas con tamaos mayores de 200 nm son
eliminadas directamente por el bazo o por fagocitosis en las clulas, lo que se
traduce en un menor tiempo de permanencia en el torrente sanguneo. Por

126
Stolnik,S.;Illum,L.;Davis,S.S.,AdvancedDrugDeliveryReviews1995,16(23),195
214.
127
Ishida, O.; Maruyama, K.; Sasaki, K.; Iwatsuru, M., International Journal of
Pharmaceutics1999,190(1),4956.

191

Captulo5Capitulo

tanto, el tamao ptimo para la aplicacin de nanogeles en el transporte y

liberacincontroladadefrmacossesitaentre10100nm.128

Estetamaopermite,adems,aprovecharelfenmenodevectorizacinpasiva
conocidocomoefectoEPR(EnhancedPermeationRetentionEffect),129quese
produce en tejidos tumorales debido a la hiperpermeabilidad de los vasos
sanguneos que los rodean. Este fenmeno, junto con la escasa eliminacin de
losnanogelesporpartedelsistemalinftico,permitelaacumulacinselectivade
losnanogeleseneltumor.

Otro de los aspectos importantes de cara a la aplicacin de nanogeles como

sistemasverstilesdeencapsulacindefrmacoseslaposibilidaddeeliminacin
delaguacontenidaenlosnanogeles,porejemplo,porliofilizacin,ylaobtencin
de stos como un slido que se pueda redisolver. De esta forma se facilita el
almacenajeymanipulacindelosnanogeles,ascomorealizarlaencapsulacin
del frmaco o producto de inters en las proporciones necesarias y en el
momentodelaadministracin.Enestalneadetrabajo,unaspectoimportantea
tenerencuentaeslaestabilidaddelosnanogelestraslaliofilizacin,yaquelos
nanogelespuedenresultarinestablesantelaexposicinalascondicionesdebaja
presinytemperaturarequeridasenesteproceso.130

En este nuevo captulo se describe la preparacin de nanogeles

fotopolimerizados, obtenidos a partir de disoluciones acuosas a bajas
concentraciones de los copolmeros bloque con grupos acrilato. Como se ha
expuesto en el Captulo 3, los copolmeros bloque estudiados mantienen la
posibilidad de organizacin en micelas y la termosensibilidad que confiere el
ncleodePluronicF127.Estaorganizacinenmicelas,juntoconlapresenciade

128
Vinogradov, S. V.; Bronich, T. K.; Kabanov, A. V., Advanced Drug Delivery Reviews
2002,54(1),135147.
129
Khandare,J.;Calderon,M.;Dagia,N.M.;Haag,R.,ChemicalSocietyReviews2012,41
(7),28242848.
130
Han,J.;Zhou,C.;Wu,Y.;Liu,F.;Wu,Q.,Biomacromolecules2013,14(5),15291540.

192

Captulo5

grupos funcionales reactivos, permite el entrecruzamiento intra e intermicelar

fotoinducidoylaformacindenanogelesfotopolimerizados.

Por lo que se refiere al caso concreto de los hidrogeles nanoestructurados

basados en Pluronic F127, merece la pena destacar la presencia de entornos
hidrofbos formados por los bloques de PPG, en los ncleos de las micelas,
rodeados de su correspondiente corona hidrfila formada por los bloques de
PEG.Estadoblenaturalezapermitelautilizacindelosnanogelescomosistemas
deencapsulacindemolculashidrfobasehidrfilas.

En este trabajo de tesis se han preparado nanogeles a partir tanto del

copolmero bloque lineal como de los nuevos derivados dendrticolineal
dendrticoestudiadosenelCaptulo3,loquehapermitidoestablecerunestudio
comparativoentredistintosnanogeles,enbaseasuestructuraqumica.

En los siguientes apartados se incluyen los aspectos ms relevantes relativos

tantoalapreparacinycaracterizacinestructuraldeestosnanogeles,comoa
sucomportamientoenentornoscelulares.

193

Captulo5

5.1.PREPARACINDENANOGELES

Paralapreparacindeloshidrogelesnanoestructuradossehaseguidoelmtodo
descrito por Tae et al. utilizado para la preparacin de nanogeles de F127Ac
2,76b, 102, 103, 131, el cual se ha adaptado con pequeas modificaciones. Este
mtodo consiste en la preparacin de una disolucin del correspondiente
copolmero bloque a concentracin superior a su CMC, con la consiguiente
formacin de micelas, y la posterior fijacin de las estructuras micelares por
fotopolimerizacin en la disolucin precursora. La utilizacin de este mtodo
suponelapreparacindelosnanogelesenunsolopasoydeformasencilla.

La aplicacin y validacin de este mtodo para la preparacin de nanogeles a

partirdelosderivadosF127Ac2,F127Ac4yF127Ac8descritosenelCaptulo
3sediscuteenlossiguientesapartados.

5.1.1.DeterminacindelaCMC

Con el clculo de la CMC se establece la concentracin a partir de la cual, el

polmeroendisolucinacuosa,escapazdeagregarseformandoorganizaciones
micelares termodinmicamente estables. Estas organizaciones micelares, a su
vez, poseen los grupos acrilato terminales que confieren a las micelas la
posibilidad de formar agregados de mayor tamao, estabilizados por
fotopolimerizacin,queconstituirnlosnanogeles.

Para la determinacin de la CMC en copolmeros bloque de Pluronic se han

descritovariosmtodosexperimentales.132Losmtodosqueutilizanunasonda
fluorescentesonlosmsfrecuentes,porloquesedecidiutilizarelmtododel
pireno.132a Estudios previos han demostrado la disminucin de la CMC con el

131
Choi,W.I.;Kim,Y.H.;Tae,G.,MacromolecularResearch2011,19(6),639642
132
(a) Ashjari, M.; Khoee, S.; Mahdavian, A. R.; Rahmatolahzadeh, R., S, Journal of Materials
ScienceMaterialsinMedicine2012,23(4),943953;(b)Kulthe,S.S.;Inamdar,N.N.;Choudhari,
Y.M.;Shirolikar,S.M.;Borde,L.C.;Mourya,V.K.,ColloidsandSurfacesb:Biointerfaces2011,88
(2),691696;(c)Sharma,P.K.;Bhatia,S.R.,InternationalJournalofPharmaceutics2004,278(2),
361377; (d) Kabanov, A. V.; Nazarova, I. R.; Astafieva, I. V.; Batrakova, E. V.; Alakhov, V. Y.;
Yaroslavov,A.A.;Kabanov,V.A.,Macromolecules1995,28(7),23032314.

195

Captulo5Capitulo

aumento de temperatura,84 por lo que todas las medidas fueron realizadas a

25C.

Elmtododelpirenosefundamentaenladiferenciadelespectrodeexcitacin
del pireno segn se encuentre en un entorno hidrfilo (exc max = 332 nm) o
hidrfobo (exc max = 335 nm). En disoluciones diluidas de copolmero bloque
lineal o dendrticolinealdendrtico (por debajo de la CMC), el pireno se
encuentraenunentornohidrfilo,mientrasqueendisolucionesporencimade
la CMC, el pireno se localizar preferentemente en la parte hidrfoba de las
micelas,dadalanaturalezahidrfobadeste,loqueproduceeldesplazamiento
de su mximo de excitacin de 332 nm a 335 nm. El grfico para la
determinacindelaCMCseobtieneconlarepresentacindelarelacindelas
intensidadesI335/I332,frenteallogaritmodelaconcentracin(LogC).Cuandola
concentracin del polmero anffilo supera la CMC, la relacin I335/I332 aumenta
considerablemente y alcanza un mximo que indica que se ha encapsulado la
mayor concentracin posible de pireno. La CMC del polmero se determina
calculandolainterseccindelasdoszonasrectasendichagrfica.

Para la obtencin de las grficas se prepararon disoluciones de nuestros

materialesaconcentraciones0.0001,0.001,0.01,0.05,0.1,0.3,0.5y1%(w/v)
decadaunodeloscompuestosacrilados,F127Ac2,F127Ac4yF127Ac8,alas
que se adicion pireno, en una concentracin de 6x108 M. A continuacin se
midilaintensidaddelosmximosdeexcitacina332y335nm.

Lapreparacindelasmuestrasascomolascondicionesdemedidasedescriben
condetalleenelapartado6.2.h.,delaParteExperimental.

En la Figura 5.1 se muestran las grficas obtenidas tras la representacin de

I335/I332frentealogC,ascomolarepresentacindelasrectascuyainterseccin
permitecalcularelvalordeCMC.

196

Captulo5

a) F127Ac2
1,2

Relaciondeintensidades
1,15
1,1
1,05

(I335/I332)
1
0,95
0,9
0,85
5 4 3 2 1 0
LogC(%(w/v))

b) F127Ac4
1,2
1,15

Relaciondeintensidades
1,1
1,05

(I335/I332)
1
0,95
0,9
0,85
5 4 3 2 1 0
LogC(%(w/v))

c) F127Ac8
1,2
Relaciondeintensidades

1,15
1,1
1,05
(I335/I332)

1
0,95
0,9
0,85
5 4 3 2 1 0
LogC(%(w/v))
Figura5.1.RepresentacingrficadelarelacindeintensidadesI335/I332frenteal
logaritmodelaconcentracin(logC),a)F127Ac2,b)F127Ac4yc)F127Ac8.

EnlaTabla5.1serecogenlosvaloresdeCMCobtenidosporelmtododelpireno
paralostrescopolmerosestudiados.

197

Captulo5Capitulo

Tabla5.1.CMCsobtenidasporelmtododelpirenoparaloscompuestosacrilados,
F127Ac2,F127Ac4yF127Ac8.

DERIVADO CMC(%(w/v))a25C
F127Ac2 0.032
F127Ac4 0.014
F127Ac8 0.011

LaCMCdelosderivadosacriladossintetizadosesconsiderablementeinferiorala
descritaparaPluronicF127(0.25%(w/v)).133Laintroduccindegruposacrilato
en Pluronic F127 supone una importante disminucin de la CMC. Adems, la
funcionalizacin de la estructura de Pluronic F127 con dendrones es efectiva
para la reduccin de la CMC, tal y como se observa al pasar del copolmero
bloquelineal,F127Ac2,aloscopolmerosbloquedendrticolineal,F127Ac4y
F127Ac8.

5.1.2.Fotopolimerizacindelosnanogeles

Paralaobtencindelosnanogelesfotopolimerizadosseprepararondisoluciones
precursoras de F127Ac2, F127Ac4 y F127Ac8 en concentracin del 0.77 %
(w/v),utilizandoparasudisolucinaguadestiladaconun0.1%defotoiniciador
I2959.Estaconcentracinseeligideacuerdoalosestudiospreviosrealizados
porTaeetal,103enlosqueseobtuvieronnanogelesdeF127Ac2condiamtros
dealrededorde60nm.Asuvez,estaconcentracinessuperioralaCMCdelos
tres compuestos estudiados, lo que garantiza la autoorganizacin en micelas
necesariaparalaposteriorformacindelosnanoagregados.

Los agregados formados fueron estabilizados por fotopolimerizacin mediante

irradiacindeestasdisolucionesconluzUV.Posteriormente,lasdisolucionesse
dializaron. La dilisis se realiz a 4 C con el propsito de revertir las posibles

133
(a)Perry,C.C.;Sabir,T.S.;Livingston,W.J.;Milligan,J.R.;Chen,Q.;Maskiewicz,V.;
Boskovic,D.S.,JournalofColloidandInterfaceScience2011,354(2),662669;(b)Gao,
Q.;Liang,Q.;Yu,F.;Xu,J.;Zhao,Q.;Sun,B.,ColloidsandSurfacesb:Biointerfaces2011,
88(2),741748.

198

Captulo5

micelasnofotopolimerizadaspresentesenelsistemayeliminarlasenformade
monmerolibreendisolucin.Adems,trasesteproceso,seeliminanagregados
de tamao menor a 30 nm, debido a las caractersticas de la membrana de
dilisis.Finalmente,lasdisolucionessometidasadilisissefiltraronconfiltrosde
0.2 m para la eliminacin de agregados de tamao superior a los 200 nm. La
preparacin detallada de los nanogeles se describe en el apartado 6.2.i., de la
ParteExperimental.

EnlaFigura5.2semuestradeformaesquemticaelprocesodeformacindelos
nanogeles.Lasmicelasendisolucin(Figura5.2(a)),unavezfotopolimerizadas
(Figura5.2(b)),proporcionannanogelescondominioshidrfobosformadospor
los bloques de PPG y dominios hidrfilos formados por los bloques de PEG en
contactoconelagua.

UV365nm

10min

Gruposacrilato

CoronadePEG


NcleodePPG
a) C>CMC b)Nanogelfotopolimerizado

Figura5.2.Representacinesquemticadelprocesodeformacinmediante
fotopolimerizacindelosnanogeles,a)micelasformadasaconcentracinsuperiorala
CMC(ConcentracinMicelarCrtica);b)Nanogelfotopolimerizado.

Conelfindeidentificarlosdiferentesnanogelessehautilizadolanomenclatura
queseexplicaconelsiguienteejemplo.PDF/NF127Ac2identificaunnanogel
en el que las letras PDF/N indican que se trata de un nanogel (N) obtenido
mediantefotopolimerizacin(P),dializado(D)yfiltradoconfiltrode0.2m(F),
preparadoapartirdelcopolmeroF127Ac2.

199

Captulo5Capitulo

Teniendo en cuenta que la temperatura a la que se lleva a cabo la

fotopolimerizacin tiene influencia en el tamao de los agregados,84 se
realizaron experimentos de reticulacin a dos temperaturas distintas, 25 C y
37C.

Mientras que los nanogeles formados a 25 C permitieron un tratamiento

posterior de dializacin y filtracin, este no fue posible con los nanogeles
obtenidos a 37 C. Tras someter alproceso defotopolimerizacin a las micelas
denuestrosmaterialesa37C,lasdisolucionescorrespondientesalosnanogeles
formadosP/NF127Ac2,P/NF127Ac4yP/NF127Ac8,semostraronturbias,
y una vez dializadas, no fue posible su filtracin a travs de filtros de 0.2 m
debidoalasaturacindelfiltro.Laturbidezylaimposibilidaddelafiltracinde
lasmuestrassugeranlapresenciadeagregadosdegrantamao.Paraconfirmar
este hecho, se estudiaron por TEM los nanogeles PD/NF127Ac2
fotopolimerizadosa37Cydializados(sinfiltrar),ylosnanogelesPDF/NF127
Ac2fotopolimerizadosa25C,dializadosyfiltrados.

Traslafotopolimerizacina37C,losnanogelespresentaronmorfologaesfrica
contamaosdelordendelasmicras,comosepuedeobservarenlaFigura5.3
(a). Sin embargo los agregados obtenidos tras la fotopolimerizacin a 25 C
presentaron tamaos nanomtricos manteniendo la forma esfrica (Figura 5.3
(b)).Elmayortamaoobtenidoalrealizarlafotopolimerizacina37Csepuede
explicarporlamayormovilidadqueadquierenlasmicelasaestatemperatura,lo
quefavoreceelcontactomicelaryconellolaformacindeagregadosdemayor
tamao. Por otra parte, tambin se ha descrito que en los copolmeros bloque
queposeenLCST,elaumentodetemperaturafavoreceelaumentodelnmero
demolculasqueformanlasmicelas,formandomicelasdemayortamao.84

200

Captulo5

0.5m 0.5m

a)PD/NF127Ac2 b)PDF/NF127Ac2

Fotopolimerizacina37C Fotopolimerizacina25C

Figura5.3.ImgenesTEMdenanogelesdeF127Ac2,a)nanogelesobtenidosmediante
polimerizacina37Cydializados,b)nanogelesobtenidosmediantepolimerizacina
25C,dializadosyfiltrados.

Basndonos en estos resultados, y con el fin de asegurar la obtencin de

nanogeles de tamao nanomtrico, se seleccion temperatura de 25 C como
temperaturaparallevaracabolosexperimentosdefotopolimerizacin.

Noobstante,paralavalidacindelmtododeobtencinporfotopolimerizacin
establecidoparalosnanogelesyaplicadoalosmaterialesF127Ac4yF127Ac8,
tras la fotopolimerizacin de las muestras a 25 C, y como paso previo al
tratamiento de dilisis y filtracin, se comprob la correcta formacin de
nanogelesmedianteTEMySEM.

EnlaFigura5.4y5.5semuestranlasimgenesdeTEMySEMrespectivamente
detodoslosmaterialesestudiados,antesdesersometidosaprocesosdedilisis
yfiltracin.Entodaslasmuestras,tantoporTEMcomoporSEM,seobservla
presencia de nanogeles de forma esfrica y tamao nanomtrico tras la
fotopolimerizacin a 25 C, lo que confirma tambin la viabilidad del mtodo
descritoporTaeetal.yadaptadoparalapreparacindenanogelesapartirde
losderivadosF127Ac4yF127Ac8.

201

Captulo5Capitulo

200nm 50nm

a)P/NF127Ac2 b)P/NF127Ac2

500nm 100nm

c)P/NF127Ac4 d)P/NF127Ac4

100nm 50nm

e)P/NF127Ac8 f)P/NF127Ac8

Figura5.4.ImgenesTEMdenanogelespreparadosporpolimerizacina25C,a)yb)
P/NF127Ac2,c)yd)P/NF127Ac4,d)yf)P/NF127Ac8.

202

Captulo5

2m 1m

a)P/NF127Ac2 b)P/NF127Ac2

1m 500nm

c)P/NF127Ac4 d)P/NF127Ac4

1m 500nm

e)P/NF127Ac8 f)P/NF127Ac8

Figura5.5.ImgenesSEMdenanogelespreparadosporpolimerizacina25C,a)yb)
P/NF127Ac2,c)yd)P/NF127Ac4,d)yf)P/NF127Ac8.

5.1.3.Liofilizacindelosnanogelesfotopolimerizados

Unavezdemostradalaformacindenanogelestraslafotopolimerizacin,ytras
su purificacin por dilisis y filtracin, se procedi a la eliminacin del agua
medianteliofilizacin.Deestaformasepudoestimarelrendimientodelproceso
depreparacindelosnanogelesllevadoacabo.

203

Captulo5Capitulo

Para ello se tomaron 3 alcuotas de 5 mL cada una, de las disoluciones

correspondientes a PDF/NF127Ac2, PDF/NF127Ac4 y PDF/NF127Ac8. La
eliminacin del agua por liofilizacin y posterior pesada del residuo slido
permitiestimarlaconcentracinmediadenanogelesenlasdisoluciones(Tabla
5.2).

Tabla5.2.Miligramosdenanogelobtenidostraseltratamientodedilisisyfiltracinde
losnanogelesfotopolimerizados.

