CONTROL DE LAS POBLACIONES

MICROBIANAS: ESTERILIZACION Y
DESINFECCION
Dr. Pedro F. Mateos

Departamento de Microbiologa y Gentica. Facultad de Farmacia. Universidad de

Salamanca

I.- DEFINICIONES Y CONCEPTOS

Esterilizacin: eliminacin de toda forma de vida, includas las esporas.

Desinfeccin: proceso de destruir los agentes infecciosos.

Antisepsia: operaciones o tcnicas encaminadas a crear un ambiente que impida el

desarrollo de los microorganismos e incluso pueda matarlos.

Asepsia: tcnicas empleadas para impedir el acceso de microorganismos al campo de

trabajo.

Antibiosis: fenmeno biolgico en el que existe una detencin o destruccin del

crecimiento microbiano debido a sustancias producidas por otro ser vivo.

Antimicrobianos: sustancias que matan o inhiben el crecimiento de los microorganismos

(antibacterianos, antifngicos, etc.).

Microbicidas: sustancias que matan las formas vegetativas, pero no necesariamente las
esporas de un microorganismo (bactericida, fungicida, etc.).

Microbiostticos: sustancias que inhiben el crecimiento de microorganismos

(bacteriostticos, fungistticos, etc.).

Antispticos: se refiere a sustancias que se aplican sobre el cuerpo.

Desinfectantes: se refiere a sustancias empleadas sobre objetos inanimados.

Agentes teraputicos: antimicrobianos empleados en el tratamiento de infecciones.

Agentes quimioteraputicos: sustancias qumicas empleadas en el tratamiento de

enfermedades infecciosas o enfermedades causadas por la proliferacin de clulas
malignas.

Antibiticos: sustancias producidas por un ser vivo que se oponen a la vida de otro ser
vivo.

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II.- MUERTE DE LAS POBLACIONES MICROBIANAS Y CURVAS DE
SUPERVIVENCIA

Criterio de muerte de un microorganismo: prdida irreversible de la capacidad de

reproduccin en un medio adecuado. Para poder determinar la eficacia antimicrobiana
(la muerte de los microorganismos) se utilizan tcnicas que descubran a los
sobrevivientes es decir, a los capaces de reproducirse; ya que los incapaces de
reproducirse estn muertos. Esto se determina generalmente mediante mtodos
cuantitativos de siembra en placa en los que los supervivientes se detectan porque
forman colonias.

Cuando una poblacin microbiana se expone a un agente letal, la cintica de la muerte

es casi siempre exponencial ya que el nmero de supervivientes disminuye de forma
geomtrica con el tiempo. Si representamos grficamente el logaritmo del nmero de
supervivientes frente al tiempo se obtiene una lnea recta cuya pendiente negativa define
la tasa de mortalidad. Esta tasa de mortalidad nos dice slamente que fraccin de la
poblacin inicial sobrevive a un determinado perodo de tratamiento. Para determinar el
nmero real de sobrevivientes es necesario conocer adems el tamao inicial de la
poblacin. De acuerdo con esto, para establecer los procedimientos de esterilizacin hay
que tener en consideracin dos factores: la tasa de mortalidad y el tamao de la
poblacin inicial. En la prctica de la esterilizacin la poblacin microbiana que ha de
ser destruida es mixta. Como los microorganismos difieren ampliamente en su
resistencia a los agentes letales, los factores que se hacen significativos son el tamao
de la poblacin inicial y la tasa de mortalidad de los miembros ms resistentes de la
poblacin mixta. Para asegurar la fiabilidad de los mtodos de esterilizacin se utilizan
suspensiones de esporas de resistencia conocida. Los procedimientos rutinarios de
esterilizacin se disean siempre de forma que proporcionen un amplio margen de
seguridad.

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III.- CONDICIONES QUE INFLUYEN EN LA ACCION ANTIMICROBIANA

Temperatura: a mayor temperatura mayor accin.

Tipo de microorganismo: las clulas vegetativas en desarrollo son mucho ms

susceptibles que las esporas.

Estado fisiolgico de las clulas: las clulas jvenes son ms vulnerables que las viejas.

Ambiente:

El calor es ms eficaz en un medio cido que en uno alcalino.

