UNIVERSIDAD NACIONAL DE LUJN

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BSICAS

INGENIERA EN ALIMENTOS

Gua prctica de

MICROBIOLOGA GENERAL

Edicin 2017
 2

CRONOGRAMA DE MICROBIOLOGA GENERAL 2017

Fecha Tema Docente

responsable

Los lunes de 15:00 a 20:00 horas y los mircoles de 15:00 a 18:00

horas.

Dos Seminarios:
a) Parsitos de origen alimentario en forma grupal y oral el 23
de noviembre de 15:00 a 18:00 horas.
b) Bsqueda en Internet, de trabajos cientficos afines con la
asignatura en forma individual para presentarlo por escrito.
 3

PROFESOR RESPONSABLE:

Profesora Titular: Dra. Hebe A. Barrios

EQUIPO DOCENTE:

Profesor Titular: Dr. Enrique Fliess

Profesor Asociado: Dr. Ricardo J. Anselmo
J.T.P.: Md. Vet. Silvia S. Viora
J.T.P.: Ing. Agr. Federico Vita
J.T.P.: Ing. Agr. Pablo Ojeda
J.T.P.: Dra. Mara Eugenia Tonelotto
Ayudante de Prim.: Ing. Agr. Carolina Silln
Ayudante de Seg.: Srta. Marianella Wild

GUA PRCTICA 2017

Las prcticas de laboratorio comprenden una serie de

experiencias que los alumnos realizarn con el asesoramiento del
personal docente.

El propsito del trabajo experimental es desarrollar los

conceptos aprendidos en la introduccin terica del tema y en la
lectura de libros y revistas especializadas.

Muchos de los resultados que obtiene el alumno en el

experimento eran esperados antes de empezar, pero lograr conocer
las manipulaciones necesarias para obtener estos resultados.

Habr ocasiones en que no se lograrn los resultados deseados

porque al trabajar con seres vivos el estudiante est tratando con
entidades variables, las mutaciones son causa de que los organismos
ya no se comporten como se haba anticipado.

Debemos recordar que los microorganismos empleados estn

vivos, por lo tanto hay ciertas reglas que se deben observar
estrictamente. La mayora de los microorganismos son inofensivos,
no obstante algunos son patgenos, por esa razn usted aprender
tcnicas aplicables al manejo de microorganismos para asegurar su
seguridad personal en el laboratorio.

Generalmente nos produce ms satisfaccin observar nuestros

resultados que los obtenidos por otros.

TRABAJOS PRCTICOS:

Prctica l: Preparacin y esterilizacin de materiales y medios de

cultivo
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Prctica 2: Controles de esterilizacin y de esterilidad

Prctica 3: Tcnica asptica y tcnicas de cultivo en placa

Prctica 4: Micologa

Prctica 5: Recuento de microorganismos viables

Prctica 6: Virus: Bacterifagos

Prctica 7: Control microbiolgico de superficies

Prctica 8: Deteccin de antimicrobianos en alimentos por mtodos

microbiolgicos
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NORMAS BSICAS DE SEGURIDAD PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO DE

MICROBIOLOGA

1. Todos los alumnos deben usar guardapolvos durante la parte

prctica para proteger su ropa de posibles contaminaciones.
2. En el laboratorio est prohibido comer, beber, fumar y tomar
mate.
3. Disponga en su mesa de trabajo de un recipiente para colocar
el material contaminado o sucio. Los cultivos de descarte o las
pipetas deben colocarse en dicho recipiente para luego ser
esterilizados. No lave el material utilizado en los trabajos
prcticos, previamente deben ser esterilizados.
4. Las superficies de trabajo deben limpiarse y descontaminarse
con desinfectantes antes y al final del trabajo.
5. Trabajar en la zona estril generada por mecheros de gas o
cmara de flujo laminar.
6. Asegrese que todas las canillas y llaves de gas, as como
todos los aparatos elctricos en su mesada estn apagados antes
de abandonar el laboratorio.
7. Lvese las manos despus de cada trabajo.
8. El cultivo con que trabaja puede ser patgeno, manjelo como
si lo fuera.
9. Al recibir el cultivo no lo destape, debe seguir ciertos
procedimientos para proceder a destaparlo.
10. Cualquier accidente personal o con los cultivos comunqueselo
al personal de la asignatura.
11. Antes de guardar el microscopio asegrese que las lentes estn
limpias de aceite de inmersin.
12. Realice las tcnicas microbiolgicas con movimientos pausados,
poco amplios y sin brusquedad. Evite hablar. Tenga siempre el
mechero encendido en lugar prximo.
13. Lleve siempre el asa de cultivo al rojo sobre la llama del
mechero, antes y despus de cada operacin que realice con ella.
14. No deposite los tapones de algodn o de plstico sobre la
mesada, evite contaminaciones con los cultivos de trabajo.
15. Los tubos de cultivo sembrados o no, siempre deben colocarse
sobre las gradillas, nunca sobre la mesada.
16. Anote en los tubos o cajas, en los cuales ha realizado la
experiencia, una identificacin de su comisin y el nmero de
diluciones si se requiere.
17. Se deber elaborar un informe de resultados por comisin para
cada trabajo prctico.
 6

18. Requiera la presencia de un docente para que lo asesore

correctamente toda vez que tenga dudas sobre la realizacin de
una tcnica.

REAS DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

Es conveniente que existan reas separadas para las siguientes

actividades:
Recepcin y almacenamiento de muestras: suelos, aguas, etc.
Preparacin de las muestras para su anlisis
reas analticas diferenciadas: esterilizacin, cultivo
(estufas), microscopa, cultivo de plantas, etc.
reas de apoyo (preparacin de medios de cultivo y reactivos,
esterilizacin y descontaminacin, almacenamiento, lavado de
material, etc.)

EQUIPOS
Refrigerador (2 a 4C y congelador)
Cabina de flujo laminar, para asegurar la esterilidad en la zona
de trabajo
Autoclave, para esterilizar el material y los medios de cultivo
Estufas de incubacin para microorganismos psicrfilos, mesfilos
y termfilos
Homogeneizador de muestras elctrico, con agitadores magnticos,
se usan en la preparacin de medios de cultivo, soluciones, etc.
Bao Mara, para descongelar reactivos, mantener fundido el agar,
realizar incubaciones
Balanzas de diferente precisin (0,1-0,001g), analtica y
digitales
PH-metros, tiles en la preparacin de medios de cultivo
Microscopios para observar la morfologa bacteriana. ptico con
aumentos de 1000x
Cuenta colonias para recuento de colonias

PAUTAS PARA EL DESARROLLO DE LOS TRABAJOS PRCTICOS

Aspiran a interiorizar al alumno en las formas en que deber

desempearse en un laboratorio de Microbiologa y sentar las bases
sobre las cuales se sustentarn las prcticas de la asignatura
Microbiologa de Alimentos. Estos prcticos tendrn muchas
actividades de tipo mostrativo y otras estrictamente prcticas de
laboratorio.

Todo el material que utilice durante los trabajos prcticos y

requiera incubacin tiene que estar marcado con el tratamiento y
nmero de Comisin. Esta es la forma de identificarlos para poder
observar los resultados en la clase prctica siguiente. Utilice
marcadores con tinta resistente al agua.
 7

Preste atencin al leer la Gua de Trabajos Prcticos, muchas

secciones tienen nicamente fines informativos. Slo se realizarn
durante los Trabajos Prcticos aquellas actividades con el ttulo
Metodologa de Trabajo.

Finalizado cada T.P. se realizar una puesta en comn con el

objetivo de sacar conclusiones generales.

Gua para la confeccin de informe

TURNO TP: GRUPO N:

INTEGRANTES:

INFORME TRABAJO PRCTICO N

TTULO:

OBJETIVOS:

RESULTADOS OBTENIDOS: (se pueden utilizar tablas y/o grficos que

expresen los resultados en forma concreta, sin detalles de los
mtodos utilizados que figuran en la gua de TP).

CONCLUSIONES: (comente brevemente las conclusiones obtenidas a

partir del anlisis de los resultados)

TRABAJO PRCTICO 1

PREPARACIN Y ESTERILIZACIN DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO

ESTERILIZACIN POR CALOR SECO

Objetivos:
1. Limpieza y acondicionamiento del material de vidrio previo a
su esterilizacin.
2. Esterilizacin por calor seco.

Como regla general:

Limpieza y acondicionamiento del material de vidrio:

1. Lavado del material:

El material de vidrio a esterilizar, deber estar previamente
lavado con detergente, enjuagado varias veces con agua corriente y
finalmente con agua destilada.
Es conveniente que el material est seco o al menos bien escurrido
antes de acondicionarlo para su esterilizacin.

2. Acondicionamiento del material de vidrio:

2.1. Pipetas:
Obturar con algodn cardado la boquilla de las pipetas de 1 ml y
mayores. Luego quemar con la llama de un mechero, las hebras de
algodn que sobresalen de la boquilla de la pipeta.
Envolver individualmente mediante el empleo de papel o introducir
la cantidad deseada por su extremo afilado en pipeteros de metal.

2.2. Cajas de Petri:

Envolver las placas de Petri cerradas con papel o introducirlas en
portaplacas de metal.

2.3. Tubos de ensayo:

Colocar a cada tubo de ensayo, un tapn de algodn efectuado segn
indicaciones que se den en clase prctica.
Introducir los tubos en soportes (canastos de metal o latas) y
luego colocar un capuchn de papel sujeto con hilo.

2.4. Erlenmeyers, frascos, etc.:

Colocar a cada recipiente vaco un tapn de algodn y luego un
capuchn de papel sujeto con hilo.

Esterilizacin:
Introducir el material de vidrio preparado segn 1 y 2 en estufa
de esterilizacin. Someter a 170C durante 90 minutos. El que est
en contenedores metlicos: 170C no menos de 2 horas.
 9

Luego de este perodo, interrumpir el sistema y dejar enfriar.

El algodn o papel de embalaje, deber presentar, a lo sumo un
color pardo, pero sin llegar a estar carbonizado.
En el caso de carecer de estufa de esterilizacin, preparar el
material de vidrio en forma similar y emplear el autoclave durante
30 minutos a 121C para esterilizar. Una vez concluida la
esterilizacin, el material deber secarse en estufa a 55C antes
de guardarlo hasta el momento que se necesite.
Segn la cantidad y tamao del material puede extenderse el tiempo
del proceso de esterilizacin.

Almacenamiento del material de vidrio estril:

Conservar en armarios y cajones, resguardndolo de posibles
recontaminaciones.

Metodologa de Trabajo
Cada alumno acondicionar y esterilizar mediante mtodos
alternativos el material de vidrio siguiendo las indicaciones que
se den en clase.

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO Y ESTERILIZACIN POR CALOR HMEDO

(VAPOR A PRESIN)

Objetivos:
1. Preparacin de medios de cultivo lquido y slidos no
termolbiles.
2. Manejo de autoclaves, esterilizacin y almacenamiento de medios
de cultivo.

Como regla general:

1. Medios que no contienen agar-agar (caldos):

Suspenderlos en agua destilada y disolver completamente mediante
agitacin con varilla de vidrio y rotacin del recipiente que los
contiene.
Verificar el pH del medio mediante el empleo de pHmetro o con papel
indicador de pH. En el caso de no coincidir con el especificado,
ajustarlo con ClH 0,1 N o NaOH 0,1 N.
Mientras no se especifique otra cosa, esterilizar en autoclave a
121C durante 15-20 minutos.

2. Medios que contienen agar-agar:

Suspenderlos en agua destilada y disolver completamente mediante
calentamiento en bao mara o en marmita de vapor (por ejemplo,
autoclave sin sobrepresin).
Puede reconocerse que se ha alcanzado la disolucin completa
cuando, al agitar, no se adhiere a la pared interna del recipiente
 10

partcula alguna de agar y la solucin, viscosa, resbala

libremente.
Templar hasta 50 60C y verificar el pH mediante el empleo de
papel indicador. En el caso de no coincidir con el especificado,
ajustarlo con ClH 0,1 N o con NaOH 0,1 N.
De inmediato, distribuirlo en la forma ms conveniente.
Rango de temperatura de gelificacin del agar-agar: 40-45C.
Mientras no se especifique otra cosa, esterilizar a 121C durante
15-20 minutos.

Esterilizacin:
1. Asegurarse que el nivel de agua alcance la placa metlica
perforada.
2. Verificar el buen funcionamiento de la vlvula de seguridad.
3. Controlar que la espita se encuentre en posicin abierta.
4. Cubrir los recipientes que contienen los medios a esterilizar,
con un capuchn de papel sujeto con hilo.
5. Disponer el material a esterilizar sobre la placa metlica
(conviene que no se encuentren demasiado juntos con el fin de
que se pueda permitir el libre paso de vapor de agua).
6. Cerrar el autoclave, ajustando las manivelas en forma cruzada y
teniendo cuidado de verificar que la tapa quede perfectamente
acoplada sobre la junta de goma.
7. Encender la fuente de calor, manteniendo abierta la vlvula de
purga (o espita) a fin de expulsar el aire del interior de la
cmara de esterilizacin.
8. Purgado el aparato, que se manifiesta por la salida de un chorro
de vapor de agua continuo durante algunos minutos, cerrar la
vlvula de purga.
9. El manmetro indica el aumento de la presin en el interior del
aparato.
10. Una vez alcanzada la temperatura de esterilizacin
generalmente 121C (medida indirectamente por la presin 15
libras/pulgada2 = 121C), regular la fuente de calefaccin y
comenzar a contar el tiempo de esterilizacin.
11. Autoclavar 15-20 minutos.
12. Transcurrido ese tiempo, interrumpir la fuente de calor y
dejar disminuir espontneamente la presin.
13. Cuando la presin ha llegado a cero, abrir la espita a fin de
eliminar cualquier exceso de presin residual.
14. Abrir el autoclave. Esperar unos minutos antes de retirar el
material.