NANOGEL mgdenanogela Concentracin

S.D. (mg/mL)
PDF/NF127Ac2 2.50.5 0.50
PDF/NF127Ac4 3.30.6 0.54
PDF/NF127Ac8 11.50.1 1.90

a
Obtenidostraslaliofilizacindealcuotasde5mL.
S.D.DesviacinEstandar

Como se ha comentado en la introduccin de este captulo, de cara a sus

aplicaciones y manipulacin, es importante comprobar la posibilidad de
redisolucindelosnanogelestrassuliofilizacin.SloenelcasodePDF/NF127
Ac2seconsiguilaredisolucindelosnanogelesenagua,mientrasquenose
consigui la redisolucin en agua o en disolventes orgnicos de los nanogeles
PDFNF127Ac4yPDFNF127Ac8.

Estosresultadostienenimplicacionesenestudiosposteriores,comoporejemplo
los estudios de encapsulacin de molculas enel interior de los nanogeles y la
determinacin de la viabilidad celular, ya que es fundamental conocer la
concentracindelasdisolucionesconlasquesetrabaja.Paraelcasodelosdos
materialesquenopermitensuredisolucin,PDFNF127Ac4yPDFNF127Ac
8, las concentraciones de trabajo utilizadas son las que se recogen en la Tabla
5.2.

204

Captulo5

5.2.ENCAPSULACINENNANOGELESPDF/NF127Acn(n=2,4y8)

La naturaleza anffila de los nanogeles preparados permite la encapsulacin en

suinteriordemolculastantohidrfilascomohidrfobas.

Parademostrarlaposibilidaddeencapsulacinambostiposdemolculassehan
realizado estudios eligiendo como molcula hidrfila la rodamina B y como
molculahidrfobaelpireno,cuyasestructurassemuestranenlaFigura5.6.

RodaminaBmolculahidrfilaPirenomolculahidrfoba

Figura5.6.EstructuraqumicadeRodaminaByPirenoutilizadosparalaencapsulacin
enlosnanogeles.

La encapsulacin de ambas molculas se realiz utilizando el mtodo de

evaporacin de disolvente.79b Este mtodo consiste en la disolucin de las
molculas hidrfilas o hidrfobas en un disolvente orgnico de bajo punto de
ebullicin y miscible con el agua, y la adicin de esta disolucin sobre la
disolucin acuosa de los nanogeles fotopolimerizados. Tras la evaporacin del
disolvente orgnico, las molculas hidrfilas quedan retenidas en los dominios
hidrfilos del nanogel y las molculas hidrfobas se localizan en los ncleos
hidrfobos del mismo. La posterior eliminacin de las molculas no
encapsuladas,pordistintastcnicasenfuncindelanaturalezadelamolculaa
encapsular,proporcionadisolucionesacuosasdenanogelescargados.Elmtodo
depreparacindelosnanogelescargadosconrodaminaBypirenosedetallaen
elapartado6.2.k.,delaParteExperimental.

205

Captulo5Capitulo

En la Tabla 5.3 se muestran los resultados obtenidos para la encapsulacin de

rodamina B y pireno, en los nanogeles preparados con los tres derivados
acrilados, y que identificaremos con la nomenclatura PDFNF127AcnROD y
PDFNF127AcnPIR, respectivamente. Los valores de encapsulacin estn
expresados mediante tres parmetros distintos: como g de molcula
encapsulada por miligramo de nanogel, Eficiencia de Encapsulacin, EE (%), y
porcentaje en peso de molcula encapsulada con respecto a la cantidad de
fluorforo(rodaminaBopireno)inicialaadida,siempreenexceso.

Tabla5.3.ResultadosdeencapsulacinderodaminaBypirenoenlosnanogeles.

gencap./mg
NANOGEL EE(%) %encap.a
nanogel
PDF/NF127Ac2ROD 56.9 40.6 37.2
PDF/NF127Ac4ROD 68.9 48.8 45.3
PDF/NF127Ac8ROD 71.1 50.6 47.1
PDF/NF127Ac2PIR 67.8 46.3 42.6
PDF/NF127Ac4PIR 54.7 37.8 34.4
PDF/NF127Ac8PIR 59.4 40.9 37.4

a
%enpesodemolculaencapsuladaconrespectoalpesodefluorforo(rodaminaB
opireno)aadido(0.15mgdefluorforo/mgdenanogel).

LacantidadderodaminaBypirenoencapsuladoexpresadacomolaEficienciade
Encapsulacin(EE%),secalculaapartirdelassiguientesecuaciones:79b

% 100

% 100

206

Captulo5

% 100

En general, los tres nanogeles preparados presentan EE alrededor de 4050 %

tanto para la molcula hidrfila, rodamina B, como la hidrfoba, pireno. En el
caso de la rodamina B se observa un aumento de la EE con el aumento del
nmero de grupos reactivos del copolmero utilizado en la preparacin de los
nanogeles. As, los nanogeles PDF/NF127Ac8ROD presentan un aumento de
EEdeun10%conrespectoalosnanogelesdelderivadolineal,PDF/NF127Ac2
ROD. Sin embargo, para el pireno no se observa una tendencia clara en la
variacin de la EE, siendo los nanogeles PDF/NF127Ac2PIR los que ofrecen
unaEEmsalta.

Junto a estos valores experimentales, tambin se ha podido comprobar la

encapsulacindeambasmolculasenestosnanogelesutilizandootrosmtodos.
As, mientras que la carga de rodamina B se ha podido visualizar mediante
difraccin de electronesTEM (ver apartado 5.3), la correcta encapsulacin de
pirenosedemostrmedianteestudiosdeexcitacinconluz.

Como se ha comentado anteriormente, el pireno experimenta un

desplazamiento de su mximo de excitacin cuando pasa de un entorno
hidrfilo, 332 nm, a uno hidrfobo, 335 nm. El pireno en el interior de los
nanogelessesituarprevisiblementeenlosdominioshidrfobos,observndose
por tanto el mximo de excitacin de los nanogeles cargados a 335 nm. En
efecto, en la Figura 5.7 se muestran los espectros de excitacin para PDF/N
F127Ac2,PDF/NF127Ac4yPDF/NF127Ac8dndeseobservaelmximoen
elespectrodeexcitacina335nm,debidoalpirenoenunentornohidrfobo,
demostrandolacorrectaencapsulacindesteenelinteriordelosnanogeles.

207

Captulo5Capitulo

800 =332
700

600
PFF/NF127Ac2PIR
500
Intensidad

PFF/NF127Ac4PIR
400

300 PFF/NF127Ac8PIR

200

100

0
300 310 320 330 340 350
Longituddeonda(nm)
Figura5.7.Espectrosdeexcitacindelosnanogelescargadosconpireno.
Desplazamientodelmximodeexcitacina335nmdebidoalpirenosituadoenun
entornohidrfobo.

5.3.CARACTERIZACINMORFOLGICADENANOGELESPDF/NF127Acn(n=2,
4y8)

Lamorfologaytamaodelosdistintosnanogelespreparadosfueestudiadapor
TEM,SEMyDLS.

Morfologa

En la Figura 5.8 y Figura 5.9 se muestran las imgenes de TEM y SEM

respectivamenteparalosnanogelesPDF/NF127Acn(n=2,4y8).Enelapartado
5.1.2.serecogenlasimgenesdeTEMcorrespondientesalosnanogelestrassu
fotopolimerizacin.Trasladilisisyfiltracintodoslosnanogelespreparadosa
partirdelos3derivadosacriladosmantuvieronsuformaesfricasinproducirse
agregacinentreellos.

208

Captulo5

500nm 100nm

a)PDF/NF127Ac2 b)PDF/NF127Ac2

100nm 100nm

c)PDF/NF127Ac4 d)PDF/NF127Ac4

500nm 50nm

e)PDF/NF127Ac8 f)PDF/NF127Ac8

Figura5.8.ImgenesTEMdenanogelesfotopolimerizadosa25C,dializadosyfiltados
a)yb)PDF/NF127Ac2,c)yd)PDF/NF127Ac4,d)yf)PDF/NF127Ac8.

209

Captulo5Capitulo

1m 500nm

a)PDF/NF127Ac2 b)PDF/NF127Ac4

200nm 500nm

c)PDF/NF127Ac4 d)PDF/NF127Ac8

Figura5.9.ImgenesSEMdenanogelesfotopolimerizadosa25C,dializadosyfiltrados
a)PDF/NF127Ac2,b)yc)PDF/NF127Ac4yd)PDF/NF127Ac8.

En cuanto a los nanogeles PDF/NF127Ac2red (nanogeles tras su liofilizacin

redisueltos en agua), se comprueba la recuperacin de la morfologa inicial,
como demuestran las imgenes de TEM y SEM, Figuras 5.10 y 5.11,
respectivamente.

210

Captulo5

200nm 100nm

a)PDF/NF127Ac2REDISUELTO b)PDF/NF127Ac2REDISUELTO

Figura5.10.ImgenesTEMdenanogelesPDF/NF127Ac2redisueltosenaguadestilada
trassersometidosaliofilizacin.

500nm 500nm

a)PDF/NF127Ac2REDISUELTO b)PDF/NF127Ac2REDISUELTO

Figura5.11.ImgenesSEMdenanogelesPDF/NF127Ac2redisueltosenaguadestilada
trassersometidosaliofilizacin.

Por lo que respecta a los nanogeles cargados, mediante TEM (Figura 5.12) se
observlamorfologaredondeadadelosnanogelestraslacargaderodaminaB.

As mismo, mediante TEM en campo oscuro, que permite la deteccin de los

electrones difractados debido a estructuras cristalinas, se detect la difraccin
debidaalarodaminaB(Figura5.12(b),(d)y(f),encolorblanco)coincidentecon
los nanogeles observados por TEM (Figura 5.12 (b), (c)ye), encolor negro), lo
queindicasuencapsulacin.

211

Captulo5Capitulo

100nm 200 nm

a)PDF/NF127Ac2ROD b)PDF/NF127Ac2ROD

200nm 200nm

c)PDF/NF127Ac4ROD d)PDF/NF127Ac4ROD

100nm 100nm

e)PDF/NF127Ac8ROD f)PDF/NF127Ac8ROD

Figura5.12.ImgenesTEMdenanogelesfotopolimerizadosa25C,dializados,filtrados
ycargadosconrodaminaB:a)PDF/NF127Ac2RODencampoclaro,b)PDF/NF127
Ac2RODencampooscuroc)PDF/NF127Ac4RODencampoclaro,d)PDF/NF127Ac
4RODencampooscurod)PDF/NF127Ac8RODencampoclaro,f)PDF/NF127Ac8
RODencampooscuro.

212

Captulo5

Cabe destacar, que ninguno de los nanogeles sin cargar present difraccin de
electrones,confirmandoqueladifraccinesdebidaalarodaminaBcargadaen
el interior de los nanogeles. En la Figura 5.13 (a) se muestran los puntos de
difraccin obtenidos para los nanogeles PDF/NF127Ac2ROD, donde se
observaladifraccinatribuidaalarodaminaBenelinteriordelosnanogelesy
para los nanogeles PDF/NF127Ac2 sin cargar (Figura 5.13 (b)), donde no se
observaningunasealdedifraccin.

a) b)

Figura5.13.PatronesdedifraccindelosnanogelesPDF/NF127Ac2a)nanogeles
cargadosconrodaminaByb)nanogelessincargar.Lospuntosblancoscorrespondena
distintospuntosdedifraccin,algunosdeloscualessesealanconflechas.

Por SEM se observ tambin la morfologa redondeada de los nanogeles

cargadosconrodaminaB(Figura5.14).

213

Captulo5Capitulo

500nm 400nm

a)PDF/NF127Ac2ROD b)PDF/NF127Ac2ROD

400nm 300nm

c)PDF/NF127Ac4ROD d)PDF/NF127Ac4ROD

1m 500nm

e)PDF/NF127Ac8ROD f)PDF/NF127Ac8ROD

Figura5.14.ImgenesSEMdenanogelesfotopolimerizadosa25C,dializados,filtrados
ycargadosconrodaminaBa)yb)nanogelesdeF127Ac2,c)yd)nanogelesdeF127Ac
4,d)yf)nanogelesdeF127Ac8.

214

Captulo5

Por TEM (Figura 5.15) y por SEM (Figura 5.16) se observaron morfologas
redondeadasparalosnanogelesPDF/NF127Ac2PIRyPDF/NF127Ac4PIR.

100nm 50nm

a)PDF/NF127Ac2PIR b)PDF/NF127Ac2PIR

200nm 100nm

c)PDF/NF127Ac4PIR d)PDF/NF127Ac4PIR

Figura5.15.ImgenesTEMdenanogelesfotopolimerizadosa25C,dializados,filtrados
ycargadosconPirenoa)yb)PDF/NF127Ac2PIR,c)yd)PDF/NF127Ac4PIR.

215

Captulo5Capitulo

500nm 400nm

a)PDF/NF127Ac2PIR b)PDF/NF127Ac2PIR

500nm 400nm

c)PDF/NF127Ac4PIR d)PDF/NF127Ac4PIR

Figura5.16.ImgenesSEMdenanogelesfotopolimerizadosa25C,dializados,filtrados
ycargadosconPirenoa)yb)PDF/NF127Ac2PIR,c)yd)PDF/NF127Ac4PIR.

Tamao

EltamaodelosnanogelesobtenidosendisolucinsemidimedianteDLS.No
obstante, se midieron tambin los dimetros medios de los nanoobjetos
observados en las imgenes de TEM y SEM. En la Tabla 5.4 se recogen los
dimetros estimados mediante TEM, SEM y DLS para diferentes nanogeles,
PDF/NF127Acn(n=2,4,8)sincargar,PDF/NF127Ac2red,nanogelredisuelto
despus de ser liofilizado y los nanogeles cargados con rodamina B y pireno,
PDF/NF127AcnROD(n=2,4,8)yPDF/NF127AcnPIR(n=2,4,8).

216

 Captulo5

Tabla5.4.Dimetrosdediferentesnanogelesestudiados,estimadosporTEMySEMy
porDLSa25Cy37C.

TEMa SEMa DLS25C DLS37C

NANOGEL (nm) (nm) (nm)S.D. (nm)S.D.
S.D. S.D. PolidispersidadS.D. PolidispersidadS.D.

61.91 520.3
PDF/NF127Ac2 9542 13822b
0.1950.006 0.1790.009
74.90.7 56.50.9
PDF/NF127Ac4 5216 4110
0.4390.009 0.3910.011
126.59.2 1020.9
PDF/NF127Ac8 6331 119.838
0.5590.071 0.3580.021
62.411.4 31.53.4
PDF/NF127Ac2redis 81.336.8 69.228
0.5430.069 0.1970.051
130.21.5 123.31.8
PDF/NF127Ac2ROD 82.544 68.227
0.4730.012 0.3790.050
891 72.18.1
PDF/NF127Ac4ROD 89.840 59.130
0.4230.012 0.4390.117
146.91.6 124.44.1
PDF/NF127Ac8ROD 145.531b 135.731b
0.2940.009 0.3030.008
55.80.5 49.90.4
PDF/NF127Ac2PIR 61.225 64.413
0.1820.005 0.1880.02
76.13 63.21.1
PDF/NF127Ac4PIR 46.614.4 58.813.5
0.5180.078 0.5700.03
95.72.6 85.01.2
PDF/NF127Ac8PIR
0.3770.002 0.2820.008

a
Tamaoscalculadoscomolamediadelamedidade,almenos,20nanogeles.
b
Tamaoscalculadoscomolamediadelamedidademenosde10nanogeles.
S.D.DesviacinEstndar.

Antesdepasaracomentarlosresultadosencontradosesprecisotenerencuenta
quelatcnicadeDLSmideeldimetrohidrodinmico,mientrasqueporSEMy
TEM las medidas se realizan sobre muestras deshidratadas, lo que puede dar
lugaraunadiscordanciaenlostamaosestimadosdeldimetroconrespectoa

217

Captulo5Capitulo

losnanogelesendisolucin,talycomosehaobservado.Adems,enalgunosde
los casos se obtienen diferencias significativas de tamao entre lo medio por
TEM y lo medido por SEM, que pueden ser debidas a la presencia de un
recubrimientodeorocomopartedelapreparacindelamuestraparaSEM.Este
recubrimiento puede alcanzar un espesor suficiente que enmascara los
nanoobjetosdemenortamao,dandolugaramedidasquepuedensererrneas.
Finalmente,enalgunasmuestrasdeTEMy/oSEMelmuestreofueinferiora20
nanogelesoinclusoenPDF/NF127Ac8PIRnosevisualizaronlosnanogeles,lo
queseatribuyaldeteriorodelamuestra.

Porloanteriorexpuesto,ydadoqueelmediodeaplicacindelosnanogeleses
en disolucin, la discusin se va a centraren los resultados obtenidos por DLS.
Conelfindeobservarlaposibletermosensibilidaddelosnanogeles,lasmedidas
serealizaronadostemperaturas,25Cy37C.

Tal y como se observa en los datos obtenidos por DLS a 37 C, los nanogeles
estudiadostienendimetrosentre50100nm,porloquesepuededecirque,en
general,sutamaoeseladecuadoparasuaplicacinentransporteyliberacin
controladadefrmacos.

DelanlisisdeestosdatosexperimentalessepuedecomentarquemedianteDLS
a 25 C los nanogeles fotopolimerizados PDF/NF127Acn (n=2, 4, 8) muestran
unincrementodeltamaoconelaumentodegeneracindelderivadoutilizado,
loqueresultacoherenteconelmayortamaodelasmolculasalincrementarla
generacindelaestructuradendrtica.

Esta tcnica, adems, corrobora que estos nanogeles PDF/NF127Acn (n=2, 4,

8)sontermosensibles,observndoseunadisminucindetamao,de10nmpara
PDF/NF127Ac2, 18.4 nm para PDF/NF127Ac4 y 24.5 nm para PDF/NF127
Ac8,conelaumentodelatemperatura,de25Ca37C.

En cuanto a los nanogeles PDF/F127Ac2redisuelto (nanogeles redisueltos en

aguatrassuliofilizacin),secompruebalarecuperacindeltamaoinicial,como

218

Captulo5

demuestran los valores de DLS a 25 C. As mismo, se comprob que la

termosensibilidad se mantiene tras el proceso de liofilizacin y redisolucin, si
bien varia en mayor medida tras la redisolucin, mostrando menor tamao las
partculasa37C

Del anlisis de los resultados obtenidos con los nanogeles cargados, se puede
comentarqueenelcasodelosnanogelescargadosconrodaminaBseprodujo
un aumento del tamao con respecto a los nanogeles no cargados, siendo la
variacin de tamao de 68.3 nm para PDF/NF127Ac2ROD, de 14 nm para
PDF/NF127Ac4RODyde20.4nmparaPDF/NF127Ac8(medidasa25C).El
incremento ms significativo de tamao, que se produce para los nanogeles
PDF/NF127Ac2ROD, puede atribuirse a una estructura externa del nanogel
menos rgida debido a la menor cantidad de grupos acrilato presentes, lo que
permiteunamayordeformacindelnanogelparaalojarlarodaminaB.

A diferencia de lo observado en la encapsulacin de la molcula hidrfila, la

encapsulacin de pireno no produjo aumento de tamao con respecto a los
nanogelessincargar.