*
 La consistencia del material, acuoso o viscoso, influye marcadamente en la
penetracin del agente.
*

Las concentraciones altas de carbohidratos aumentan, por lo general, la resistencia

trmica de los organismos.
*

La presencia de materia orgnica extraa reduce notablemente la eficacia de los

agentes qumicos antimicrobianos por inactivar stos o proteger al microorganismo.

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IV.- AGENTES ESTERILIZANTES FISICOS

1.- Altas Temperaturas

La alta temperatura combinada con un alto grado de humedad es uno de los mtodos
ms efectivos para destruir microorganismos. Hay que distinguir entre calor hmedo y
calor seco. El hmedo mata los microorganismos porque coagula sus protenas siendo
ms rpido y efectivo que el calor seco que los destruye al oxidar sus constituyentes
qumicos. La accin letal del calor es una relacin de temperatura y tiempo afectada por
muchas condiciones. Por ejemplo, las esporas de Clostridium botulinum son destruidas
en 4 a 20 minutos a 120 C en calor hmedo, mientras que se necesitan alrededor de 2
horas de exposicin al calor seco para obtener los mismos resultados.

A.- Esterilizacin por calor hmedo: (se utiliza para soluciones acuosas)

Autoclave: El calor en la forma de vapor a saturacin y a presin es el agente ms

prctico para esterilizar ya que el vapor a presin proporciona temperaturas superiores a
las que se obtienen por ebullicin. El aparato utilizado se llama autoclave (una olla que
regula la presin interna y el tiempo). Los autoclaves de laboratorio se emplean
generalmente a una presin de vapor de una atmsfera por encima de la presin
atmosfrica lo cual corresponde a una temperatura de 120 C. El tiempo de exposicin
depende del volumen del lquido, de tal manera que para volmenes pequeos (hasta
unos 3 litros) se utilizan 20 minutos a 120 C; si los volmenes son mayores debe
alargarse el tiempo de tratamiento. Algunos materiales no se deben esterilizar en el
autoclave. Sustancias que no se mezclan con el agua no pueden ser alcanzadas por el
vapor sobreviviendo los microorganismos que contengan. Otras sustancias se alteran o
son destruidas por tratamientos prolongados de calor emplendose en estos casos otros
mtodos de esterilizacin.

Tindalizacin: Se utiliza cuando las sustancias qumicas no pueden calentarse por

encima de 100 C sin que resulten daadas. Consiste en el calentamiento del material de
80 a 100 C hasta 1 hora durante 3 das con sucesivos perodos de incubacin. Las
esporas resistentes germinarn durante los perodos de incubacin y en la siguiente
exposicin al calor las clulas vegetativas son destruidas.
Pasteurizacin: La leche, nata y ciertas bebidas alcohlicas (cerveza y vino) se someten
a tratamientos de calor controlado que slo matan a ciertos tipos de microorganismos
pero no a todos. La leche pasteurizada no es estril. La temperatura seleccionada para la
pasteurizacin se basa en el tiempo trmico mortal de microorganismos patgenos (es el
tiempo ms corto necesario para matar una suspensin de bacterias a una temperatura
determinada). Mycobacterium tuberculosis es de los microorganismos patgenos ms
resistentes al calor que puede transmitirse por la leche cruda y se destruye en 15
minutos a 60 C. Posteriormente se descubri que Coxiella burnetti, agente causal de la
fiebre Q, se encuentra a veces en la leche y es ms resistente al calor que
Mycobacterium tuberculosis por lo que la pasteurizacin de la leche se realiza a 62,8 C
durante 30 minutos o a una temperatura ligeramente superior, 71,7 C durante 15
segundos (Flash-Pasteurizacin).

B.- Esterilizacin por calor seco: (se utiliza para materiales slidos estables al calor)

Horno Pasteur: El calor seco se utiliza principalmente para esterilizar material de vidrio
y otros materiales slidos estables al calor. El aparato que se emplea es el horno Pasteur.
Para el material de vidrio de laboratorio se consideran suficientes dos horas de
exposicin a 160 C.

Incineracin: La destruccin de los microorganismos por incineracin es una prctica

rutinaria en los laboratorios. Las asas de siembra se calientan a la llama de mecheros
Bunsen. La incineracin tambin se utiliza en la eliminacin de residuos hospitalarios.

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2.- Bajas Temperaturas

En general, el metabolismo de las bacterias est inhibido a temperaturas por debajo de

0 C. Sin embargo estas temperaturas no matan a los microorganismos sino que pueden
conservarlos durante largos perodos de tiempo. Esta circunstancia es aprovechada por
los microbilogos para conservar los microorganismos indefinidamente. Los cultivos de
microorganismos se conservan congelados a -70 C o incluso mejor en tanques de
nitrgeno lquido a -196 C.