Cuando el autoclave no est en uso, la tapa debe permanecer apoyada

sobre el cuerpo del autoclave.

Limpiar peridicamente la cmara y el depsito de agua a fin de

eliminar posibles incrustaciones.

Acondicionamiento de medios de cultivo estriles:

 11

Una vez culminado el proceso de autoclavado, se deben guardar los

recipientes que contienen los medios de cultivo en un armario al
abrigo de posibles contaminaciones.
A fin de evitar la excesiva deshidratacin de los medios de
cultivo, sobre todo, cuando no han de usarse por largo tiempo, es
conveniente guardarlos en el refrigerador (4C) pero previamente
debern dejarse en armario a temperatura ambiente 1 a 2 das para
lograr el secado completo de los tapones de algodn y papel de
envoltura, a fin de evitar recontaminaciones.

Almacenamiento de medios de cultivo deshidratados:

Dentro de lo posible, los medios de cultivo deshidratados debern
conservarse en lugar seco, protegidos contra la luz, a una
temperatura de +15C hasta +30C y en envases siempre bien
cerrados.
Inmediatamente despus de retirar de los envases la cantidad de
medio de cultivo que se necesite, debern cerrarse de nuevo los
envases firmemente.

Metodologa de Trabajo
Cada alumno preparar un medio de cultivo siguiendo las
indicaciones que se den en clase.
 12

TRABAJO PRCTICO 2

CONTROLES DE ESTERILIZACIN Y DE ESTERILIDAD

1. Control de la temperatura de esterilizacin en el autoclave:

Se coloca un tubito con cido benzoico en polvo (p.f. 121C) junto

al material a esterilizar. Si se alcanza la temperatura de fusin
durante el proceso de esterilizacin, luego del enfriamiento
quedar una masa homognea de cido benzoico.
Tambin se usan mezclas indicadoras adheridas sobre cartn u otro
material, tal como la compuesta por carbonato de plomo + azufre
precipitado + carbonato de litio (10 + 1+ 3). Esta mezcla vira al
gris despus de 30 minutos a 100C, en 3 4 minutos a 110C y en
30 segundos a 121C. Toma color negro si est expuesta ms de 30
minutos a 110C y en 5 minutos a 121C.

2. Control de la eficacia de la esterilizacin en autoclave y

estufa de esterilizacin (Control Biolgico):

2.1. Introducir aspticamente endosporos bacterianos (cultivo seco

o suelo tamizado) en tres tubos de ensayo estriles mediante la
ayuda de una esptula estril.

2.2. Control de Esterilizacin:

2.2.1. Someter al primer tubo a 170C durante 120 minutos en la

estufa de esterilizacin.
2.2.2. Someter al segundo tubo a 121C durante 1520 minutos en
el autoclave.

2.3. Control de Viabilidad de los Endosporos bacterianos:

No someter a ningn tratamiento trmico el tercer tubo.

2.4. Control de Esterilidad:

Reservar un cuarto tubo de ensayo (que no contenga endosporos

bacterianos) que haya sido esterilizado simultneamente con los
tres tubos de ensayo empleados anteriormente.

5. Introducir aspticamente + 5 ml de caldo nutritivo a cada tubo

de ensayo.

6. Incubar a 30C durante 48 horas.

7. Observar el crecimiento microbiano, que se muestra por un

desarrollo de turbidez en el caldo.

8. Completar el cuadro siguiente y sacar conclusiones:

 13

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

Control de Control de Control de Control de

............ ............ .............. ..............

Crecimiento Crecimiento Crecimiento Crecimiento

microbiano: microbiano: microbiano: microbiano:
+/ +/ +/ +/

Significado: Significado: Significado: Significado:

3. Control biolgico utilizando ampollas de Geobacillus

stearothermophilus STEAROTROL:

STEAROTROL (Britania) contiene una suspensin de esporas de

Bacillus stearothermophilus en un medio de cultivo apropiado. La
concentracin de esporas ha sido estandarizada para obtener una
sobrevida de 5-7 minutos a 121C, siendo destruida si se autoclava
a la misma temperatura por 15-20 minutos.
Si la exposicin en el autoclave es a menor temperatura o por un
perodo ms corto, en una posterior incubacin, las esporas
desarrollarn, indicando una esterilizacin insuficiente.
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Como el medio posee un indicador prpura de bromocresol, vira al

amarillo indicando la produccin de cido a partir de la glucosa,
facilitando la deteccin de desarrollo en esterilizaciones
deficientes.

PROCEDIMIENTO
Colocar las ampollas STEAROTROL sin abrir junto con el material a
esterilizar, en lugares diferentes, para probar distintas zonas de
calor, especialmente aquellas de difcil acceso al flujo de vapor
dentro del autoclave, y cuidando que no se rompan para que no
contamine el material ni lo ensucien.
Proceder a esterilizar por 15-20 minutos a 121C.
Una vez finalizado el proceso, retirar las ampollas e incubarlas en
estufa o bao termosttico entre 56C y 65C durante 48 h. Luego de
24 / 48 h de cultivo observar las ampollas sin abrir, la aparicin
de turbidez y color amarillo indican que la esterilizacin ha
fallado. Si no se observa desarrollo ni cambio de color al cabo de
48 h mantener el cultivo hasta 7 das, examinando peridicamente.
La ampolla control debe haber desarrollado ya a las 24 h y ser
francamente positiva a las 48 h.
Las ampollas que mantienen su color prpura indican que la
esterilizacin ha sido bien realizada. Si las ampollas han sido
sobrecalentadas presentan un color rojo a marrn.

PRECAUCIONES
Las ampollas son para uso profesional solamente. Dado que contienen
cultivos vivos, deben ser manejadas con cuidado para evitar
roturas. Conservar en heladera entre 2 y 8C en un espacio que no
contenga materiales biolgicos ni alimentos. Cada ampolla solo
puede ser usada una vez y luego destruida por calcinacin.

USOS
Las esporas han sido utilizadas para el control de procesos de
esterilizacin por calor hmedo durante mucho tiempo y
especialmente en procesos de productos enlatados y farmacuticos.

4. Control de esterilidad del material de vidrio y de medios de

cultivo:
Se efecta sobre el material y medios de cultivo para verificar si
se hallan estriles.

4.1. Material de vidrio y plstico:

- Una pipeta presuntivamente estril se llena repetidamente en
forma aspetica con un medio de cultivo lquido, rico, estril, y
luego ese medio se coloca en un tubo de ensayo estril y se incuba.

- A un Erlenmeyer, tubo o frasco se le agrega aspticamente caldo

tripticasa soja y se incuba luego de homogeneizar.

- A una placa de Petri se le agrega aspticamente agar tripticasa

soja y se incuba.
 15

4.2. Medios de cultivo contenidos en tubos o frascos se incuban

directamente 2 das a 37C y posteriormente 2 das a 30C para
detectar cualquier contaminacin residual.
Si el medio de cultivo ha de utilizarse para el cultivo de
psicrfilos o termfilos, la preincubacin tendr lugar a la
temperatura apropiada o de lo contrario se introducir un control
(sin sembrar al realizar el ensayo).
 16

TRABAJO PRCTICO 3

PARTE I: TECNICA ASPTICA

La mayora de los ejercicios y experimentos que Ud. realizar

durante este cuatrimestre utiliza medios de cultivo estriles y
cultivos puros (progenie de un organismo aislado). Una serie de
operaciones tienen que ser desarrolladas para limitar el riesgo de
contaminar esos materiales durante las manipulaciones. Esas
operaciones son conocidas como tcnicas aspticas. Tambin ayudan a
proteger a los investigadores de infectarse a s mismos o evitar la
diseminacin de organismos en el medio ambiente. Aprenda las reglas
y procedimientos siguientes y comprenda cmo cada requisito
contribuye a mantener la asepsia.

OBJETIVOS: Los alumnos deben ser capaces de

1. Describir los principios de los procedimientos aspticos

2. Transferir soluciones estriles y verter agar en placas sin
contaminarlos
3. Rotular correctamente las placas de agar y tubos

Reglas generales

1. Trabajar en una mesada limpia. Guardar todos los materiales

innecesarios.
2. Vestir un guardapolvo; lavarse las manos antes de realizar
cualquier manipulacin y despus de haber terminado.
3. Desinfectar la mesada con un desinfectante apropiado antes de
comenzar a trabajar y al terminar el trabajo diario.
4. Conservar todos los cultivos cerrados y los tubos en posicin
vertical en una gradilla preparados para su utilizacin.
5. Trabajar rpidamente sin perturbaciones.

Tcnica asptica para la preparacin de placas de agar

1. Fundir el agar estril y colocar el recipiente en un bao de

agua a 45-50 C. Asegurarse que haya agua suficiente para cubrir
el agar. Si es necesario, usar una argolla de metal para
prevenir que en envase de agar oscile.
2. Colocar las placas de Petri estriles en la mesada desinfectada.
3. Retirar la tapa del recipiente conteniendo el agar y pasar la
boca por la flama para destruir organismos contaminantes.
Mantener el recipiente en un ngulo y no en posicin vertical.
4. Verter el agar en las cajas de Petri. Rotar la placa suavemente
para distribuir el agar y permitir que el agar cubra todo el
fondo de la placa.
5. Si queda agar remanente en el envase, pasar la boca por la flama
y cerrar el recipiente. Retornarlo inmediatamente al bao de
agua.
 17

6. Dejar solidificar las placas. Rotular las bases de las placas

con el tipo de medio de cultivo que contienen y la fecha en que
fueron realizadas.
7. Si las placas se van a conservar por ms de 48 horas,
envolverlas en una bolsa plstica.

Tcnica asptica para transferencia de organismos

1. Repicar a partir de cultivos en caldo o en medio de cultivo

slido

a. Los microorganismos pueden repicarse de caldo con un ansa de

rulo o una pipeta; de medios de cultivo slidos con un ansa de
rulo o ansa recta.
b. Las ansas de rulo y rectas pueden realizarse con alambre
nicrom y esterilizarse por flameado directo hasta el rojo
incipiente. El mango ntegro de metal debe esterilizarse. Esto se
hace flameando desde el extremo a la punta (evitando aerosoles
lquidos en el ansa). El flameado incinera todos los organismos
que estn presentes. Una vez estril, el ansa se inserta en un
tubo de caldo y el lquido se extrae.
c. Con el ansa recta se toca una porcin del cultivo en medio
slido.
d. Disponer de pipetas que se compran ya estriles o esterilizar en
pipeteros antes de su utilizacin. Recuerde tener el pipetero a
su lado. NO LO PONGA DE PIE. (Por qu?). Cuando saca una pipeta
del pipetero, solo toque la boquilla y solamente una pipeta.
Cerrar el pipetero cuando Ud. ha extrado la pipeta. Nunca
retornar pipetas al pipetero. Si inadvertidamente el extremo toca
otra superficie, no usar la pipeta. Tomar una nueva. Tambin
pueden usarse micropipetas con tips estriles.

2. Transferir caldos de cultivo en erlenmeyers o tubos

a. Despus de sacar la tapa, flamear la boca del erlenmeyer o tubo.

b. Sosteniendo el recipiente en un ngulo, introducir el ansa de
rulo o ansa recta dentro del lquido y agitar suavemente. Si
utiliza una pipeta, puede tomarse un volumen determinado.
c. Flamear la boca del Erlenmeyer o tubo antes de volver a tapar.
Flamear el ansa de rulo o ansa recta despus de utilizar para
incinerar cualquier organismo remanente. Disponer todas las
pipetas contaminadas o tips en los recipientes apropiados.

3. Transferir a agar inclinado o pico de flauta

a. Despus de sacar la tapa, flamear la boca del tubo.

b. Sosteniendo el tubo en un ngulo, deslizar el ansa de rulo o
ansa recta desde el fondo del pico de flauta hasta el extremo
superior del agar.
c. Flamear la boca del tubo antes de volver a tapar.
 18

d. Flamear el ansa de rulo o ansa recta despus de utilizar para

incinerar cualquier organismo remanente.

4. Transferir a placas de agar

Se describen varios mtodos en la seccin de TCNICAS DE CULTIVO EN

PLACA.

Practica tcnica asptica:

MATERIALES
Cajas de Petri estriles
Agar tripticasa soja (TSA) o similar templado a 50C
Ansa de cultivo
Pipetas de 1 ml estriles
Pipeteros
Agua estril
Caldo tripticasa soja (TSB) o similar
Debido a que ni los implementos de inoculacin ni los recipientes
se pueden soltar durante las manipulaciones, la parte ms difcil
de estos procedimientos a menudo es una persona manipulando todo
simultneamente. Su instructor demostrar que esto puede hacerse y
usted practicar esta tcnica realizando los traslados siguientes:

Agar tripticasa soja (TSA)

Digerido pancretico de casena 15,0 g
Digerido papanico de harina de soja 5,0 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Agar 15,0 g
Agua destilada 1 l

Caldo tripticasa soja (TSB)

Digerido pancretico de casena 17,0 g
Digerido papanico de harina de soja 3,0 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Fosfato dibsico de potasio 2,5 g
Glucosa 2,5 g
Agua destilada 1 l

Metodologa de Trabajo

a) Verter una placa de Petri.

b) Transferir un ansa de agua estril a dos tubos de caldo
tripticasa soja (TSB).
c) Transferir 0.1 ml de agua estril a dos tubos de TSB estril
utilizando pipetas estriles.
d) Incubar a temperatura ambiente durante 48 horas.
 19

e) Examinar el crecimiento. Si hay algn crecimiento en el caldo o

sobre la placa, Ud. no ha realizado correctamente la tcnica de
transferencia asptica.

Preguntas sobre tcnica asptica

1) Por qu es importante lavarse las manos antes y despus de

manipular los cultivos?

2) El agar se templa a aproximadamente 50C antes del vertido. Por

qu?

