ANALISIS MICROBIOLGICO DE AGUA Y HIELO PARA CONSUMO

HUMANO.

OBJETIVOS

Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos coliformes fecales.

Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua mediante la bsqueda de microorganismos
coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli.
Organizar e interpretar los resultados.

GENERALIDADES

Debido a que un gran nmero de enfermedades son transmitidas por va fecal-oral utilizando como
vehculo los alimentos y el agua, es necesario contar con microorganismos que funcione como indicador
de contaminacin fecal. Estos deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal,
deben tener una sobrevivencia similar a la de los patgenos intestinales y debe de ser capaces de
desarrollarse extraintestinalmente.

El grupo coliforme es constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal, sin embargo, las
caractersticas de sobrevivencia y la capacidad para multiplicarse fuera del intestino tambin se observan
en aguas potables, por lo que el grupo coliforme se utiliza como indicador de contaminacin fecal en
agua; conforme mayor sea el nmero de coliformes en agua, mayor ser la probabilidad de estar frente
a una contaminacin reciente.

Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no slo sobreviven, sino que se multiplican, por lo que en
los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado distinto al que recibe en el agua. En productos
alimenticios que han recibido un tratamiento trmico (pasteurizacin, horneado, coccin, etc.), se utilizan
como indicadores de malas prcticas sanitarias.

Los microorganismos coliformes constituyen un grupo heterogneo con hbitat primordialmente

intestinal para la mayora de las especies que involucra.

El grupo de bacterias coliformes totales comprende todos los bacilos Gram- negativos aerobios o
anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con produccin de gas en un lapso
mximo de 48 h. a 35C 1C. E ste grupo esta conformado por 4 gneros principalmente:
Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella.

El grupo de coliformes fecales, est constituido por bacterias Gram-negativas capaces de fermentar
la lactosa con produccin de gas a las 48 h. de incubacin a
44.5 0.1C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la ms prominente es
Escherichia coli.

La demostracin y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo de

medios de cultivo lquidos y slidos con caractersticas selectivas y diferenciales.

Escherichia coli es un bacilo corto Gram negativo que se encuentra clasificado dentro de la familia
Enterobacteriaceae (bacterias entricas), existe como comensal en el intestino delgado de humanos
y animales. Sin embargo, hay algunas cepas de E. coli patgenas que provocan enfermedades
diarreicas. Estas E. coli se clasifican con base en las caractersticas que presentan sus factores de
virulencia nicos, cada grupo provoca la enfermedad por un mecanismo diferente. Las propiedades de
adherencia a las clulas epiteliales de los intestinos grueso y delgado son codificadas por genes situados
en plsmidos. De manera similar las toxinas son mediadas por plsmidos o fagos.

Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E. coli enterotoxignica
(ETEC), E. coli enteropatgena (EPEC), E. coli enterohemorrgica (EHEC), E. coli enteroinvasiva
(EIEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) E. coli enteroadherente difusa (DAEC). Existen otras cepas que
no han sido perfectamente caracterizadas; de las cepas anteriores, las 4 primeras estn implicadas en
intoxicaciones causadas por el consumo de agua y alimentos contaminados.

Escherichia coli enterotoxignica ETEC es reconocida como el agente causal de la diarrea del
viajero, la cual se caracteriza por diarreas acuosas con o sin fiebre. Este tipo de infecciones es muy
frecuente en pases subdesarrollados y afecta principalmente a los nios.

Patognesis: El microorganismo es capaz de producir dos tipos de toxina. Una toxina termolbil de
aproximadamente 89 kDa cuya secuencia, antigenicidad y funcin es similar a la toxina del clera, la
otra toxina que produce es termoestable y es de bajo peso molecular (4 kDa) y es capaz de resistir
temperaturas de ebullicin hasta por 30 minutos.