Aligualqueenlosotroscasosestudiados,losnanogelescargadosmantienensu
comportamiento termosensible como se deduce de los tamaos determinados
porDLS,alasdostemperaturas(Tabla5.4).Lasvariacionesdetamaocoinciden
conlasobservadasenlosnanogelessincargar.

5.4.ENSAYOSCELULARES

Los ensayos celulares con estos materiales han consistido en el estudio de su

toxicidad, evaluando la viabilidad celular, as como ensayos preliminares de
internalizacin celular. Ambos tipos de estudios han sido realizados en
colaboracin con la Dra. Pilar Martn Duque, investigadora ARAID, y Rebeca
Gonzlez,enelCIBA(CentrodeInvestigacionesBiomdicasdeAragn,IACS).

219

Captulo5Capitulo

5.4.1.Viabilidadcelular

La citotoxicidad de los nanogeles se determin mediante ensayos de viabilidad

celular,utilizandodoslneascelulares:MSC(clulasmesenquimalesderatn)y
HeLa(clulascancergenas,HomoSapiensCervixAdenocarcinoma).

ConelmaterialPDF/NF127Ac2seensayarontresconcentraciones,0.25,0.5y
1 mg/mL, preparando estas muestras por disolucin directa del material
liofilizadoenmediodecultivoDMEMF12paraclulasMSCyDMEMhighglucose
paraclulasHeLa,alaconcentracindeseada.

Debido a la imposibilidad de redisolucin tras la liofilizacin, los ensayos

celulares con PDF/NF127Ac4 y PDF/NF127Ac8 se realizaron con las
disoluciones que se obtienen tras el proceso de fotopolimerizacin, dilisis y
filtracin tal y como se ha explicado en el apartado 5.1.3. (ver Tabla 5.2). Esto
implica que las muestras se obtienen disueltas en agua destilada. Para los
ensayosdetoxicidad,seajustlaconcentracinporadicindemediodecultivo
DMEMF12paraclulasMSCyDMEMhighglucoseparaclulasHeLa.

EnelcasodePDF/NF127Ac4(conunaconcentracinenaguadestiladade0.54
mg/ml)los ensayosdeviabilidadcelularsloserealizaronaunaconcentracin
de0.25mg/ml.Porelcontrario,conPDF/NF127Ac8(conunaconcentracinen
aguadestiladade1.9mg/ml)seensayaronalastresconcentraciones,0.25,0.5y
1mg/ml.

Los protocolos de trabajo seguidos para la preparacin de las clulas,

preparacin de las disoluciones de nanogeles y preparacin de los ensayos de
viabilidad celular se describen con detalle en el apartado 6.2.l., de la Parte
Experimental. Los estudios de viabilidad celular se realizaron utilizando el
mtodoAlamarBlue,quesedescribeenelAnexoIII.

EnlaFigura5.17semuestranlosresultadosdeviabilidadcelularobtenidospara
lostrestiposdenanogelesestudiadosconlasdoslneascelulares.

220

Captulo5

a) PDF/NF127Acn(n=2,4,8) b) PDF/NF127Acn(n=2,4,8)
0.25mg/mLHeLa 0.25mg/mlMSC
140
ViabilidadCelular(%) 117,0 140

ViabilidadCelular(%)
102,0 111,3
120 120
80,4
100 63,3 81,2 100 75,1
74,8 64,5 62,7
80 80
57,4 43,1 53,0
60 60 19,6 32,6 56,1
40,9
40 40 12,9
20 20
0 0
24horas 48horas 72horas 24horas 48horas 72horas

c) PDF/NF127Acn(n=2,8) d) PDF/NF127Acn(n=2,8)
0.5mg/mLHeLa 0.5mg/mlMSC
140 119,0 140
ViabilidadCelular(%)

ViabilidadCelular(%)
120 120
100 77,9 100
61,6 71,6
80 61,2 54,7 80 59,6
60 42,1 60 33,4
40 40 30,9 24,0
20 20 14,7
0 0
24horas 48horas 72horas 24horas 48horas 72horas

e) PDF/NF127Acn(n=2,8) f) PDF/NF127Acn(n=2,8)
1mg/mLHeLa 1mg/mlMSC
140 140
ViabilidadCelular(%)

ViabilidadCelular(%)

120 108,8
120
100 100
80 80 53,3
47,6 53,1 50,2
60 48,3 60
40 40 18,9
12,9 17,1 8,4 8,1
20 4,9 20
0 0
24horas 48horas 72horas 24horas 48horas 72horas

PDF/NF127Ac2PDF/NF127Ac4PDF/NF127Ac8
Figura5.17.ViabilidadcelulardelosnanogelesPDF/NF127Ac2,PDF/NF127Ac4y
PDF/NF127Ac8,aconcentraciones0.25mg/mL(ayb),0.5mg/mL(cyd)y1mg/mL
(eyf),encultivosconclulasHeLa(columnadelaizquierda)yconclulasMSC
(columnadeladerecha).

ParaclulasHeLa,losnanogelesPDF/NF127Ac4yPDF/NF127Ac8sonmenos
citotxicos a concentracin 0.25 mg/ml tras 72 horas de ensayo que los
nanogelesPDF/NF127Ac2.Cabedestacar,quelosnanogelesPDF/NF127Ac8

221

Captulo5Capitulo

presentan tras 72 horas a concentracin 1 mg/ml, los mejores niveles de

viabilidadcelular(superioral50%)paraestetipodeclulas.

De forma general, los nanogeles resultaron significativamente ms txicos con

MSC.Losporcentajesdesupervivenciacelulardisminuyenanivelesinferioresal
30% con el paso del tiempo y el incremento de la concentracin. Si bien, se
repite el hecho de que PDF/NF127Ac8 es, en general, menos txico que
PDF/NF127Ac2,especialmenteaconcentracionesinferioresa1mg/mL.

Por otra parte, con el fin de poder comparar nuestros resultados con anlogos
descritos en la literatura, decir que los nicos valores de viabilidad celular
comparables, han sido descritos para PDF/NF127Ac2. Estos nanogeles a una
concentracin de 1 mg/mL, tras 24 horas de ensayo, con cultivos con clulas
tumorales SCC7, mostraron viabilidades prximas al 100%.76b Estos resultados
reflejan la clara influencia del tipo de clula utilizada para la realizacin de los
ensayosenelvalordelaviabilidadcelular.

5.4.2.Ensayosdeinternalizacin

Conelfindeanalizarlacapacidaddeestosnanogelesdeaccederalinteriorde
las clulas, se han realizado tambin ensayos de internalizacin celular,
utilizandoparaelmarcajedelosnanogelesrodaminaByunamolculaderivada
delamisma,talycomosediscuteenlossiguientessubapartados.

EstudiosdeinternalizacindenanogelescargadosconrodaminaB

Este tipo de ensayo consiste en el estudio del proceso de entrada de los

nanogeles en el interior de clulas. Para la realizacin de estos estudios se
utilizaron clulas tumorales HeLa, que se incubaron durante 4 horas junto con
disolucionesenaguadestiladadelosnanogelescargadosconrodaminaB,alas
quepreviamenteseajustlaconcentracinporadicindemediodecultivohigh
glucose. Se han utilizado nanogeles cargados con rodamina B con el fin de

222

Captulo5

visualizar la localizacin de los nanogeles con respecto de las clulas mediante

microscopiaconfocaldefluorescencia.

Paraestosestudios,los filamentosdeactinadelcitoesqueletodelasclulasse
marcaron utilizando el fluorforo verde Alexa fluor 488, y el ncleo se ti
utilizando el fluorforo azul DAPI. Esta tincin permite distinguirlos de los
nanogeles cargados que se observaron de color rosa, caracterstico de la
rodamina B. El procedimiento de preparacin, incubacin de las clulas con la
disolucin de nanogel cargado con rodamina B y marcaje de las clulas se
describeenelapartado6.2.l.,delaParteExperimental.

EnlaTabla5.5serecogenlascaractersticasgeneralesrelativasalosensayosde
internalizacin realizados. En la primera y la segunda columna se incluyen la
concentracin de nanogel y la cantidad de rodamina B encapsulada por
miligramodenanogelenladisolucininicialdenanogeles,respectivamente.La
tercera columna recoge la concentracin final de nanogel utilizada en los
ensayos de internalizacin tras ajustar la concentracin por adicin de DMEM
highglucose,hastaunvolumentotalde500L.Lacuartacolumnacorresponde
alacantidadtotalderodaminaBencapsuladapresenteenelensayo.

Tabla5.5.ConcentracindenanogelesycantidadderodaminaButilizadaenlos
ensayosdeinternalizacin.

gROD
C.disa C.Intb gRODc
NANOGEL encap./mg
(mg/mL) .(mg/mL) encap.
nanogel
PDF/NF127Ac2ROD 1.0* 56.9 0.8 23
PDF/NF127Ac4ROD 0.54 68.9 0.5 17
0.675 23
PDF/NF127Ac8ROD 1.90 71.1
1.35 48

a
Concentracindenanogelenladisolucininicial,enaguadestilada
b
Concentracindenanogelenelensayodeinternalizacin.
c
g de rodamina B encapsulados presentes en un volumen de 500 L utilizados en el
ensayodeinternalizacin.
*Concentracinobtenidaporredisolucindenanogelesliofilizadosenaguadestilada.

223

Captulo5Capitulo

LaconcentracinfinalderodaminaBdelnanogelPDF/NF127Ac4RODestuvo
limitada por la baja concentracin de nanogel obtenida tras la preparacin y
tratamiento de los nanogeles, proporcionando disoluciones con menor
contenidodenanogelesyrodaminaBencapsulada.

En la Figura 5.18 se recogen las imgenes de microscopia confocal de

fluorescenciadelosdiferentesnanogelesestudiados:PDF/NF127Ac2ROD(23
g), PDF/NF127Ac4ROD (17 g) y PDF/NF127Ac8ROD (23 g). En la parte
superiordedichafigurasemuestranloscontrolesrealizadosincubandoclulas
HeLaconrodaminaBenformalibre,enlamismacantidadderodaminaBquela
encapsuladaenlosnanogeles(17y23g).Comocontrol,lasimgenes(a)y(b)
muestran la internalizacin de rodamina B, la cual entra en las clulas
localizndose en el citoesqueleto de estas. Es sabido que la internalizacin de
molculas de pequeo tamao se produce por mecanismos de difusin no
energticos, producidos por la simple presencia de un gradiente de
concentracin.134

EnelcasodelarodaminaBencapsuladaenlosnanogelesPDF/NF127Ac2ROD
y PDF/NF127Ac8ROD (Figura 5.18 (c) y (e) respectivamente) tambin se
observ internalizacin de rodamina B en las clulas. En este caso, y debido al
tamaoquepresentanlosnanogelescargadosconrodaminaB,cabeesperarun
procesodeinternalizacinporendocitosis.134Uncasoparticulareselobservado
con PDF/NF127Ac4ROD (Figura 5.18 (d)), detectndose la ruptura del
citoesqueleto, probablemente debido a la baja concentracin de medio de
cultivo presente en el ensayo, que da lugar a una disolucin hipotnica y la
consiguiente explosin de las paredes celulares. Con estos ensayos cualitativos
realizados es difcil percibir el grado de internalizacin de los nanogeles con
rodaminaBconrespectoaloscontrolesascomodiferenciarsilarodaminaBse
liberaantesdeentrarenlaclula,alaqueentrapordifusin.

134
Alberts,B.,Johnson,A.,Lewis,J.,Raff,M.,Roberts,K.,Walter,P.,MolecularBiology
oftheCell,4thedition,GarlandScience,NewYork.2002.

224

Captulo5

a) b)

CONTROL37CROD(23g) CONTROL37CROD(17g)

c) d)

PDF/NF127Ac2ROD37C(23g) PDF/NF127Ac4ROD37C(17g)

e)

PDF/NF127Ac8ROD37C(23g)

Figura5.18.Imgenesdemicroscopaconfocaldelosensayosdeinternalizacincelular,
tras4horasdeincubacin.EnsayosdecontrolconrodaminaBlibrea37C:a)23gyb)
17g.EnsayosconrodaminaBencapsulada:c)PDF/NF127Ac2ROD,d)PDF/NF127
Ac4RODye)PDF/NF127Ac8ROD.Enazul:ncleocelular,enverde:actinadel
citoesqueleto,enrojo:rodaminaB.Laescalacorrespondea20m.

225

Captulo5Capitulo

Para intentar dilucidar el grado de internalizacin de los nanogeles, se

plantearon ensayos a dos temperaturas, 4 C y 37 C, con nanogeles PDF/N
F127Ac8ROD. Para estos ensayos se utiliz una mayor concentracin de
nanogel y por tanto una mayor cantidad de rodamina B cargada, 48 g, con el
objetivo de conseguir una mayor intensidad de fluorescencia que la observada
paraensayosrealizadosamenorconcentracin.Laseleccindelatemperatura
de 4 C responde a que los procesos de internalizacin que requieren gasto
energtico,comoeslaendocitosis,seencuentraninhibidosaestatemperatura,
lo que debera impedir por tanto la internalizacin de nanogeles cargados con
rodaminaB,queseinternalizaporestemecanismo.Sinembargo,ladifusinde
rodamina B libre no se vera inhibida al tratarse de un proceso sin coste
energticoparalaclula.

En la Figura 5.19 se muestran los ensayos de controles y los de internalizacin

realizadosalasdostemperaturasdetrabajo.

EnamboscontrolessedetectalainternalizacinderodaminaBensuformalibre
debida a procesos de difusin (imagenes (a) y (b)). Como se ha observado y
comentadoanteriormente,a37Cdenuevoseproducelainternalizacindelos
nanogeles (imagen (c)), siendo difcil percibir el grado de internalizacin con
respecto al control. A 4 C se observa un aumento de la fluorescencia en el
interiordelasclulas(imagen(d))conrespectoalensayoanlogorealizadoa37
C(imagen(c)).ConsiderandoquelarodaminaBencapsuladaenlosnanogeles
nopuedeinternalizarseporquea4Cseproducelainhibicindelaendocitosis,
elaumentodefluorescenciadebecorresponderarodaminaBlibreinternalizada
porunprocesodedifusin.Porello,estosresultadosparecenindicarquedebido
a la termosensibilidad que presentan los nanogeles, stos experimentan un
aumento de tamao con la disminucin de la temperatura, lo que produce la
liberacinalmediodelarodaminaBencapsulada,creandoasungradientede
concentracin responsable de la internalizacin de la rodamina B en su forma
libreporunprocesodedifusin.Estacircunstanciahacequeesteexperimento

226

Captulo5

no sea el ms adecuado para estudiar el grado de internalizacin de los

nanogeles.

a) b)

CONTROL37CROD(48g) CONTROL4CROD(48g)

c) d)

PDF/NF127Ac8ROD37C(48g) PDF/NF127Ac8ROD4C(48g)
Figura5.19.Imgenesdemicroscopiaconfocaldelosensayosdeinternalizacincelular,
tras4horasdeincubacin.EnsayosdecontrolconrodaminaBlibre:a)48g,37Cyb)
48g,4C.EnsayosconrodaminaBencapsulada:c)PDF/NF127Ac8RODa37C,d)
PDF/NF127Ac8RODa4C.Enazul:ncleocelular,enverde:actinadelcitoesqueleto,
enrojo:rodaminaB.Laescalacorrespondea20m.

ConelfindemodificarlarpidaliberacindelarodaminaBa4Calmediode
ensayo,debidofundamentalmenteasuelevadasolubilidadenagua,sepensen
un modelo ms adecuado que permitiera comprobar la encapsulacin y los
procesos de internalizacin por endocitosis de los nanogeles cargados, modelo
queseexplicaacontinuacin.

227

Captulo5Capitulo

Estudios de internalizacin de nanogeles cargados con RodaminaEST

(rodaminacidoesterico)

Para asegurar unamayor retencin de la rodamina en el interior delnanogel y

disminuirsurpidaliberacinseplantelasntesisdeunamolculafluorescente
derivadaderodaminaBdecarcteranffilo,quepermitainducirinteraccionesno
covalenteshidrfobasconelnanogelascomomodificarsusolubilidadenagua.

ConestefinsediseunamolculafuncionalizadaconundendrndebisMPA
de primera generacin con cadenas terminales de cido esterico (Rodamina
EST), cuya estructura se muestra en la Figura 5.20. Esta molcula, que ha sido
sintetizada y utilizada en el grupo de investigacin, ha demostrado una mayor
capacidaddeinternalizacinenlasclulaspordifusinensuformalibrequela
rodaminaB,loquepuedefacilitarestudioscomparativoscualitativos.

Figura5.20.EstructuraqumicadelarodaminaESTquesecaracterizaporsucarcter
anffilo.

El procedimiento de encapsulacin de la rodaminaEST en el interior de los

nanogelesfuesimilaralutilizadoparalaencapsulacinderodaminaB,descrito
enelapartado6.2.k.,delaParteExperimental,aunqueeliminandolaetapade
purificacinpordilisis,dadoquelamolculaespocosolubleenagua.Deesta
forma se consider que toda la molcula adicionada queda encapsulada en el
interiordelosnanogeles.

228

Captulo5

ParalaincubacindelasclulasHeLaconlosnanogelescargadosconrodamina
ESTylatincindelasclulasconAlexafluor488yDAPIseprocediconformeal
procedimientodescritoenelapartado6.2.l.,delaParteExperimental.

En la Tabla 5.6 se muestra la concentracin de nanogel y rodaminaEST

encapsulada en la disolucin inicial, as como la concentracin final de nanogel
utilizada en los ensayos de internalizacin, obtenida tras el ajuste de la
concentacin por adicin de DMEM high glucose, as como la cantidad de
rodaminaEST presente. De nuevo, los ensayos con los nanogeles de F127Ac4
estuvieron limitados por la baja concentracin de estos en disolucin,
ensayandoseaunaconcentracinmsbajaqueelrestodenanogeles.

Tabla5.6.ConcentracindenanogelesycantidadderodaminaESTutilizadaenlos
ensayosdeinternalizacin.

gRODEST
C.dis.a C.intb gRODEST
NANOGEL encap./mg
(mg/mL) (mg/mL) encap.
nanogel
PDF/NF127Ac2RODEST 1.0* 150 0.64 50
PDF/NF127Ac4RODEST 0.54 150 0.32 25
PDF/NF127Ac8RODEST 1.90 150 0.64 50

a
Concentracindenanogelenladisolucininicial,enaguadestilada.
b
Concentracindenanogelenelensayodeinternalizacin.
c
gderodaminaESTencapsuladospresentesenunvolumende500Lutilizadosenel
ensayodeinternalizacin.
*Concentracinobtenidaporredisolucindenanogelesliofilizadosenaguadestilada.