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3.- Radiaciones

A.- Radiaciones ionizantes

Rayos gamma: Las radiaciones gamma tienen mucha energa y son emitidas por ciertos
istopos radiactivos como es el Co60 pero son difciles de controlar ya que este istopo
emite constantemente los rayos gamma en todas direcciones. Estos rayos gamma
pueden penetrar los materiales por lo que un producto se puede empaquetar primero y
despus esterilizar.

Rayos catdicos (Radiacin con haz de electrones): Se usan para esterilizar material
quirrgico, medicamentos y otros materiales. Una ventaja es que el material se puede
esterilizar despus de empacado (ya que stas radiaciones penetran las envolturas) y a la
temperatura ambiente.

B.- Radiaciones no ionizantes

Luz ultravioleta: La porcin ultravioleta del espectro incluye todas las radiaciones desde
15 a 390 nm. Las longitudes de onda alrededor de 265 nm son las que tienen mayor
eficacia como bactericidas (200 - 295 nm). Se usan para reducir la poblacin microbiana
en quirfanos, cuartos de llenado aspticos en la industria farmacutica y para tratar
superficies contaminadas en la industria de alimentos y leche. La luz UV tiene poca
capacidad para penetrar la materia por lo que slo los microorganismos que se
encuentran en la superficie de los objetos que se exponen directamente a la accin de la
luz UV son susceptibles de ser destrudos.

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4.- Filtracin

Algunos materiales como los lquidos biolgicos (suero de animales, soluciones de

enzimas, algunas vitaminas y antibiticos) son termolbiles. Otros agentes fsicos como
las radiaciones son perjudiciales para estos materiales e imprcticos para esterilizarlos,
por lo que se recurre a la filtracin a travs de filtros capaces de retener los
microorganismos. Los microorganismos quedan retenidos en parte por el pequeo
tamao de los poros del filtro y en parte por adsorcin a las paredes del poro durante su
paso a travs del filtro debido a la carga elctrica del filtro y de los microorganismos.
Debido al pequeo tamao de los virus, nunca es posible tener certeza de que, por los
mtodos de filtracin que dejan libre de bacterias una solucin, se van a eliminar
tambin los virus.

A.- Filtros de membrana

Los filtros de membranas son discos de steres de celulosa con poros tan pequeos que
previenen el paso de los microorganismos. Existen distintos tipos de filtro dependiendo
del tamao de poro. Estos filtros son desechables. Adems de utilizarse en la
esterilizacin de lquidos se usan en el anlisis microbiolgico de aguas ya que
concentran los microorganismos existentes en grandes volmenes de agua.

B.- Filtros HEPA

Un filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air) est compuesto por pliegues de acetato
de celulosa que retienen las partculas (includos los microorganismos) del aire que sale
de una campana de flujo laminar.

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5.- Desecacin

La desecacin de las clulas vegetativas microbianas paraliza su actividad metablica.

Este proceso fsico se utilizaba ampliamente antes del desarrollo de la refrigeracin. El
tiempo de supervivencia de los microorganismos despus de desecados depende de
muchos factores, entre ellos la especie microbiana. En general, los cocos Gram (-) son
ms susceptibles a la desecacin que los cocos Gram (+). Las endoesporas bacterianas
son muy resistentes a la desecacin pudiendo permanecer viables indefinidamente.

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V.- AGENTES ESTERILIZANTES QUIMICOS

1.- Oxido de etileno: El requerimiento esencial para un agente qumico esterilizante es

que sea voltil as como txico para los microorganismos, de manera que pueda ser
fcilmente eliminado del objeto esterilizado despus del tratamiento. Normalmente se
utiliza el xido de etileno, un lquido que hierve a 10,7 C. Se usa en la industria para la
esterilizacin de placas Petri, jeringas y otros objetos de plstico que se funden a
temperaturas superiores a los 100 C. Debido a su alto poder de penetracin estos
objetos se empaquetan primero y despus se esterilizan. El xido de etileno acta
inactivando enzimas y otras protenas que contienen grupos sulfidrilos (R-SH) mediante
una reaccin llamada alquilacin (R-S-CH2CH2O-H).