La infeccin puede ser adquirida por el consumo de alimentos como vegetales frescos (lechuga en
ensaladas) y agua. La dosis infectiva para adultos ha sido calculada en aproximadamente 108
bacterias, por otra parte en jvenes y ancianos la dosis infectiva puede ser ms baja. Escherichia coli
enteropatgena ECEP. Es causa importante de diarrea en los lactantes particularmente en los pases
en vas de desarrollo. La ECEP se adhiere a las clulas de la mucosa del intestino delgado. Sus factores
de virulencia favorecen la adhesin y en ocasiones penetra a las clulas mucosas. La infeccin por
ECEP provoca diarrea acuosa generalmente autolimitada aunque en ocasiones puede ser
crnica.

Patognesis. El microorganismo produce dos protenas: la intimina que es codificada por el gen eae y
un factor de adherencia que es codificado por un plsmido, ambas protenas permite su unin a los
enterocitos y la destruccin de las microvellosidades intestinales.

Las epidemias causadas por este microorganismo se deben al consumo de agua contaminada y
productos crnicos. En estudios con voluntarios se encontr que la dosis infectiva es de 106
microorganismos. La diarrea por ECEP se ha vinculado con mltiples serotipos especficos de E. coli
los cuales pueden ser identificados mediante la tipificacin del antgeno O (somtico) y en ocasiones
del antgeno H
(flagelar).

Escherichia coli enteroinvasiva EIEC. Este microorganismo se encuentra estrechamente relacionado

con el gnero Shigella, produce una enfermedad similar a la shigelosis. La enfermedad se
presenta comnmente en nios de pases subdesarrollados y en personas que viajan a dichos lugares.
La EIEC provoca la enfermedad (diarrea disentrica invasiva) al invadir las clulas epiteliales de la
mucosa intestinal.

A pesar de que la dosis infectiva para Shigella es de 10 a 100 microorganismos, en el caso de EIEC
la dosis infectiva es de aproximadamente 106 bacterias. Algunas caractersticas importantes de este
microorganismo que permiten diferenciarlo de la cepa tpica de E. coli son: No utiliza la lactosa como
fuente de carbono, no descarboxilan la lisina, es inmvil y anaerogenicos.

La patogenicidad de este organismo se debe a su capacidad para invadir y destruir el epitelio

del colon debido a que es capaz de evadir la lisis en los fagolisosomas.

Escherichia coli enterohemorrgica EHEC produce verotoxina, denominada as por su efecto

citotxico sobre las clulas Vero, una lnea de clulas renales de monoverde africano. Existen al menos
dos variantes antignicas de la toxina. La ECEH se ha asociado con colitis hemorrgica, una variedad
grave de diarrea; y con el sndrome urmico hemoltico, enfermedad capaz de producir insuficiencia
renal aguda, anemia hemoltica microangioptica y trombocitopenia. La verotoxina tiene muchas
propiedades similares a la toxina shiga producida por algunas cepas de Shigella dysenteriae tippo 1;
De los serotipos de E. coli que producen la verotoxina el ms comn y el nico que puede
identificarse en muestras clnicas es el O157:H7. La E. coli O157:H7 no emplea sorbitol y es negativa
a la prueba de MUG. Es la causa ms comn de esta infeccin es el consumo de carne sin cocinar o
poco cocinada, particularmente carne picada procesada en grandes cantidades. Los casos de colitis
hemorrgica y sus complicaciones asociadas pueden prevenirse mediante la coccin completa de la
carne

En la siguiente tabla se resumen algunas propiedades y sntomas causados por las cepas de
Escherichia coli antes descritas.