Los resultados de estos estudios se muestran en dos secuencias de imgenes

(Figuras5.21y5.22),correspondientesadoscantidadesdiferentesderodamina
ESTencapsulada,50genelcasodelosensayosconPDF/NF127Ac2RODEST
y PDF/NF127Ac8RODEST, y 25 g para PDF/NF127Ac4RODEST. Para
facilitar la comparacin de los resultados se incluyen tambin los
correspondientes ensayos de control. Con el fin de analizar el efecto de la

229

Captulo5Capitulo

temperaturaenelprocesodeinternalizacin,denuevosehatrabajadoa37Cy
4C.

EnlaFigura5.21(a)y(b)semuestraslasimagenesdecontrolobtenidasconuna
cantidad de rodaminaEST de 50 g, a las dos temperaturas, 4 C y 37 C
respectivamente. Como se puede observar, la internalizacin de rodaminaEST
libreesindependientedelatemperatura.

Sin embargo, no ocurre lo mismo cuando esta molcula est encapsulada en

nanogeles. La internalizacin de los nanogeles PDF/NF127Ac2RODEST se
producea37C(Figura5.21(c))deformamslentaquelainternalizacindela
molcula libre (Figura 5.21 (a)), como se deduce de la menor intensidad de la
fluorescencia debida a la internalizacin de nanogeles cargados con rodamina
EST. En cambio, a 4 C (Figura 5.21 (d)), con los procesos de endocitosis
inhibidos,noseobservafluorescenciaenelinteriordelasclulas,confirmando
quelosnanogelesentranalaclulaporendocitosisyquelarodaminaESTnose
libera al medio de ensayo, encontrndose efectivamente encapsulada en el
interiordelosnanogeles.

La internalizacin de los nanogeles PDF/NF127Ac8RODEST a 37 C (Figura

5.21 (e)) y a 4 C (Figura 5.21 (f)) present el mismo comportamiento que los
nanogelesPDF/NF127Ac2RODEST,siendoladiferenciadefluorescenciaalas
dos temperaturas de trabajo menos significativas que en este caso. La menor
intensidaddefluorescenciaobservadaenlaimagen(e)conrespectoalaimagen
(c) se puede atribuir a que la internalizacin de PDF/NF127Ac8RODEST a
37 C se produce de forma ms lenta que los PDF/NF127Ac2RODEST a la
mismatemperatura.

Adems el uso de rodaminaEST hace que el cambio de tamao que

experimentan los nanogeles al disminuir la temperatura a 4 C no produzca la
liberacin de esta al medio (Figura 5.21, imgenes (d) y (f)), a diferencia de lo
ocurridoconlarodaminaB(Figura5.19,imagen(d)).

230

Captulo5

a) b)

CONTROL37CRODEST(50g) CONTROL4CRODEST(50g)

c) d)

PDF/NF127Ac2RODEST37C(50g) PDF/NF127Ac2RODEST4C(50g)

e) f)

PDF/NF127Ac8RODEST37C(50g) PDF/NF127Ac8RODEST4C(50g)
Figura5.21.Imgenesdemicroscopiaconfocaldelosensayosdeinternalizacincelular,
tras4horasdeincubacin.EnsayosdecontrolconrodaminaESTlibre:a)50g,37C,b)
50g,4C;EnsayosconrodaminaESTencapsulada:c)PDF/NF127Ac2RODESTa
37C,d)PDF/NF127Ac2RODESTa4C.c)PDF/NF127Ac8RODESTa37C,d)
PDF/NF127Ac8RODESTa4C.Enazul:ncleocelular,enverde:actinadel
citoesqueleto,enrojo:rodaminaEST.Laescalacorrespondea20m.

231

Captulo5Capitulo

EnlaFigura5.22semuestranlosresultadosdeinternalizacinobservadospara
losensayosconnanogelesPDF/NF127Ac4RODEST, consuscorrespondientes
controles. A diferencia de lo observado con los otros dos tipos de nanogeles
ensayados se visualiza un aumento de la intensidad de fluorescencia a baja
temperatura, con respecto a los mismos ensayos realizados a 37 C. Estos
nanogeles,a4C,producenlaliberacindelarodaminaESTencapsuladaloque
permite la internalizacin de la molcula por procesos de difusin. Todava
queda por resolver la diferencia de comportamiento de estos nanogeles con
respectoalosotrosdos.

a) b)

CONTROL37CRODEST(25g) CONTROL4CRODEST(25g)

c) d)

PDF/NF127Ac4RODEST37C(25g) PDF/NF127Ac4RODEST4C(25g)
Figura5.22.Imgenesdemicroscopiaconfocaldelosensayosdeinternalizacincelular,
tras4horasdeincubacin.EnsayosdecontrolconrodaminaESTlibre:a)25g,37C,b)
25g,4C.EnsayosconrodaminaESTencapsulada:c)PDF/NF127Ac4RODESTa
37C,d)PDF/NF127Ac4RODESTa4C.Enazul:ncleocelular,enverde:actinadel
citoesqueleto,enrojo:rodaminaEST.Laescalacorrespondea20m.

232

Captulo5

A modo de resumen, en la Tabla 5.7 se recogen los ensayos de internalizacin

celularrealizadosysusresultados.

Tabla5.7.ResumendeensayosdeinternalizacinrealizadosenclulasHeLa.

Nanogel Carga 37C 4C Internalizacin

ROD(17y23g) + +(pordifusin)
ROD(48g) + +(pordifusin)
ROD(48g) + +(pordifusin)
PDF/NF127Ac2ROD ROD(23g) + +
PDF/NF127Ac4ROD ROD(17g) + Roturadeclulas
PDF/NF127Ac8ROD ROD(23g) + +
PDF/NF127Ac8ROD ROD(48g) + +
PDF/NF127Ac8ROD ROD(48g) + +(pordifusin)
RODEST(50g) + +(pordifusin)
RODEST(50g) + +(pordifusin)
RODEST(25g) + +(pordifusin)
RODEST(25g) + +(pordifusin)
PDF/NF127Ac2RODEST RODEST(50g) + +(mslentaquelibre)
PDF/NF127Ac2RODEST RODEST(50g) + (endocitosisinhibida)
PDF/NF127Ac8RODEST RODEST(50g) + +(mslentaquelibre)
PDF/NF127Ac8RODEST RODEST(50g) + (endocitosisinhibida)
PDF/NF127Ac4RODEST RODEST(25g) + +
PDF/NF127Ac4RODEST RODEST(25g) + +(pordifusin)

Ensayodeinternalizacinpositivo:ensayoquepresentafluorescenciaenelinteriorde
lacluladebidaalapresenciadefluorforo(rodaminaBorodaminaEST),ensuforma
libreoencapsuladaenelnanogel.

Ensayos cualitativos preliminares han demostrado que estos nanogeles se

internalizan de forma efectiva en el interior de la clula. Sin embargo, son
necesarios ms ensayos de internalizacin, incluyendo ensayos de tipo
cuantitativoyensayosenfuncindeltiemposeincubacindelasclulasconlos
nanogeles.Estosestudiospermitirnconfirmarlaviabilidaddeestosmateriales

233

Captulo5Capitulo

como transportadores de frmacos y explicar el distinto comportamiento

observado para cada uno de los nanogeles estudiados, investigacin que se
planteacomounobjetivofuturo.

Losresultadosdeinternalizacinydeencapsulacindemolculaspermitirnel
usodelos nanogelescomosistemasdeencapsulacindefrmacoshidrfobos,
como la Camptotecina, frmaco con baja solubilidad en agua y elevada
citotoxicidad en su forma libre, activo contra la hepatitis. As mismo, se
comprobar la efectividad y toxicidad de los nanogeles cargados con
Camptotecina al producirse la internalizacin celular, en comparacin con el
frmacolibre.DichosexperimentosserealizarnencolaboracinconOlgaAbin
del Instituto Universitario de Investigacin de Biocomputacin y Fsica de
SistemasComplejos(BIFI),pertenecientealIACS.

234

CAPTULO6

PARTEEXPERIMENTAL

Captulo6

Enestecaptuloseincluyentodosaquellosaspectosrelacionadosconeltrabajo
experimentaldesarrolladoparaestatesisdoctoral.

Paraellosehanconsideradolossiguientesapartados:

Sntesisycaracterizacindeloscompuestos:
Apartado en el que se describen los procedimientos experimentales que han
permitido obtener los diferentes compuestos, as como los datos relativos a su
caracterizacinqumica.
Lanomenclaturaynumeracinqueidentificacadacompuestoeslautilizadaen
losesquemassintticosytextoincluidosenlosCaptulos3y4.

Protocolosdetrabajo:
Apartado en el que se recogen los diferentes procedimientos experimentales
puestos a punto, estandarizados y desarrollados para la preparacin o
caracterizacindelosdiferentesmateriales.

Materialesytcnicasexperimentales.
Apartadoenelqueseincluyenlosmateriales,tcnicasyequiposutilizadosenla
preparacinycaracterizacindelosdistintosmateriales.

237

Captulo6

6.1.SNTESISYCARACTERIZACINDELOSCOMPUESTOS

CompuestoF127Ac2[1]
DescritoporTirellietal.,MacromolecularChemistryandPhysics2002,203(10
11),14661472.(Referencia101c).

En un matraz se pesa Pluronic F127 (10 g, 0.79 mmol) secado previamente a

vacoysedisuelveen20mLdediclorometanoseco.Unavezdisueltoelpolmero
seaadetrietilamina(0.97mL,6.99mmol)gotaagotabajoatmsferadeargn.
El matraz de reaccin de introduce en un bao de hielo y se aade muy
lentamente,gotaogotaclorurodeacriloilo(0.54mL,6.35mmol).Lamezclade
reaccin se mantiene a temperatura ambiente, bajo atmsfera de argn y en
oscuridaddurantetodalanoche.Transcurridoestetiemposefiltraelcrudode
reaccinsobrealminaneutraparalaeliminacindelsubproductohidrocloruro
de trietilamonio. Al filtrado se le aade Na2CO3 anhidro y se mantiene con
agitacin en oscuridad durante 2 horas. El slido se filtra por gravedad y el
filtradoseconcentraenelrotavapor.Acontinuacinlamezclaseviertesobreun
litrodedietilterfrio.Elslidoqueprecipitasedejadecantarduranteunanoche
en el frigorfico, y el precipitado se filtra y se lava con dietil ter frio,
obtenindoseunslidoblanco.Rto:6778%.

1
HRMN(400MHz,CDCl3):(ppm):1.13(m,201H,A),3.373.82(m,~1100H,B,
C, D, E, F), 4.31 (m, 4H, G), 5.83 (dd, Jcis=10.4 Hz, Jgem=1.6 Hz, 2H, J), 6.15 (dd,
Jtrans=17.2Hz,Jcis=10.4Hz,2H,I),6.42(dd,Jtrans=17.2Hz,Jgem=1.6Hz,2H,J).
13
CRMN (125 MHz, CDCl3): (ppm): 17.317.4 (A), 63.6 (G), 68.469.1 (F), 70.5
(D,E),72.973.3(C),75.175.375.5(B),128.2(I),130.9(J),166.1(H).
FTIR(cm1,neto,pelculadelgadasobreNaCl):2882(CHst),1724(C=O),1114
(C_O_C).
MS(MALDI+):mximosam/z5201.1y13449.6.

239

Captulo6Capitulo

ANLISIS ELEMENTAL para C603 H1200 O268, calculado: C, 56.94; H, 9.44.,

experimental:C,56.44;H,9.47.

Compuesto[2]
Descrito por Hult et al., Macromolecules 1998, 31 (13), 40614068. (Referencia
63).

Enunmatrazsedisuelvecido2,2bis(hidroximetil)propinico(10g,74.5mmol),
2,2dimetoxipropano (13.8 mL, 112 mmol) y cido ptoluensulfnico
monohidrato(0.7g,3.7mmol)en50mLdeacetonaseca.Lamezcladereaccin
se agita durante 2 horas en atmsfera de argn a temperatura ambiente.
Transcurridoestetiemposeadicionaalamezcladereaccin1mLdeunamezcla
amoniaco/etanol1.1(v/v).Acontinuacinseeliminaeldisolventeenrotavapory
elresiduoblancoseredisuelveen250mLdediclorometano.Lafaseorgnicase
extrae con 20 mL de agua (x2), se seca con MgSO4, se filtra y evapora a
sequedad.Elproductoseobtienecomounslidoblanco.10.3g.Rto.:79%.

1
HRMN(400MHz,CDCl3):(ppm):1.21(s,3H,D),1.42(s,3H,A),1.45(s,3H,
A),3.68(d,J=12Hz,2H,C),4.18(d,J=12Hz,2H,C).
13
CRMN(100MHz,CDCl3):(ppm):18.4(D),21.8(A),25.3(A),41.7(E),65.9(C,
C),98.3(B),180.0(F).
FTIR(cm1,KBr):3142(COOHst),29952891(CHst),1723(C=O).
MS(ESI+)paraC8H14O4,calculado:174.09,experimental:(M+Na+)196.9.

240

Captulo6

Compuesto[3]
Descrito por Hult et al., Macromolecules 1998, 31 (13), 40614068. (Referencia
63).

Enunmatrazsedisuelvecido2,2bis(hidroximetil)propionico(18g,134mmol)
y KOH (8.6 g, 154 mmol) en 100 mL de dimetilformamida seca. La reaccin se
mantiene a 100 C durante una hora. Transcurrido este tiempo se adiciona
bromuro de bencilo (19 mL, 162 mmol). La mezcla de reaccin se mantiene
durante15horasa100C.Elcrudodereaccinseevaporaenelrotavaporyse
redisuelveen300mLdediclorometano.Acontinuacinseextraecon50mLde
agua(x2),sesecalafaseorgnicaconMgSO4,sefiltrayeldisolventeseevapora
en el rotavapor. El aceite amarillo obtenido se cristaliza en una mezcla
diclorometano/hexano1:1(v/v).Elproductoseobtienecomounslidoblanco.
Rto.:4354%.

1
HRMN(400MHz,CDCl3):(ppm):1.08(s,3H,A),3.74(d,J=12Hz,2H,C),3.94
(d,J=12Hz,2H,C),5.21(S,2H,E),7.36(M,5H,G,H,I).
13
CRMN(100MHz,CDCl3):(ppm):17.2(A),49.3(B),66.7(C,C),68.4(E),127.9
(G),128.4(I),128.7(H),175.8(D).
IR(cm1,nujol):3351.6(OH),2923.22853.2(CHst),1701.3(C=Ost).
MS(MALDI+)paraC12H16O4,calculado:224.2,experimental:(M+Na+)246.8.

241

Captulo6Capitulo

Compuesto[4]
Descrito por Hult et al., Macromolecules 1998, 31 (13), 40614068. (Referencia
63).

Enunmatrazsedisuelven[2](10g,57.4mmol),[3](6.1g,27.4mmol)yDPTS
(3.2 g, 10.9 mmol) en 90 mL de diclorometano seco. La mezcla de reaccin se
enfra a 0 C y se purga con argn. A continuacin se aade
N,Ndicicliohexilcarbodimida(DCC)(14.3g,69.1mmol)previamentedisueltaen
diclorometano.Lamezcladereaccinsemantieneatemperaturaambienteyen
atmsfera de argn durante una noche. El precipitado de N,Ndiciclohexilurea
(DCU)formadosefiltrayelfiltradoseevaporaenelrotavaporparaobtenerun
aceite amarillo. El crudo se purifica por cromatografa en columna eluyendo
inicialmente con hexano e incrementando gradualmente la polaridad del
disolvente de elucin hasta hexano/acetato de etilo 60:40. El producto se
obtieneenformadeaceiteamarillentoviscoso.10.2g.Rto.:70%.

1
HRMN(300MHz,CDCl3):(ppm):1.09(s,3H,D),1.30(s,3H,H),1.34(s,3H,A),
1.41(s,3H,A),3.58(d,J=12Hz,4H,C),4.11(d,J=12Hz,4H,C),4.34(s,4H,G),
5.16(s,2H,K),7.34(m,5H,M,N,O).
13
CRMN(100MHz,CDCl3):(ppm):17.6(H),18.4(D),22.2(A),24.9(A),42.0
(E),46.8(I),65.3(C,C),65.9(G),66.9(K),98.0(B),128.1(M),128.3(O),128.5
(N),135.4(L),172.3(J),173.4(F).
FTIR(cm1,puro):2991.42876.7(CHst),1737(C=Ost).
MS(MALDI+)paraC29H43O10,calculado:536.6,experimental:(M+Na+)559.2.

242

Captulo6

Compuesto[5]
Descrito por Hult et al., Macromolecules 1998, 31 (13), 40614068. (Referencia
63).

Enunmatrazsedisuelve[4](4g,7.5mmol)en40mLdeacetatodeetiloyse
aadeun10%enpesodePd/C.Serealizan3ciclosvacoargnylamezclade
reaccin se deja en atmsfera de hidrgeno durante 4 horas a temperatura
ambiente. El crudo se filtra sobre Celite para eliminar el Pd/C. El producto se
obtienecomounslidoblancotraslaevaporacindeldisolvente.2.8g.Rto.:83
%.

1
HRMN(300MHz,CDCl3):(ppm):1.15(s,3H,D),1.31(s,3H,H),1.35(s,3H,A),
1.41(s,3H,A),3.62(d,J=12Hz,4H,C),4.16(d,J=12Hz,4H,C),4.33(s,4H,G).
FTIR(cm1,neto,pelculadelgadasobreNaCl):3180(COOHst),29882884(CH
st),1731(C=O).

Compuesto[6]
DescritoporFrchetetal.,JACS2001,123(25),59085917.(Referencia62).

En un matraz se adiciona cido 2,2bis(hidroximetil)propinico (15 g, 111.8

mmol), , dimetoxitolueno (25.5 mL, 166.6 mmol) y cido ptoluensulfnico
(1.05 g, 5.5 mmol) en 120 mL de acetona seca. La mezcla de reaccin se agita
durante4horas.Transcurridoestetiempo,semantieneelmatrazdereaccinen

243

Captulo6Capitulo

el frigorfico durante toda la noche. El slido blanco formado se filtra y se lava

conacetonafra.Rto:3164%.

1
HRMN (300 MHz, CDCl3): (ppm): 1.11 (s, 3H, G), 3.70 (d, J=11.7 Hz, 2H, F),
4.64(d,J=11.4Hz,2H,F),5.49(s,1H,E),7.37(m,3H,A,B),7.47(m,2H,C).
13
CRMN(75MHz,CDCl3):(ppm):17.7(G),42.1(H),73.4(F),101.9(E),126.2
(C),128.3(B),129.0(A),137.5(D),178.8(I).
FTIR(cm1,KBr):3005(OH),2865(CHst),1702(C=O).
MS(ESI+)paraC12H14O4,calculado:222.24,experimental:(M+Na+)245.
ANLISISELEMENTALparaC12H14O4,calculado:C,64.85;H,6.35.,experimental:
C,64.39;H,6.37.

Compuesto[7]
DescritoporFrchetetal.,JACS2001,123(25),59085917.(Referencia62).