3) Con qu propsito se flamea la boca del tubo de ensayo?

4) Qu precauciones deben tomarse al manipular un cultivo de una

bacteria patgena?
 20

PARTE II: TCNICAS DE CULTIVO EN PLACA

OBJECTIVOS: Los alumnos deben ser capaces de

1. definir cultivo puro y unidad formadora de colonia

2. comparar las ventajas e inconvenientes de los procedimientos de
siembra en todo el medio, por extensin en superficie y
aislamiento por agotamiento
3. aislar un microorganismo en cultivo puro utilizando los
procedimientos de siembra en todo el medio, por extensin en
superficie y aislamiento por agotamiento
4. determinar qu tcnica es apropiada en varias situaciones

Hasta 1883, las bacterias se hacan crecer en el laboratorio solo

en medios de cultivo lquidos o sobre la superficie de frutas y
vegetales. Uno de los ms importantes descubrimientos en
microbiologa fue el desarrollado por Robert Koch consistente en un
medio nutritivo slido para obtener cultivos puros. Los
microorganismos podran ser estriados sobre la superficie slida y
separados unos de otros. Cuando esos organismos individuales se
reproducan, formaban las colonias. Como cada unidad formadora de
colonia (UFC) representa la progenie de una bacteria aislada; se
trata de un cultivo puro. El primer agente solidificante
ampliamente utilizado fue la gelatina, que desafortunadamente funde
a temperaturas por encima de 30C. (En el verano puede ser
imposible trabajar con gelatina en un cuarto sin aire
acondicionado). Debido a esta limitacin, el agar, un producto
derivado de algas marinas, reemplaz la gelatina.
Solamente con cultivos las propiedades de tipos individuales de
microorganismos pueden ser examinadas y comprendidas. Las bacterias
pueden separarse unas de otras por cada uno de los siguientes
mtodos: aislamiento por agotamiento, siembra por extensin en
superficie y siembra en todo el medio. Ud. debe aprender estos tres
mtodos para aislar colonias. Recordar aplicar la tcnica asptica
para prevenir contaminacin a partir del ambiente.

MATERIALES
Agar tripticasa soja (TSA) u otro medio de agar apropiado
Cajas de Petri
Esptula de Drigalsky o varilla de vidrio doblada en L
Alcohol 96
Pipetas
Ansa
Cultivos mixtos en caldo para plaquear en todo el medio (102/ml) y
por extensin en superficie (103/ml) Micrococcus luteus,
Micrococcus roseus, Staphylococcus epidermidis
Cultivos mixtos de 108/ml para aislar por agotamiento

Metodologa de Trabajo

SIEMBRA EN TODO EL MEDIO

 21

1. Suspender los organismos del cultivo en caldo (de 102/ml)

homogeneizando en vortex. Pipetear 1 ml de la mezcla en cajas de
Petri estriles individuales. Asegurarse de flamear la boca del
tubo de ensayo antes y despus de pipetear.
2. Flamear la boca de una botella de TSA (fundido y templado a
50C) y cuidadosamente verter 15 a 20 ml de agar dentro de la
caja de Petri. Flamear la boca de la botella, cubrirla y
retornarla al bao de agua. No mantener el agar fuera del bao
de agua por un perodo prolongado de tiempo.
3. Mezclar los contenidos de la placa de Petri mediante movimientos
suaves sobre la mesada formando una figura de ocho.
4. Dejar solidificar el agar e incubar durante 48 horas en posicin
invertida para prevenir la condensacin.

SIEMBRA POR EXTENSIN EN SUPERFICIE

1. Verter una placa de TSA y dejar solidificar.

2. Suspender los organismos del cultivo lquido (de 103/ml).
Destapar el tubo de ensayo y flamear la boca del tubo. No
contaminar la tapa durante este procedimiento. Extraer 0.1 ml de
organismos. Flamear la boca nuevamente y tapar el tubo.
3. Colocar los organismos en el centro de la placa.
4. Sumergir la esptula de Drigalsky en alcohol 96 y escurrir el
exceso de lquido. Mantener el recipiente con alcohol alejado de
las flamas.
5. Cuidadosamente flamear la varilla. Cuando todo el alcohol se ha
quemado, volver a repetir el tem 4 dos veces ms.
6. Dejar enfriar por unos pocos segundos. Ud. puede asegurarse que
la esptula se ha enfriado apoyndola sobre la superficie del
agar en un borde de la placa.
7. Utilizar la esptula para desparramar el inculo sobre la
superficie de la placa mientras rota la placa sobre la mesada.
8. Retornar la esptula al alcohol.
9. Incubar la placa durante 48 horas en posicin invertida.
10. Observar las colonias aisladas.

AISLAMIENTO POR AGOTAMIENTO

1. Verter una placa de TSA y dejar solidificar. Retornar el TSA al

bao de agua.
2. Secar la superficie de la placa a 55C durante 20 minutos, con
la tapa sacada y la superficie del agar hacia abajo e inclinada.
3. Suspender los organismos del cultivo mixto en caldo de 108/ml.
Flamear el ansa y el alambre hasta el rojo incipiente. Destapar
el tubo de ensayo y flamear la boca del tubo. No contaminar la
tapa o el ansa durante este procedimiento. Extraer un ansa de
organismos. Flamear la boca nuevamente y volver a tapar el tubo.
4. Estriar los organismos sobre una pequea regin del borde de la
placa segn la metodologa mostrada en la Figura 2 o Figura 3.
Este procedimiento se conoce como aislamiento por agotamiento y
tiene un efecto diluyente. La friccin del ansa de cultivo
 22

contra el agar causa la prdida de organismos del ansa. Cerca

del final del procedimiento de estriado, se separan bastante
lejos organismos individuales sobre la superficie del agar para
dar lugar a colonias aisladas despus de la incubacin.
5. Flamear el ansa antes de dejarla.
6. Incubar la placa durante 48 horas en posicin invertida.
7. Observar las colonias aisladas.

PRIMER PROCEDIMIENTO DE AISLAMIENTO POR AGOTAMIENTO:

Fig. 2: Estriado Para Aislamiento, Paso 1

(Ir a Paso 2)

Estriar el inculo sobre el rea 1. Flamear el ansa y enfriar el

alambre tocando el borde del agar.

Fig. 2: Estriado Para Aislamiento, Paso 2

(Ir a Paso 3)
 23

Rotar la placa de modo tal que el rea 1 quede a su izquierda.

Estriar el inculo del rea 1 sobre el rea 2. Flamear el ansa
y enfriar el alambre tocando el borde del agar.

Fig. 2: Estriado Para Aislamiento, Paso 3

Rotar la placa de modo tal que el rea 2 quede a su izquierda.

Estriar el inculo del rea 2 sobre el rea

SEGUNDO PROCEDIMIENTO DE AISLAMIENTO POR AGOTAMIENTO:

Fig. 3: Estriado Para Aislamiento, Paso 1
(Ir a Paso 2)

Estriar el inculo sobre el rea 1. Flamear el ansa y enfriar el

alambre tocando el borde del agar.
 24

Fig. 3: Estriado Para Aislamiento, Paso 2

(Ir a Paso 3)

Estriar el inculo del rea "1" sobre el rea "2." Flamear el ansa
y enfriar el alambre tocando el borde el agar.

Fig. 3: Estriado Para Aislamiento, Paso 3

(Ir a Paso 4)

Estriar el inculo del rea "2" sobre el rea "3." Flamear el ansa
y enfriar el alambre tocando el borde el agar.
 25

Fig. 3: Estriado Para Aislamiento, Paso 4

(Ir a Paso 5)

Estriar el inculo del rea "3" sobre el rea "4." Flamear el ansa
y enfriar el alambre tocando el borde del agar.

Fig. 3: Estriado Para Aislamiento, Paso 5

(Ir a Paso 6)

Estriar el inculo del rea 4 sobre el rea 5.

 26

Fig. 3: Estriado Para Aislamiento, Paso 6

Sin flamear el ansa, tambin estriar el rea 6.

Preguntas sobre cultivos puros

1. Cules son las ventajas e inconvenientes de cada tcnica de

aislamiento?

2. Usted expone una placa de agar al ambiente y consigue buen

crecimiento. Un nmero de colonias superpuestas y desea aislar
los organismos en cultivo puro. Qu tcnica utilizara?
Explicar.

3. Por qu el agar se templa a 50C antes de verter y no se vierte

directamente cuando ha fundido?
 27

4. Cmo podra Ud. realizar una siembra por extensin en

superficie a partir de un cultivo en agar inclinado?

5. Ud. necesita disponer de dos placas con 100 UFC, una

mediante el mtodo de siembra por extensin en superficie y
otra por siembra en todo el medio, a partir de un cultivo
lquido de 108 organismos/ml. Realizar el esquema de
diluciones e indicar cules debera plaquear para conseguir el
objetivo buscado.
 28

TRABAJO PRCTICO 4

MICOLOGA
Objetivos:
Aprender a reconocer las caractersticas morfolgicas macro y
microscpicas de los hongos pluri y unicelulares de importancia en
el sector agroalimentario.

Observacin macroscpica:
Registrar las caractersticas siguientes de las macrocolonias,
adverso y reverso mediante una lupa binocular haciendo incidir
sobre la placa luz lateral:
- Color de la colonia
- Cambios del mismo en el reverso
- Cambios del color en el medio
- Textura superficial (suelta, compacta, plana, rugosa, curvada,
aterciopelada, enmaraada, flocosa, vellosa, filamentosa,
gelatinosa, coricea, etc.)
- Olor si existe
- Caractersticas del micelio, areo y sumergido (aspecto, color,
consistencia, presencia o ausencia de septos, etc.)
- Caractersticas y disposicin de los rganos de fructificacin
maduros, sean esporangios, conidios, conidiforos sueltos, etc.
- Color, tamao y forma de los rganos de fructificacin maduros.

Observacin microscpica: Segn anexo 5.

Bibliografa:

Alexopoulos,C.J. and Mims, W.; Introduccin a la Micologa, Ed. Universitaria de

Buenos Aires, 1977.

Guiraud, J. and Galzy, P.; L'analyze microbiologique dans les industries

alimentaires, Editions de L'usine, 1981, cap.2.

Lennette and col.; Manual of Clinical Microbiology, 4ta Ed., American Society for
Microbiology, 1985, cap.46.

Moore-Landecker, E.; Fundamentals of The Fungi, 2nd ed., Prentice-Hall, 1982.

Pelczar and Reid; Microbiology, McGraw-Hill Book Cy., 1972, caps.14 y 15.

Pitt, J. & Hocking, A., Fungi and food spoilage, Academic Press, London, 1985.

Samson, R.A and col.; "Introduction to Food-Borne Fungi". 1995.

Stanier and col.; The Microbial World, 5ta ed., Prentice-Hall, 1986, p.536-544.
 29

Figura 1: Micelio Figura 2: Micelio

tabicado o septado no tabicado o cenoctico

Figura 3: Pseudomicelio en levaduras

Figura 4: Rhizopus sp
 30

Figura 5: Clamidosporas Figura 6: Zigotes o zygosporas

Figura 7: Gemacin en Figura 8: Fisin en levaduras

levaduras

Figura 9: Ascos sin ascocarpo

 31

Corte tranversal de un cleistotecio

Figura 10: Ascos cleistotecio

Figura 11: Ascos en peritecio Figura 12: Ascocarpo apotecio

Figura 13: Aureobasidium o Pullularia

 32

Figura 14: Penicillium Figura 15: Botrytis

Figura 16: Aspergillus Figura 17: Geotrichum

 33

Figura 18: Figura 19: Figura 20

Alternaria Curvularia Helminthosporium

Figura 21 Fusarium
 34

Figura 22: Phoma Figura 23: Rhizoctonia

Tomado de:
http://bilbo.edu.uy/microbio/hongos.htm/
 35

TRABAJO PRCTICO 5

RECUENTOS DE MICROORGANISMOS VIABLES

Objetivos:
Capacitar al estudiante en las metodologas ms utilizadas en
microbiologa, para la cuantificacin de microorganismos viables.
Desarrollar habilidades en los estudiantes para el recuento de
las poblaciones de microorganismos viables presentes en muestras
de diferente origen.

1. Recuento en placa

1.1. Por vertido en placa o siembra en profundidad

1.2. Por extensin en superficie

1.3. Por siembra de gotas en superficie

2. Nmero Ms Probable o tcnica de dilucin en tubo

Al momento de elegir la tcnica de recuento de microorganismos

viables, se debe tener en cuenta el tipo de muestra sobre la que se
va a trabajar, porque es posible que algunos de los mtodos no sean
aplicables.

RECUENTO EN PLACA
Permite determinar indirectamente el nmero de microorganismos
presentes en una muestra en base a que se desarrollen en medio de
cultivo, en placa, formando colonias. Por lo tanto se determinan
por este mtodo slo las clulas microbianas VIABLES en las
condiciones de trabajo (nutrientes, atmsfera, temperatura). Como
las colonias pueden originarse tanto de una clula como de un grupo
de clulas, se utiliza el trmino: UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS
(u.f.c.) Adems, a los efectos de que todas las clulas que estn
en una placa tengan una adecuada disponibilidad de nutrientes, y
que la incertidumbre del mtodo sea menor, se establece que las
condiciones ptimas de recuento se dan cuando desarrollan entre 30
y 300 colonias por placa. Esta regla general se usa siempre que no
haya una especificacin diferente. Si fuera posible y necesario se
puede repetir el recuento para obtener placas con un nmero de
colonias ptimas.