Propiedades y sntomas causados por algunas cepas de Escherichia coli

patgenas
ETEC EPEC EHEC EIEC
Toxina Lbil/estable - Shiga o vero -

Invasiva
- - - +
Intiminas
- + + -
Enterohemolisina - - + -

Aspecto de las Aguadas Aguadas Aguadas muy Mucoides y

heces sanguinolentas sanguinolentas sanguinolentas
Presencia de
leucocitos en - - - +
heces
Fiebre baja + - +

Intestino Colon y parte

involucrado Delgado Delgado Colon baja del
delgado
Dosis infectiva Alta Alta baja Alta
Serotipos O26, O111 y O157:H7, O26,
varios Varios
otros O111 y otros

Dependiendo del contenido de los microorganismos coliformes en la matriz agua que se

analice, se usan diferentes mtodos:
1. Determinacin de bacterias coliformes, coliformes fecales y Escherichia coli por la
tcnica del Nmero Ms Probable (NMP)
2. Recuento de bacterias coliformes totales y Escherichia coli por filtracin por
membrana

1. DETERMINACIN DE BACTERIAS COLIFORMES, COLIFORMES FECALES Y

ESCHERICHIA COLI POR LA TCNICA DE NMERO MS PROBABLE (NMP)
FUNDAMENTO

La determinacin de microorganismos coliformes totales por el mtodo del Nmero ms Probable

(NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con produccin
de cido y gas al incubarlos a 35C 1C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que
contenga sales biliares. Esta determinacin consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase
confirmativa.

En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el cual permite
la recuperacin de los microorganismos daados que se encuentres presentes en la muestra y que
sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea
como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo
de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante.

La determinacin del nmero ms probable de microorganismos coliformes fecales se realiza a

partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias
para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 0.1C por
un periodo de 24 a 48 h.

La bsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo EC, los cuales se
siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de
metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioqumicas bsicas (IMViC) a las colonias tpicas.
Principio del mtodo

El mtodo se basa en la propiedad que tienen los microorganismos denominados coliformes de

fermentar la lactosa con produccin de cido y desprendimiento de gas a una temperatura entre
35C 2 C e incubados durante un periodo comprendido entre 24h a 48h.

Consiste en un ensayo de dos fases, una presuntiva en caldo lauril sulfato triptosa y otra
confirmativa.
Materiales, equipos y reactivos

Equipos:

Estufa de cultivo regulada a 35 2C

Contador de colonias con lente amplificador de imagen
Homogeneizador de tubos Vortex
Microondas
Balanza de precisin 3000 0,1g
Autoclave
Bao Maria estufa de cultivo regulados a 44,5 C.
Incinerador de asas de inoculacin

Materiales

Frascos de vidrio tapa rosca de 250 ml

Frascos de vidrio tapa rosca de 500 ml
Pipetas graduadas de 1 ml
Pipeteador
Cajas Petri de vidrio esteriles
Tubos de cultivo de 160 x 16 mm con tapa rosca
Tubos Durham de 50 mm x 5 mm
Asas de inoculacin
Marcador indeleble
Gradillas

Medios de cultivo y reactivos

Solucin reguladora de fosfatos (Fosfato Butterfield)

Solucin madre
Composicin Cantidad
Dihidrogenofosfato de potasio 34 g
Agua destilada 1L
Preparacin:
Disolver el dihidrgeno fosfato de potasio en 500 ml de agua y ajustar el pH a 7,20 con NaOH 1N o HCl 1N. Completar a 1
litro con agua destilada y mezcla bien.
Transferir la solucin preparada a frascos de vidrio con tapa rosca. Mantener la solucin preparada y estril en refrigeracin.

Solucin diluida de trabajo

Composicin Cantidad
Solucin Madre 1,25 ml
Agua destilada 1L
Preparacin:
Tomar los 1.25 ml de solucin madre y llevar a 1 litro con agua destilada
Transferir la solucin preparada a frascos de vidrio con tapa rosca y esterilizar a 121C durante 15 minutos. Mantener la
solucin preparada y estril en refrigeracin