Enunmatrazsedisuelve[6](15.5g.,69.7mmol)en100mLdediclorometano
seco. En otro matraz se disuelve DCC (8.05 g, 39 mmol) en 40 mL de
diclorometano seco. La disolucin de DCC se aade sobre la disolucin del
compuesto [6] y la mezcla de ambos se deja con agitacin a temperatura
ambientedurantetodalanoche.ElsubproductoDCUformadosefiltrayselava
con un pequeo volumen de diclorometano. El filtradoo se concentra en
rotavaporyseprecipitaen1Ldehexano.Traslafiltracinseobtiene[7]como
unslidoblanco.Rto.:8896%.
1
HRMN (300 MHz, CDCl3): (ppm): 1.12 (s, 6H, G), 3.69 (d, J=11.6 Hz, 4H, F),
4.66(d,J=11.7Hz,4H,F),5.47(s,2H,E),7.34(m,6H,A,B),7.45(m,4H,C).62
13
CRMN(75MHz,CDCl3):(ppm):16.9(G),44.2(H),73.2(F,F),102.1(E),126.3
(C),128.2(B),129.1(A),137.6(D),169.1(I).
FTIR(cm1,KBr):2865(CHst),1816(C=Ostsim),1746(C=Ostas).
MS(MALDI+)paraC12H26O7,calculado:426.46,experimental:465.1(M+K+)

244

Captulo6

ANLISISELEMENTALparaC24H14O4,calculado:C,67.59;H,6.15.,experimental:
C,66.93;H,6.07.

CompuestoF127Bn2[8]

EnunmatrazsedisuelvePluronicF127previamenteseco(10.0g,0.79mmol),
en20mLdediclorometanoseco.SeaadeDMAP(0.12g,0.95mmol)sobrela
disolucin anterior y una vez disuelto este producto se aade [7] (2.0 g, 4.76
mmol). La mezcla de reaccin se mantiene a temperatura ambiente, bajo
atmsferadeargndurante48horashoras.Transcurridoesetiemposeaaden
6 mL de metanol, para la destruccin del anhdrido en exceso, y la mezcla se
mantienebajoagitacindurante6horas.Elcrudodereaccinseviertesobre1L
dedietilterfrio.Elslidoqueprecipitasedejadecantarduranteunanocheen
elfrigorfico,sefiltrayselavacondietilterfrio.Slidoblanco.Rto.:8899%

1
HRMN(400MHz,CDCl3):(ppm):1.04(s,6H,J),1.13(m,201H,A),3.373.82
(m,~1100H,B,C,D,E,F,I),4.35(m,4H,G),4.66(d,J=11.6Hz,4H,I),5.44(s,2H,
L),7.32(m,6H,P,Q),7.42(m,4H,N).
13
CRMN (100 MHz, CDCl3): (ppm): 17.3, 17.4 (A), 17.9 (J), 42.4 (K), 64.2 (G),
68.568.669.1(F),70.5(D,E),72.973.3(C,I,I),75.175.375.5(B),101.7(L),
126.2(N),128.2(Q),128.9(P),137.9(M),173.9(H).
FTIR(cm1,neto,pelculadelgadasobreNaCl):2883(CHst),1737(C=O),1114
(C_O_C).
MS(MALDI+):mximosam/z5050.2y13297.2
ANLISIS ELEMENTAL para C621H1220O272, calculado: C, 57.29; H, 9.38.,
experimental:C,56.68;H,9.55.

245

Captulo6Capitulo

CompuestoF127OH4[9]

En un matraz se disuelven 9.5 g (0.73 mmol) de [8] en 200 mL de acetato de
etilo. Una vez disuelto se aade un 10 % en peso de Pd/C. A continuacin se
realizan 3 ciclos vacoargn y se deja la mezcla de reaccin bajo atmsfera de
hidrgeno durante toda la noche. El Pd se filtra sobre Celite y el filtrado se
evaporaasequedadparaobtenerunslidoblanco.Rto.:96%.

1
HRMN(300MHz,CDCl3):(ppm):1.11(s,6H,J),1.13(m,201H,A),3.373.82
(m,~1100H,B,C,D,E,F,I),4.34(m,4H,G).
13
CRMN(75MHz,CDCl3):(ppm):17.1(J),17.317.4(A),49.5(K),63.2(G),67.3
(I),68.7(F),70.5(D,E),72.973.3(C),75.175.375.5(B),175.6(H).
FTIR (cm1, neto, pelcula delgada sobre NaCl): 3482 (OH), 2884 (CH st), 1728
(C=O),1112(C_O_C).
MS(MALDI+):mximosam/z5213.9y13780.1.
ANLISIS ELEMENTAL para C607H1212O272, calculado: C, 56.42; H, 9.44.,
experimental:C,56.04;H,9.98.

CompuestoF127Bn4[10]

En un matraz se disuelven 4 g (0.31 mmol) de [9] en 15 mL de diclorometano

seco. Una vez disuelto se aade [7] (2.13 g, 4.99 mmol) y DMAP (122 mg, 1
mmol). La mezcla de reaccin se deja bajo atmsfera de argn, a temperatura
ambientedurante3das.Transcurridoestetiemposeaaden6mLdemetanol,

246

Captulo6

paraladestruccindelanhdridoenexceso,ylamezclaseagitadurante7horas.
El crudo de reaccin se vierte sobre 500 mL de dietil ter fro. El precipitado
formadosefiltraylavacondietilterfroparaobtener[10].Slidoblanco.Rto.:
7194%

1
HRMN(300MHz,CDCl3):(ppm):0.93(s,12H,N),1.13(m,201H,A),1.24(s,
6H,J),3.373.82(m,~1100H,B,C,D,E,F,L),4.11(m,4H,G),4.37(s,8H,I),4.56
(d,J=11.5Hz,8H,L),5.40(s,4H,P),7.28(m,12H,S,T),7.38(m,8H,R).
13
CRMN(75MHz,CDCl3):(ppm):17.317.4(A),17.6(N),17.7(J),42.5(K),46.7
(M),64.1(G),65.4(I),68.468.6(F),70.5(D,E),72.973.3(C,L,L),75.175.3
75.5(B),101.6(P),126.1(R),128.0(T),128.8(S),137.7(Q),173.1(H).
FTIR(cm1,neto,pelculadelgadasobreNaCl):2883(CHst),1741(C=O),1113
(C_O_C).
MS(MALDI+):mximosam/z5615.9y13844.4.
ANLISIS ELEMENTAL para C655H1260O284, calculado: C, 57.59; H, 9.23.,
experimental:C,56.89;H,9.74.

CompuestoF127OH8[11]

Enunmatrazsedisuelve[10](2.8g,0.21mmol)en100mLdeacetatodeetilo.
Unavezdisueltoseaadeun10%enpesodePd/C.Acontinuacinserealizan3
ciclos vacioargn y se deja la reaccin bajo atmsfera de hidrgeno durante
toda la noche. El Pd se filtra sobre Celite y el filtrado se evapora a sequedad
paraobtenerunslidoblanco.Rto.:96%Cuantitativo.

247

Captulo6Capitulo

1
HRMN(400MHz,CDCl3):(ppm):1.05(s,12H,N),1.13(m,201H,A),1.28(s,
6H,J),3.373.79(m,~1100H,B,C,D,E,F,L),4.264.38(IIq,8H,II=35Hz,JII=
11.2Hz,I,I),4.26(m,4H,G).
13
CRMN (100 MHz, CDCl3): (ppm): 17.1 (N), 17.3 17.4 (A), 17.9 (J), 46.4 (K),
49.7(M),64.3(I),64.9(G),67.367.4(L),68.568.8(F),70.5(D,E),72.973.3(C),
75.175.375.5(B),172.9(H),174.9(H).
FTIR (cm1, neto, pelcula delgada sobre NaCl): 3457 (OH), 2884 (CH st), 1733
(C=O),1113(C_O_C).
MS(MALDI+):mximosam/z5286.1y13693.8.
ANLISIS ELEMENTAL para C627H1244O284, calculado: C, 56.59; H, 9.36.,
experimental:C,56.17;H,9.98.

CompuestoF127Ac4[12]

Enunmatrazsedisuelve[9](2.0g,0.16mmol)en20mLdediclorometanoseco.
Se aade trietilamina (0.39 mL, 2.76 mmol) y 4metoxifenol (200 mg) como
inhibidor de la polimerizacin. Se realizan en la mezcla de reaccin tres ciclos
vacoargn y a continuacin la mezcla se enfra con hielo. Trancurridos 10
minutos se aade cloruro de acriloilo (0.22 mL, 2.66 mmol), gota a gota, con
agitacinylamezcladereaccinsedejabajoatmsferadeargnyenoscuridad
durante 48 horas. El crudo de reaccin se filtra a travs de una columna de
almina neutra para eliminarel subproducto formado, y el filtrado sesecacon
Na2CO3anhidrodurante2horas.Transcurridoestetiemposefiltrayelfiltradose
concentraenrotavapor.Acontinuacin,elconcentradoseprecipitaen300mL
dedietilterfro.Elproductoseobtienecomounslidoblancotraslafiltracin.
Rto.:4578%

248

Captulo6

1
HRMN(300MHz,CDCl3):(ppm):1.13(m,201H,A),1.30(s,6H,J),3.373.82
(m,~1100H,B,C,D,E,F),4.34(IIq,8H,II=7.6Hz,JII=11.2Hz,I,I),4.27(m,4H,
G),5.85(dd,Jcis=10.4Hz,Jgem=1.3Hz,4H,N),6.10(dd,Jtrans=17.2Hz,Jcis=10.4Hz,
4H,M),6.39(dd,Jtrans=17.2Hz,Jgem=1.3Hz,4H,N).
13
CRMN(75MHz,CDCl3):(ppm):17.317.4(A),17.7(J),46.3(K),65.4(I),68.7
(G), 70.5 (D, E, F), 72.9 73.3 (C), 75.1 75.3 75.5 (B), 127.8 (M), 131.2 (N, N),
165.4(L),172.5(H).
FTIR(cm1,neto,pelculadelgadasobreNaCl):2869(CHst),1733(C=O),1110
(C_O_C).
MS(MALDI+):mximosam/z5920.3y13255.4.
ANLISIS ELEMENTAL para C619H1220O276, calculado: C, 56.93; H, 9.35.,
experimental:C,56.52;H,9.73.

CompuestoF127Ac8[13]

En un matraz se disuelve [11] (1.5 g, 0.11 mmol) en 20 mL de diclorometano

seco.Seaadetrietilamina(0.55mL,3.98mmol)y4metoxifenol(200mg)como
inhibidordepolimerizacin.Serealizanenelmediodereaccintresciclosvaco
argnyacontinuacinseenfralamezclaconhielo.Tras10minutosseaade
clorurodeacriloilo(0.29mL,3.61mmol),gotaagota,yconagitacinylamezcla
dereaccinsedejabajoatmsferadeargnyenoscuridaddurante72horas.El
crudo de reaccin se filtra a travs de una columna de almina neutra y el
filtradosesecaconNa2CO3anhidrodurante2horas.Elfiltradoseconcentraen

249

Captulo6Capitulo

rotavaporysepurificaporprecipitacinen250mLdedietilterfro.Elproducto
seobtienetrasfiltracincomounslidoblanco.Rto.:4782%.

1
HRMN (300 MHz, CDCl3): (ppm): 1.13 (m, 201H, A), 1.23 (s, 6H, J), 1.27 (s,
12H,N),3.373.87(m,~1100H,B,C,D,E,F),4.234.30(m,28H,G,I,L),5.85(dd,
Jcis=10.4Hz,Jgem=1.3Hz,4H,Q),6.10(dd,Jtrans=17.3Hz,Jcis=10.4Hz,4H,R),6.39
(dd,Jtrans=17.3Hz,Jgem=1.3Hz,4H,Q).
13
CRMN(125MHz,CDCl3):(ppm):17.317.4(A),17.7(J,N),45.8(K),46.5(M),
64.9(G),65.365.6(I,L),68.568.7(F),70.5(D,E),72.973.3(C),75.175.375.5
(B),127.7(Q),131.5(R),165.4(P),171.9172.0(H).
FTIR(cm1,neto,pelculadelgadasobreNaCl):2867(CHst),1733(C=O),1109
(C_O_C).
MS(MALDI+):mximosam/z5761.4y14176.6.
ANLISIS ELEMENTAL para C651H1260O292, calculado: C, 56.90; H, 9.18.,
experimental:C,56.48;H,9.66.

CompuestoF127PN2[14]
DescritoporParketal.Langmuir2006,22(4),17581762.

ProcedimientoexperimentalconcondicionesdereaccinB

En un matraz se pesa Pluronic F127 (5 g, 0.40 mmol), previamente seco y se

disuelveen15mLdediclorometanoseco.Acontinuacinseaadepiridinaseca
(0.9 mL) y cloroformiato de pnitrofenilo (0.65 g, 3.2 mmol) bajo atmsfera de
argn.Lamezcladereaccinsemantieneatemperaturaambiente,conagitacin
durante toda la noche. El crudo de reaccin se diluye con 50 mL de
diclorometano y se extrae con NaHSO4 1 M (2 x 30 mL) y disolucin de NaCl
saturada (1 x 30 mL). La fase orgnica se seca con MgSO4 y se concentra en
rotavapor.Lafaseorgnicaconcentradaseprecipitaen200mLdedietilterfrio.

250

Captulo6

Elproductoseobtienetrasfiltracinylavadocondietilterfrocomounslido
blanco.Rto.:7585%.

ProcedimientoexperimentalconcondicionesdereaccinD

En un matraz se pesa Pluronic F127 (5 g, 0.40 mmol), previamente seco, y se

disuelveen15mLdediclorometanoseco.
Porotrolado,sedisuelvecloroformiatodepnitrofenilo(1.13g,5.60mmol)en5
mL de diclorometano, y se aade bajo atmsfera de argn sobre la disolucin
anterior.
AladisolucinresultanteseleadicionaDMAP(0.68g,5.60mmol),previamente
disuelta en 5 mL de diclorometano. La mezcla de reaccin se mantiene bajo
agitacinyenatmsferadeargndurante4horas.Transcurridoestetiempo,el
crudodereaccinseviertesobre350mLdedietilterfro.Elslidoblancoque
precipitasefiltraylavacondietilterfrioyacontinuacin,seredisuelveen100
mL de diclorometano. La fase orgnica se extrae con HCl 1N (2x75 mL) y con
disolucin saturada de NaCl (1x75 mL) para eliminar el cloruro de
dimetilaminopiridinio formado en la reaccin, se seca con MgSO4 anhidro y se
evaporahastasequedad.Elproductoseobtienecomounslidoblanco.Rto:65
74%.

1
HRMN(300MHz,CDCl3)(ppm):1.13(m,201H,A),3.373.85(m,~1000H,B,
C,D,E,F),4.414.44(m,4H,G),7.38(m,4H,J),8.26(m,4H,K).
13
CRMN(75MHz,CDCl3):(ppm):17.417.5(A),68.4(G),68.7(F),70.7(D,E),
72.973.5(C),75.275.475.6(B),121.8(J),125.4(K),145.5(L),152.5(H),155.6
(I).
FTIR (cm1, neto, pelcula delgada sobre NaCl): 2867 (CH st), 1769 (C=O st
carbonato),1520(NO2stas),1200(COstascarbonato),1110(C_O_C).
MS(MALDI+):mximosam/z4999.3y12842.8.
ANLISISELEMENTALparaC611H1202N2O274,calculado:C,56.63;N,0.22;H,9.28.,
experimental:C,56.12;N,0.11;H,8.64.

251

Captulo6Capitulo

CompuestoF127SH2[15]
DescritoporParketal.,Langmuir2006,22(14),63806384.

MtododesntesisE

Enunmatrazsedisuelve[14](0.5g,0.041mmol)en25mLdeaguadestilada.A
continuacinseaadedihidroclorurode2,2diaminoetildisulfuro(cistamina)y
0.5 mL de TEA. La mezcla de reaccin se mantiene a temperatura ambiente y
atmsferadeargndurantetodalanoche.Acontinuacinelcrudodereaccin
se dializa con membrana (Spectra/Por Dyalisis membrane MWCO 3500,
Spectrum)hastaladesaparicindelatonalidadamarillentadelsubproductode
reaccin pnitrofenol (7 das). Una vez eliminado el subproducto se aade al
dializado 148 mg de D,L ditiotreitol (DTT) como agente reductor y se deja
reaccionardurante6horasenatmsferadeargn.Elcrudosedializadurante3
dasutilizandobufferdecitratoapH=4paralaeliminacindelagentereductor.
Elproductoseobtienetrasliofilizacindeldializado.

MtododesntesisF

Enunmatrazdedisuelve[14](2g,0.16mmol)en30mLdediclorometanoseco.
A continuacin se aade cisteamina (24 mg, 0.32 mmol) bajo atmsfera de
argn.Lamezcladereaccinsemantieneatemperaturaambienteconagitacin
durantetodalanoche.Elcrudodereaccinseprecipitaen200mLdedietilter
fro, se filtra y se lava con dietil ter fro para eliminar el subproducto p
nitrofenol.Elproductoseobtienecomounslidoamarillo.Rto.:9196%.

1
HRMN(500MHz,CDCl3):(ppm):1.13(m,201H,A),2.79(t,4H,J),3.373.77
(m,~1000H,B,C,D,E,F,I),4.20(m,4H,G).
13
CRMN (125 MHz, CDCl3): (ppm): 17.4 17.5 (A), 38.2 (J), 39.9 (I), 64.2 (G),
68.668.769.7(F),70.7(D,E),72.973.5(C),75.275.475.6(B).

252

Captulo6

FTIR (cm1, neto, pelcula delgada sobre NaCl): 2867 (CH st), 1732 (C=O
carbamato),1525(NO2stas),1108(C_O_C).
MS(MALDI+):mximoam/z4849.7.
ANLISIS ELEMENTAL para C603H1206N2O268S2, calculado: C, 56.50; N, 0.22; H,
9.42,S,0.50.,experimental:C,55.83;N,0.11;H,8.64,S,0.76.

CompuestoF127PN4[16]

En un matraz se pesa [9] (2.3 g, 0.18 mmol) y se disuelve en 17 mL de

diclorometano seco. A continuacin se aade piridina seca (0.8 mL) y
cloroformiato de pnitrofenilo (0.6 g, 2.9 mmol) bajo atmsfera de argn. La
reaccin se mantiene a temperatura ambiente, con agitacin durante toda la
noche. El crudo de reaccin se diluye con 50 mL de diclorometano y se extrae
conNaHSO41M(2x30mL)ydisolucindeNaClsaturada(1x30mL).Lafase
orgnica se seca con MgSO4 y se concentra en rotavapor. El concentrado se
viertesobre200mLdedietilterfrio.Elproductoqueprecipitaseobtienetras
filtracinylavadocondietilterfrocomounslidoblanco.Rto.:7192%.