Procedimiento
La preparacin de la muestra se realiza como para cualquier mtodo
utilizando diluyentes adecuados. Se preparan diluciones decimales
sucesivas (relacin muestra/volumen de dilucin 1 en 10), partiendo
generalmente de 10 g o ml de muestra en 90 ml de diluyente para la
primera dilucin (1/10 o 10-1). Para la segunda dilucin (1/100 o
10-2) se toma 1 ml de la 10-1 y se descarga en 9 ml de diluyente y
as sucesivamente. Se descarta la pipeta luego de cada descarga.
 36

Cada vez que se prepara una dilucin en necesario homogeneizarla

adecuadamente para lograr una distribucin de los microorganismos
en todo el volumen de dilucin. Esto se logra por agitacin (si es
un frasco con tapn hermtico se realiza con agitacin durante 25
veces, formando un arco de aprox. 30 cm y si es un tubo con
agitacin con Vortex). Tambin puede cargarse y descargarse un
determinado volumen de la dilucin con una nueva pipeta (al menos
diez veces), y finalmente tomar el volumen deseado.

La dilucin final depende del nmero esperado de microorganismos en

la muestra original.
Para productos limpios puede ser suficiente hasta 10-3. Y para
productos altamente contaminados, puede necesitarse una dilucin
hasta 10-6.
Una vez preparadas las diluciones, se siembra dentro de los 15
minutos siguientes.

ANTES DE PROCEDER A LA SIEMBRA SE ROTULAN LAS BASES DE LAS PLACAS

CON LOS SIGUIENTES DATOS:
Identificacin de la muestra: Nombre y/o cdigo
Cantidad de muestra plaqueada en g o ml
Superficie o profundidad
Fecha
Operador

RECUENTO POR VERTIDO EN PLACA O SIEMBRA EN PROFUNDIDAD

Se deposita 1 ml de cada dilucin en placas de Petri estriles,

vacas, por duplicado. Se puede emplear la misma pipeta para todas
las diluciones si se comienza por la ms diluida.

En algunas situaciones puede sembrarse un volumen diferente, en

general no ms de 2 ml por placa. Por ejemplo, para cargas
microbianas bajas se dividen 10 ml de la dilucin 1/10 de una
 37

muestra slida 10 ml de una muestra lquida sin diluir entre 5

placas de Petri estriles.

Posteriormente, se agrega a cada placa 15 a 20 ml del medio de

cultivo a emplear, previamente fundido y templado a 45 + 2C en
bao de Mara. Se agita moviendo la placa tapada sobre la
superficie de la mesa con movimiento circular, horario y
antihorario y hacia delante y hacia atrs.

RECUENTO POR EXTENSIN EN SUPERFICIE

Se deposita en la superficie de las placas que ya contienen el

medio de cultivo, 0.1 ml de cada dilucin. Se realiza duplicado
para cada dilucin. Se puede emplear la misma pipeta para todas las
diluciones si se comienza por la ms diluida. Luego de realizada la
descarga de la muestra, se procede a extenderla sobre toda la
superficie de las placas para que se absorba, usando esptula de
Drigalsky o varilla de vidrio doblada en L estril.

Medio de cultivo
Se elige segn el tipo de microorganismos que se quiere contar
pudiendo emplearse medios ricos, electivos, selectivos o selectivos
y diferenciales.

Incubacin
Una vez enfriado el agar en el caso del recuento en profundidad, y
absorbida la muestra en el caso de recuento en superficie, las
placas se invierten, y se ponen en la estufa que corresponde segn
los microorganismos a contar, durante el tiempo propuesto en la
tcnica correspondiente.

INTERPRETACIN
Finalizado el perodo de incubacin se observa con buena luz a
efectos de visualizar todas las colonias y diferenciarlas de
cualquier partcula de muestra que pueda confundir. Contar todas
las colonias desarrolladas por placa, marcando cada una con un
lpiz de tinta indeleble. Se cuentan como colonias individuales
todas aquellas que disten de las colonias prximas una distancia al
menos igual al dimetro de la colonia ms pequea.
Cuando se utilizan medios NO SELECTIVOS se procede de la siguiente
forma:
1) Se cuentan en primer lugar las placas que tengan entre 30 y 300
colonias. Se hace el clculo multiplicando por la inversa de la
dilucin y luego se promedian si corresponde- los valores de las
distintas placas y diluciones. Para el informe final se toma en
cuenta solo los valores de estas placas.
Si no hay placas que contengan entre 30 y 300 colonias proceder de
la siguiente manera:
2) Si slo hubieran placas con menos de 30 colonias, se hace el
clculo multiplicando por la inversa de la dilucin y se informa
 38

igualmente el resultado, expresndolo por g o ml de muestra. En

este caso se informa el resultado como ESTIMADO.
Si no hubiera colonias en ninguna de las placas, se informa como:
Menor que 1 o 10 (segn sea en profundidad o superficie) por la
inversa de la dilucin menor.
3) Si en todas las placas hubiera ms de 300 colonias, se estima el
resultado. Si no es posible distinguir colonias individuales
(crecimiento confluente) se puede informar el resultado como mayor
de 300 por la inversa de la dilucin mayor. Si es posible
distinguir colonias individuales y estn homogneamente
distribuidas, se cuentan las colonias en una superficie conocida de
la placa y luego se extrapola a la superficie total de la placa: 65
cm2 para las de vidrio comunes, o 57 cm2 para las de plstico.

Se siguen las siguientes reglas:

Si hay menos de 10 colonias por cm2, se cuentan 13 cuadrados de 1
cm de lado: 7 consecutivos horizontales y 6 consecutivos
verticales. El total de colonias contadas se multiplica por 5 o 4.4
segn el tipo de placa, para estimar el nmero de colonias en toda
la placa. En este caso se informa el resultado como ESTIMADO
Si hay ms de 10 colonias por cm2, se cuentan 4 cuadrados de 1 cm
de lado, y el promedio se multiplica por 65 o 57 segn el tipo de
placa. En este caso se informa el resultado como ESTIMADO
Si hay ms de 100 colonias en 1 cm2, no se cuentan sino que se
estima el resultado como mayor de 6500 o 5700 por placa.
Una vez estimado el nmero de colonias por placa, se aplica el
factor de conversin para expresar el resultado por gramo o ml de
muestra, de acuerdo al mtodo (profundidad o superficie), y a las
diluciones sembradas.
Es frecuente que desarrollen colonias extendidas sobre la
superficie o el fondo y bordes de la placa, o que se den cadenas de
colonias unidas. Este tipo de crecimiento se denomina "spreaders" y
se cuentan como una. Cuando el spreader cubre ms del 50% de la
placa, esta no debe contarse. Cuando el spreader cubre una
superficie menor del 50%, se cuentan las colonias en el resto de la
placa, SOLO si estn uniformemente distribuidas.
Si en todas las placas hay spreaders se informa: Spreaders
Todas las situaciones en las que no se pueda informar el recuento
por no caer en los casos anteriores, (ej.: contaminacin, mal
funcionamiento del medio), se informa como: "Accidente de
laboratorio"
Cuando se emplean medios SELECTIVOS, el nmero de colonias que se
considera ptimo para contar, suele ser menor de 300, es necesario
referirse a la tcnica correspondiente (de referencia) a los
efectos de la interpretacin de los resultados.
Como excepcin, cuando se siembran en profundidad 2 ml de la
dilucin 1/10 de una muestra slida 2 ml de una muestra lquida
sin diluir en 5 placas no se calcula el promedio sino se suma el
nmero de colonias desarrolladas en todas las placas y dicho valor
 39

representa directamente la cantidad de ufc en 1 g o en 10 ml de

muestra.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE AMBOS MTODOS:

Por vertido en placa Por extensin en superficie
Mayor cantidad de muestra Menor cantidad de muestra

Mayor precisin Menor precisin

Mejor aprovechamiento de Peor aprovechamiento de

nutrientes nutrientes

Dificultad al subcultivar Facilidad para subcultivar

colonias colonias

Visualizacin de colonias Fcil visualizacin

dificultosa

No se afectan los
Temperatura del agar puede
microorganismos
afectar la viabilidad de
termosensibles
algunos microorganismos

En aerobiosis desarrollan En aerobiosis slo crecen

microorganismos aerobios aerobios estrictos y aerobio-
estrictos, aerobio- anaerobios facultativos
anaerobios facultativos y
microaerfilos

Expresin de los resultados:

Se informan los resultados de recuento con slo DOS CIFRAS
SIGNIFICATIVAS, redondeando los valores cuando corresponda.
Redondear la segunda cifra significativa a la inmediata superior si
la tercera cifra es 6, 7, 8 9. Redondear la segunda cifra
significativa a la inmediata inferior si la tercera cifra es 1, 2,
3 y 4. Si la tercera cifra es 5 redondear hacia arriba si la
segunda cifra es impar y hacia abajo si es par
Ej.: 137 se informa 140 1,4 x 102
145000 se informa 1,4 x 105

En el informe de un recuento en placa se expresa:

Recuento de (tipo de microorganismo): X u.f.c. /g o ml

RECUENTO EN PLACA POR SIEMBRA DE GOTAS EN SUPERFICIE

Dividir la base de dos placas de Petri con rotulador en seis
porciones iguales y rotular cada una indicando las correspondientes
diluciones por duplicado: 106, 10-5,10-4,10 3, 10-2 y 10-1.
 40

Con una micropipeta y punta estril tomar 10 l de la dilucin 106

y depositarlos en spot en su porcin correspondiente de la placa.
Con la misma punta seguir por este orden poniendo 10 l de cada una
de las diluciones 10-5, 10-4, 10-3, 10-2 y 10-1 en sus correspondientes
porciones de la placa de cultivo. Realizar por duplicado cada
dilucin.
Para ello, levantar la tapa de la placa y colocar la punta de la
micropipeta en posicin vertical y a una altura aproximada de 2 cm
de la superficie del medio de cultivo, dejar caer la gota en el
centro de cada uno de los dos sectores que corresponden a esa
dilucin.

Tapar las placas y dejarlas sin invertir una media hora hasta que
se hayan secado las gotas.

Incubacin de los medios

Incubar en las condiciones de tiempo, atmsfera y Temperatura
indicadas para cada medio/microorganismo.

Lectura e interpretacin de los resultados

Despus de la incubacin seleccionar los sectores que presenten
menos de 30 colonias por gota y proceder a la cuantificacin de las
mismas.
Determinar el nmero promedio para la dilucin apropiada y calcular
las unidades formadoras de colonias (ufc) por gramo o ml de muestra
con la siguiente frmula:

ufc NxF
=
g o ml V

En donde N = Nmero promedio de colonias

F = inversa del factor de dilucin
 41

V = Volumen de la gota

Segn: Recomendaciones generales para el control de calidad interno

en Microbiologa Clnica CCI-SEIMC-02 Realizado: Grupo colaborador
GEGMIC Fecha: 16-05-04 Versin: 1 Pg. 9/22

MTODO DEL NMERO MS PROBABLE O TCNICA DE DILUCIN EN TUBO

Una referencia esencial que trata el desarrollo de la tcnica del

nmero ms probable y citan numerosos e importantes trabajos
cientficos pero que son difciles de encontrar en la literatura
sobre este tema es:

Oblinger, J.L., Koburger, J.A. 1975. "Understanding and Teaching

the Most Probable Number Technique. J. Milk Food Technol. 38(9):
540-545.

Un mtodo relacionado que utiliza placas con siembra de gotas en

superficie se puede ver en:
http://www.splammo.net/ppproj/cpmicro.html#platedilution

Para visualizar la base terica del Mtodo del Nmero Ms Probable

(NMP), pensar en una serie de diluciones decimales que se realizan
a partir de una muestra de agua siendo inoculado un ml de cada
dilucin en un tubo separado de un medio de cultivo rico o general.

Luego de la incubacin, se observa en cada tubo la presencia o

ausencia de crecimiento. Tericamente, si al menos un organismo ha
estado presente en alguno de los inculos, se debera observar un
crecimiento visible en aquel tubo en particular. Si el caldo
inoculado a partir de la dilucin 10-3 mostr crecimiento, pero en
el caldo de la dilucin 10-4 no, sera posible decir que haba ms
de 1 x 103 organismos por ml de muestra original pero menos de 1 x
104 por ml.

Las bacterias en una muestra, si las hay, no se hallan

uniformemente distribuidas. Por ejemplo, si una muestra de 10 ml
contiene un total de 300 organismos, no siempre una alcuota de un
 42

ml contendr 30 organismos; algunos contendrn ms o menos, pero el

promedio de las 10 alcuotas de 1 ml de la muestra original de 10
ml ser 30. Esto tambin es vlido en el caso de las diluciones
realizadas.

Para aumentar la precisin estadstica de este tipo de prueba, ms

de un tubo puede ser inoculado a partir de cada dilucin. Los
procedimientos estndares de NMP utilizan un mnimo de 3 diluciones
y 3, 5 10 tubos por dilucin. La variabilidad estadstica de la
distribucin bacteriana es mejor estimarla utilizando la mayor
cantidad de tubos siempre que sea posible o prctica. Luego de la
incubacin, se registran los tubos positivos y negativos y se
consulta una Tabla de NMP estandarizada para determinar el nmero
ms probable de organismos (dando los resultados positivos) por
unidad de volumen de muestra original.

En el siguiente ejemplo, una serie de 3 tubos con un medio de

cultivo lquido, rico o general, se inocula a partir de cada
dilucin decimal, con un ml de inculo.

Luego de la incubacin, se registra el nmero de tubos mostrando

crecimiento. Como se realizaron diluciones sucesivas, los
organismos se diluyeron hasta tal punto que en siete de los tubos
no lleg inculo (rotulados negativos). Con el fin de estimar el
nmero de organismos por ml de muestra que podra causar este tipo
de respuesta de crecimiento, localizamos las tres series de tubos
que muestren la dilucin de los organismos "a la extincin" - es
decir, los tubos que fueron inoculados desde las diluciones 10-2,
10-3 y 10-4.