Caldo Lauril sulfato-triptosa

Composicin Cantidad
Triptona 20 g
 Lactosa 5g
Bile Salts N3 1,5 g
Di-Potasio fosfato 4g
Mono-potasio fosfato 1,5 g
Cloruro de sodio 5g
Agua destilada 1L
Preparacin:
Disolver los componentes en el agua destilada y ajustar el pH a 6,9 0,2, distribuir de a 10 ml en tubos de cultivo con tapa
rosca, colocar los tubos Durhan invertidos y tapar
Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos dejar enfriar y almacenar en refrigeracin
Caldo Verde brillante-bilis lactosa al 2%
Composicin Cantidad
Peptona 10 g
Lactosa 10 g
Ox-Bile (purificado) 20 g
Brillante Green 0,0133
Agua destilada 1L
Preparacin:
Disolver los componentes en el agua destilada y ajustar el pH a 7,4 0,2, distribuir de a 10 ml en tubos de cultivo con tapa
rosca, colocar los tubos Durhan invertidos y tapar
Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos dejar enfriar y almacenar en refrigeracin

Caldo E. Coli (EC)

Composicin Cantidad
Tryptosa 20 g
Lactosa 5g
Cloruro de sodio 5g
Dipotasio hidrogenofosfato 2,75 g
Potasio digihidrogenofosfato 2,75
Sodio Lauril Sulfato 0,1 g
Agua destilada 1L
Preparacin:
Disolver los componentes en el agua destilada y ajustar el pH a 6,8 0,2, distribuir de a 10 ml en tubos de cultivo con tapa
rosca, colocar los tubos Durhan invertidos y tapar
Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos dejar enfriar y almacenar en refrigeracin

Agar-violeta cristal-rojo neutro bilis lactosa

Composicin Cantidad
Extracto de levadura 3g
Peptona 7g
Cloruro de sodio 5g
Bile salts N3 1,5 g
Lactosa 10 g
Rojo neutro 0,03 g
Cristal violeta 0,002 g
Agar 12 g
Agua destilada 1L
Preparacin:
Disolver los componentes en el agua destilada y ajustar el pH a 7,4 0,2, llevar a ebullicin hasta disolver por completo, no
esterilizar, enriar hasta 50C mezclar bien verter en placas, dejar enfriar y almacenar en refrigeracin

Agua triptonada al 1 %
Composicin Cantidad
Nitrgeno total 12,7 g
Amonio nitrgeno 3,7 g
Cloruro de sodio 5g
Tryptona 1g
Agua destilada 1L
Preparacin:
 Disolver los componentes en el agua destilada y ajustar el pH a 7,3 0,2, distribuir de a 5 ml en tubos para cultivo
Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos dejar enfriar y almacenar en refrigeracin.

Reactivo de Kovacs
Composicin Cantidad
p-dimetil amino benzaldehdo 5g
HCl p.a. 25 ml
Alcohol tetraamilico 75 ml
Preparacin:
Disolver el p-Dimetil amino benzaldehdo en el alcohol tetramilico y aadir el cido clorhdrico
Conservar en frasco color mbar y almacenar en rerigeracin..

Caldo MR-VP
Composicin Cantidad
Peptona tamponada 7g
Fosfato dipotsico 5g
Dextrosa 5g
Fosfato sdico 1g
Agua destilada 1L
Preparacin:
Disolver los componentes en el agua destilada y ajustar el pH a 6,900,2, distribuir de a 5 ml en tubos para cultivo
Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos dejar enfriar y almacenar en refrigeracin.

Agar Citrato Simmons

Composicin Cantidad
Sulfato de magnesio 7g
Dihidrogenofosfato de amonio 5g
Fosfato sdico de amonio 5g
Citrato sdico tribsico 1g
Agua destilada 1L
Preparacin:
Disolver los componentes en el agua destilada y ajustar el pH a 7,000,2, llevar a ebullicin hasta disolucin completa,
Mezclar bien y distribuir en tubos de cultivo con tapa rosca, esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos
Dejar solidificar los tubos en posicin inclinada y guardar en refrigeracin.

Preparacin indicadora de rojo de metilo

Composicin Cantidad
Rojo de metilo 0,04 g
Etanol absoluto 60 ml
Agua destilada 40 ml
Preparacin:
Disolver el rojo de metilo en el etanol absoluto y aadir el agua destilada, ajustar el pH a 5,00 aproximadamente (La solucin
deber tener un color anaranjado)
Almacenar en refrigeracin.