2.- Glutaraldehido: Una solucin acuosa al 2% presenta una amplia actividad

antimicrobiana. Es efectivo frente a virus, clulas vegetativas y esporas de bacterias y
hongos. Se usa en medicina para esterilizar instrumentos urolgicos y pticos.

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VI.- DESINFECTANTES Y ANTISEPTICOS

Esterilizacin: es el proceso de destruccin de todas las formas de vida microbiana.

Desinfeccin: es el proceso de destruccin de los agentes infecciosos.

Desinfectantes: son aquellas sustancias qumicas que matan las formas vegetativas y no
necesariamente las formas de resistencia de los microorganismos patgenos. Se refiere a
sustancias empleadas sobre objetos inanimados.

Antispticos: son aquellas sustancias qumicas que previenen el crecimiento o accin de

los microorganismos ya sea destruyndolos o inhibiendo su crecimiento y actividad. Se
refiere a sustancias que se aplican sobre el cuerpo.

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A.- INORGANICOS

1.- Metales: Los ms efectivos son el mercurio, plata ,cobre y zinc. Actan inactivando
las protenas celulares al combinarse con ellas. Entre los compuestos de mercurio que se
emplean como antispticos en heridas superficiales de la piel y mucosas estn el
mercurocromo (mercromina) y el mertiolato. Entre los compuestos de plata utilizados
como antispticos est el nitrato de plata (AgNO3) que en solucin al 1% se ha utilizado
para prevenir infecciones gonoccicas en los ojos de los recin nacidos aunque
actualmente se est reemplazando por antibiticos como la penicilina. Entre los
compuestos de cobre se encuentra el sulfato de cobre (CuSO4) que se utiliza como
algicida en los recipientes abiertos que contienen agua. Tambin es fungicida por lo que
se utiliza para controlar las infecciones fngicas de plantas (Mezcla Bordolesa). Los
compuestos de zinc tambin son fungicidas por lo que se utilizan para tratar el pi de
atleta.

2.- Acidos y lcalis: Actan alterando la permeabilidad y coagulando las protenas. En

general los cidos son ms eficaces que los lcalis. Dentro de estos compuestos se
encuentran el sulfrico (H2SO4), ntrico (HNO3), hidrxido sdico (NaOH) e hidrxido
potsico (KOH). Tienen aplicacin limitada debido a su naturaleza custica y corrosiva.
An as el NaOH se utiliza en la industria del vino para limpiar las cubas de madera.

3.- Compuestos inorgnicos oxidantes: actan oxidando los componentes de la

membrana y enzimas. El agua oxigenada (H2O2) al 6% (20 volmenes) se utiliza como
antisptico en pequeas heridas de la piel.

4.- Halgenos: Los halgenos especialmente el cloro y el iodo son componentes de

muchos antimicrobianos. Los halgenos son agentes fuertemente oxidantes por lo que
son altamente reactivos y destructivos para los componentes vitales de las clulas
microbianas.

Cloro: La muerte de los microorganismos por accin del cloro se debe en parte a la
combinacin directa del cloro con las protenas de las membranas celulares y los
enzimas. As mismo en presencia de agua desprende oxgeno naciente (O) que oxida la
materia orgnica:

Cl2 + H2O ----------------> HCl + HClO (cido hipocloroso)

HClO ----------------> HCl + O (oxgeno naciente)

El gas cloro licuificado se utiliza en la desinfeccin del agua de bebida y piscinas. El

hipoclorito sdico (leja) al 1% se puede utilizar como desinfectante domstico.

Iodo: El mecanismo mediante el cual el iodo ejerce su accin antimicrobiana es debido

a su accin oxidante. Adems la habilidad que tiene el iodo para combinarse con el
aminocido tirosina resulta en la inactivacin de enzimas y otras protenas. El iodo se
puede utilizar como antisptico bajo dos formas: i) tintura de iodo, es una solucin
alcohlica (tintura) de iodo (I2) ms ioduro potsico (KI) o ioduro sdico (NaI). ii)
iodforos, son mezclas de iodo (I2) con compuestos que actan como agentes
transportadores y solubilizadores del iodo. Por ejemplo, la povidona iodada (Betadine)
es un complejo de iodo y polivinil pirrolidona (PVP). Los iodforos tienen la ventaja de
que no tien la piel. Las preparaciones de iodo se utilizan principalmente para
desinfectar la piel as como en la desinfeccin de pequeas cantidades de agua. Los
vapores de iodo se utilizan a veces para desinfectar el aire.