1
HRMN(300MHz,CDCl3):(ppm):1.13(m,201H,A),1.38(s,6H,J),3.373.85
(m,~1000H,B,C,D,E,F),4.34(m,4H,G),4.52(ABq,8H,AB=31.8Hz,JAB=9Hz,
I,I),7.37(m,8H,M),8.26(m,8H,O).
13
CRMN (75 MHz, CDCl3): (ppm): 17.4 17.5 (A), 17.7 (J), 46.5 (K), 64.5 (G),
68.668.769.2(F),70.7(D,E,I,I),72.973.5(C),75.275.475.6(B),121.7(M),
125.3(O),145.5(P),152.1(L),155.2(N),171.5(H).

253

Captulo6Capitulo

FTIR (cm1, neto, pelcula delgada sobre NaCl): 2867 (CH st), 1772 (C=O st
carbonato),1732(C=Oester),1527(NO2 stas),1212(COstascarbonato),1113
(C_O_C).
MS(MALDI+):mximosam/z5340.8y13561.3.
ANLISISELEMENTALparaC635H1224N4O288,calculado:C,54.65;N,0.40;H,8.78.,
experimental:C,56.10;N,0.35;H,9.02.

CompuestoF127SH4[17]

En un matraz se disuelve [16] (1.7 g, 0.13 mmol) en 30 mL de diclorometano

seco.Acontinuacinseaadecisteamina(50mg,0.65mmol)bajoatmsferade
argn. La mezcla de reaccin se deja a temperatura ambiente, con agitacin
durantetodalanoche.Elcrudodereaccinseprecipitaen200mLdedietilter
fro,sefiltrayselavacondietilterfroparaeliminarelpnitrofenol.Elproducto
seobtienecomounslidoamarillo.Rto.:92%Cuantitativo.

1
HRMN(500MHz,CDCl3):(ppm):1.13(m,201H,A),1.23(s,6H,J),2.792.95
(m,8H,N),3.373.76(m,~1000H,B,C,D,E,F,M),4.27(m,12H,I,G).
13
CRMN(125MHz,CDCl3):(ppm):17.417.5(A),18.3(J),38.5(N),41.8(M),
64.2(I),67.4(G),68.668.769.0(F),70.7(D,E),72.973.5(C),75.275.4 75.6
(B),156.2(L).
FTIR (cm1, neto, pelcula delgada sobre NaCl): 2880 (CH st), 1733 (C=O st
carbamato,C=Oester),1112(C_O_C).
MS(MALDI+):mximosam/z5184.5y13217.4.
ANLISIS ELEMENTAL para C619H1232N4O276S4, calculado: C, 56.08; N, 0.42; H,
9.30,S,0.97.,experimental:C,55.59;N,0.14;H,8.97,S,1.29.

254

Captulo6

CompuestoF127PN8[18]

En un matraz se pesa [11] (1.6 g, 0.12 mmol) y se disuelve en 50 mL de

diclorometano seco. A continuacin se aade piridina seca (1.3 mL) y
cloroformiato de pnitrofenilo (0.8 g, 3.9 mmol) bajo atmsfera de argn. La
reaccinsedejaatemperaturaambiente,conagitacindurantetodalanoche.El
crudodereaccinsediluyecon50mLdediclorometanoyseextraeconNaHSO4
1 M (2 x 30 mL) y disolucin de NaCl saturada(1 x 30 mL). La fase orgnica se
secaconMgSO4yseconcentraenrotavapor.Elconcentradoseprecipitaen200
mLdedietilterfrio.Elslidoblancoobtenidosefiltrayselavacondietilter
fro.Rto.:8092%.

1
HRMN(300MHz,CDCl3):(ppm):1.13(m,201H,A),1.34(s,6H,J),1.37(s,12H,
N),3.373.85(m,~1000H,B,C,D,E,F),4.27(m,4H,G),4.45(m,24H,I,L),7.37
(m,16H,R),8.26(m,16H,S).
13
CRMN(75MHz,CDCl3):(ppm):17.417.5(A),17.7(J,M),46.6(K,M),65.8
(G),69.1(F),70.7(D,E,I),72.973.5(C),75.275.475.6(B),121.7(R),125.3(S),
145.6(T),152.0(P),155.2(Q),171.05(H,H).
FTIR (cm1, neto, pelcula delgada sobre NaCl): 2867 (CH st), 1771 (C=O st
carbonato), 1736 (C=O st ester), 1526 (NO2 st as), 1212 (CO st as carbonato),
1008(C_O_C).
MS(MALDI+):mximosam/z5871.7y14635.1.
ANLISISELEMENTALparaC683H1268N8O316,calculado:C,56.07;N,0.77;H,8.67.,
experimental:C,55.62;N,0.67;H,7.66.

255

Captulo6Capitulo

CompuestoPEGAc2[19]

En un matraz se disuelve PEG (Pm=2000 g/mol) (1 g, 0.51 mmol) en 15 mL de

diclorometano seco. A continuacin se aade TEA (0.65 mL, 4.7 mmol) y 4
metoxifenol(50mg)comoinhibidor.Serealizanalmediodereaccintresciclos
vacoargn y a continuacin se enfra la mezcla de reaccin con hielo.
Trancurridos10minutosseaadeclorurodeacriloilo(0.34mL,4.2mmol),gotaa
gota,conagitacinylamezcladereaccinsedejabajoatmsferadeargnyen
oscuridad durante 24 horas. El crudo de reaccin se filtra a travs de una
columnadealminaneutraparaeliminarclorurodetretilamonioformadocomo
subproducto y el filtrado se seca con Na2CO3 anhidro durante 2 horas.
Transcurrido este tiempo se filtra y el filtrado se concentra en rotavapor. A
continuacinelconcentradosevierteen200mLdedietilterfro.Elproductose
obtienecomounslidoblancotraslafiltracin.0.9g.Rto.:82%

1
HRMN(300MHz,CDCl3):(ppm):3.64(s,180H,A),3.74(t,4H,B),4.31(t,4H,
C),5.83(dd,Jcis=10.2Hz,Jgem=1.5Hz,2H,F),6.15(dd,Jtrans=17.1Hz,Jcis=10.2Hz,
2H,E),6.42(dd,Jtrans=17.1Hz,Jgem=1.5Hz,4H,F).

CompuestoF127NH(CH2)6OH2[20]

Enunmatrazdedisuelve[14](2.5g,0.2mmol)en15mLdediclorometanoseco.
Acontinuacinseaade6amino1hexanol(50mg,0.43mmol)bajoatmsfera
de argn. La mezcla de reaccin se mantiene a temperatura ambiente con
agitacindurantetodalanoche.Elcrudodereaccinseprecipitaen200mLde
dietil ter fro, se filtra y se lava con dietil ter fro para eliminar pnitrofenol

256

Captulo6

formadocomosubproducto.Elproductoseobtienecomounslidoblanco.1.8
g.Rto.:70%.

1
HRMN(300MHz,CDCl3):(ppm):1.13(m,201H,A),1.34(m,8H,K,L),1.53(m,
8H,J,M),3.16(q,4H,I),3.373.77(m,~1000H,B,C,D,E,N),3.87(m,4H,F),4.20
(m,4H,G).
13
CRMN(75MHz,CDCl3):(ppm):17.417.5(A),25.3(L),26.3(J),29.9(K),32.5
(M), 40.9 (I), 62.6 (G), 63.8 (N), 68.6 (F), 70.7 (D, E), 72.9 73.5 (C), 75.2 75.4
75.6(B),156.4(H).
FTIR(cm1,neto,ATR):2867(CHst),1726(C=Ocarbamato),1108(C_O_C).

CompuestoF127NHAc2[21]

En un matraz se disuelve [20] (1.5 g, 0.12 mmol) en 15 mL de diclorometano

seco.AcontinuacinseaadeTEA(0.14mL,1.04mmol)y4metoxifenol(50mg)
comoinhibidor.Serealizanalamezclatresciclosvacoargnyacontinuacinse
enfraconhielo.Trancurridos10minutosseaadeclorurodeacriloilo(0.08mL,
0.94 mmol), gota a gota con agitacin y la reaccin se deja bajo atmsfera de
argnyenoscuridaddurante24horas.Elcrudodereaccinsefiltraatravsde
una columna de almina neutra para eliminar el subproducto cloruro de
tretilamonio y el filtrado se seca con Na2CO3 anhidro durante 2 horas.
Transcurrido este tiempo se filtra y el filtrado se concentra en rotavapor. A
continuacin se precipita en 200 mL de dietil ter fro. El producto se obtiene
comounslidoblancotraslafiltracin.1.2g.Rto.:78%

1
HRMN(400MHz,CDCl3):(ppm):1.13(m,201H,A),1.37(m,8H,K,L),1.52(m,
4H,J),1.67(m,4H,M),3.16(q,4H,I),3.373.77(m,~1000H,B,C,D,E),3.81(m,
4H, F), 4.20 (m, 4H, G), 5.81 (dd, Jcis=10.4 Hz, Jgem=1.6 Hz, 2H, F), 6.10 (dd,
Jtrans=17.2Hz,Jcis=10.4Hz,2H,E),6.39(dd,Jtrans=17.2Hz,Jgem=1.6Hz,4H,F).

257

Captulo6Capitulo

13
CRMN(75MHz,CDCl3):(ppm):17.417.5(A),25.6(L),26.3K),28.5(K),29.8
(M), 40.9 (I), 64.4 (N), 66.9 (G), 68.6 (F), 70.7 (D, E), 72.9 73.5 (C), 75.2 75.4
75.6(B),128.6(Q),130.5(R),156.4(H),166.2(P).
FTIR(cm1,ATR):2867(CHst),1728(C=O),(1108(C_O_C).

258

Captulo6

6.2.PROTOCOLOSDETRABAJO

a. Protocolo de estudio de gelificacin mediante el mtodo de inversin del

vial

Lasdisolucionespreparadasalasdistintasconcentraciones16.5%,18%,20%,
23%y25%(w/v)enPBS10mMpH7.4,semantuvieronduranteunanochea4
Cyenoscuridadparaasegurarlacompletadisolucindelpolmero.
100Ldedisolucinaestudiosedispusieronenunvialde2mL.
lamuestrasecalentconunbloquecalefactoraunavelocidadde1C/mincon
el fin de producir la transicin solgel. Se consider como temperatura de
transicin de fase (LCST) la temperatura a la cual, tras inversin del vial, no se
observaflujodelamuestradurante10segundos.
unavezalcanzadoelestadogelsecontinucalentandoalamismavelocidadel
gelfsicohastaconseguirlatransicindegeladisolucin(transicingelsol).

b.ProtocolodeestudiodegelificacinmedianteDSC

En cpsulas hermticas de DSC se colocaron entre 15 y 20 miligramos de

muestra (disoluciones preparadas de la misma forma que en el mtodo de
inversindelvial).
EnelhornodeDSC,aunavelocidadde5C/min,elmaterialsesometiaun
calentamiento de 10C a 60C y posterior enfriamiento de 60C a 10C,
permitiendounperiododeestabilizacinentreambosde5minutos.

c.Protocolodepreparacindeloshidrogelesfotopolimerizados

Elpolmerofotopolimerizable(F127Ac2,F127Ac4oF127Ac8)sedisolvien
PBS10mM(pH7.4)con0.1%enpesodefotoiniciadorIrgacure2959(I2959),a
dosconcentracionesdiferentesdelpolmero:18%(w/v)y23%(w/v).
La disolucin se mantuvo una noche a 4 C y en oscuridad para su completa
disolucin.

259

Captulo6Capitulo

100 l de la disolucin precursora fra se introdujeron en un molde cilndrico

abierto,de6mmdedimetropor3mmdealtura,colocadosobreunportade
vidrio que sirvi como base y dispuesto todo el sistema sobre una placa
calefactora.
Elsistemasecalenta37Ccomprobandolaformacindelgel.
Elgelseexpusoaradiacinultravioleta(365nm)durante10minutos,conuna
distanciadelalmparaalamuestrade8cm.
Los hidrogeles fotopolimerizados formados se desmoldaron para su posterior
estudio.

d.ProtocolodecaracterizacindelosmaterialesporSEM

ParallevaracaboelestudioporSEMdeloshidrogelesfotopolimerizados,stos
fueron incubados en 2 mL de PBS 10 mM pH 7.4 a 37 C durante 3 das para
conseguirelestadodeequilibrio.
Loshidrogelesequilibradosseintrodujeronennitrgenolquido,sefracturaron
y se liofilizaron durante una noche. La congelacin con nitrgeno lquido y la
posterior fractura en fro, permite que la morfologa interna del hidrogel no se
veaalteradaenelprocesodefractura.
Las muestras se fijaron en cinta de carbono y se recubrieron con oro para su
observacinporSEM.

e.Protocolodeestudiodedegradacindeloshidrogeles

Los hidrogeles fotopolimerizados se pesaron (W0, peso inicial del hidrogel) e

incubaronen2mLdePBS10mMpH7.4a37C.
El peso de la muestra se control a intervalos regulares de tiempo (Wt) y
despus de cada pesada se aadi 2 mL de PBS nuevo para mantener las
condicionesinicialesdeincubacin.
ElgradodehinchamientosedeterminmedianteelcocienteWt/W0.
Losensayosserealizaronportriplicado.

260

Captulo6

f.Protocolodeensayosdeviabilidadcelularenhidrogeles

Preparacindelasclulas:LasclulasMSChumanasutilizadasenlosensayos
fueron cultivadas en medio de cultivo alfaMEM (Minimum Essential Medium)
con FGF (Fibroblast Growth Factor) y un 10 % de FBS (Fetal Bovine Serum). El
mediosecambicada34dasylasclulasfuerontripsinizadas,conelfinde
separarlasclulasdesusoporte,cuandosealcanzun80%deconfluencia.

Preparacindelasdisolucionesdepolmero:
el polmero en estado slido se esteriliz previamente exponindolo a
luzUVdurante1hora.
A continuacin los polmeros esterilizados se disolvieron en la
concentracin correspondiente, en medio de cultivo DMEM (Dulbeccos
Modified Eagles Medium), que contena 0.1 % (w/v) de fotoiniciador
I2959 o sin fotoiniciador en el caso de ensayos sin fotopolimerizar,
manteniendo la muestra durante una noche a 4 C. El medio de cultivo
conosinfotoiniciadorseesterilizpreviamenteporfiltracinatravsde
unfiltrode0.22m.
Ensayosdeviabilidad:
Todos los ensayos tanto en entorno 2D como en 3D se han realizado por
triplicado.
preparacindemuestras2D:enunaplacade96pocillossesembraron
10000clulasencadapocillo,secubrieroncon100Ldeladisolucinde
polmeroyseincubarondurante5minutosa37Chastalaformacindel
hidrogelfsico.
Una vez formado el hidrogel fsico, en el caso de los ensayos sin
fotopolimerizar, o tras la fotopolimerizacin, en el caso de los ensayos
con geles fotopolimerizados, se aadieron 100 L de medio de cultivo
fresco (DMEM con 20 % de FBS) para mantener las condiciones usuales
decultivocelular.
Paralarealizacindelosensayoscelularesconelpolmeroendisolucin
se prepar una muestra del polmero del doble de la concentracin

261

Captulo6Capitulo

necesariaparaelensayodisueltaenDMEM.Acontinuacinladisolucin
del polmero se diluy a la mitad (concentracin del ensayo) utilizando
DMEMcon20%deFBS,ysedejdisolvera4Cdurante1hora.
200Ldeladisolucinresultanteseadicionaronalospocillossobreuna
capa de clulas para la determinacin de la viabilidad celular en
disolucin.
preparacin de muestras 3D: las clulas se dispersaron en las
disoluciones de polmero a una densidad final de 1x105 clulas/mL. 100
Ldelasdisolucionesdepolmeroconclulassetransfirieronaunaplaca
de 96 pocillos (10000 clulas por pocillo), y se incubaron durante 5
minutosa37Chastalaformacindelhidrogelfsico.
Una vez formado el hidrogel fsico, en el caso de los ensayos sin
fotopolimerizar, o tras la fotopolimerizacin en el caso de los ensayos
fotopolimerizados se aadi 100 L de medio de cultivo fresco (DMEM
con 20 % de FBS) a cada pocillo, tras la formacin del hidrogel, para
mantenerlascondicioneshabitualesparaelcultivocelular.
Procesodefotopolimerizacin:
loshidrogelesconclulasenentorno2Do3Dseincubandurante5min
a37Chastalaproduccindelgelfsico.
elgelseexponearadiacinultravioleta(365nm)durante10minutos,
conunadistanciadelalmparaalamuestrade8cm.
Clculodeviabilidadcelular:
Loshidrogelesconclulassecultivarona37Cy5%deCO2durante24,
4872horas.
Transcurridosestostiempos,lasclulassetieronconCalceinAMycon
Ethidiumhomodimer.Pararealizarlatincinseadicionencadapocillo
50Ldeunadisolucindelasiguientecomposicin:1LdeCalceinAM+
1ldeEthidiumhomodimer+660LdeDMEM.

262

Captulo6

Las placas con agentes de tincin se incubaron durante 30 minutos a

37Cy5%deCO2.Transcurridoestetiempo,lasclulasvivasymuertas
sevisualizaronutilizandomicroscopiadefluorescencia.
Losporcentajesdeviabilidadcelular,frenteauncontrol,secalcularon
utilizandolasiguienteecuacin:

%viabilidadcelular
%deviabilidadcelular
%viabilidadcelularcontrol
x100

El porcentaje de clulas vivas y muertas se determin por contaje del

nmerodeclulasdecadatipo,conformealmtodoutilizado(verAnexo
III),ydelnmerototaldeclulas.Encadaunodelos3pocillosdecada
ensayo realizado se tomaron 2 fotografas de dos zonas diferentes del
pocillo. Los resultados mostrados son por tanto una media de 6 valores
expresadosconsucorrespondientedesviacinestndar.

Como ensayo de control se prepararon 3 pocillos con el mismo nmero

de clulas utilizadas en los ensayos 2D y 3D, 10000 clulas por pocillo,
nicamenteconmediodecultivo.
Alcabode24,48y72horassedeterminlaviabilidadcelulardelcontrol
por fluorescencia, utilizando el mtodo live/dead. Tras 72 horas de
ensayoseobtuvounaviabilidadcelularprximaal99%comosepuede
observarenlaFigura6.1.

100
Viabilidadcelular(%)

80
60 24HORAS
40 48HORAS
72HORAS
20
0
CONTROL
Concentracin(%enpeso)
Figura6.1.Viabilidadcelulardelensayodecontrol.