Solucin al 5% de Alfa naftol

Composicin Cantidad
Alfa Naftol 5g
Etanol absoluto 100 ml
Preparacin:
Disolver el alfa naftol en el etanol absoluto, almacenar en refrigeracin

Solucin al 40% de KOH

Composicin Cantidad
KOH 40 g
Agua destilada 100 ml
Preparacin:
Disolver el hidrxido de potasio en el agua destilada, almacenar en refrigeracin.

Procedimiento
Preparacin de muestras y de las diluciones

Con el fin de asegurar un reparto uniforme de los microorganismos, mezclar cuidadosamentre la muestra,
invirtiendo el recipiente que la contiene varias veces.
Si el recipiente est complementamente lleno, transferir a otro recipiente estril y continuar con el
procedimiento.
1. Lavar el envase en el que est contenida la muestra.
En el caso de los hielos, dejar que retorne a su estado lquido a temperatura ambiente.
2. Tomar 25 ml de muestra y colocar en un frasco que contenga 225 ml de diluyente.
3. Se toma 1 ml de la primer dilucin (10-1=0.1) colocndolo a un tubo que tiene 9 ml del diluyente,
obtenindose de esta manera la dilucin 10-2=0.01, la misma que se homogeneiza cuidadosamente
con ayuda del vortex.
4. De la dilucin obtenida (10-2=0.01), se transfiere 1 ml a otro tubo conteniendo 9 ml del diluyente,
obtenindose as la dilucin 10-3 =0,001.

Prueba presuntiva

1. Se inocula cada uno de los tres tubos que contiene caldo lauril sulfato y tubos Durham
invertidos con 1,0 ml de la dilucin 10-1 = 0,1.
2. Se repite la misma operacin con las diluciones 10-2 y 10-3
3. Se incuban a 352C por un periodo de 24 48 h y se hace la lectura de prueba: Observar la
formacin de gas en los tubos en los tubos de fermentacin. Anotar los tubos en los que se ve
presencia de gas al cabo de 24 h, incubar los negativos 24 h adicionales.La ausencia de gas a
las 48 h significa prueba presuntiva es negativa para coliformes. Si existe formacin de gas en
los tubos, registrar el nmero de tubos positivos de cada dilucin.
Prueba confirmativa para coliformes totales

1. De cada uno de los tubos con caldo lauril sulfato que han producido gas se hace una toma, con
un asa de inoculacin, y se inocula en tubos con caldo de verde brillante bilis, lactosa y tubos de
Durham invertidos.
2. Se incuban a 35 2 C de 24 a 48 h. La formacin de gas confirma la presencia de bacterias
coliformes, se anota entonces el nmero de tubos cuya reaccin es positiva.

Prueba confirmativa para coliforme fecales

1. De cada uno de los tubos con caldo lauril sulfato que han producido gas se hace una toma con
un asa de inoculacin y se inocula en tubos con caldo de E. Coli (EC) con tubos Durham
invertidos (atemperados previamente a 44.5 C por 30 min).
2. Los tubos sembrados se incuban a 44.5 C por 24h.
3. La presencia de gas indica una prueba presuntiva para coliformes fecales, se anota entonces el
nmero de tubos cuya reaccin es positiva.

Clculo (NMP) de coliformes

Se indica el nmero ms probable adecuado al nmero de tubos positivos basndose en la tabla del
NMP.
Ejemplo: Si el resultado fuera.
3 tubos + en la dilucin 1:10
1 tubo + en la dilucin 1:100
0 tubos + en la dilucin 1:1000

La tabla da como resultado NMP=43 coliformes/ml de agua

Pruebas confirmativas para E. Coli

1. De cada tubo que contiene caldo E. coli con formacin de gas se extrae una porcin con el asa de
inoculacin y se siembra por agotamiento sobre la superficie de placas de agar selectivo (Agar-
 Violeta cristal-rojo neutro-bilis-lactosa). Es esencial que una porcin de la placa muestre colonias
bien aisladas.
2. Se incuban las placas a 35 C 2 C por un periodo de 18 a 24 h y luego se examina las
colonias sospechosas de E. coli.
3. Se pican dos colonias tpicas de cada placa para realizar las pruebas bioqumicas IMVIC.
Pruebas IMVIC

Se hacen los ensayos de indol, rojo de metilo, medio de Voges - Proskauer y citrato con las
colonias desarrolladas en el agar.