Tabla NMP de 3-Tubos

 43

N de Tubos
Positivos en NMP en el inculo de la serie
intermedia de tubos
Primera Serie ltima
serie intermedia serie

0 0 0 < 0.03

0 0 1 0.03

0 0 2 0.06

0 0 3 0.09

0 1 0 0.03

0 1 1 0.061

0 1 2 0.092

0 1 3 0.12

0 2 0 0.062

0 2 1 0.093

0 2 2 0.12

0 2 3 0.16

0 3 0 0.094

0 3 1 0.13

0 3 2 0.16

0 3 3 0.19

1 0 0 0.036

1 0 1 0.072

1 0 2 0.11

1 0 3 0.15

1 1 0 0.073

1 1 1 0.11

1 1 2 0.15
 44

1 1 3 0.19

1 2 0 0.11

1 2 1 0.15

1 2 2 0.20

1 2 3 0.24

1 3 0 0.16

1 3 1 0.20

1 3 2 0.24

1 3 3 0.29

2 0 0 0.091

2 0 1 0.14

2 0 2 0.20

2 0 3 0.26

2 1 0 0.15

2 1 1 0.20

2 1 2 0.27

2 1 3 0.34

2 2 0 0.21

2 2 1 0.28

2 2 2 0.35

2 2 3 0.42

2 3 0 0.29

2 3 1 0.36

2 3 2 0.44

2 3 3 0.53

3 0 0 0.23
 45

3 0 1 0.39

3 0 2 0.64

3 0 3 0.95

3 1 0 0.43

3 1 1 0.75

3 1 2 1.2

3 1 3 1.6

3 2 0 0.93

3 2 1 1.5

3 2 2 2.1

3 2 3 2.9

3 3 0 2.4

3 3 1 4.6

3 3 2 11

3 3 3 > 24

La tabla superior es Tabla NMP de 3-Tubos que fue tomada de

Oblinger y Koburger (1975) y adaptada para utilizar en la
determinacin del nmero ms probable de organismos positivos por
inculo en la serie intermedia de tubos. El encabezamiento de la
ltima columna nos dice que esta combinacin de resultados (en
orden: 3-2-0) sugiere un promedio de 0.93 organismos que se inocul
en cada uno de los tubos de la serie intermedia (de las tres series
de tubos seleccionados) - es decir, aquel inocul con un ml de una
dilucin 10-3. Por lo tanto, el nmero ms probable de organismos
por ml de la muestra original sin diluir sera 0.93 x 103 o 9.3 x
102.

Una Tabla NMP de 5-Tubos se menciona a continuacin:

N de Tubos
Positivos en NMP en el inculo de la serie
intermedia de tubos
Primera Serie ltima
serie intermedia serie
 46

0 0 0 < 0.01

0 0 1 0.02

0 1 0 0.02

0 2 0 0.04

1 0 0 0.02

1 0 1 0.04

1 1 0 0.04

1 1 1 0.06

1 2 0 0.06

2 0 0 0.05

2 0 1 0.07

2 1 0 0.07

2 1 1 0.09

2 2 0 0.09

2 3 0 0.12

3 0 0 0.08

3 0 1 0.11

3 1 0 0.11

3 1 1 0.14

3 2 0 0.14

3 2 1 0.17

4 0 0 0.13

4 0 1 0.17

4 1 0 0.17

4 1 1 0.21

4 1 2 0.26
 47

4 2 0 0.22

4 2 1 0.26

4 3 0 0.27

4 3 1 0.33

4 4 0 0.34

5 0 0 0.23

5 0 1 0.31

5 0 2 0.43

5 1 0 0.33

5 1 1 0.46

5 1 2 0.63

5 2 0 0.49

5 2 1 0.7

5 2 2 0.94

5 3 0 0.79

5 3 1 1.1

5 3 2 1.4

5 3 3 1.8

5 4 0 1.3

5 4 1 1.7

5 4 2 2.2

5 4 3 2.8

5 4 4 3.5

5 5 0 2.4

5 5 1 3.5

5 5 2 5.4
 48

5 5 3 9.2

5 5 4 16

5 5 5 > 24

Se trata de una tabla NMP de 5-tubos, tomada de Standard Methods

for the Examination of Water and Wastewater, 15th edition (1980) y
adaptada para utilizar en la determinacin del nmero ms probable
de organismos positivos por inculo en la serie intermedia de
tubos. Las mismas reglas se aplican como se indic anteriormente en
que la cantidad actual de muestra decrece en forma decimal en cada
serie sucesiva de tubos que se puede lograr (por ejemplo)
haciendo inoculaciones de un ml a partir de las diluciones
decimales decrecientes como en el ejemplo siguiente.

Como problema ejemplo: Supongamos 5 tubos de un medio rico o

general se inocula cada uno con 1 ml de la dilucin 10-2 de una
muestra de agua, y 5 ms son igualmente inocularon partir de una
dilucin 10-3 as como lo son 5 ms con una dilucin 10-4. Si los
resultados muestran 5 tubos positivos para la primera serie de
tubos, 3 para la segunda y 1 para la ltima serie, la combinacin
5-3-1 coincide con el valor MPN de 1.1 que, segn la tabla,
significa que habra (en promedio) aproximadamente 1.1 organismos
positivos por ml en la dilucin 10-3. Por lo tanto, el nmero por ml
de muestra original de agua sin diluir sera 1.1 x 103. Recuerde que
tal valor es realmente una estimacin aproximada. Con lmites de
confianza del 95% para cada combinacin de resultados positivos en
Standard Methods para diluciones decimales sucesivas.

Este mtodo, con la tabla asociada, solo se puede aplicar si

existen diluciones decimales sucesivas (en un medio de cultivo
apropiado) para comparar los resultados con la tabla.

Algunas premisas a tener en cuenta:

Distintas cantidades a un ml pueden ser inoculadas en los

tubos. Por ejemplo, inoculando 0.1 ml de una dilucin 10-3 es
equivalente a inocular 1 ml de una dilucin 10-4: es lo mismo que
realizar una dilucin 10-4.
No importa qu cantidad de medio de cultivo hay en los tubos que
se inocularon. Por ejemplo, la misma respuesta de crecimiento se
evidenciara en tubos de medio de cultivo doble concentracin.
Adems, no tenemos que inocular nuestros tubos a partir de
diluciones. Por ejemplo, uno puede partir de series de tubos
donde 10 gramos son inoculados en cada tubo de la primera serie,
1 gramo es inoculado en cada tubo de la segunda serie, y 0.1
gramo es inoculado en cada tubo de la tercer serie. La secuencia
 49

de cantidades decimales decrecientes se mantiene. (Recordemos

que la llamada "dilucin rotulada" representa la cantidad real
de muestra que est siendo inoculada). Vase el segundo problema
de muestra a continuacin.

Aqu se plantean algunos ejemplos de problemas del NMP.

I. A partir de una muestra de agua de ro, Ud. inocul 10 ml en 90

ml de diluyente estril; esta es la primera dilucin indicada en
la tabla siguiente. Luego de mezclarla muy bien, 1 ml de esta
dilucin fue aadida a 99 ml de diluyente estril, y una tercera
dilucin fue realizada de la misma forma. De cada una de dichas
diluciones, tubos de caldo glucosa-prpura de bromocresol fueron
inoculados con las cantidades mostradas en la tabla siguiente.
Luego de una apropiada incubacin, se observaron los tubos que
manifestaron crecimiento y produccin de cido, y los resultados
se resumen a continuacin:
II.
Dilucin de agua de ro Primera Segunda Tercera
dilucin dilucin dilucin
(= 10-1) (= 10-3) (= 10-5)
Cantidad inoculada en cada
uno de tres tubos 1 ml 0.1 ml 1 ml 0.1 ml 1 ml 0.1 ml
de caldo glucosa-prpura de
bromocresol
Serie de tubos A B C D E F
(designaciones usadas abajo)
N de tubos mostrando 3 3 3 3 2 0
crecimiento
N de tubos mostrando 3 3 3 1 0 0
produccin de cido

Cul fue el nmero ms probable de fermentadores de glucosa por

ml de muestra original de agua? Aqu se encuentra una forma de
hallar la respuesta:

Seleccionar las tres series de tubos consecutivos que muestren

dilucin a extincin de organismos fermentadores de glucosa
por ej. series C, D y E. Podemos indicar 3-1-0 para
representar el nmero de tubos positivos
Consultar la tabla NMP, 3-1-0 indica que un promedio de 0.43
organismos (causantes de la reaccin mencionada) fue inoculado
en cada uno de los tubos de la serie intermedia (D) es decir
los tubos inoculados con 0.1 ml de la dilucin 10-3, que entonces
 50

sera la dilucin 10-4 por lo que el factor de dilucin es 104.

(Recordar que representa la cantidad de muestra sin diluir que
est siendo inoculada, puede imaginar que 10-4 ml de muestra de
agua ha sido inoculado en cada tubo de la serie D).
Utilizando matemtica bsica, si 0.43 estaba en 0.1 ml de la
dilucin 10-3, esto equivaldra a 4.3 en 1 ml de la misma
dilucin 10-3.
Por lo tanto el nmero ms probable de organismos fermentadores
de glucosa por ml de muestra original no diluida es 4.3 x 103.
Un mtodo alternativo sera multiplicar el valor NMP de la tabla
(0.43) por el factor de dilucin de la serie de tubos D que es
104. El resultado es el mismo: 0.43 x 104 = 4.3 x 103.

III. Una muestra de hamburguesa cruda fue dividida aspticamente, y

porciones pesadas fueron aadidas a Erlenmeyer de caldo de
enriquecimiento utilizado en el procedimiento de aislamiento e
identificacin de Salmonella segn FDA. Las cantidades
utilizadas estn indicadas en la tabla siguiente. El
procedimiento ntegro FDA fue realizado a partir de cada
Erlenmeyer y el nmero de Erlenmeyers en los cuales se confirm
la presencia de Salmonella se indica a continuacin:

Cantidad de hamburguesa aadida a cada uno 20 g 2.0 g 0.2 g

de los tres Erlenmeyers de caldo
N de Erlenmeyers donde se aisl Salmonella 3 3 1

Calcular la cantidad de Salmonella por gramo de hamburguesa.

Consultar la tabla, 3-3-1 indica un promedio de 4.6 organismos

(en este caso, Salmonella) fueron inoculados en cada uno de los
Erlenmeyers de la serie intermedia es decir, aquellos
inoculados con 2 gramos de hamburguesa.
Si 4.6 estaban en 2 gramos de hamburguesa, esto equivale a 2.3 en
1 gramo.
Notar que no se han efectuado diluciones, pero al igual se
inocularon cantidades decimalmente decrecientes. Cuanto menor
sea el nmero de organismos que se puede esperar, menos se tiene
que diluir la muestra. Por el contrario, usted necesita tomar
porciones decimalmente ms grandes de la muestra sin diluir como
hemos visto en este ejemplo.

Otros problemas para ejercitarse pueden hallarse consultando la

pgina: http://www.jlindquist.net/generalmicro/102prob2SX.html
 51

Ir a:
Mike Curiale's MPN Calculator.
Site Outline of related pages.

Tomado de: http://www.jlindquist.net/generalmicro/102dil3.html

Bibliografa:

ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Tcnicas de anlisis microbiolgico.

Vol. 1. 2. edicin. Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa, 1984.

Rojas Trivio, A. 2011. Conceptos y Prctica de Microbiologa General.

Universidad Nacional de Colombia, sede Palmira. 161 p.
 52

TRABAJO PRCTICO 6

VIRUS: BACTERIFAGOS

Introduccin

Los virus son agentes infecciosos con caractersticas viables y no

viables.

1. Caractersticas viables de los virus

a. Se reproducen a un grado fantstico, pero solamente dentro de

las clulas viables del husped.
b. Pueden mutar.

2. Caractersticas no viables de los virus

a. Son acelulares, es decir, carecen de citoplasma y organelas

celulares.
b. No realizan el metabolismo en s y deben replicarse utilizando
la maquinaria metablica de la clula husped. En otras palabras,
los virus no crecen ni se dividen. En cambio, los nuevos
componentes virales se sintetizan y congregan dentro de la clula
husped infectada.
c. Poseen DNA o RNA pero nunca ambos.

Generalmente los virus son mucho ms pequeos que las bacterias. La

mayora son submicroscpicos, con un rango en tamao de 10-250
nanmetros. Estructuralmente, los virus son mucho ms simples que
las bacterias. Cada virus contiene un genoma de cadena doble o
simple de DNA o RNA que funciona como su material gentico. ste se
halla rodeado por una capa proteica llamada capside o cubierta
compuesta de subunidades de protena llamadas capsomeros. Muchos
virus consisten en nada ms de cido nucleico y una cpside, en
tal caso se conocen como virus nucleocapside o virus desnudos.

La mayora de los virus animales presentan una capa que rodea el

nucleocpside y se conocen como virus envueltos. La capa
generalmente proviene de las membranas de la clula husped a
travs de un proceso denominado brotacin o gemacin, aunque el
virus incorpora glicoprotena propia en esta capa.

Los Bacterifagos son virus que infectan solo bacterias. Adems de

la nucleocapside o cabeza, algunos tienen una estructura de cola
bastante compleja usada en la adsorcin a la pared de la clula de
la bacteria husped.

Como los virus carecen de organelas y son totalmente dependientes

de la maquinaria metablica de la clula husped para su
replicacin, ellos no pueden crecer en medios sintticos. En el
laboratorio, los virus animales se multiplican en animales, en
 53

huevos embrionados, o en cultivos celulares (En el cultivo celular,

las clulas del animal husped se hacen crecer en medio sinttico y
luego se infectan con los virus). Los virus de plantas se cultivan
en plantas o en cultivo celular vegetal. Los bacterifagos se
cultivan en la bacteria susceptible. Los bacterifagos son los
virus ms fciles de estudiar en el laboratorio. La mayora de
bacterifagos, tales como los Colifagos T4, se replican mediante un
ciclo de vida ltico y se conocen como bacterifagos lticos.