263

Captulo6Capitulo

Marcajedelasclulasenhidrogelesparaobservacinpormicroscopiaconfocal:

Loshidrogelesconclulassecultivarona37Cy5%deCO2durante24
horas.Acontinuacin,lasclulassetieroncon50Ldeunadisolucin
de Calcein AM (1L Calcein AM en 660 L de DMEM). Las placas con
tincinseincubarondurante30minutosa37Cy5%deCO2.Unavez
transcurridoesetiemposeadicionaron5LdeDAPIdirectamenteenel
pocilloylasmuestrassevolvieronaincubardurante30minutosa37Cy
5%deCO2.Lasclulassevisualizaronconmicroscopiaconfocal.

g.Protocolodecaracterizacinmecnicadeloshidrogeles

Loshidrogelessefotopolimerizarondelaformadescritaenelapartado6.2.c.
Unavezobtenidoslosgelesfotopolimerizadosfueronalmacenadosa37Cen
PBS10mMpH=7.4hastasuensayo(nuncamsde4horas).
Losdatosexperimentalesobtenidosencadaensayoseanalizaronmedianteel
uso de un ejecutable en el programa MatLab, a partir del cual se gener la
curva de tensindeformacin (), de la que se obtuvieron diferentes
parmetros mecnicos en funcin del mtodo utilizado (monotnico o carga
relajacin)ydeltipodeensayoencondicionesNCoCC.
Losvaloresdelosdistintosparmetrosmecnicossemuestrancomolamedia
de los valores obtenidos con 6 probetas ensayadas, con su correspondiente
error.
Paralarealizacindelosensayosdefatigasehanutilizadocmarasdeensayo
(Figura 6.2) que permiten mantener los hidrogeles fotopolimerizados entre los
dosmbolosmetlicos,sumergidosenPBS10mMpH7.4a37C,utilizandoun
baotermostatizadoexterno(Figura6.3).Paraevitarlaaparicindehongosse
adicion al PBS un 1% v/v de una mezcla de antibiticos
(Penicilina/Estreptomicina)yun0.5%v/vdeFungizona.

264

Captulo6

Figura6.2.Detalledelascmarasdeensayoutilizadasparalosensayosdefatiga.

Figura6.3.Detalledelascmarasdeensayoutilizadasparalosensayosdefatigaconel
baotermostatizadoexterno.

h.ProtocolodedeterminacindelaCMC

Lasdisolucionesdeloscopolmerosbloquelinealydendrticolinealdendrtico
demayorconcentracin(1,0.5,0.3y0.1%(w/v))seprepararonpordisolucin
directa de los materiales en agua destilada. Las disoluciones de menor
concentracin (0.05, 0.01, 0.001, 0.0001 % (w/v)) se prepararon por dilucin a
partir de una disolucin de mayor concentracin. Todas las disoluciones se
mantuvierondurante4horasa4C.
Paralapreparacindeladisolucindepirenosedisolvieron0.485mgdepireno
en200mLdeagua(1.2x105M).Paragarantizarunacompletadisolucindeste
ydadasubajasolubilidadenagua,elpirenosedisolvipreviamenteenacetona,

265

Captulo6Capitulo

yestadisolucinseadicionsobre200mLdeaguadestilada.Acontinuacinla
acetonaseevapordurante4horasavaco.
Sobrelasdisolucionesacuosasdelosdiferentescopolmerosseadicionaron10
Ldeladisolucindepireno(1.2x105M)paraconseguirunaconcentracinfinal
de pireno de 6x108 M. Las disoluciones se incubaron durante 1 hora a
temperaturaambienteyenoscuridad.
Elespectrodeexcitacindelasdiferentesmuestrasconpirenosemidienel
intervalode300a350nmconemisin=390nm.Deestosespectrossetrabajcon
elvalordelaintensidad,a332nm(I332)ya335nm(I335),paracadaunadelas
concentracionesdematerialpreparadas.

i.Protocolodepreparacindenanogelesfotopolimerizados

Sepreparunadisolucinal10%(w/v)delcopolmeroenaguadestilada,que
contenaun0.1%(w/v)defotoiniciadorIrgacure2959previamentedisuelto.Esta
disolucinsemantuvoduranteunanochea4Cparasucompletadisolucin.
Estadisolucinal10%(w/v)sefiltrutilizandounfiltrode0.2mdeacetatode
celulosaparaeliminarposiblespartculasensuspensin.
A partir de esta disolucin del 10% (w/v) se prepararon disoluciones de
concentracin0.77%(w/v),utilizandoparasudilucinunadisolucinacuosacon
un0.1%(w/v)defotoiniciadorI2959previamentefiltradaconfiltrode0.2m.
Las disoluciones precursoras al 0.77% (w/v) se equilibraron durante 1 hora a
temperaturaambiente,paraconseguirelestadodeequilibrio.
5 mL de las disoluciones precursoras con el copolmero reactivo se
fotopolimerizaron en un recipiente de vidrio cilndrico de 6 cm de dimetro,
irradiandoconluzultravioleta(365nm)durante10minutosaunadistanciade8
cmdelalmparaalamuestra.
Lafotopolimerizacinsellevacaboa25C.Paramantenerlatemperaturade
fotopolimerizacin constante se utiliz una placa calefactora, sobre la cual se
colocelmoldecilndricodevidrio.

266

Captulo6

Las disoluciones fotopolimerizadas se dializaron a 4 C durante 24 horas

(nanogelesdeF127Ac2)ydurante72horas(nanogelesdeF127Ac4yF127Ac
8), utilizando una membrana de acetato de celulosa Spectra/Por Biotech
MWCO300,000(Spectrum)conuntamaodeporode30nm.Elmayortiempo
dedilisisaplicadoparalosnanogelesdelosderivadosF127Ac4yF127Ac8se
debe al mayor peso molecular que presentan lo que disminuye la velocidad de
dilisis,talycomoseobservaenlasespecificacionesdelamembranadedilisis
utilizada.
A continuacin, las muestras dializadas (ms 1 mL de agua destilada utilizado
paralavarlamembranadedilisis)sefiltrarondenuevoconfiltrosdeacetatode
celulosade0.2m,paralaeliminacindeagregadosdetamaosuperioralos
200nm.

j.ProtocolodecaracterizacinporTEMySEMdenanogelesfotopolimerizados

ParalapreparacindemuestrasdeTEM,seadicionaunagotadeladisolucin
acuosa de los nanogeles sobre una rejilla de cobre recubierta de carbono. El
exceso de muestra se seca con papel de filtro y la rejilla se deja secar a
temperaturaambiente.
Para la preparacin de muestras de SEM, se adiciona una gota de disolucin
acuosadenanogelessobreuncubreredondodevidriode12mmdedimetro.
Lamuestrasedejasecaratemperaturaambienteyunavezsecaserecubrecon
oro.

k.Protocolodeencapsulacinennanogeles

EncapsulacinderodaminaB

Se prepar una disolucin de rodamina B de concentracin 0.15 mg/ml en

etanol.

267

Captulo6Capitulo

Esta disolucin se adicion sobre la disolucin de cada uno de los nanogeles,

PDF/NF127Acn(n=2,4y8).Lacantidadderodaminaadicionadaconrespecto
alacantidaddenanogelesfue0.15mgderodamina/mgdenanogel.
A continuacin la mezcla de ambas disoluciones se incub a temperatura
ambientedurante24horas.
Eletanolseevaporconagitacinorbitalyladisolucinacuosadenanogeles
cargadosconrodaminayrodaminanoencapsuladaresultantesedializ(SlideA
LyzesDyalisisCassetteG22,000MWCO,ThermoScientific)conaguadestilada
durante24horasparaeliminarlarodaminanoencapsulada.
La cuantificacin de la rodamina no encapsulada en las aguas de dilisis se
realizporfluorescencia(max en agua=576nm).Paralarealizacindelacurvade
calibrado de la rodamina se utilizaron disoluciones acuosas en el rango de
concentraciones 2.538 g/ml. La cantidad derodamina encapsuladase calcul
deformaindirectacomoladiferenciaentrelacantidadderodaminaadicionada
inicialmenteylacantidadderodaminapresenteenlasaguasdedilisis.

Encapsulacindepireno

Sepreparunadisolucindepirenodeconcentracin0.15mg/mlenacetona.
Esta disolucin se adicion sobre la disolucin de cada uno de los nanogeles,
PDF/NF127Acn(n=2,4y8).Lacantidaddepirenoadicionadaconrespectoala
cantidaddenanogelesfue0.15mgdepireno/mgdenanogel.
A continuacin la mezcla de ambas disoluciones se incub a temperatura
ambientedurante24horas.
La acetona se evapor con agitacin orbital, produciendo la precipitacin del
pirenonoencapsuladoenladisolucinacuosadenanogeles.
La disolucin acuosa de nanogeles cargados con pireno y pireno no
encapsuladoenformadeprecipitadosefiltratravsdefiltrosdeteflnde0.45
m.Elfiltroselavconacetonaparalarecuperacindelpirenonoencapsulado
ysucuantificacin.

268

Captulo6

Elpirenonoencapsuladoprecipitadosecuantificporfluorescencia,utilizando
elespectrodeexcitacin(maxenacetona=332.5nm).Paralarealizacindelacurva
de calibrado del pireno se utilizaron disoluciones de pireno en acetona en el
rangodeconcentraciones13.4268g/ml.Lacantidaddepirenoencapsuladose
calcul de forma indirecta como la diferencia entre la cantidad de pireno
adicionada inicialmente y la cantidad de pireno no encapsulado en forma de
precipitado.

6.3.l.Protocolodeensayoscelularesconnanogeles

Preparacindelasclulas:LasclulasHeLasecultivaronenDMEMhighglucose
(4.5g/l),4mMdeLglutamina,10%deFBS,1%dePenicilina/Estreptomicinay
1%deAnfotericinaBylasclulasMSCderatnsecultivaronenDMEMF12(3g/l
deglucosa)2mMdeLglutamina,10%deFBS,1%dePenicilina/Estreptomicinay
1%deAnfotericinaB.Lasclulassemantuvierona37C,con21%O2y5%CO2
paraHeLay3%O2y5%CO2paraMSC.Cuandolasclulasalcanzaronun8090%
deconfluenciaselavaronconDPBS(DulbbeccosPhosphateBufferedSaline),se
aadisolucindetripsinaal1%yseincubarondurante5minutosa37C,para
permitir la rotura de las protenas que producen la adhesin de las clulas al
recipiente de cultivo. La accin de la tripsina se detuvo aadiendo medio de
cultivofresco.
Preparacin de las disoluciones de nanogeles: En el caso de los nanogeles
PDF/F127Ac2,trassuliofilizacin,seredisolvieronalaconcentracindeseada
directamente en DMEM high glucose para ensayos con HeLa y en DMEM F12
paraensayosconMSC.ParalosnanogelesPDF/NF127Ac4yPDF/NF127Ac8,
disueltosenaguadestilada,laconcentracinseajustporadicindemediode
cultivo DMEM high glucose para ensayos con HeLa y con DMEM F12 para
ensayos con MSC. Previo al ajuste de la concentracin, las disoluciones de
nanogeles de PDF/NF127Ac4 y PDF/NF127Ac8 en agua destilada una vez
fotopolimerizadasydializadassefiltraronconfiltrosde0.22mparaesterilizar.
Todas las manipulaciones de redisolucin, filtrado o ajuste de la concentracin

269

Captulo6Capitulo

poradicindemediodecultivoserealizaronencampanadeflujolaminarpara
garantizarlascondicionesdeesterilidad.

Ensayosdeviabilidad:LasclulasHeLaoMSCsesembraronaunadensidadde
10000 clulas por pocillo, utilizando placas de 96 pocillos. Tras 24 horas de
incubacinseretirelmediodecultivoyseaadieron100Ldedisolucinde
nanogeles de la concentracin deseada. Todos los ensayos se realizaron por
triplicado.
Elmediodecultivoconnanogelesseretirtras24,48o72horasdeincubaciny
se aadi medio de cultivo fresco. A continuacin se aadi una disolucin de
AlamarBlue,enunacantidaddel10%delvolumendemediopresenteencada
pocillo. Tras 2 horas de incubacin a 37 C, la fluorescencia se ley a 530/590
(excitacin/emisin)enunlectordeplacas.Laviabilidadcelularseexprescomo
la viabilidad de clulas relativa al control (% comparado con las clulas control
incubadassloconmediodecultivo).
Ensayosdeinternalizacin:
LasclulasHeLasesembraronaunadensidad40000clulasporpocillo,
sobreportasde12mmdispuestosenelfondodelospocillosdeplacasde
cultivode24pocillos.
Para la incubacin con los nanogeles cargados con rodamina B o
rodaminaEST se adicion disolucin de nanogel con rodamina B o
rodaminaEST disuelto en agua destilada, cuya concentracin se ajust
previamenteporadicindemediodecultivoDMEMhighglucose,siendo
elvolumenfinaldelensayode500L.Lasclulasseincubarondurante4
horasa37Coa4C.
Transcurrido ese tiempo, se retir el medio de cultivo con nanogel
cargadoconrodaminaylasclulasselavaron3vecesconPBS.
La fijacin de las clulas se realiz por adicin de 300 L de
formaldehido al 4% e incubacin durante 20 minutos a temperatura
ambiente.
Acontinuacinlasclulasselavarondurante5minutosconPBS(x2).

270

Captulo6

Pararealizarelmarcajedelaactinadelasclulasseutilizelfluorforo
verdeAlexafluor488.Elportaconlasclulassedispusosobreunagota
de 40 L de Alexa fluor y se incub durante 1 hora a temperatura
ambiente.Lasclulasselavarondurante5minutosconPBSBS(PBS+1%
BSA(BovineSerumAlbumin)+0.1%Saponina),PBSB(PBS+1%BSA)yagua
destilada.
Los cubres se secaron con papel de filtro. Para realizar el marcaje del
ncleo de las clulas se aadi sobre el cubre 5 L de DAPIMowiol. El
cubresetapconunporta,sesellconlacadeuastransparenteytras
su secado se almacen a 4 C en oscuridad hasta observacin por
microscopiaconfocal.

6.3.MATERIALESYTCNICAS

Los reactivos y disolventes utilizados en la sntesis de los compuestos fueron

suministradosporSigmaAldrichoAcrs.
LamembranadeacetatodecelulosaSpectra/PorBiotechdeMWCO300,000y
lamembranaSpectra/PordeMWCO3500fueronsuministradasporSpectrum.
La membrana SlideALyzes Dyalisis Cassette G2 de MWCO 2,000 fue
suministradaporThermoScientific.
El DMEM, DMEM F12, DMEM high glucose, DPBS y Lglutamina fueron
sumistrados por Gibco, Invitrogen para Life Technologies, Thermo Fisher
Scientific,Espaa.
ElkitLive/dead(CalceinAM/Ethidiumhomodimer),PhalloidinAlexafluor488y
DAPI(dilactate)fueronsuministradosporInvitrogen.
ElmowiolfuesumistradoporMerck.
La Penicilina, Estreptomicina, Anfotericina B y tripsina (TrypsinVersene 10X)
fueronsuministradasporLonza.
LaBSAfuesumistradaporSigmaAldrich.
LasclulasHeLafueronsuministradasporCancerResearchUKcellbank.

271

Captulo6Capitulo

Las clulas MSC de ratn (bone marrow of C57BL/6 mouse at 8 weeks after
gestation)fueronsumistradasporGibco.

Los espectros de 1HRMN y 13CRMN se han registrado en los siguientes

equipos:BrukerAV400(operandoa400MHzpara1Hy100MHzpara13C)oAV
500 (operando a 500 MHz para 1H y 125 MHz para 13C), Bruker AMX300
(operando a 300 MHz para 1H y 75 MHz para 13C), equipos del Servicio de
ResonanciaMagnticadelCEQMA(CentrodeQumicayMaterialesdeAragn).
El CDCl3 se ha utilizado como disolvente; los desplazamientos qumicos se
muestranenppmrelativosaTMS,utilizandoelpicodedisolventecomoestndar
interno.

Los espectros de FTIR se han realizado en un espectrofotmetro Thermo

NICOLET Avatar 360 FTIR utilizando una pastilla de NaCl como soporte o un
equipo Bruker Vertex 70 en modo ATR modelo MKII Golden Gate Single
Reflection ATR System de Specac. Equipos del Departamento de Qumica
OrgnicadelaUniversidaddeZaragoza.

Elanlisiselementaldeloscompuestosseharealizadoenunmicroanalizador
Perkin Elmer CHN 2400, equipo perteneciente al Servicio de Anlisis Elemental
delCEQMA.

LostermogramasdeDSCsehanrealizadoenelequipoQ20V24.10Build122de
TA Instruments, utilizando cpsulas de aluminio para la preparacin de las
muestras.EquipodelServiciodeCalorimetradelCEQMA.

La espectrometra de masas se ha realizado en un ESI Brker Esquire 300+,

MALDI+/TOF Brker Microflex system, utilizando NAFTA/ditranol como matriz.
EquipodelServiciodeEspetrometradeMasasdelCEQMA.

LasmuestrasdeSEMsehanobservadoenunequipoInspectF50perteneciente
alLaboratoriodeMicroscopiasAvanzadas(LMA)delInstitutodeNanocienciade
Aragn(INA).

272

Captulo6

Las medidas de TEM han sido realizadas en un microscopio TECNAI G20 (FEI
COMPANY), 200 kV, perteneciente al LMA del INA. Las muestras fueron
preparadasenrejillasholleycarbonfilm300MeshCu(50)deAgarScientific.

Las medidas de DLS se realizaron en un equipo Malvern Instrument Nano ZS

queutilizaunlaserdeHeNeconunalongituddeondade633nmyunngulode
deteccinde173,a25Cy37C.

LasmedidasdeGPCsehanrealizadosobremuestrasdeconcentracin1mg/ml
utilizando un equipo Waters e2695 Alliance equipado con un detector de
dispersin de luz, columnas Styragel HR1 de Waters o PLgel 5m MIXEDC de
AgilentTechnologies.LasmedidassehanrealizadoconTHF(gradoHPLC)como
disolvente,conunflujode1ml/min.Paraelcalibradosehanutilizadopatrones
depoliestireno.

Las medidas de fluorescencia se han realizado en un espectrmetro de

fluorescenciaPerkinElmerLS55,pertenecientealINA.

LaliofilizacinserealizenunliofilizadorCryodos50deTelstarperteneciente
alINA.

Las propiedades mecnicas se midieron en una mquina de ensayos uniaxial

Instrom5848yunamquinaInstromMicroTester5548.Losensayosdefatigase
realizaron en una mquina BOSE ElectroForce 5210 BioDynamic con capacidad
para 4 cmaras de ensayo y una fuerza mxima aplicable de 200 N. Equipos
pertenecientesalgrupoGEMMdelI3A.

Las clulas HeLa se incubaron en un incubador de CO2 Excella ECO170 (New

BrunswichScientific,UK).LasMSCseincubaronenunincubadordeCO2Forma
seriesIIwaterjacketed,HEPAclass100(ThermoFisherScientific,Spain).

Las imgenes en contraste de fases y de fluorescencia de las clulas se han

realizadoenunmicroscopioinvertidomodeloOlympusIX81enelCIBA(Centro
deInvestigacionesBiomdicasdeAragn).

273

Captulo6Capitulo

LafluorescenciaenelmtodoAlamarBluesedeterminconunlectordeplacas
Synergy HT de Biotek perteneciente a la Unidad de Investigacin Translacional
(UIT)delHospitalMiguelServet,IACS.