Prueba de rojo de metilo

Se inocula un tubo que contiene caldo MR - VP, se incuba durante 48 h a la temperatura de 35C 2
C y se aaden a cada tubo cinco gotas de indicador rojo de metilo.
Prueba positiva = color rojo
Prueba negativa = color amarillo

Prueba de Voges Proskauer

Se incuba un tubo que contenga 5 ml de caldo MR - VP a 35 C 2 C durante 48 2 hrs luego

aspticamente y a temperatura ambiente, se transfiere a un tubo de ensayo 1 ml del cultivo
incubado y se agregan 0,6 ml de la solucin de alfa-naftol y 0,2 ml de la solucin de KOH al 40 %,
agitando luego de la adicin de cada solucin.
Leer el resultado a partir de los 15 min hasta un periodo mximo de 2 h de haber agregado los
reactivos
Prueba positiva = color rosado
Prueba negativa = corlor pardo

Prueba de indol

Se inocula un tubo que contenga agua triptonada (Caldo triptona). Despues de 48 h de incubacin a
una temperatura de 352C. Aadir 0,2 a 0,3 ml del reactivos de Kovacs, para la investigacin del
Indol, mezclar bien y examinar
Prueba positiva = formacin de un anillo color rojo (anillo o solucin alcolica)
Prueba negativa = se mantiene el color del reactivo

Prueba Citrato

Inocular en el medio Agar Citrato Simmons, incubar a 35C 2C durante 2-5 das. La coloracin
azul del medio indica una reaccin positiva.
Prueba positiva = color azul
Prueba negativa = color verde

Interpretacin de resultados

Todos los tubos que fermentan lactosa con produccin de gas a 35 C 2 C en 48 h y son bacilos
Gram-negativos, cuyas pruebas IMVIC sean de acuerdo al cuadro, "++--" (Biotipo I) o "-+--" (Biotipo
II), son considerados E. Coli, segn la tabla
Indol Rojo de metilo Voges Proskauer Citrato Tipo
+ + - - E. coli tpico
- + - - E. coli atpico
+ + - + Tpico intermedio
- + - + Atpico intermedio
- - + + E. aerogenes tpico
+ - + + E. aerogenes atpico

Expresin de resultados:
Los resultados son expresados por el Numero Mas Probable por gramo ml (NMP/g ml)

ANEXO 1

Nmero Ms Probable (NMP) por 1 gramo usando 3 tubos de diluciones: 1:10, 1:100, 1:100

1:10 1:100 1:1000 NMP 1:10 1:100 1:1000 NMP 1:10 1:100 1:1000 NMP 1:10 1:100 1:1000 NMP
0 0 0 <3 1 0 0 3.6 2 0 0 9.1 3 0 0 23
0 0 1 3 1 0 1 7.2 2 0 1 14 3 0 1 39
0 0 2 6 1 0 2 11 2 0 2 20 3 0 2 64
0 0 3 9 1 0 3 15 2 0 3 26 3 0 3 95
0 1 0 3 1 1 0 7.3 2 1 0 15 3 1 0 43
0 1 1 6.1 1 1 1 11 2 1 1 20 3 1 1 75
0 1 2 9.2 1 1 2 15 2 1 2 27 3 1 2 120

