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Em 1985, surgiu a primeira gerao de ensaios para o diagnstico da infeco pelo HIV. Esses
ensaios empregavam antgenos virais, obtidos a partir da lise viral em cultura de clulas.
Incubao Lavagem
Incubao Lavagem
Degradao do substrato
Reao de cor: presena de
anticorpos
Legenda
Fase slida Antgeno de HIV (Ag)
(Poo de uma placa de 96 poos) (Ligados fase slida poo da placa)
IgG Anti-HIV Substrato (S)
Presente na amostra do indivduo (Cromgeno + H2O2)
Conjugado (Conj)
Ac anti-IgG Humana + Enzima
Em 1987, surgiu a segunda gerao de ensaios, que empregavam o mesmo formato indireto da
primeira gerao.
A diferena entre essas duas geraes foi a utilizao de antgenos recombinantes e peptdeos
sintticos, originados de regies especficas de protenas do vrus. A introduo de antgenos
recombinantes aumentou a sensibilidade e a especificidade dos ensaios.
No incio dos anos de 1990, o problema da variabilidade do HIV tornou-se evidente. Os ensaios
passaram a incluir antgenos para o HIV-2, com o objetivo de possibilitar o reconhecimento de
anticorpos anti-HIV-1 e anti-HIV-2. Adicionalmente, novos antgenos do HIV-1, grupos M, N e O
foram includos.
Incubao Lavagem
Incubao Lavagem
Degradao do substrato
Reao de cor: presena de
anticorpos
Legenda
Fase slida Antgeno de HIV (Ag)
(Poo de uma placa de 96 poos) (Ligados fase slida poo da placa)
IgG Anti-HIV IgM Anti-HIV
Presente na amostra do indivduo Presente na amostra do indivduo
Conjugado (Conj) Substrato (S)
Peptdeos sintticos ou protenas (Cromgeno + H2O2)
recombinantes de HIV + enzima
A modificao do formato dos testes para ELISA sanduche ou imunomtrico tornou o ensaio
mais sensvel e especfico, pois todas as classes de anticorpos anti-HIV (IgG, IgM e IgA)
passaram a ser detectadas. Os ensaios de terceira gerao reduziram o perodo de janela
imunolgica.
Descrio:
Incubao Lavagem
Incubao Lavagem
Degradao do substrato
Reao de cor: presena de
anticorpos
Legenda
Fase slida Antgeno de HIV (Ag)
(Poo de uma placa de 96 poos) (Ligados fase slida poo da placa)
IgG Anti-HIV IgM Anti-HIV
Presente na amostra do indivduo Presente na amostra do indivduo
Conjugado (Conj) Substrato (S)
Peptdeos sintticos ou protenas (Cromgeno + H2O2)
recombinantes de HIV + enzima
Descrio:
I. Na fase slida, esto fixados: anticorpos contra o antgeno p24 e antgenos (protenas) do
HIV-1 (como as protenas gp160, gp120 e gp41), antgenos do grupo O e antgenos de HIV-2 .
II. A presena de anticorpos, na amostra, detectada pela adio de uma soluo de protenas
recombinantes e de peptdeos sintticos do HIV, conjugadas com uma enzima. A presena de
antgeno, na amostra, indicada pela adio de uma imunoglobulina anti-p24 conjugada a uma
enzima.
IV. Cada conjunto diagnstico indica como calcular o ponto de corte (cut off), a partir do qual
as reaes so interpretadas como reagentes, no reagentes ou indeterminadas.
Descrio:
Anticorpos da
amostra
Ag marcado
com biotina
Conjugado: anticorpo
antibiotina + fosfatase
alcalina
Substrato
4 metilumbileferil-fosfato
Degradao do substrato
produz fosforescncia
Ligao do conjugado ao
complexo Ag-Ac-Ag
Descrio: 5 - estreptavidina
protena (obtida da bactria
Streptomyces avidinii)
I. A etapa inicial desta reao ocorre em meio lquido, por isso no que se liga fortemente
apresenta uma fase slida. molcula de biotina.
Observe, na figura a seguir, detalhes de um EQL para o diagnstico da infeco pelo HIV.
Eletroquimioluminiscncia
Biotina Rutnio Esferas magnticas
recobertas com
estreptoavidina
Descrio:
a lise do vrus da amostra para liberao dos antgenos p24, que se ligaro aos
anticorpos anti-p24, fixados na parte superior do cone. Os anticorpos anti-p24
marcados com biotina tambm se ligam aos antgenos p24 presentes na amostra;
simultaneamente, os anticorpos anti-HIV presentes na amostra ligam-se aos
antgenos da parte inferior do cone.
III. Em uma segunda etapa, adicionado apenas na parte inferior do cone um conjugado
composto de antgenos de HIV marcados com biotina. Esses antgenos ligam-se aos
anticorpos presentes na amostra.
IV. Na terceira etapa, adiciona-se outro conjugado composto de estreptavidina marcada com
uma enzima. Essa estreptavidina liga-se s biotinas presentes tanto na parte superior quanto
na parte inferior do cone.
Veja, na figura a seguir, detalhes de um ensaio imunolgico com revelao fluorescente para o
diagnstico da infeco pelo HIV.
Legenda
Antgeno biotinilado Anti p24 biotinilada
Ac IgM da amostra Anticorpos anti p24 Ac IgG da amostra
Antgeno de HIV p24
Figura 6 Representao esquemtica de um ensaio imunolgico com revelao fluorescente (ELFA). Fonte: Telelab
Descrio:
III. Na terceira etapa, adicionado o substrato (um derivado do luminol e um sal percido) e
um agente de transferncia de eltrons.
IV. A reao entre o conjugado e o substrato origina um produto luminoso, captado e medido
pelo equipamento.
!
Vm sendo desenvolvidos ensaios que utilizam a metodologia CLIA
e detectam simultaneamente antgeno p24 e anticorpos anti-HIV-1
e HIV-2.
Sistema de revelao
Anticorpo
Antgeno
Descrio:
II. A fase slida formada por micropartculas magnticas recobertas por antgenos
recombinantes de HIV-1, incluindo o grupo O e HIV-2 e anticorpos monoclonais anti-p24.
Etapa 1 Etapa 2
Mistura de micropartculas recobertas Adio do conjugado e gerao
Deteco de Anticorpos
anti-HIV-1 e Anti HIV-2
Micropartculas revestidas
com antgenos capturam Anticorpos da amostra
os anticorpos se ligam aos antgenos e Conjugado se liga aos
formam complexo ag-ac complexos ag-ac
Produo de Luz
Antgeno p24 de HIV
Deteco de
Figura 8 Representao esquemtica de ensaio imunolgico quimioluminescente magntico (CMIA). Fonte: Telelab
!
Os ensaios combinados, ou de 4. gerao, detectam a presena
da p24, na amostra do usurio. Assim, utilizam anticorpos
anti-p24 para detectar a presena desse antgeno. Por isso, nos
testes combinados, so utilizados outros antgenos do HIV-1,
como as glicoprotenas gp160, gp120 e gp41, para detectar a
presena de anticorpos, na amostra.