El ciclo de vida ltico del Colifago T4 consiste en los siguientes

pasos:

1. Adsorcin
Los sitios de ataque de la cola del bacterifago se adsorben a los
sitios receptores sobre la pared celular de una bacteria husped
susceptible.

2. Penetracin
Una enzima bacterifaga taladra un orificio en la pared celular
bacteriana y el bacterifago inyecta su genoma dentro de la
bacteria. ste comienza el perodo eclipse, perodo en el cual
ningn bacterifago intacto puede observarse dentro de la bacteria.

3. Replicacin
Enzimas codificadas por el genoma bacterifago obstruyen la
sntesis macromolecular de la bacteria (protena, RNA, DNA). El
genoma bacterifago se replica y la maquinaria metablica de la
bacteria es utilizada para sintetizar enzimas bacterifagas y
componentes bacterifagos estructurales.

4. Maduracin
Las partes del bacterifago se congregan alrededor del genoma.

5. Liberacin
Una lisosyma codificada por el bacterifago disuelve el
peptidoglicano bacteriano causando la lisis osmtica de la bacteria
y la liberacin de los bacterifagos intactos.

6. Reinfeccin
De 50-200 bacterifagos pueden producirse por bacteria infectada y
ellos ahora infectar las bacterias circundantes.

Algunos bacterifagos se replican mediante el ciclo de vida

lisognico y se denominan bacterifagos temperados. Cuando un
bacterifago temperado infecta una bacteria, ste puede 1)
replicarse por el ciclo de vida ltico y causar la lisis de la
bacteria husped, o puede 2) incorporar su DNA en el DNA de la
bacteria y establecerse un estado no infeccioso. En el ltimo caso,
el ciclo comienza con la fijacin del bacterifago en la bacteria
husped e inyecta su genoma, como en el ciclo ltico. Sin embargo,
el bacterifago no mata a la bacteria husped. En su lugar, el DNA
 54

bacterifago se inserta o integra al DNA de la bacteria husped. En

esta fase, el virus se denomina profago. La expresin de los genes
del bacterifago controlando la replicacin bacterifaga se reprime
mediante una protena represora y el DNA bacterifago se replica
como parte del nucleoide bacteriano. Sin embargo, puede ocurrir la
induccin espontnea, aproximadamente uno de cada billn de
bacterias conteniendo un profago., revierten a su estado
infeccioso, es decir, los genes del bacterifago se activan y los
fagos se multiplican como en el ciclo de vida ltico.

Hoy Ud. infectar la bacteria Escherichia coli ATTC 13706 con su

bacterifago especfico, Colifago T4. En la primera parte del
prctico realizar un recuento de calvas o placas de lisis. Una
calva o placa de lisis es un rea pequea, clara sobre una placa de
agar donde la bacteria husped ha sido lisada como resultado del
ciclo de vida ltico de los bacterifagos infecciosos. Cuando la
bacteria se multiplica sobre la placa forman un csped de
crecimiento confluente. Mientras tanto, cada bacterifago se
adsorbe a una bacteria, se multiplicar y causar la lisis de dicha
bacteria. Los bacterifagos liberados luego infectarn a bacterias
vecinas, causando su lisis. Como resultado de este proceso, se
observa sobre la placa un rea de lisis visible bien limitada,
denominada calva o placa de lisis.

La segunda parte del prctico demostrar la especificidad viral. La

especificidad viral se define como una cepa especfica de
bacterifago solo se adsorber a una cepa especfica de bacteria
husped susceptible. En efecto, la especificidad viral es tan
especfica como una reaccin enzima-sustrato o una reaccin
antgeno-anticuerpo. Por tal motivo, la especificidad viral puede
utilizarse algunas veces como prueba identificatoria de una
bacteria incgnita. Bacterifagos conocidos se usan para
identificar una bacteria desconocida observando si la bacteria es o
no lisada. Esto se conoce como fagotipificacin.

La fagotipificacin resulta muy til en la identificacin de

bacterias como Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y
serovariedades de Salmonella. Por ejemplo, utilizando una serie de
bacterifagos estafiloccicos conocidos contra Staphylococcus
aureus aislado de un ambiente determinado, uno puede determinar si
es idntico o diferente de la cepa de Staphylococcus aureus
aislada de una lesin o de un alimento. Esto puede utilizarse para
establecer la ruta de transmisin.

En la tercera parte del prctico podr determinar la potabilidad de

una muestra de agua mediante un mtodo rpido e indirecto, basado
en la deteccin de colifagos (fagos que infectan Escherichia coli)
en un volumen determinado de muestra.

Objetivos
 55

- Realizar la titulacin de un cultivo lquido del Colifago T4,

bacterifago especfico de Escherichia coli ATTC 13706.
- Fagotipificar cepas incgnitas a fin de determinar si alguna
es Escherichia coli.
- Determinar colifagos en aguas de consumo para verificar su
potabilidad.

Materiales

8 Tubos conteniendo 9.0 ml de NaCl al 0,85%

5 Tubos con 5 ml de caldo nutritivo con 0,7% de agar-agar y 0,04%
de CaCl2
7 placas de Petri, de 90 x 15 mm, con de agar nutritivo con 0,04%
de CaCl2
3 placas de Petri, de 150 x 15 mm, estriles
1 frasco con 100 ml de agar nutritivo con 0,04% de CaCl2
1 Erlenmeyer estril, de 250 ml de capacidad
1 probeta estril de 100 ml
Pipetas de 1 ml estriles
Pipetas de 0,1 ml estriles

A. Titulacin del Colifago T4

Procedimiento

El profesor proporcionar a los alumnos un cultivo de la bacteria

husped (E. coli ATTC 13706) en caldo nutritivo de 24 h a 35C y
suspensin del Colifago T4.

Tcnica de dilucin y siembra en placa

1. A partir de la suspensin del bacterifago, efectuar diluciones

decimales hasta 10-8 inclusive en 9 ml de NaCl al 0,85%.
2. En cada uno de 5 tubos conteniendo 5 ml de caldo nutritivo con
0,7% agar-agar y 0,04% de CaCl2, fundido y templado a 50 2C
incorporar 0,5 ml de un cultivo de la bacteria hospedadora en 5
ml de caldo nutritivo de 24 h a 35C y; 0,1 ml de las ltimas
cinco diluciones decimales.
3. De inmediato homogeneizar en vortex y verter en placas
individuales, de 90 mm de dimetro, conteniendo 15 ml de agar
nutritivo con 0,04% de CaCl2, desparramando la mezcla
uniformemente sobre la superficie del agar y evitando la
presencia de burbujas de aire.
4. Dejar solidificar e incubar las placas en la habitual posicin
invertida a 35C durante 4 a 15 horas efectuando lecturas a
intervalos frecuentes.
 56

La presencia del bacterifago se visualiza en la aparicin de

calvas o placas de lisis.

B. ESPECIFICIDAD VIRAL

Procedimiento

El profesor proporcionar cultivo de 4 bacterias incgnitas en

caldo nutritivo rotuladas N 1, N 2, N 3, y N 4 y; suspensin de
Colifago T4.

Siembra

1. Utilizando un marcador indeleble, dibujar una lnea en el fondo

de dos placas de agar nutritivo con 0,04% de CaCl2, dividindolas
a la mitad. Numerar los 4 sectores 1, 2, 3 y 4, que corresponde
a las 4 bacterias incgnitas.
2. Dibujar un crculo en el centro de cada uno de los 4 sectores.
3. Con ansa estril, estriar la bacteria incgnita 1 en el sector 1
de la primera placa de agar nutritivo dentro del crculo que Ud.
dibuj. Ser precavido de no estriar dentro de otros sectores de
la placa.
4. Estriar la bacteria incgnita 2 sobre el sector 2 de la primera
placa de agar nutritivo.
5. Estriar la bacteria incgnita 3 sobre el sector 3 de la segunda
placa de agar nutritivo.
6. Estriar la bacteria incgnita 4 sobre el sector 4 de la segunda
placa de agar nutritivo.
7. Aadir al centro de cada rea limitada por el crculo una asada
del Colifago T4, esterilizando el ansa en cada oportunidad.
8. Incubar las 2 placas de agar nutritivo invertidas a 35C durante
4 a 15 horas.

C DETERMINACIN DE COLIFAGOS A PARTIR DE AGUAS DE POZO POR LA

TCNICA DE PLACA VERTIDA

El hallazgo de colifagos en una muestra de agua, indica la

presencia de Escherichia coli y por lo tanto contaminacin de
origen fecal.

Procedimiento

1. Fundir 100 ml de agar nutritivo conteniendo 0,04% de CaCl2 y

colocarlo en un bao mara a 50 + 2C. Cuando templ a dicha
temperatura adicionarle 1 ml de una solucin alcohlica de
cloruro de trifeniltetrazolio y retornar al bao mara.
2. Medir 100 ml de muestra de agua, previamente homogeneizada, en
una probeta estril de 100 ml. Verter dicho volumen en un
 57

Erlenmeyer estril de 250 ml de capacidad y colocarlo en un bao

mara a 50 + 2C.
3. Inocular la muestra de agua con 5 ml de un cultivo de 24 h de
Escherichia coli (ATTC 13706) en caldo nutritivo a 37C.
4. Cuidadosa y lentamente verter el medio de cultivo dentro de la
muestra de agua y mezclar por rotacin, luego dividir la mezcla
en tres placas de vidrio de 150 x 15 mm, evitando la formacin
de burbujas de aire. Incubar a 35C durante 4 horas sin invertir
las placas.

La presencia de calvas o placas de lisis (reas claras), donde el

fago ha lisado las clulas bacterianas, contrastando con el medio
opaco por el crecimiento confluente de E. coli, indicara
contaminacin de origen fecal en la muestra de agua analizada.

Resultados

A. Titulacin del Colifago T4

Determinar las unidades formadoras de calvas o placas de lisis/ml

de cultivo original del Colifago T4.

Dilucin:.............. Dilucin:..............
Recuento:.............. Recuento:...............

B. Especificidad viral

Realizar un dibujo de sus resultados y establecer cul de los

desconocidos (N 1, N 2, N 3 N 4) fue Escherichia coli
 58

C DETERMINACIN DE COLIFAGOS

Cuantificar y dibujar las calvas o placas de lisis desarrolladas en

las tres placas.

1 2 3

Bibliografa:

http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/16mutacion.htm

http://mikrobiologia.elte.hu/?q=system/files/PRACTICALGUIDE-2012-A.pdf
 59

TRABAJO PRCTICO 7

CONTROL MICROBIOLGICO DE SUPERFICIES

Introduccin

Existen diferentes mtodos para evaluar la calidad higinica de

superficies, manos y ambiente; los mtodos pueden ser cualitativos
o cuantitativos. Ambos son de gran utilidad tanto para medir la
eficiencia de los productos bactericidas utilizados en la higiene
de superficies, como para evaluar la calidad higinica de la
superficie de ciertos alimentos.

Dentro de los cualitativos podemos mencionar la esponja de

celulosa, muy eficaz en la determinacin de presencia/ausencia de
microorganismos patgenos, particularmente en las investigaciones
de brotes de ETA y; la cinta de celulosa adhesiva (Scotch) cuando
deseamos realizar control higinico de manos.

Los mtodos cuantitativos habituales son: sacabocado/delimitador,

hisopo /delimitador, aclarado o lavado y; el agar salchicha de Ten
Cate.

El chequeo es de extraordinaria importancia, ya que segn el grado

de contaminacin que tengan las superficies, manos y ambiente asi
ser la contaminacin; si es mucha, puede influir en el producto
terminado y causar enfermedades al consumidor.

Es conveniente realizar cada cierto perodo de tiempo el chequeo

microbiolgico para detectar las fuentes de contaminacin durante
el proceso y tomar medidas que eviten la accin de estas fuentes
con el objetivo de prever cualquier alteracin en la calidad del
producto terminado.

La determinacin exacta de la contaminacin de equipos o

recipientes es bastante difcil, debido a que no todos tienen las
mismas caractersticas en cuanto a tamao, superficie, etc. Algunos
equipos tienen las superficies lisas y otros son tan accidentados
que presentan dificultad para la realizacin de la toma de muestra;
adems, la construccin de algunos equipos hace difcil determinar
la superficie de contacto con el producto que se elabora y es
precisamente todo esto lo que dificulta la determinacin exacta de
la contaminacin.

Para determinar exactamente la contaminacin de un equipo, habra

que calcular la cantidad de microorganismos que contiene por una
unidad general de superficie; por ejemplo: 100 microorganismos por
cada centmetro, decmetro o metro cuadrado de superficie. De este
modo se podran establecer comparaciones entre la contaminacin de
un equipo en una planta y otro equipo del mismo tipo en otra planta
y ver si tienen una contaminacin semejante o muy diferente o, en
 60

ltimo caso, determinar las causas que provocan una mayor

contaminacin en un lugar que en otro.

De acuerdo a todo lo mencionado precedentemente, depender del buen

criterio del microbilogo la eleccin del mtodo de muestreo que
resulte ms aplicable y eficiente segn la superficie que queramos
muestrear.

Objetivos
Que el alumno conozca algunas de las tcnicas disponibles para
evaluar la calidad higinica de superficies, manos y ambiente. Que
compare las ventajas y desventajas de cada una en funcin de la
informacin que se obtiene, del tiempo invertido y de los recursos
necesarios.