Las imgenes de microscopia confocal se realizaron en un equipo Fluoview

FV10iconinmersinenaceite,pertenecientealCIBA(CentrodeInvestigaciones
BiomdicasdeAragn).Lasimgenessevisualizaronytrataronconelsoftware
FV10ASW4.0Viewer.

274

CAPTULO7

CONCLUSIONES

Captulo7

Se han sintetizado copolmeros bloque basados en Pluronic F127, con

estructura lineal o dendrticalinealdendrtica (derivados de bisMPA), y con
diferentes grupos terminales (COCH=CH2, SH, Bn y OH), que proporcionan
hidrogelestermosensiblesinyectablesymoldeables.

La presencia de grupos reactivos en estos copolmeros permite obtener, va

procesosdefotopolimerizacin,hidrogelesdemayorconsistenciamecnicaque
sus precursores, utilizando tanto materiales monocomponente (COCH=CH2)
comoformulacionesbicomponente(COCH=CH2+SH).

Estos hidrogeles presentan distintos tiempos de degradacin, as como

morfologas internas porosas, con tamao de poro microscpico. Algunos de
estoshidrogelesmuestranviabilidadescelularesinvitro(clulasMSChumanas)
superiores al 85% a las 72 horas, en ensayos 2D, lo que permite pensar en su
posibleaplicacinenIngenieradeTejidos.

LoscopolmeroscongruposterminalesCOCH=CH2soncompuestosadecuados
para la preparacin de nanogeles, va procesos de fotopolimerizacin,
obteniendo nanopartculas con tamaos entre 50 y 100 nm a 37 C, y
viabilidadescelularesinvitro(clulasHeLa)superioresal50%alas72horas.

Estosnanogelessontermosensiblesypuedencargarseconmolculashidrfilas
e hidrfobas, as como producir su transporte e internalizacin en medios
celularesinvitro(clulasHeLa),loquepermitepensarensuposibleaplicacin
comosistemasdeTransporteyLiberacincontroladadefrmacos.

277

ANEXOS

ANEXOS

En estos apartados se recogen descripciones detalladas y datos de tcnicas,

procedimientos y estudios realizados y obtenidos como parte del trabajo
desarrolladoenestatesisdoctoral.

281



ANEXOS

ANEXOI.CARACTERIZACINESTRCUTURAL

FiguraI.1.EspectrodeHSQCparalamolculaF127Ac8ENCDCl3,500MHz.

FiguraI.2.EspectrodeHMBCparalamolculaF127Ac8enCDCl3,500MHz.

283

ANEXOSCapitulo

50
a) 1200 b)
40
800 30

LSU
LSU

20
400
10
0 0
0 10 20 30 0 10 20 30
Tiempo(minutos) Tiempo(minutos)
c) 120 d) 150
100
80 100
LSU

LSU
60
40 50
20
0 0
0 10 20 30 0 10 20 30
Tiempo(minutos) Tiempo(minutos)
e) 120 f) 80
100
60
80
LSU
LSU

60 40
40
20
20
0 0
0 10 20 30 0 10 20 30
Tiempo(minutos) Tiempo(minutos)
g) 700 h) 25
600 20
500
15
400
LSU
LSU

300 10
200
5
100
0 0
0 10 20 30 0 10 20 30
Tiempo(minutos) Tiempo(minutos)
FiguraI.3.CromatogramasdeGPCdelosderivadosdePluronicF127descritos:
a)PluronicF127,b)F127Ac2,c)F127Bn2,d)F127OH4,e)F127Ac4,f)
F127Bn4,g)F127OH8yh)F127Ac8.Cromatogramasa),d)yg)realizados
concolumnaStyrageHR1THFWaters,restodecromatogramasrealizadoscon
columnaPLgel5mMIXEDCdeAgilentTechnologies.

284

ANEXOS

30

I J 35

40

45

f1 (ppm)
50

55

G 60

65

4.7 4.5 4.3 4.1 3.9 3.7 3.5 3.3 3.1 2.9 2.7
f2 (ppm)
FiguraI.4.EspectrodeHSQCparalamolculaF127SH2enCDCl3,500MHz.

J
O M
I,IGF

FiguraI.5.Espectrode1HRMNparalamolculaF127PN4enCDCl3,300MHz.

285

ANEXOSCapitulo

100
a) 90
80
70
60
LSU

50
40
30
20
10
0
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo(minutos)

100
b)
90
80
70
60
LSU

50
40
30
20
10
0
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo(minutos)

100
c) 90
80
70
60
LSU

50
40
30
20
10
0
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo(minutos)

FiguraI.6.CromatogramasobtenidosporGPCconcolumnasPLgel5mMIXEDCde
AgilentTechnologiesparaa)F127PN2,b)F127PN4yc)F127PN8.

286

ANEXOS

a)
100

Intensidad(%)
50

0
2000 7000 12000 17000
m/z
b)
100
Intensidad(%)

50

0
2000 7000 12000 17000
m/z
c)
100
Intensidad(%)

50

0
2000 7000 12000 17000
m/z
d)
100
Intensidad(%)

50

0
2000 7000 12000 17000
m/z
e)
100
Intensidad(%)

50

0
2000 7000 12000 17000
m/z

FiguraI.7.EspectrosMALDIMS:a)F127PN2,b)F127SH2,c)F127PN4,d)F127SH4y
e)F127PN8.

287

ANEXOSCapitulo

ANEXOII.CARACTERIZACINDEHIDROGELESPORDSC

LautilizacindelatcnicadeDSCparaladeterminacindelaLCST(LowCritical
SolutionTemperature)dePluronicF127hasidodescritaporvariosautores.135
En los termogramas se muestra el flujo de calor frente a la temperatura,
observndose dos cambios de la lnea base, adjudicados al proceso de
micelizacinydegelificacin(FiguraII.1).

El primer pico endotrmico Figura II.1 (a) corresponde al proceso de

micelizacin, que supone la agregacin de las cadenas de polmero en micelas.
EstepicopermiteobtenerlaCMT,queeslatemperaturaalacualseproducela
micelizacinparaunadisolucindepolmerodeunadeterminadaconcentracin.

(a)

(b)

FiguraII.1.TermogramadeDSCdeunadisolucinacuosaal30%w/vdePluronic
F127.135d

ElsegundopicodelaFiguraII.1(b),tambinendotrmico,ycorrespondienteal
procesodegelificacin,aparececomounpequeopicoaladerechadelpicode
micelizacinypermiteladeterminacindelaLCST.Enlagelificacinporefecto

135
(a)Nie,S.F.;Hsiao,W.L.W.;Pan,W.S.;Yang,Z.J.,Int.J.Nanomed.2011,6,151166;
(b)Barba,A.A.;d'Amore,M.;Grassi,M.;Chirico,S.;Lamberti,G.;Titomanlio,G.,Journal
ofAppliedPolymerScience2009,114(2),688695;(c)Li,L.;Lim,L.H.;Wang,Q.;Jiang,S.
P., Polymer 2008, 49 (7), 19521960; (d) Cabana, A.; AtKadi, A.; Juhsz, J., Journal of
ColloidandInterfaceScience1997,190(2),307312.

288

ANEXOS

de la temperatura se produce una reorganizacin de las micelas ya formadas.

Esta transicin supone un pequeo cambio de entalpa por lo que utilizando la
representacindelflujodecalorfrentealatemperaturaestepicosloesvisible
paradisolucionesdePluronicF127deelevadaconcentracin.135d

EnlaFiguraII.2(a)semuestraeltermogramacorrespondienteaunadisolucin
de F127Ac4 al 25 % (w/v) dnde solo se aprecia el proceso reversible de
micelizacinenelcalentamientoyenelenfriamiento.Porello,paraunamejor
determinacin de la temperatura de gelificacin, se ha trabajado con la
representacin de la derivada del flujo de calor respecto al tiempo frente a la
temperatura(FiguraII.2(b)).135aElprimerpicomsgrande,debidoaunmayor
valordeentalpa,correspondealprocesodemicelizacin(CMT),mientrasqueel
segundopicomspequeo,debidoaunmenorvalordeentalpa,correspondea
latransicinsolgel(LCST).

289

ANEXOSCapitulo

0,4
a) SOL GEL
0,3

Flujodecalor(W/g)
0,2
0,1
0
0,1
0,2 SOL GEL
0,3
0,4
10 10 30 50
Temperatura(C)

Micelizacincalentamiento
b) 4

3
DerivadaFlujodeCalor

2
(mW/min)

Gelificacincalentamiento
1

2
0 10 20 30
Temperatura(C)

FiguraII.2.TermogramadeDSCdeF127Ac4al25%w/venPBS10mMpH7.4,a)Flujo
decalor(W/g)frentealatemperaturaenelprocesodecalentamientoyenfriamiento,
b)Derivadadelflujodecalorconrespectoaltiempo(mW/min)frentealatemperatura
enelprocesodecalentamiento.

290

ANEXOS

ANEXOIII.ENSAYOSDEVIABILIDADCELULAR

MtododeMTTparaladeterminacindelaviabilidadcelular

ElmtodoMTTfuedesarrolladoporMosmann118ben1983ymodificadoen1986
porFranoisDenizotyRitaLang.118a

El ensayo con MTT se basa en la reduccin metablica del bromuro de 3(4,5

dimetiltiazol2ilo)2,5difeniltetrazol (MTT) que realiza la enzima mitocondrial
succinatodeshidrogenasatransformndoloenuncompuestocoloreadodecolor
azul,Formazn(FiguraIII.1).Lamedidadelaabsorbanciadeestecompuestoa
570nmpermitedeterminarlafuncionalidadmitocondrialdelasclulastratadas
y por tanto la viabilidad celular. A mayor cantidad de Formazn producido la
viabilidadcelularesmayor.

MTT(coloramarillo) Formazn(colorazul)
FiguraIII.1.ReduccinmetabolicadelMTTaFormaznproducidaporlaenzima
succinatodeshidrogenasa.

En nuestro caso se aadi el MTT a cada uno de los pocillos. Tras incubacin
durante4horasa37Cy5%deCO2seprocediaredisolverelFormaznparasu
cuantificacin.Enestepuntoseobservquepartedeloshidrogelesretenanel
Formazn en su estructura, siendo imposible su total disolucin y por tanto su
cuantificacin.Estehechoeramsnotableenloshidrogelesfotopolimerizados.
Por tanto este mtodo se descart para la medida de viabilidad de nuestros
hidrogeles.

291

ANEXOSCapitulo

Mtodolive/deadparaladeterminacindelaviabilidadcelular

La viabilidad celular de nuestros materiales se evalu por el mtodo live/dead

(Invitrogen). Este mtodo consiste en la tincin especfica de las clulas vivas
utilizandoCalceinAM(Calceinacetoxymethylester)ylatincinespecficadelas
clulasmuertasconEthidiumhomodimer1.

La Calcein AM es un compuesto no fluorescente permeable a la membrana

celularquesetransformaenuncompuestoquepresentaunagranfluorescencia
verde cuando es hidrolizado por las enzimas estearasas intracelulares. (Figura
III.2) La actividad intracelular de las estearasas y la integridad de la membrana
plasmticasoncaractersticasdelasclulasvivas.

FiguraIII.2.HidrlisisdeCalceinAMparadarlugaraCalceinproducidaporlaenzima
estearasaenelinteriordelaclulas.

El Ethidium homodimer1 (Figura III.3) es un compuesto impermeable a la

membrana celular que produce fluorescencia en el rojo cuando se une a los
cidos nuclecos del ADN. Cuando la clula est viva, con su membrana celular
intacta, este compuesto no puede penetrar en el interior de la clula y no se

292

ANEXOS

produce unin al ADN, sin proporcionar fluorescencia. En cambio, cuando la

clulaestmuerta,estecompuestoescapazdeinteraccionarconelADNdebido
a la prdida de integridad estructural por la muerte celular, produciendo la
fluorescenciaenelrojo.

FiguraIII.3.EstructuraqumicadelamolculaEthidiumhomodimer1.

MtodoAlamarBlueparaladeterminacindelaviabilidadcelular

La Resazurina es un fluorofro redox comercialmente disponible como Alamar

Blue. Este fluorforo experimenta cambios colorimtricos y fluorimtricos
relacionadosconlaactividadmetablica.Elensayoestbasadoenlahabilidad
de las clulas viables o metablicamente activas de reducir Resazurina a
Resorufina o dihidroresorufina (Figura III.4). La conversin ocurre de forma
intracelular,cuandolaformaoxidadadelaResazurinapenetraenelcitosolyes
convertidoasuformareducidaporaccindelaenzimamitocondrial,aceptando
electronesdelNADPH,FADH,FMNH,NADHascomodenumerososcitocromos.
Estareduccinesresponsabledeuncambioenlafluorescenciadesdelaforma
oxidadaonofluorescente,alaformareducidaquesloes.

293

ANEXOSCapitulo

FiguraIII.4.TransformacindeResaruzinaaResorufinaporreaccionesdereduccinen
lasclulasviablesometabolicamenteactivas.

La Resarzurina es un compuesto no txico para las clulas y es estable en el

mediodecultivo,loquepermiteunamedidacontinuadelaproliferacincelular
in vitro. Los compuestos txicos que afectan a la viabilidad celular y a la
proliferacintambinafectanalacapacidaddereduccindelaResarzurina,yla
velocidad de la reduccin es directamente proporcional al nmero de clulas
viablespresentes.

294

ANEXOS

ANEXOIV.CARACTERIZACINMECNICADEHIDROGELES.

Dentro de los ensayos dinmicos y estticos los ms utilizados en la

caracterizacindelaspropiedadesmecnicasdelcartlagoarticularsonensayos
de tipo esttico, entre los que se incluyen los mtodos de compresin uniaxial
monotnica y los mtodos de compresin uniaxial de cargarelajacin. Ambos
mtodos se pueden realizar en compresin no confinada (NC), compresin
confinada (CC) o de indentacin dependiendo del utillaje utilizado para la
aplicacindelacarga.

Las principales diferencias entre los ensayos de compresin no confinados y

confinados, se centran en la diferencia del comportamiento del material bajo
diferentesrestriccionesdemovimiento.Paraelcasodeensayosdecompresin
no confinados, al hidrogel se le permite generar una deformacin lateral a
medidaqueactalacargaoeldesplazamiento,porloquelasfibrasqueforman
el hidrogel se reubican progresivamente al deformarse paulatinamente,
actuandoatraccintransversal.Alfinaldelensayoseobtendrunamatrizcon
mayoresdimensionesconrespectoaldimetroinicialydemenorespesor.Porel
contrario en un ensayo de compresin confinada se impide la deformacin
lateral al ubicar al hidrogel en un habitculo que le impide dicha deformacin,
provocando que las fibras no puedan reacomodarse libremente, por lo que las
dimensionesdelmaterialsolocambianconrespectoalespesor.Otradiferencia
importante est en el comportamiento y limitaciones que presenta el flujo
interno dentro del hidrogel. En este sentido, para ensayos de compresin no
confinados el flujo puede producirse libremente por las paredes laterales del
hidrogel,mientrasqueparaunensayodecompresinconfinadadichoflujoseve
forzadoasalirporlaparteinferiordelmismo.119120

i)Ensayosdecompresinuniaxialmonotnica

Enestetipodeensayoslacargasevaaplicandodeformalinealyuniforme.Con
estosensayosseobtienenelMdulodeRigidez(Emedido):MdulodeYoung(ES)y
MduloAgregado(HA).

295

ANEXOSCapitulo

Emedido se calcula como la pendiente en la zona de comportamiento lineal del

materialenlagrficatensindeformacin().Esimportantedestacarquede
cada tipo de ensayo realizado, NC y CC, y debido a las restricciones de
movimiento ejercidas por los utillajes utilizados, tal y como se ha descrito
anteriormente, ste Mdulo tiene connotaciones diferentes, denominndose
MdulodeYoung(Emedido=ES)paraNCyMduloAgregado(Emedido=HA)paraCC.
Ambosparmetrosproporcionanunamedidadeladurezadelhidrogelbajolos
efectosdeunacarga.120

ii)Ensayosdecompresinuniaxialdecargarelajacin

CoeficientedePoisson()
es la relacin entre la deformacin lateral y la deformacin axial en una
probetaconcargaaxial.

Paraelclculodeserepresentanlosvaloresobtenidosdetensindeformacin
por los mtodos de NC y CC y se obtienen ES y HA, de la forma descrita en el
apartado anterior. Cabe destacar que estos valores obtenidos son diferentes a
loshalladosatravsdelmtododecompresinuniaxialdecargamonotnicaya
que en los ensayos de cargarelajacin se extrae el agua del interior de los
hidrogeles por lo que se evala nicamente las propiedades de la matriz
polimrica.seobtienedeformaempricamediantelacombinacindeESyHA
por medio de la Ecuacin (1). Esta frmula slo es aplicable dentro del lmite
elsticodelmaterial.

(1)

296

 ANEXOS

Permeabilidad()

Elclculodelapermeabilidad,,serealizaaplicandolaEcuacin(2),dondees
el tiempo de relajacin, h es el espesor de la muestra y HA es el Mdulo
Agregado.ElclculodeyHAserealizanconensayosdecompresinuniaxialde
cargarelajacindetipoCC.

(2)

LaFiguraIV.1(a)muestralacurvatpicadetensindeformacinobtenidapara
los ensayos de cargarelajacin. En ella se observa el ajuste lineal por mnimos
cuadrados(enrojo)delospuntosdemximarelajacinquepermiteobteneral
valordeHA.

a) b)

c)

FiguraIV.1.a)Curvatpicadetensinvs.deformacinobtenidaparaP/H23F127Ac2enun
ensayodecompresinuniaxialdecargarelajacinconfinada.Encolorrojo,elajustelineal
pormnimoscuadradosenlospuntosdemximarelajacin,b)Curvatpicadefuerzavs.
tiempoparaunarampadecargarelajacin,c)Seleccin(enrojo)yajusteexponencial(en
azul)paraelclculodelapermeabilidadapartirdeunacurvaderelajacin.

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ANEXOSCapitulo

Paraelclculode,enunensayodeCCdecargarelajacinsepuedemedirla
fuerzadereaccinenfuncindeltiemporequeridoparaalcanzarelequilibrioen
cadacicloderelajacin.LaEcuacin(3)esunafuncinexponencialdeltiempo
dondeFeslafuerzaaplicada,Feslafuerzaamximarelajacin(t=infinito)yse
suponequeesigualacero,F0eslafuerzaamximatensin(t=0)y(tiempode
relajacin)eselparmetroacalcular.EnlaFiguraIV.1(b)semuestralagrfica
correspondientealafuerzaaplicadafrentealtiempo.

(3)

Elajusteexponencialpormnimoscuadradosenlospuntosdemximarelajacin
encadacurvaderelajacinpermiteobtener.

La Figura IV.1 (c) muestra la zona seleccionada para llevar a cabo el ajuste (en
colorrojo)ascomoelajusteexponencialpormnimoscuadrados(encolorazul)
apartirdelcualsecalcula.119

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