0 1 3 12 1 1 3 19 2 1 3 34 3 1 3 160
0 2 0 6.2 1 2 0 11 2 2 0 21 3 2 0 93
0 2 1 9.3 1 2 1 15 2 2 1 28 3 2 1 150
0 2 2 12 1 2 2 20 2 2 2 35 3 2 2 210
0 2 3 16 1 2 3 24 2 2 3 42 3 2 3 290
0 3 0 9.4 1 3 0 16 2 3 0 29 3 3 0 240
0 3 1 13 1 3 1 20 2 3 1 36 3 3 1 460
0 3 2 16 1 3 2 24 2 3 2 44 3 3 2 1100
0 3 3 19 1 3 3 29 2 3 3 53 3 3 3 >1100
FUENTE: AOAC Oficial Method 966.24 Coliform Group and Escherichia coli in Tree Nut Meats
1997

Objetivo

Establecer un procedimiento para el recuento de bacterias coliformes totales y Escherichia coli mediante
filtracin por membranas

DCN Discos de cartn nutriente, son bases nutrientes en seco, estriles y almacenables durante 1
2 aos a temperatura ambiente, y pueden utilizarse en cuanto se los humecta
DCN Colichrom Para la identificacin rpida selectiva y cuantitativa de E. coli y Coliformes en
aguas, alimentos u otros materiales de anlisis en menos de 24 horas. El medio tiene aditivos
cromognicos para la diferenciacin ptica de las colonias
TERGITOL TTC NPS Discos de carton nutriente para la identificacin rpida selectiva y cuantitativa
de E. coli y coliformes en aguas, alimentos u otros materiales de anlisis en menos de 24 horas. El
medio tiene aditivos cromognicos para la identificacin ptica de las colonias.

Principio del mtodo

Mediante la filtracin a travs de una membrana se logra retener la carga microbiana existente en la
muestra y al colocar esta membrana sobre una base de agar o DCN se logra el desarrollo y la formacin de
colonias visibles.
Materiales, equipos y reactivos
Equipos:

Estufa de incubacin regulada a 37C 2C

 Equipo para filtracin por membrana
Contador de colonias (RE-051)
Materiales:
Frascos estriles
Cajas de petri
Pipetas graduadas de 10 ml y 1 ml
Marcador indeleble
Medios de cultivo y reactivos
Agua destilada esteril
DCN Colichrom o "TERGITOL TTC NPS"
Membranas filtrantes blancas reticuladas de 0,45 m, estriles

Procedimiento

1. Realizar la preparacin y homogeneizacin de las muestras

2. Preparar el equipo de filtracin
3. Conectar la manguera de la bomba de vaco a un matraz kitazato
4. Colocar el embudo para filtracin
5. Sobre este colocar el filtro metlico que soporta la membrana filtrante
6. Con una pinza estril colocar la membrana filtrante
7. Finalmente colocar el vaso graduado donde se deposita la muestra el mismo que se sostiene con una
pinza.
8. Filtrar 100 ml de la muestra a analizar, enjuagar con agua esterilizada o agua de peptona y
succionar cuidadosamente hasta que no quede resto alguno.
9. Retirar el filtro de membrana, colocarlo encima del DCN Colichrom preparado de la siguiente
manera:
Sacar de su envase las cajas petri que contienen disco de cartn nutriente (DCN). Humectar el
DCN en la caja petri con 3 a 3,5 ml de agua destilada estril, cuando la humectacin es optima,
se nota a simple vista la saturacin del lquido.
Tener cuidado de que no se formen burbujas de aire entre la membrana y el medio de cultivo

Incubacin

Realizar la incubacin de la caja petri invertidas a 37 C 2C durante 16 a 24 hr

Recuento y clculo de colonias
Las colonias pueden contarse entre las 16 y 24 horas de incubacin. Para facilitar el recuento se utilizara
un contador de colonias, siendo las colonias de las siguientes caractersticas:
Bacterias Coliformes : Colonias rojas
E. Coli: Colonias azules
Expresin de resultados
El recuento se expresara en unidades formadoras de colonias por 100 ml. (UFC/100ml.) calculado. No
tener en cuenta ms de dos cifras significativas.