Materiales

Cajas de Petri estriles

Pipetas estriles
Alcohol etlico 96
Sacabocado de acero de 5,5 cm de dimetro
Delimitador de acero de 11,5 cm de dimetro
Esponja de celulosa o poliuretano estril
Bistur
Pinza
Frascos estriles
Agua peptonada al 0,1% estril
1 tubo con 10 ml de agua peptonada al 0,1% estril
Hisopo de algodn
Bolsas de polietileno no usadas
Cinta de celulosa adhesiva (Scotch)
Agar Salchicha de Ten Cate
Cuchillo
Caldo nutritivo estril
Algunos medios slidos selectivos

Procedimiento

1. Sacabocado / delimitador

2. Hisopo / delimitador

3. Aclarado o lavado

4. Esponja de celulosa o poliuretano

5. Cinta de celulosa adhesiva (Scotch)

6. Agar Salchicha de Ten Cate

 61

Sacabocado / delimitador

Impregnar con alcohol y flamear un sacabocado de acero capaz de

delimitar una superficie conocida gracias al filo que posee en uno
de sus extremos.
Luego de unos segundos colocar el sacabocado sobre un trozo de
alimento.
Imprimir al sacabocado un movimiento de rotacin hacia la izquierda
y hacia la derecha.
Con la ayuda de un bistur y pinza estriles retirar una lmina de
alimento de 2 mm de espesor, de la superficie delimitada.
Colocar la muestra en un frasco conteniendo un volumen de agua
peptonada al 0,1 % estril para permitir obtener la relacin 1 cm 2
/ cm 3.

Hisopo / delimitador

Preparar un hisopo de algodn sobre varilla de madera, de acero o

de aluminio. Estandarizar la cantidad y la superficie que cubre el
algodn sobre la varilla. Esterilizar los hisopos en autoclave
acondicionados en tubos o en cajas metlicas.
Con la ayuda de un delimitador metlico estril (de 50 100 cm 2)
frotar en un sentido sobre toda la superficie delimitada y luego
girando el hisopo, frotar nuevamente la superficie en sentido
perpendicular.
Si la superficie es seca utilizar un hisopo humedecido en agua
destilada estril.
Colocar el hisopo en 10 ml de diluyente estril y agitar
enrgicamente.
Este mtodo es tambin de utilidad en el estudio de superficies
irregulares, en este caso sin delimitador.

Aclarado o lavado

Pesar el alimento (1 parte por peso) en un frasco estril de tapa

a rosca.
Aadir diluyente estril (10 partes por peso).
Agitar vigorosamente el recipiente mediante movimiento recproco
durante 2 minutos. El agua de lavado consiste en una dilucin 1:10.
Este procedimiento se aplica a embutidos, carnes en trozos, presas
de aves, frutas secas, legumbres, ensaladas, etc.

Esponja de celulosa o poliuretano

Colocar individualmente piezas de esponja de celulosa o poliuretano

de 5 x 5 x 5 cm en bolsas de papel Kraft y esterilizar a 121C por
15-20 minutos.
Para controlar microbiolgicamente una superficie conocida, por
ejemplo una media res, una mesa, etc., colocar una bolsa de
 62

polietileno no usada a manera de guante, tomar la esponja estril

y pasarla sobre toda la superficie a controlar.
Luego invertir la bolsa de tal manera que la esponja quede
contenida en ella cerrando la bolsa con una banda elstica.
Transportar al Laboratorio, agregar agua peptonada al 0,1 % o caldo
lactosado estril y mezclar.
Si la superficie a controlar es seca conviene humedecer la esponja
antes de su aplicacin.

Cinta de celulosa adhesiva (Scotch)

Plegar sobre s misma y sin contaminar la extremidad de un film de

cinta.
Aplicar la misma sobre una superficie plana en una longitud de 7
cm y presionar enrgicamente.
Luego, desprender la cinta y depositarla sobre un medio de cultivo
slido, cuya superficie se encuentre bien seca. Dejar en contacto
algunos segundos y desprender suavemente la cinta descartndola.
Este mtodo puede usarse con medios selectivos para grupos o
familias especficas en el control higinico de manos.

Agar Salchicha de Ten Cate

Preparar una salchicha de agar nutritivo u otro medio segn lo que

se desee investigar. Esterilizar y conservar en refrigerador.
En el momento de su aplicacin, retirar la porcin inicial de la
salchicha con ayuda de un cuchillo estril.
Con la nueva superficie expuesta aplicar por contacto sobre la
superficie a controlar.
Luego con un cuchillo estril cortar aprox. 1 cm de espesor y
colocar la rebanada del agar sobre una placa de Petri estril, con
la superficie sembrada hacia arriba.
Incubar a 35C por 48 h.
Efectuar el recuento y expresar el resultado por cm 2.

El alumno deber analizar las ventajas y desventajas de cada uno de

los procedimientos sealados.
 63

TRABAJO PRCTICO 8

DETECCIN DE ANTIMICROBIANOS EN ALIMENTOS POR MTODOS

MICROBIOLGICOS

Introduccin

La presencia de residuos qumicos en los alimentos, cuyos

metabolitos podran causar algn efecto nocivo para la salud del
consumidor es un tema de preocupacin en la industria alimenticia.

En la produccin primaria de alimentos, a travs de los diferentes

eslabones de la cadena productiva, pueden llegar a incorporarse
aditivos, promotores de crecimiento o antimicrobianos.

Los antibiticos son utilizados con frecuencia en la cra de

animales para consumo humano. Los residuos de stos que permanecen
en carne o huevos pueden causar efectos adversos en la salud
pblica, resistencia microbiana, alergias, efectos cancergenos,
teratognesis.

Existe metodologa qumica, por ejemplo high performance liquid

chromatography (HPLC) (3) y microbiolgica (1) (2) (4) para la
deteccin de antibiticos y sus metabolitos en productos de origen
animal. Dentro de la microbiolgica puede adoptarse la indicada en
(2).

Las quinolonas son grupos antimicrobianos de uso difundido en aves,

carne y huevos. El plan CREHA (SENASA), plan de control de residuos
e higiene en alimentos, establece la investigacin de quinolonas en
carne y huevos.

La metodologa de deteccin qumica es costosa y lenta. El mtodo

microbiolgico, si bien es menos especfico, podra ser de utilidad
como monitoreo de los animales que se reciben en una planta
procesadora, y podra realizarse en el mismo laboratorio de control
de calidad de la empresa.

Objetivos

Introducir al alumno en la deteccin de antimicrobianos en carnes y

huevos por mtodos microbiolgicos, aplicables en una empresa
productora de alimentos.

Materiales

Cajas de Petri estriles

Pipetas estriles
Etanol 96
Bistur
Pinza
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Frascos estriles
Solucin salina isotnica estril
Hisopo de algodn estril
Bolsas aptas para homogeneizador de alimentos (Stomacher)
Enrofloxacina
Sensidisco
Cultivo de Escherichia coli sensible a enrofloxacina
Agar de Mueller-Hinton
Sacabocado estril

Procedimiento

1. Se le aplicar a 5 gallinas ponedoras, ubicadas en jaulas

individuales, durante 4 das seguidos, una dosis de 10 mg/kg de
peso vivo por va intramuscular, de Enrofloxacina, antibitico
perteneciente al grupo de las quinolonas, de amplio uso en
medicina veterinaria.
2. Se recogern los huevos puestos durante ese perodo.
3. Al quinto da post inyeccin se sacrificarn las gallinas
extrayendo: hgado, riones, ovarios y msculo pectoral. Se
colocarn los cinco rganos en una bolsa apta para
homogeneizador de alimentos (Stomacher). Cada bolsa ser
considerada una muestra. Rotular.
4. El trabajo podr dividirse en grupos, de acuerdo a la cantidad
de alumnos.

Se proceder de igual forma con 5 gallinas control que no recibirn

tratamiento.

1. A cada muestra se les agregar aproximadamente 100 ml de

solucin fisiolgica.
2. Homogeneizar en Stomacher.
3. Se proceder de la misma forma con los huevos, extrayndoles la
cscara.
4. Se preparar una placa de agar Mueller-Hinton de 5 mm de espesor
por cada muestra.
5. Se sembrar en superficie con hisopo estril, una cepa de
Escherichia coli, sensible a Enrofloxacina. A esta tcnica se
la denomina en csped (4).
6. Se dividir la placa segn el siguiente diagrama:
 65

1. Control de siembra
2. Control de antibitico: Se colocar un disco con antibitico
(Sensidisco Enrofloxacina)
3. Control de gallina sin tratar
4. Muestra
5. Incubar a 37C durante 48 horas.
6. Nota: En 3 y 4. Se extraer una porcin de agar con sacabocado
utilizando tcnicas estriles. Se colocar en cada pocillo, 0,05
ml aproximadamente de la muestra correspondiente.
7. Lectura: Realizar la medicin de halo de inhibicin, con calibre
o regla

Interpretacin de resultados

Los resultados esperados sern los siguientes:

1. Crecimiento en csped.
2. El dimetro del halo evala la sensibilidad de la cepa
Escherichia coli sembrada a la Enrofloxacina.
3. Control negativo de ave sin tratar, evala otros antimicrobianos
presentes en la muestra (poder lisognico de tejidos)
4. Se mide la amplitud de los halos. Se compara con las diferentes
muestras.

Bibliografa

Los alumnos contarn con copias de la bibliografa citada, y se

podrn discutir sus contenidos.

Daz R., Gamazo C., Lpez-Goi I. Manual prctico de microbiologa. pg. 123-125.
Masson S.A.; Barcelona, Espaa. 1995.
 66

Pascual Anderson, Mara del Rosario; pg. 138. Microbiologa Alimentaria.

Microbiologa analtica para alimentos y bebidas. Daz de Santos, S.A. Madrid,
Espaa. 1992.

Tarbin, J A., Tyler, D J., Shearer, G. Analysis of enrofloxacin and metabolite

ciprofloxacin in bovine and porcine muscle by high performance liquid
chromatography following cation Exchange clean-up. pg. 345-350, Food additives
and contaminants, Vol. 9, N 4. 1992.

X Curso Antimicrobianos desde el laboratorio, Divisin antimicrobianos, Instituto

Nacional de Microbiologa Dr. C. G. Malbrn. 1992.
 67

OBSERVACIN DE LOS MICROORGANISMOS

Introduccin

Los microorganismos poseen un ndice de refraccin muy cercano al

del agua y en su mayora no poseen color. Por lo tanto, la
principal dificultad para observarlos con un microscopio ptico es
la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea. El
mtodo ms sencillo para aumentar el contraste es teirlos
utilizando colorantes. Los colorantes son compuestos orgnicos que
tienen una afinidad particular por compuestos celulares
especficos.

Los colorantes pueden clasificarse en:

Bsicos. Muchos de los colorantes utilizados comnmente estn

cargados positivamente (son catinicos) y se combinan fuertemente
con los componentes celulares cargados negativamente como los
cidos nucleicos y los polisacridos cidos. El azul de metileno,
el cristal violeta y la safranina son ejemplos de colorantes
catinicos.
cidos. Estn cargados negativamente y se combinan con
constituyentes celulares cargados positivamente como las protenas
bsicas. Ejemplos: rojo Congo, eosina, fucsina cida.
Liposolubles. Se combinan con las sustancias de carcter lipdico
mostrando as su presencia y localizacin. Ejemplo: Negro Sudn.
Mordientes. Algunos colorantes son ms efectivos cuando las clulas
han sido tratadas con otro compuesto qumico que no es un colorante
por s mismo. Esta sustancia se llama mordiente. Los mordientes
forman un complejo insoluble con el colorante llamado laca, que
fija el colorante a la estructura celular. Ejemplos: cido tnico,
fenol, lugol, sulfato de amonio.

Tipos de tinciones.

Se pueden clasificar en dos grupos:

1.- Por el nmero de colorantes utilizados
Simple. Consiste en la utilizacin de un solo colorante.
Ejemplo: azul de metileno y fucsina fenicada. Se utiliza para
aumentar el contraste y detectar la presencia bacteriana, la
morfologa, etc. Las clulas se tien uniformemente. Si los
microorganismos se tien, por ejemplo, con azul de metileno,
muestran en el interior de las clulas algunos grnulos
metacromticos, ms intensamente teidos que el resto de la
clula, lo que indica la presencia de entidades qumicas
activas que tienen mayor afinidad por el colorante que el resto
de la clula en conjunto. Ejemplos: tincin de la flora del
yoghurt con azul de metileno y tincin de bacteroides con
fucsina fenicada.
Compuesta. Consiste en la utilizacin de ms de un colorante.
Ejemplo: tincin de Gram, tincin de esporas.
 68

2.- Por alguna particularidad determinada, independientemente del

nmero de colorantes utilizados.
Tincin diferencial. Son los procedimientos que utilizan ms
de un colorante y que ponen de manifiesto diferencias entre
las clulas bacterianas. Ejemplo: tincin de Gram.
Tincin especial. Pueden ser simples o compuestas. Se
caracterizan por ser coloraciones que manifiestan estructuras
celulares determinadas y especficas. Ejemplos: tincin de
pared celular, de polisacridos bacterianos, de flagelos y
cilias, de esporas, de ncleo, etc.
Tincin negativa. Este procedimiento es la inversa de la
tincin usual. Las clulas quedan sin teir pero se colorea el
medio que las rodea. Se ve por lo tanto el perfil de las
clulas. Los microorganismos quedan transparentes delimitados
por un fondo oscuro. Los materiales que se utilizan en este
tipo de tincin suelen ser materiales opacos que no tienen
afinidad por los componentes celulares. Ejemplo: tinta china
para observar cpsulas.
 69

Anexo 1: PREPARACIN DEL FROTIS

Se denomina frotis a la extensin que se realiza sobre un

portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo ms
posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la
preparacin es muy difcil obtener una imagen clara y ntida. Este
frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos
para poder aplicar los mtodos habituales de tincin que permiten
la observacin al microscopio sin que la muestra sea arrastrada en
los sucesivos lavados. La fijacin de una extensin microbiana hace
que los microorganismos queden inactivados y adheridos al vidrio
alterando lo menos posible la morfologa y las posibles
agrupaciones de clulas que pudiera haber.