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B.- ORGANICOS

1.- Alcoholes: El alcohol metlico (1C) es menos bactericida que el etlico (2C) y
adems es altamente txico. Hay un aumento en el poder bactericida a medida que
aumenta la longitud de la cadena carbonada; pero como los alcoholes con peso
molecular superior al del proplico (3C) no se mezclan en todas las proporciones con el
agua, no se suelen utilizar como desinfectantes. Los alcoholes actan desnaturalizando
las protenas, disolviendo las capas lipdicas y como agentes deshidratantes. El etanol al
96% se usa como antisptico de la piel y como desinfectante en los termmetros
clnicos orales y algunos instrumentos quirrgicos.

2.- Fenol y compuestos fenlicos: Una solucin acuosa al 5% de fenol mata

rpidamente a las clulas vegetativas de los microorganismos. Sin embargo, las esporas
son mucho ms resistentes al fenol. Debido a que el fenol es txico y tiene un olor
desagradable ya casi no se usa como desinfectante o antisptico, siendo reemplazado
por compuestos fenlicos que son sustancias derivadas del fenol menos txicas y ms
activas frente a los microorganismos. Lysol es una mezcla de compuestos fenlicos que
se utiliza para desinfectar objetos inanimados como los suelos, paredes y superficies. El
fenol y compuestos fenlicos actan alterando la permeabilidad de la membrana
citoplsmica as como desnaturalizando protenas.

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VII.- EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS

DESINFECTANTES Y ANTISEPTICOS

1.- Tcnica de dilucin en tubo: Primero se realizan diferentes diluciones del agente
qumico. El mismo volumen de cada dilucin se dispensa en tubos estriles. A cada tubo
se le aade la misma cantidad de una suspensin del microorganismo utilizado como
prueba. A determinados intervalos de tiempo se transfiere una alcuota de cada tubo a
otro tubo que contenga medio de cultivo. Estos tubos inoculados se incuban a la
temperatura ptima de crecimiento del microorganismo utilizado como prueba durante
24 a 48 horas. Al cabo de este tiempo se examina el crecimiento del microorganismo
mediante la aparicin de turbidez en el tubo (crecimiento +) o ausencia de turbidez
(crecimiento -). Aquellos tubos que presenten crecimiento negativo indican la dilucin a
la cual ese agente qumico mata al microorganismo utilizado como prueba cuando este
microorganismo es expuesto al agente qumico durante ese perodo de tiempo.

2.- Tcnica de la placa de agar: Se inocula una placa que contenga medio de cultivo
slido con el microorganismo utilizado como prueba. El agente qumico se coloca en el
centro de la placa, bien dentro de un cilindro o impregnado en un disco de papel. Al
cabo de 24 a 48 horas se observan zonas de inhibicin (crecimiento -) alrededor del
agente qumico. Una modificacin de esta tcnica es la incorporacin del agente
qumico en el medio de cultivo antes de verterlo sobre la placa. Una vez solidificado se
inocula con el microorganismo utilizado como prueba, se incuba y se examina el
crecimiento microbiano.

3.- Tcnica del coeficiente fenlico: Es una tcnica estandarizada que se utiliza para
comparar el poder desinfectante de un agente qumico frente al del fenol. Es una
modificacin de la tcnica de dilucin en tubo tal como se describe a continuacin: (i)
Se prepara una serie de tubos conteniendo cada uno 5 ml de diferentes diluciones del
desinfectante. (ii) A la vez se prepara una segunda serie de tubos que contengan
diferentes diluciones de fenol. (iii) Cada tubo de las dos series se inocula con 0,5 ml de
un cultivo de 24 horas del microorganismo utilizado como prueba (cepas especficas de
Salmonella typhi o Staphylococcus aureus). (iv) A los 5, 10 y 15 minutos se recoge una
alcuota de cada tubo que se inocula en otro tubo que contenga medio de cultivo estril.
(v) Estos tubos inoculados se incuban durante 24 a 48 horas y se observa el crecimiento
del microorganismo (aparicin de turbidez). (vi) La mayor dilucin del desinfectante
que mate a los microorganismos en 10 minutos pero no los mate en 5 minutos se divide
por la dilucin mayor de fenol que d los mismos resultados. El nmero obtenido es el
coeficiente fenlico de ese desinfectante.