REALIZACIN DEL FROTIS

1. Colocar una pequea gota de agua en el centro de un portaobjetos

limpio. Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se
puede usar el asa de siembra, ya que en el extremo curvo de su
filamento queda retenida una mnima gota de agua, que resulta
suficiente.

2. Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones aspticas, una

pequea cantidad del cultivo microbiano en medio slido y
transferirlo a la gota de agua. Remover la mezcla con el asa de
siembra hasta formar una suspensin homognea que quede bastante
extendida para facilitar su secado.
3.
Si la muestra se toma de un cultivo en medio lquido, no es
necesario realizar los dos primeros pasos ya que basta con
colocar y extender una gota de la suspensin microbiana, que se
toma con el asa de siembra, directamente sobre el portaobjetos.

4. Esperar hasta que el lquido se evapore o acelerar su

evaporacin acercando el portaobjetos a la llama del mechero. En
este caso hay que tener mucha precaucin de no calentar
demasiado el portaobjetos pues las clulas pueden deformarse o
romperse.

FIJACIN DE LOS MICROORGANISMOS AL PORTAOBJETOS

1. Por calor: Pasar tres veces el portaobjetos por la llama durante

unos segundos. Dejar enfriar el portaobjetos entre los pases.

2. Con metanol (para microorganismos procedentes de medio lquido):

Aadir unas gotas de metanol sobre la extensin completamente
seca. Golpear el portaobjetos por su canto con cuidado contra la
mesa de trabajo para retirar de inmediato el exceso de metanol.
Esperar a que el metanol se evapore completamente.
 70

3. Una vez realizado el frotis y fijadas los microorganismos, las

preparaciones pueden ser observadas al microscopio, aunque
carecen de contraste. Lo normal es continuar con el proceso de
tincin.
 71

Anexo 2: TINCIN SIMPLE

MATERIALES

Microscopio
Portaobjetos
Asa de siembra
Cultivo bacteriano
Pinzas
Mechero
Azul de metileno alcalino
Safranina

PROCEDIMIENTO

Es la tincin en que se utiliza un solo colorante.

Como colorantes utilizaremos el azul de metileno alcalino o la

safranina, ambos de naturaleza bsica.

La tcnica es la siguiente:

1. Hacer el frotis, secarlo y fijarlo.

2. Cubrir con colorante la preparacin y dejarlo actuar durante un

minuto.

3. Lavar suavemente con agua para eliminar el exceso de colorante.

4. Secar al aire y observar al microscopio con el objetivo de

inmersin (100x) empleando aceite de inmersin.

Esta tcnica permite observar la morfologa y tamao de las

bacterias, as como los tipos de agrupaciones que forman.

Azul de metileno alcalino

Disolver 0,3 g de azul de metileno en 30 ml de alcohol etlico al
95% y mezclarlo con 100 ml de solucin de hidrxido de potasio al
0,01%.

Safranina:
Safranina O (sol. al 5% en etanol de 96) 10 ml
Agua destilada 100 ml
 72

Anexo 3: TINCIN DE GRAM

MATERIALES
Microscopio
Portaobjetos
Asa de siembra
Cultivo bacteriano
Pinzas
Mechero
Cristal violeta
Lugol de Gram
Alcohol-acetona
Safranina

PROCEDIMIENTO

1. Preparar los frotis bacterianos segn anexo 4.

2. Teir con cristal violeta 1 min.
3. Lavar con agua corriente y escurrir el exceso.
En este paso las clulas, tanto las Gram + como las Gram -, se
tien de violeta.
4. Cubrir con Lugol 1 min.
5. Lavar con agua corriente y escurrir el exceso.
El lugol es una solucin acuosa de I2/IK que tiene la funcin de
hacer de mordiente. El principio activo es el I2, que
solubilizado en agua por la presencia de IK, penetra en la
clula y forma un complejo con el colorante. Este complejo es
insoluble en agua y soluble en alcohol y acetona. Todas las
clulas mantiene el color violeta.
6. Decolorar con alcohol-acetona (1:1)o simplemente con alcohol de
96 hasta que la preparacin deje de perder color (30 seg)
7. Lavar con agua corriente y escurrir el exceso.
El lavado con alcohol y acetona solubiliza el complejo y
decolora algunas clulas (aquellas que son Gram -) y no a otras
(aquellas que son Gram +). La diferencia fundamental entonces
entre estos dos tipos de clulas es su resistencia a la
decoloracin; esta resistencia radica en la naturaleza diferente
de la pared celular de ambos tipos de bacterias. Las bacterias
Gram + tienen paredes celulares muy gruesas que se deshidratan
con el alcohol. Esto lleva al cierre de los poros de la pared
evitando que el alcohol penetre en las clulas y por lo tanto
los complejos insolubles cristal violeta/yodo no salen de las
clulas. En las bacterias Gram la delgada capa de
peptidoglucano de la pared no evita el paso del solvente y en
consecuencia el complejo se lava de las clulas.
8. Teir con safranina 1 min.
9. Lavar con agua corriente y escurrir el exceso.
Esta etapa, coloracin de contraste, se utiliza para poner de
manifiesto las clulas Gram que fueron decoloradas en el paso
anterior y no seran visibles sin esta coloracin. Se puede
 73

utilizar tambin fucsina. Las clulas Gram adoptan una

coloracin rosada y las Gram + permanecen violeta.
10. Secar la preparacin.
11. Examinar al microscopio con objetivo de inmersin.

Caractersticas del cultivo bacteriano cuyas clulas van a ser

sometidas a tincin de Gram

Se deben tener presentes las siguientes precauciones:

Estado fisiolgico del cultivo bacteriano. La tincin se debe
realizar sobre clulas procedentes de un cultivo joven, es decir de
24 h o menos de desarrollo ya que ciertas bacterias son solo Gram +
durante el curso de su crecimiento activo y pierden la capacidad de
retener el complejo yodo-cristal violeta cuando el crecimiento
cesa.
Desarrollo del cultivo en medio agarizado. La coloracin se debe
realizar sobre clulas provenientes de un cultivo realizado en
medio agarizado. Si los microorganismos se ha desarrollado en medio
lquido al tomar la muestra se arrastran componentes del mismo que
pueden reaccionar con los colorantes y dificultar la observacin.

Gram positivo Gram negativo

COMPOSICIN DE LAS SOLUCIONES UTILIZADAS EN LA COLORACIN DE GRAM

Solucin de cristal violeta

Cristal violeta 10 g
Oxalato de amonio 4 g
Etanol 100 ml
Agua destilada 400 ml

Solucin de Lugol
Yodo 1 g
Yoduro de potasio 2 g
Agua destilada 300 ml
 74

Mezclar en un mortero, agregar el agua en pequeas porciones y el

resto emplear para lavar el mortero, recolectando todo en un frasco
de color caramelo.

Solucin de safranina
Safranina 2,5% en etanol 10 ml
Agua destilada 100 ml

Bibliografa:

Rojas Trivio, A. 2011. Conceptos y Prctica de Microbiologa General.

Universidad Nacional de Colombia, sede Palmira. 161 p.

Esa Lpez-Jcome, L; Hernndez-Durn, M; Coln-Castro, C. A; Ortega-Pea, S;

Cern-Gonzlez, G; Franco-Cendejas, R. 2014. Artculo de revisin: Las tinciones
bsicas en el laboratorio de microbiologa. 3 (1): 10-18
http://www.medigraphic.org.mx
 75

Anexo 4: TINCIN DE ENDOSPOROS BACTERIANOS

MATERIALES

Microscopio
Portaobjetos
Asa de siembra
Cultivo bacteriano en fase estacionaria
Pinzas
Mechero
Papel de filtro
Solucin acuosa de verde de malaquita al 5%
Safranina

PROCEDIMIENTO

1. Hacer el frotis y secarlo.

2. Fijar por calor 3 4 veces.
3. Colocar un tozo de papel de filtro sobre el preparado y
saturarlo con verde de malaquita.
4. Permitir que el verde d malaquita asiente sobre el portaobjetos
durante un minuto.
5. Sosteniendo el portaobjetos con pinzas, calentar cuidadosamente
en la llama amarilla del mechero hasta que comience a desprender
vapores. Retirar el portaobjetos del calor hasta que los vapores
desaparecen; luego volver a calentar. Continuar vaporizando el
preparado de esta forma durante 5 minutos. Como el verde de
malaquita se evapora, continuamente aadir ms. No dejar que el
papel se seque.
6. Pasados los 5 minutos de vaporizacin, lavar el exceso de
colorante y eliminar el papel de filtro con agua. No se olvide
de lavar cualquier cristal de colorante que se halle en los
bordes del portaobjetos.
7. Dejar secar al aire.
8. Ahora inundar el preparado con safranina y colorear por un
minuto.
9. Lavar el exceso de safranina con agua, dejar secar, y observar
con objetivo de inmersin.

Los endosporos bacterianos se vern de color verde y las clulas

vegetativas rojas.
 76

Otro aspecto que debe tenerse en cuenta al observar esporos es su

posicin: terminal, subterminal o central, y si deforman o no a la
bacteria ya que sern caractersticas que ayudarn en la
clasificacin.
 77

Anexo 5: OBSERVACIN MICROSCPICA DE HONGOS

MATERIALES

Microscopio
Portaobjetos
Asa de siembra
Cultivo fngico
Pinzas
Mechero
Azul de lactofenol
Azul de metileno alcalino
Cinta adhesiva transparente

Observacin microscpica de mohos en montaje con cinta adhesiva

1. Se corta una tira de 4-5 cm de cinta adhesiva transparente

tomndola nicamente por los extremos.

2. Cerca del mechero se abre la caja y se presiona ligeramente la

cinta transparente sobre la periferia de la colonia.

3. Colocar la cinta con la muestra adherida sobre una gota de azul

de lactofenol o KOH al 10 % o azul de metileno alcalino
previamente colocada en el centro de un portaobjetos. La cinta
funcionar como cubreobjetos por lo que se deber aplanar lo
mejor posible, evitando la formacin de burbujas y sin alterar
demasiado las estructuras.

4. Dejar reposar durante 3-5 minutos y hacer las observaciones en

el microscopio a diferentes aumentos.

5. Localizar en las preparaciones hifas, estructuras especiales

como conidiforos, conidios, esporangiforos, esporangios y
rizoides. Determine si las hifas presentan septos o no.

OBSERVACIN MICROSCPICA DE LEVADURAS

Introduccin

Las levaduras son hongos de talo unicelular, capaces de

reproducirse asexualmente por gemacin o fisin. Algunos gneros
pueden formar pseudomicelio, y la mayora de ellas fermentan uno o
varios azcares. Su identificacin se basa en criterios
morfolgicos y fisiolgicos.

Las pruebas morfolgicas (caractersticas macro y microscpicas)

permiten aproximarse al gnero al que pertenecen teniendo en cuenta
 78

que la identificacin definitiva se hace en base a pruebas

bioqumicas.
Definimos algunos trminos habituales en micologa.
Blastospora: Clula fngica que se forma como consecuencia de un
proceso de gemacin.
Clamidospora: Espora esfrica formada en las hifas, ya sea en
posicin intercalar o terminal, de pared gruesa y cuyo dimetro
es mayor que el de los filamentos en los que se forma.
Micelio: Conjunto de hifas o filamentos de un hongo.

PROCEDIMIENTO

1. Cubrir el frotis con 2 gotas de azul de metileno alcalino

durante 30 segundos a 1 minuto.

2. Eliminar el exceso de colorante con lavado suave al agua

corriente.

3. Dejar secar al aire.

4. Hacer observaciones al microscopio a diferentes aumentos.

Azul de lactofenol

Cristales de fenol 20 g
cido lctico 20 ml
Glicerol 40 ml
Azul coton (metil-azul) 0,05 g
Agua destilada 20 ml

Conservar en frasco hermtico color caramelo.

 79

SEMINARIOS 2017

1. TEMAS MICROBIOLGICOS POR INTERNET:

1. Microorganismos indicadores o marcadores.
2. Microbiologa de los manipuladores de alimentos.
3. Microbiologa del vino y cerveza.
4. Microbiologa de quesos.
5. Microbiologa de la kombucha.
6. Microbiologa del kfir de leche y de agua.
7. Probabilistic Identification of Bacteria v. 1.9.2, de Trevor
Bryant (University of Southampton).
http://www.som.soton.ac.uk/staff/tnb/pib.htm.
8. IdBact v. 1.1, de Goran Kronvall i Daniel Wiman (Karolinska
Institute). http://www.ki.se/labmed/clim/get_copy.htm.
9. Encefalitis espongiforme bovina (virus de la vaca loca).
10. Leptospira spp.
11. Legionella spp.
12. Examen microscpico de alimentos.
13. Investigacin de alimentos implicados en enfermedad.
14. Anlisis de Riesgos y Control de Puntos Crticos (H.A.C.C.P.)
15. Salmonella.
16. Shigella.
17. Campylobacter.
18. Yersinia enterocolitica y Y. pseudotuberculosis.
19. Vibrios
20. Listeria monocytogenes.
21. Staphylococcus aureus.
22. Bacillus cereus.
23. Escherichia coli O157:H7
24. Clostridium perfringens.
25. Clostridium botulinum.
26. Micotoxinas en alimentos.
27. Investigacin de bacterifagos en leches fermentadas.
28. Pseudomonas aeruginosa en aguas.
29. Recuento total de microorganismos por el mtodo de Breed en
alimentos.
30. Efluentes industriales en industrias lcteas.
31. Cronobacter sakazakii en alimentos para bebs.
32. Determinacin de la potabilidad del agua de consumo mediante la
cuantificacin de colifagos.

2. Seminario: Parsitos transmitidos por alimentos

1. Cryptosporidium parvum
2. Taenia saginata / solium
3. Trichuris trichiuria / Ascaris lumbricoides
4. Trichinella spiralis
5. Giardia lamblia
6. Toxoplasma gondii
7. Cyclospora cayetanensis
8. Entamoeba histolytica